Primer revisin

Primer revisinSegunda revisin

Nota:

Fecha:

Firma del docente:

IMAGING DE pH EN DOS DIMENSIONES Y APLICACION

A MONITOREO DE SISTEMAS EN FLUJOAutores: Noelia Bracamonte, Luciana Karothy, Glenda Kozakiewicz, Andrea MonroyFecha de realizacin del TP: 21 de Agosto de 2012

Fecha de entrega del informe: 3 de Septiembre de 20121. Objetivos Mapeo de pH en un sistema con flujo continuo, mediante la utilizacin de un indicador cido-base y el registro de datos con una cmara digital.

2. Materiales y mtodos

2.1 Materiales y equipamiento

Solucin de un complejo de Rutenio y Calcn como indicador acido-base. Cmara fotogrfica digital con un sensor de semiconductor (matriz de CCD).

Programa de acceso libre ImageJ.

2.2 Mtodos y desarrollo experimental2.2.1 Descripcin del sistema con flujo continuo

En este trabajo, se utiliz Calcn como indicador cido-base cuyo valor de pKa es de 7,4. Su forma cida posee un mximo de absorcin a 515 nm (verde) y en su forma bsica, la absorcin mxima se presenta a 610-640 nm (rojo). En la Figura 1, se pueden apreciar los espectros de absorcin de las especies cida y bsica.

Figura 1. Espectro de absorcin de Calcn a pH 3 y 10 (izquierda) y estructura de Calcn (derecha).

El dispositivo montado consisti en un delgado tubo capilar por el cual se hizo circular, en flujo continuo, una solucin de un complejo de Rutenio y Calcn. El mismo fue excitado mediante un pulso lser en un punto del capilar, provocando la ruptura fotoqumica del complejo liberando, as, butilamina. La presencia de dicha base en el medio, alcaliniz el sistema y caus el viraje de color del indicador en solucin. En la Figura 2, se presenta un esquema del dispositivo empleado.

Figura 2. Esquema del sistema utilizado. A) representa la entrada de la solucin , B) la direccin del flujo, C) el descarte, D) el objetivo del microscopio y E) el lser de 405nm enfocado sobre el capilar.

2.2.2 Sensor empleadoPara obtener las imgenes del flujo, se utiliz una cmara fotogrfica digital con un sensor de semiconductor (matriz de CCD) capaz de captar la cantidad de luz en forma independiente, en cada uno de los puntos que forman la imagen. Para ello, la matriz de CCD se encuentra dividida en los tres colores primarios (RGB, por las siglas en ingls de rojo, verde y azul). Las respuestas de los filtros del dispositivo no son lo suficientemente angostos como para considerar que la luz que llega a cada pxel es monocromtica y, por lo tanto, no sera correcto aplicar la Ley de Lambert-Beer (cuya expresin se puede ver en la Ecuacin (1.A) del Apndice) de manera directa. Para resolver este inconveniente, se utiliz como fuente de iluminacin, un dispositivo LED rojo (635 nm) y otro LED verde (535 nm) con un ancho de banda de unos 20 nm, Su implementacin redujo apreciablemente el intervalo de longitudes de onda de la luz que llegaba a cada filtro. 2.2.3 Obtencin de datos y procesamiento

La manipulacin de imgenes recolectadas se realiz con el software Image J. Se dividi el video en los tres canales que representan cada filtro (rojo, verde y azul) y se trabaj nicamente con el correspondiente al rojo (635 nm). Esto ltimo result til por mltiples razones. Una de ellas es que, a esa longitud de onda, la absorbancia correspondiente a la especie cida del Calcn es despreciable frente a la de la especie bsica, lo cual, puede corroborarse en la Figura 1. Otra ventaja es que el espectro de la especie bsica presenta su mximo de absorcin y, por lo tanto, es posible aplicar la Ley de Lambert-Beer con mayor sensibilidad que en otras regiones del espectro.

Teniendo en cuenta que a 635 nm nicamente absorbe la especie bsica, se tom como I0 un promedio de imgenes en las que la solucin tena un pH tal que el indicador se encontraba mayoritariamente como especie cida. A su vez, se utiliz un promedio de imgenes con la finalidad de reducir el ruido asociado a tomar un nico valor para cada punto de la imagen. Posteriormente, se realiz una serie de operaciones sobre las imgenes del video para obtener informacin del pH en cada punto del flujo.

La primera operacin consisti en convertir la seal de cada pxel de intensidad I de luz a transmitancia (T). Esto se logr dividiendo la seal de cada pxel de cada frame del video (I) por la seal del I0 correspondiente a cada pxel. Luego, se obtuvo la recproca de T, se aplic logaritmo natural y se multiplic por 2,303. As, se obtuvo un video de absorbancia de la especie bsica. Posteriormente, se convirti este video en fraccin molar de la especie bsica (XB) al dividir la absorbancia de cada pxel por el valor de absorbancia mximo correspondiente a las zonas fuertemente bsicas, generadas por el pulso del lser. De este modo, se gener un video de XB y uno de (1- XB). Finalmente, teniendo en cuenta la expresin de la Ecuacin (1), se realizaron los clculos correspondientes utilizando el valor de pKa 7,4 y obtener un video que brindara informacin del pH del flujo en cada punto.

(1)

En distintos pasos se fijaron valores mximos y mnimos, utilizando como criterio el conocimiento previo acerca de los parmetros y de la muestra.

3. Resultados3.1 Obtencin de la I0Para obtener la absorbancia correspondientes a I0, se promedi distintas imgenes en las que la especie bsica del indicador se encontraba ausente del flujo. Para ello, el video contaba con una seccin final, en la cual, se dej de incidir con el lser y, por lo tanto, el flujo contena nicamente a la especie cida. Las imgenes correspondientes a dicha seccin fueron las seleccionadas para llevar a cabo esta operacin.

El grfico de la Figura 3, representa la variacin de intensidad media de luz en funcin del frame para una regin rectangular en particular. Como se puede observar, aproximadamente, a partir del frame 149 la seal se estabiliza por lo que se tom dicho frame como el primero de la zona para la obtencin de I0. As, las imgenes promediadas para obtener el parmetro mencionado fueron las comprendidas entre el frame 149 y el ltimo del video (el 173).

Figura 3. Grfico de intensidad media de luz (I) para una regin particular en funcin del tiempo (frame).

3.2 Fotos de cuadros importantes del video y anlisis de la forma del perfil de pHLas figuras que se presentan a continuacin, reflejan el avance de la pluma de pH a lo largo del capilar. Desde la Figura 4.a) hasta la 4.d) se puede ver la pluma en las distintas posiciones del cuadro. Las cuatro figuras se encuentran ordenadas y corresponden a los frames 28, 31, 35 y 38, respectivamente.a)

b)

c)

d)

Figura 4. Avance de la pluma de pH a lo largo del capilar. A su vez, se presenta la recta que se utiliz para calcular el pH vs distancia en pixeles en cada frame. En a) se puede ver la aparicin de zonas bsicas ocasionadas por la incidencia del lser, y en b), c) y d) se observa cmo avanza la pluma de pH.

A partir de las imgenes representadas arriba, se apreciar cmo se desarrolla el flujo continuo dentro del capilar. La especie coloreada formada en el punto de excitacin del lser se mueve a lo largo del capilar con una mayor velocidad en el centro y velocidad nula en los bordes del mismo dando lugar a un perfil de velocidades parablico. Esta caracterstica es propia de un fluido en flujo o corriente laminar, y explica el aspecto de pluma que se observa alrededor de la zona bsica a medida que circula por el capilar. 3.3 Variacin del pH con la longitud

Para las cuatro imgenes mostradas en la Figura 4, se traz una lnea horizontal (de color amarilla) para estudiar cmo vara el pH a lo largo del capilar en cada una de ellas. Con una misma recta se realizaron todas las medidas. En las Figuras 5.a) a 5.d) se exponen los grficos obtenidos en cada caso.a)

b)

c)

d)

Figura 5. Grficos de pH en funcin de la distancia (en pxeles). a) Corresponde al frame 28, b) al 31, c) al 35 y d) al 38.

Se puede observar cmo, a medida que se desplaza la pluma, se desplazan los mximos en los perfiles de los grficos de pH en funcin de la distancia. Esta tendencia concuerda con los colores del perfil pluma que se observa en la Figura 4. Por otro lado, se esperara ver que el perfil de pH de la Figura 5.b) tuviera valores menores que el de la Figura 5.a) pero, se observa lo contrario. Una causa de lo observado podra ser que la butilamina no se libera instantneamente y, por lo tanto, el pH no aumenta de forma abrupta. En las Figuras 5.c) y 5.d) se puede observar que los grficos se ensanchan y el valor mximo disminuye lo cual, se debe a que se diluye la zona bsica determinada por la pluma como consecuencia del mezclado y la difusin de los OH- que son generados por la butilamina liberada en el fluido.3.4 Variacin del pH con el tiempo

A continuacin, en la Figura 6, se presenta el grfico de pH en funcin del tiempo registrado para una pequea regin rectangular ubicada en el centro del capilar:

Figura 6. Variacin del pH con el tiempo (frame) para una pequea regin rectangular.

Aqu, se pueden distinguir distintos picos correspondientes a valores de pH cercanos a 8. Analizando el aspecto de los picos, se observa que aparecen dando un aumento brusco de pH y luego, desciende con una menor pendiente hasta la aparicin del siguiente pico. La aparicin del pico se puede adjudicar a la llegada del punto de inters de la pluma de pH. Al tratarse de un punto que se encuentra en el centro de la imagen, se deduce que la pluma ya atraves la mitad de la seccin fotografiada del capilar y, por lo tanto, ya se encuentra a un pH menos bsico que el que posea al formarse. Esto ltimo concuerda con la observacin de mximos de pH cercanos a 8 en la Figura 6, que son menores que los valores de pH superiores a 10 que se observan en la Figura 5.b). El descenso suave de pH que sigue a la aparicin del pico se debe al pasaje del resto de la pluma y a su posterior desaparicin de la imagen.

Finalmente, puede apreciarse claramente que a partir del frame 140, el grfico se vuelve irregular como consecuencia del ruido de fondo. Este efecto est relacionado con la toma de imgenes y es propio del mtodo, aunque se sepa que el sistema no posee fluctuaciones tan violentas de pH y que el valor del mismo se mantiene estable. 3.5 Anlisis del error en pH en distintas zonas

Se debe destacar que, las mediciones de pH realizadas a travs de este mtodo, poseen un ruido apreciable. Esto, se puede observar claramente en todos los grficos presentados hasta el momento. Las fuentes de ruido pueden estar asociadas a distintos factores. Por un lado, se debe tener en cuenta que se est tomando imgenes de un fluido cuyo movimiento es de una velocidad apreciable. Esto, puede generar variaciones en las mediciones de intensidad de luz registradas por la cmara, si la misma no es de calidad suficiente. Adems, si las paredes del capilar son imperfectas, se generan turbulencias en los bordes que generan mezclados aleatorios y alteran las concentraciones locales, por lo cual, las seales registradas por la cmara se ven afectadas, contribuyendo a un incremento del ruido.

Por otra parte, es esperable que ciertas zonas presenten mayor ruido que otras. Por ejemplo, en zonas cercanas al pKa del indicador, las concentraciones relativas de la especie cida y bsica son muy parecidas, y pequeas variaciones de pH generan cambios importantes en la coloracin, que es lo que se utiliza indirectamente para cuantificar el pH. Por lo tanto, en las regiones de pH cercanas al pKa se puede esperar una mayor variabilidad en la determinacin de pH.

Como una aproximacin de las limitaciones del mtodo empleado, se estudi el ruido a travs del desvo estndar del I0 (SB). Para ello, se tom un cuadro correspondiente al blanco (frame 165) y se realiz un histograma de pH en un recuadro representativo del frame seleccionado. De esta manera, se pudo asignar un valor promedio del pH en el blanco y estimar la varianza del mismo. En la Figura 7, se presenta el frame utilizado y el histograma correspondiente.a)

b)

Figura 7. Blanco de pH. a) Fotografa del frame utilizado para calcular el valor promedio de pH del blanco. b) Histograma de los valores que toma el pH dentro de ese sector.

En el histograma de la Figura 7, se puede observar el valor promedio de pH de fondo y su desvo estndar. En la tabla de la Figura 8, se presenta el desvo estndar (SB), el promedio (XB) y se asign un rango de pH segn la ecuacin 3.A del Apndice. No se utiliz un intervalo de confianza ya que, al dividir la desviacin estndar por la cantidad de puntos tomados, se obtiene un valor sumamente pequeo resultando el intervalo de confianza extremadamente acotado, lo cual, no refleja la variabilidad observada. Por otro lado, si se toma el valor promedio y un corrimiento de dos veces el desvo estndar, el intervalo obtenido sera sumamente grande, lo que se sabe que no es correcto ya que el sistema se encuentra con el pH estabilizado en esa seccin del video. Los valores mencionados, se pueden apreciar a continuacin:SBXBRango asignado

1,3753,5664 1

Figura 8. Valores de XB, SB y Rango de valores obtenidos para el pH del blanco (cido).

Finalmente, dado que el programa no puede discernir entre el error que se comete por fluctuaciones o ruido y el cambio del pH por la ruptura del complejo, el criterio escogido para determinar los errores fue dividir una imagen en zonas y estudiar la distribucin de valores de pH en cada una de ellas. El software utilizado permite visualizar distintas zonas que contienen pxeles con valores de pH dentro de intervalos determinados. Como consecuencia del ruido instrumental, las zonas presentan lmites muy bruscos, por lo tanto, se suaviz gaussianamente a cada pxel con 2 pxeles vecinos, a travs de la funcin Gaussian Blur. Esto permiti tener zonas mejor definidas para estudiar, disminuyendo el ruido. Sin embargo, esta herramienta tiene la desventaja de que aumenta el nmero de pxeles NaN (Not at Number). Para asignar un pH a la escala de colores, se trabaj sobre la imagen que se presenta en la Figura 9. Los valores de pH que figuran en la misma se obtuvieron a partir de tomar un frame (31) y seleccionar rectngulos en distintas zonas (colores), obteniendo la media y el desvo estndar en los mismos (manteniendo el mismo rea de estudio seleccionado). De esta forma se realiz un anlisis estadstico con los datos de cada regin, asignando un valor medio a cada color y su error asociado.

Figura 9. Grafico del calibrado de colores para la asignacin de valores medios con sus respectivos errores.

ConclusionesA lo largo de este trabajo prctico, fue posible realizar la medicin del pH de un sistema en movimiento aproximado a dos dimensiones. El conjunto de datos obtenidos se bas en la medicin de la intensidad de la radiacin electromagntica transmitida por un compuesto coloreado utilizando una cmara digital como sensor.

La utilizacin del software ImageJ, permiti la manipulacin de las imgenes recogidas por la cmara fotogrfica y, mediante operaciones matemticas, fue posible obtener los resultados en unidades de pH a partir de datos de intensidades relativas de colores en cada frame o fotografa del video capturado. Es importante mencionar que, luego de las operaciones realizadas, surgieron una gran cantidad de pixeles sin valores asignados que quedaron excluidos del anlisis crtico.

En cuanto al especto general de las imgenes, se pudo apreciar una figura de pluma en el perfil de pH en las zonas cercanas al punto de incidencia del lser, lo cual, permite concluir que el flujo se desplazaba como un flujo laminar dentro del capilar.

Por otra parte, se pudo observar que existe un importante ruido asociado a la medicin, trayendo aparejado unos lmites de deteccin y cuantificacin que acotan el alcance de la tcnica. An as, al trabajar estadsticamente con una cantidad de datos suficientemente grande fue posible obtener valores medios de pH con errores pequeos para cada zona determinada en la pluma.Bibliografa

Anlisis Instrumental, D. Skoog y J. Leary, 4 Edicin, 1994. Ed McGraw-Hill.ApndiceSegn laLey de Lambert-Beer se tiene que:

(1.A)donde () es el coeficiente de absortividad molar de la especie considerada, b la longitud de la cubeta y c la concentracin. Adems, A se relaciona con la intensidad de luz que llega al detector (en este caso, a cada pxel de la matriz de CCD de la cmara digital) del siguiente modo: (2.A)donde I0 es la intensidad de luz que atraviesa el flujo y llega al detector cuando no hay analito presente (en este caso, cuando no se encuentra la especie bsica) e I es la intensidad que llega al detector cuando el flujo contiene al analito.

Por otro lado, para calcular los valores medios en cada color con su respectivo error, se utiliz la siguiente expresin:

(3.A)

PAGE 1

_1408187291.unknown

_1408137029.bin

_1378019766.unknown

_1378019767.unknown

_1378019748.unknown