Importancia del control genético en animales de laboratorio

Sandra Mai CHEA-CSIC

Animal de laboratorio= Reactivo Biológico

Son aquellas especies de vertebrados domésticos tradicionalmente usado como animal de experimentación.

Capaces de dar una respuesta confiable y reproducible.

Se tiende a que su homogeneidad somática, genética y sanitaria este controlada.

CHEA, 2012.

Animal de experimentación =Biomodelo experimental

• Engendrado y producido en condiciones controladas

• Mantenido en un entorno controlado

• Con antecedentes genéticos y microbiológicos conocidos

• De los que existe una comprobación sistemática

Nomura 1987

Diferentes tipos de reactivos biológicos.

•Genéticamente Estandarizadas:

Líneas Consanguíneas o Endocriadas (inbred strains)Híbridos F1Grupos Exocriados (outbread stocks)

•No estandarizadas Genéticamente.

Líneas consanguíneas/Endocriadas/Endogamicas

Una línea (o cepa) consanguínea es aquella que resulta del acoplamiento sistemático e ininterrumpido entre hermanos y hermanas (en inglés, full-sib mating), por más de 20 generaciones. Todos los animales descienden de un único par de progenitores.

Lineas consanguíneas: constitución genética esta fija en forma casi definitiva.

“It is the conviction of many geneticists that the use of inbred mice in cancer research has made possible many contributions of a fundamental nature that would not have been made otherwise” (L.C. Strong, 1942).

“The introduction of inbred mice into biology is comparable in importance with that of the analytical balance into chemistry” (H. Gruneberg, 1952).

“...the development of inbred strains has constituted probably the greatest advance in all cancer research” (W.E. Heston, 1963)

Características:

-Una población de individuos genéticamente homogéneos y estable (isogenicidad)

Individuos homocigotos en todos los loci del genoma- un solo tipo de gameto: "línea pura"

Características:

-Una población de individuos fenotípicamente idénticos

-Cada línea presenta individualidad con respecto a sus cualidades. Rasgo importante para elegir la línea para trabajar.

-La aparición de mutaciones espontáneas y un mínimo de heterocigosis residual puede generar una sublínea.

Líneas Endocriadas

Uso General: ampliamente distribuidas

y usadas en distintas disciplinas.

Uso Particular: rasgo particular que la hace útil

para determinados estudios (ej sensibilidad a infecciones o a desarrollar

tumores)

Algunos Ejemplos: Líneas Consanguíneas de Ratón de uso general

•Modelos: cardiovasculares, neurobiología y sensorial.•Control de farmacos. • Inmunología•Ensayos de Audición

DBA/2

•Modelos generales•Desarrollo de hibridoma •Producción de anticuerpos monoclonales•Infecciones

BALB/c C57BL/6

•Modelos: cardiovasculares, neurobiología y sensorial.•Obesidad y Diabetes•Producción de trasngenicos y knockout•Control de farmacos.

http://jaxmice.jax.org/strain/

http://www.criver.com

Algunos Ejemplos: Líneas Consanguíneas de Ratón de uso particular

•Carece de Timo y es incapaz de producir células T. •Inmunodeficientes.

•Uso: biología tumoral y xenotrasplantes.

•Heterocigocis no son inmunodeficientes y tienen pelo

BALB/c Nude

•Genera linfomas espontáneamente

AKR

http://www.criver.com

Algunos Ejemplos: Líneas Consanguíneas de Ratas de uso general

http://jaxmice.jax.org/strain/

http://www.criver.com

•Modelos generales•Estudios de Transplantes •artritis/inflamación•Alergia experimental • encefalitis, •Diabetes inducida por STZ

Lewis

•Modelos multipropositos:•Control de farmacos. • Oncología•Nutrición

Ficher (F344)

Algunos Ejemplos: Líneas Consanguíneas de Ratas de uso particular

http://www.criver.com

Spontaneously Hypertensive (SHR) Rat

Spontaneously Hypertensive Obese (SHROB) Rat

Líneas no consanguíneasExocriadas/Exogámicas

Genéticamente heterogéneos: baja homocigosis e isogenicidad

Fenotipicamente no tiene porque ser idénticos.

Grupos de roedores de laboratorio que mejor representan la variabilidad genética de una población típica.

Sistemas de cría tendientes a impedir que se realicen cruzamientos entre individuos emparentados. Esto es dificultoso en una colonia cerrada, por lo cual se debe partir de un gran número de parejas reproductoras.

Uso en farmacología y toxicología y en experimentos de selección.

Líneas más economicas

Algunos Ejemplos: Líneas No Consanguíneas de Ratón

•Modelos Generales .•Control de farmacos

Swiss Webste

http://jaxmice.jax.org/strain/

http://www.criver.com

•Modelos generales•Pseudopreñez•Cirugia•Control de farmacos

CD1

Algunos Ejemplos: Líneas No Consanguíneas de Rata

http://jaxmice.jax.org/strain/

http://www.criver.com

•Modelos generales•Estudios comportamentales

Long Evans

•Modelos Generales .•Control de farmacos•Envejecimiento•Infecciones

Wistar

•Modelos generales•Oncología•Control de farmacos•Nutrición y Obesidad

Sprague Dawley

Híbridos F1 Son la primera generación obtenida del cruzamiento de dos

líneas consanguíneas.

Son isogénicos, pero heterocigotas para todos los loci en que difieren las líneas parentales.

Vigor Híbrido: estado físico superior al de la línea parental y mejor adaptación al medio.

Alternativa a usar lineas no consanguíneas ya que se genera polimorfismos.

Control Genético

¿Por qué es necesario el control genético de las líneas?

Determinar pureza genética de los animales

Definir si la colonia es consanguinea o no.

Determinar si mi sistema de cría mantiene la heterocigosis

Determinar posibles contaminaciones en la colonia consanguínea.

Determinar Híbridos.

Determinar transgénicos.

Control genético El fundamento consiste en analizar caracteres y

compararlos con valores de referencia establecido internacionalmente para la línea consanguínea.

Tres tipos de controles (Festing):

Caracterización: Analizar el mayor número de loci posibles para describir una nueva línea.

Control tipo I: confirma el perfil genético de una línea.

Control tipo II: analiza el grupo mínimo de loci para determinar entre varias líneas

Nos permite verificar si los animales aún conservan las características genéticas originales de la línea a la cual pertenecen.

Métodos de Control

• Polimorfismo Bioquímico

• Oteometría cada vez menos usados

• Histocompatibilidad Tisular

• Tipificación del ADN: microsatelites

Polimorfismo Bioquímico

Isoenzima: en la población existen diferentes formas moleculares de una determinada enzima con similares propiedades catalíticas: esterasa 1 (Es1), esterasa 2 (Es2), esterasa 3 (Es3), etc.

Aloenzimas: distintos alelos de un mismo locus de isoenzima. Se designan con las letras a, b, c, etc. (Es1a, Es1b, Es1c).

La diferente velocidad de migración de las isoenzimas en un gel de electroforesis permite determinar a que alelo correspondo

Línea Consanguinea: existe un patrón único de aloenzimas para cada línea particular y esta caracterizado.

Ventajas:•La mayoría de las líneasconsanguíneas de rata yratón se encuentran caracterizadas 20 locis para Isoenzimas

Desventajas:•Bajo polimorfismo•Protocolos tediosos•Cadena de frío•Sacrificio de los animales•Costoso

Osteometría

Comparación de características morfométricas de determinados huesos.

Los cuales su forma y tamaño esta determinado por herencia y son característicos de cada línea.

Se miden 11 puntos predeterminados a nivel de la mandíbula y se compara con un patrón de referencia.

Compatibilidad TisularTransplantes de Piel:

Entre un organismo donante y otro receptor. El transplante será rechazado si ambos individuos no son genéticamente idénticos.

Tecnica ya en desuso: esperar mucho, falsos positivos y falsos negativos

Tecnicas Inmunológicas: los eritrocitos y linfocitos son capaces de inducir la producción de anticuerpos en un animal distinto genéticamente.

Ratones de una línea determinada se inocula con celulas sanguineas de otra línea.

Luego de 3 o 4 semanas se determina la presencia de anticuerpos. Si hay Ac entonces no son de la misma línea

Marcadores de ADN: Analisis de microsatelites por PCR.

Microsatélites o SSLP (simple sequence length polimorphisms) •Secuencias de ADN de 1-6 pares de bases

• Repetidas entre 15-40 veces en tandem

• Dispersas a lo largo del genoma de los eucariotas• 7.000 loci identificados en el ratón y 4.000 en la rata (primers disponibles)

• Gran nivel de polimorfismo entre las distintas líneas.

La amplificación por PCR de estos microsatelites es caracteristico para cada especie.

Protocolo

Extracción del ADN

Animal a analizar.

Amplificación del los microsatelites con primers específicos por PCR.

Migración del producto de amplificación en geles de agarosa/poliacrilamida

Marcadores de ADN: Analisis de microsatelites por PCR.

D= numero del cromosoma Mit= código del laboratorio/numero del marcador

Tamaño de amplificación en pb

Resultados

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

300

200

100

C P C P C P C P C P C P C P C P

Primer 1 Primer 2 Primer 3 Primer 4 P1 P5

D1Mit14 D11Mit38 D15Mit214 D7Mit301D11Mit4

BALB/c BALB/c BALB/c BALB/cC57BL/6 C57BL/6 C57BL/6 C57BL/6

HH

Interpretación de los resultados

Muestra Problema 1: Se comporta como homocigota para BALB/c para 3 microsatélites

Muestra Problema 2: Se comporta como homocigota para C57BL/6 para 4 microsatélites

Muestra Problema 3: Podemos visualizar que es un hibrido por presentar 2 alelos (Hetrocigota C57BL76 y DBA/2)

Contaminación de una colonia cosanguinea

S= control para cepa albina SJL

C= control para cepa albina Balb/c

1 y 2 muestras problemas

¿Por qué es necesario el control genético de las líneas?

Determinar pureza genética de los animales

Definir si la colonia es consanguinea o no.

Determinar si mi sistema de cría mantiene la heterocigosis

Determinar posibles contaminaciones en la colonia consanguínea.

Determinar Híbridos.

Determinar transgénicos.