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Casa abierta al tiempo UNIVERSIDAD AUTONOMA M ETROPOLITANA-IZTAPALAPA
Identificación de los microorganismos causan- tes de la mastitis y su efecto sobre algunos componentes de la leche.
TRABAJO TERMINAL DE LA CARRERA DE P S Ó N ANIMAL QUE PRESENTA PARA RÉPLICA FINAL
o
María Fernanda Conches0 Cobos
TUTORES RESPONSABLES:
M. en C. Elisa Vega Ávila Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar.
México, D.F. a 3 de julio de 1991
M
Agradezco a:
Mis asesoras M. en C. Elisa Vega Avda y Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar, por su com-
pronsión, confianza y gran apoyo en la realización de este trabajo.
M. en C.Rodolfo Velasco por la ayuda que me brindó
M. en C. Jorge I. Olivera por su colaboración
AI Sr. José Ramón Barbón, por facilitarnos los animales del rancho Guadalupe, o
Villa de Márquez Querétaro.
INDICE
INTRODUCCION
Tipos de mastitis
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus dysgalactiae
Escherichia coli
Corynebacterium pyogenes
Diagnóstico y control
Análisis fisicoquímicos
Análisis bacteriológicos
Anti biograma
OBJETIVOS
MATERIAL
Esquema de trabajo
M ETODOLOG IA
RESULTADOS
DISCUSION
CONCLUSION
RESUMEN
APENDICE
Medios de cultivo
Bioquímicas
Reactivos Tinción de Gram
___
1
2
4
5
6
7
9
11
12
13
14
17
18
20
21
27
43
46
40
50
54
60
Reactivos pruebas fisicoquímicas 61
63 El BLI O6 RAF IA
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Introducción
El ganado bovino, ha sido un factor clave en el desarrollo de la civilización occidental,
para producir carne o leche(1). La vaca ha llegado a ser la mayor productora de leche del
mundo,(5)ésto se ha logrado gracias a una selección de crianza, produciendo al ganado
lechero, llamado así, porque tiene una glándula mamaria, cuyo potencial de secreción excede
en mucho, los requerimientos del recién nacido(7).
La leche en la ubre se almacena en los alveolos. Su liberacibn es estimulada en forma
refleja a través de la descarga de la hormona de liberación láctea, oxitocina, y transportada por
el torrente sanguíneo a la glándula mamaria. El estímulo más natural para la liberación de la
oxitocina es la manipulación de los pezones y la extracción de la primera leche. La oxitocina
llega a la ubre un minuto después de ser aplicado el estímulo. Las células mioepiteliales que
rodean a los alveolos responden a la hormona contrayéndose, mandando la leche hacia el
sistema de conductos que la llevan por el interior de la glándula y a las cisternas de los pezones.
La ordeña debe iniciarse inmediatamente después de que ocurre la bajada de la leche. Lavaca
debe estar completamente relajada, ya que de lo contrario, la adrenalina que se libera, cuando
está inquieta, puede evitar la secreción láctea( 1 8).
La leche es un alimento muy importante, especialmente para los pequeños. Un niño que
beba 570 ml al día, tiene cubierta gran proporción de sus necesidades. Uno de los problemas
principales que existen en México, es el déficit en la producción de leche, originando la
necesidad de importarla en cantidades crecientes para satisfacer la demanda interna(%).
La leche por ser un producto biológico, está sujeto a variaciones en la composición y
en la cantidad de leche producida. Estos cambios se atribuyen principalmente a la raza,
alimentación, edo. de salud, período de lactancia de la vaca y al clima(l1).
La leche está compuesta de dos fases: acuosa y grasa. En la fase acuosa están
presentes en solución, el azúcar de la leche (lactosa), que es el carbohidrato que la compone;
minerales como el calcio, fósforo y magnesio; las vitaminas hidrosolubles; proteínas en
suspensión coloidal, que se dividen en dos:proteínas verdaderas(caseína) y las del suero.
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La fase grasa contiene las vitaminas liposolubles (esteroides y carotenoides) además
de la grasa de la leche o butírica, compuesta principalmente de triglicéridos(2).
Las ubres, debido al tamaño y a su posición están especialmente propensas a lesiones
e infecciones. La inflamación de éstas, produce con frecuencia la mastitis. Este proceso
patológico altera la composición de la leche, la cual causa grandes pérdidas económicas, que
van desde una disminución en la producción de la leche y menor valor a la venta,aumento de
los costos de trabajo, fármacos y servicios veterinarios, etc.(5,6,7,9,25).
El término mastitis, proviene de la palabra griega mastos (glándula mamaria) y del sufijo
itis (inflamación).
Cualquier lesión del tejido interno de la glándula mamaria provoca una respuesta
inflamatoria o mastitis(3).
En estudios realizados en México, en 1986, se observó que en el ganado ordeñado
mecánicamente había una incidencia de mastitis de un 33 a 46%, mientras que con ordeño
manual era del 90 al 100% (8). La infección de la glándula ocurre a través del conducto de la
teta cuando entran las bacterias por el orificio, si el medio es favorable para ellas, se multiplican
y los productos del metabolismo de éstas, van a lesionar el tojido(3). Este proceso patológico
produce alteraciones físicas y químicas. Entre las anomalías más importantes, cabe mencionar,
cambio de color, presencia de coágulos, y de gran número de leucocitos. Aunque en muchos
casos hay tumefacción, calor, dolor e induración de la glándula mamaria, una gran proporción
de glándulas con mastitis no se identifica fácilmente por palpación manual, ni por exámen
visual, debido al elevado número de casos subclínicos(l7), por lo cual ha sido necesario
clasificarlos en diferentes subtipos de mastitis:
a) Mastitis clínica: Esta se caracteriza en todos los casos, por signos locales con
modificaciones del aspecto de la ubre y de la secreción láctea, la cual, por lo general se ve
disminuida, Los estudios han demostrado que con este tipo de mastitis se puede perder hasta
un 50% de la producción potencial del cuarto. Esta mastitis tiene la ventaja de ser detectada
fácilmente, y se pueden tomar las medidas adecuadas, como el aislamiento del animal,
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tratamientos, ordeña de la vaca afectada al final, reforzar las medidas higiénicas, dando por
resultado un rápido control(5,14,18).
b) Mastitis clínica aguda: Suele aparecer repentinamente y tiene un curso de pocos
días, los casos muy severos pueden culminar con la muerte. Puede afectar uno o más cuartos,
los cuales a la inspección y palpación presentan enrojecimiento, endurecimiento, calor y dolor.
AI ordeñarse puede observarse en la leche coágulos amarillentos o pus.
c) Mastitis clínica crónica: Esta presentación es la común y la de más larga duración,
ya que puede perdurar por varios meses o de una lactación a otra. Después de no manifestar
signos clínicos aparentes, ocasiona cambios en el tejido glandular de la ubre y en la
composición de la leche.
El volúmen y calidad de ésta, decrece debido a la continua inflamación del tejido
secretor de la glándula, que es reemplazado por tejido cicatrizal y en ocasiones por la
formación de nódulos. Ataques recurrentes de mastitis agudas, son muy frecuentes en casos
crónicos( 18).
d) Mastitis traumática: Es la causa inicial de mastitis de tipo infecciosa y es debido a
una lesión, causada por golpes, patadas, lasceraciones, fluctuaciones de vacío, sobreordeño,
formas o tipos de ordeña manual.
e) Mastitis subclínica: En este caso, no muestra evidencias de inflamación, pero revela
una infección de la glándula y un aumento en el número de células somáticas al exámen de
la leche, así como cambios químicos y físicos en la composición de ésta, pérdida en la
producción láctea, y pérdidas por contaminación microbiana,por todo esto,el tipo de mastitis
subclínica, es la que causa mayores pérdidas económicas(l4,18).
Cuando la mastitis ya se ha declarado en el hato, se deben seguir las siguientes
medidas profilácticas:
-Sacar toda la leche, ya sea a mano, o mecánicamente, al final de toda la ordeña.
-Se limpian los pezones con algodón empapado de un desinfectante adecuado.
-Dar tratamiento curativo con antibiótico, por vía intramamaria, en caso de que la
enfermedad sea provocada por bacterias(36). Estos son solo auxiliares secundarios en su
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control. La elección de ellos, deberá hacerse cuando el exámen del animal haya revelado, cual
es el germen que causa la enfermedad, hay que tener cuidado, pues el uso indiscriminado de
los antibióticos puede contaminar la leche en niveles elevados. También se debe administrar
durante el tiempo necesario, pues la bacteria se puede hacer resistente, y volver este problema
de difícil solución(4,12).
La severidad de la inflamación, dependerá hasta cierto punto de la naturaleza del
microorganismo, resistencia de la vaca, prácticas de ordeño y factores ambientales(3).
Dentro de los agentes causales más importantes de la mastitis, se encuentran: *
Staphvlococcus aureus, Streptococcus aqalactiae, Streptococcus dvsnalactiae, Escherichia
- coli y Corvnebacterium r>vonenes.
Staphviococcus aureus. El hábitat normal de éste, son las mucosas y piel de diversas
especies animales(l8). Actualmente es la causa más importante de mastitis en la mayoría de
las áreas lecheras debido aque causa mastitis aguda o crónica, las infecciones responden mal
al tratamiento y es fácilmente transmitido durante el ordeño. Este microorganismo puede
causar mastitis hiperaguda, gangrenosa,aguda, subaguda y crónico subclínico. Se ha
reportado que el 50% o más de las vacas de un establo pueden presentar infecciones
subclínicas crónicas (1 9).
Este microorganismo generalmente penetra a la ubre a través del canal de la teta y en
algunos casos entra a través de heridas o lesiones de la superficie de 6sta.Una vez dentro,
el desarrollo, la severidad y la cronicidad de la
mastitis, se relaciona a factores tales como la adherencia del microorganismo a las superficies
epiteliales internas, la presencia de anticuerpos contra la toxina aifa, beta y coagulasa, la
frecuencia de ordeño y la capacidad del microorganismo para utilizar los nutrientes dentro de
la ubre y multiplicarse.
La fagocitosis de los estafilococos realizada por los leucocitoc en la leche, es inhibida
por los grasas de la leche, así como por la caseína; a pesar de verse disminuido este
mecanismo de defensa, se puede reducir la suceptibilidad de la ubre hacia otros microorga-
nismos(l6).
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Los estafilococos se presentan como microorganismos esféricos y de tamaño uniforme
( cerca de 0.8 um de diámetro). Son anaerobios facultativos, pero se obtiene un crecimiento
más abundante en condiciones aerobias a una temperatura de 30 a 37O C y con un.pH de
7.0 a 7.5. Requieren cierta cantidad de aminoácidos, vitaminas y una fuente de carbono
fermentable(21).
En medios líquidos, los microorganismos aparecen aislados o en grupos pequeños,
que asemejan racimos de uvas. No son móviles, no forman esporas y no poseen sustancia
capsular in vitro.
Las colonias de estafilococos patógenos, son de color blanco porcelana, amarillo o
anaranjado cuando se desarrollan en medios sólidos, como sal y manitol. En agar sangre, se
observa una hemólisis beta, que rodea las colonias de los organismos, que producen
hemolisinas solubles(21,22). . Diferenciación de las especies del género Staphvlococcus (1 O)
S.aureus S.etidermidis
Glucosa (ácido) + + Coagulasa + -
Streptococcus aqalactiae. Este microorganismo necesita de la glándula mamaria para su
perpetuación en la naturaleza. El microorganismo entra en la glándula a través de la abertura
de la tetilla y reside en la leche y en las superficies de los canales lácteos. No penetra en el
tejido( 19).
La infección se disemina entre las vacas a través de las manos de los ordeñadores o
de la contaminación del equipo de ordeño. Algunas veces la boca de los terneros pueden
servir como medio para transmitir el microorganismo a las glándulas mamarias inmaduras de
otras terneras(l6,lg).
La multiplicación del microorganismo en las paredes de los senos glandulares y de los
conductos, origina inflamación y fibrosis, lentamente progresivas a las áreas adyacentes de
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la glándula.
Los animales más viejos, son afectados con mayor frecuencia. El ordeño excesivo
puede agudizar la enfermedad.
La leche o la secreción de la ubre, sufre alteraciones variables, presentando en
ocasiones ligera anormalidad y en otras, masas filamentosas de fibrina, sangre y material
purulento denso.La inflamación de la ubre da lugar a la formación de nuevo tejido intersticial;
de ahí que la fibrosis altera la consistencia normalmente blanda de la glándula mamaria,
endureciéndose en forma de masas no perceptibles a la vista, pero que pueden ser
identificadas al tacto.
El número de leucocitos en la leche que proviene de las ubres inflamadas, es mucho
mayor que el encontrado en la leche normal, por lo general excede 500 O00 por ml(16).
Los Streptococcus, con cocos grampositivos, catalasa negativa, que tienden a agruparse
en cadenas.las células individuales no son perfectamente esféricas, no forman esporas,no
son móviles, son anaerobios facultativos, con metabolismo fermentativo, con requerimientos
nutricionales complejos.
Las colonias son del tipo mucoide y arrugado. Son translÚcidas,delicadas, pequeñas,
con un diámetro de I mm. La superficie de la colonia es suave, brillante y con bordes
redondeados(21).
Las colonias de StreDtococcus aqalactiae,en agar sangre, después de 24 Hrs. de
incubación, forman cúpulas de color grisáceo a opalescente, que pueden estar rodeados de
una zona de beta-hemólisis. Tienen gran capacidad de hidrolizar el hipurato do sodio.Se
caracteriza por ser CAMP positivo.
Streptococcus dvsaalactiae. Este microorganismo causa una mastitis aguda y grave;
difiere de la anterior tan solo en pequeñas particularidades del cultivo.
Las cadenas en la mayoría de los casos son de corta o mediana longitud.Las colonias
presentan hemólisis beta.
La leche tornasolada no siempre se coagula a 37O C en 48 Hrs, sin embargo,siempre
se reduce la leche con azul de metileno. EL pH final en caldo glucosa varia entre 5.3 y 5.0 nunca
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más bajo. El hipurato de sodio no se hidroliza. Esta es la mejor prueba para diferenciarlo del
S. aaalactiae.
Este microorganismo se ha aislado de diferentes zonas anatómicas de los bovinos.
La mastitis causada por este agente no es altamente contagiosa(l6,18).
Existen varios criterios para la clasificación de los Streptococcus; la clasificación de
Sherman (lo), se basa en los siguientes criterios: hábitat natural, propensión a causar la
enfermedad, acción sobre alimentos y otras sustancias, capacidad Útil desde el punto
comercial. De acuerdo a éste, se formaron cuatro grupos: Piogénico,Viridans, Láctico y
Enterococo( 1 O).
Clasificación fisiológica de Sherman para Streptococcus (1 O).
Categoría Crec. en Mac Conkey Crec. a 45OC Crec. en azul NaCl de Metileno 1%
Piogénico - - - - Viridans + - Láctico + Enterococo + + + +
- - - - -
I omado de Carter,G.R.1979
Diferenciación de algunas especies del género Streptococcus
Saaalactiae S.dvsaalactiae S.zooepidermicus Smoaenes
H.hipurato + - - - CAMP + - - - Leche To AC B C A Hemólisis alfa alfa beta beta
- - . Azul Met.1 + +
beta gamma
A-Acid0 (1 O) B-Acido, coágulo irregular C-CO&g,kido
Escherichia coli. Es el más importante de los microorganicmos ambientales gramnegativos,
que causan la mastitis en el ganado vacuno de granja. La incidencia puede ser muy alta en
algunos establos,
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Existen pruebas, que dicen que la mastitis por E.coli es más frecuente en establos
donde se practica la desinfección, estos procedimientos reducen la población de
microorganismos comensales, sobre y dentro de las ubres, estos agentes patógenos, son por
ejemplo: Corvnebacterium y Stafilococcus no patógenos, favoreciendo el desarrollo de la
E.coli (16).
El inadecuado saneamiento de las máquinas de ordeño y las fluctuaciones irregulares
de su succión, contribuyen a la aparición de la enfermedad.
El microorganismo penetra a través del meato.En la patogenia de la enfermedad, puede
ser importante considerar la adherencia de algunas cepas de E. coli fimbriada a las células
epiteliales de la glándula mamaria.En ciertos casos, la colonización se limita al canal secretor
y a la cisterna inferior de la teta. Este microorganismo libera endotoxinas, que desencadena
una respuesta inflamatoria en muchas regiones de la glándula; sin embargo en la mayoría de
los casos,en la mastitis por E.coli existe una verdadera infección intramamaria originada por
el microorganismo.La endotoxina liberada, causa un aumento importante del flujo sanguíneo
mamario. Hay tumefacción notable de la glándula de secreción láctea, se ve reemplazada por
un líquido seroso. La absorción de la endotoxina hasta el torrente circulatorio del animal,
produce fiebre elevada, depresión, leucopenia, seguida de leucocitosis, hipoglucemia, y en
casos graves, choque irreversible y muerte del animal.
Debido a que la recuperación del tejido mamario es lenta, las pérdidas en cuanto a
producción de leche, pueden ser considerables(l6,17).
E.coli es un bacilo gramnegativo, aerobio facultativo, no esporulado, que crece bien
en diferentes medios. Algunas especies son móvibles por flagelos perítricos y otras no;
reducen los nitratos a nitritos y utilizan la glucosa en forma fermentativa con formación de ácido
Y gas-
Son generalmente fimbriados. Las colonias crecen en gelatina nutritiva, son opacas y
generalmente translúcidas, lisas y de consistencia homogénea, presentan la forma de hoja de
arce común a muchas enterobacterias.
Cuando crecen en ciertos medios como en agar azul de metileno-eosina(EMB) las
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colonias toman un color brillante verde metálico.
Crecen en medios con fuente de nitrógeno inorgánico y glucosa a una temperatura de
IOOC- 46OC. Fermentan diversos azúcares como lactosa produciendo ácido y gas, dando por
resultado ácido láctico, fórmico, acético y en menor proporción alcohol etílico(22).
Diferenciación de E. Coli con otras Enterobacterias (30).
TSI ( S/F) LIA(S/F) EMB MUCATO
E.coii Ac(Alc)/Ac AI c/Alc( N) Brillo verde met Ac Krebsiella Ac/Ac Alc(N)/Alc(N) Gris-café - Shigella Alc/Ac Alc/Ac Incoloras - Salmonella Alc/Ac Alc/Alc(N) Incoloras -
Corynebacterium Dvoaenes. En Europa, la mastitis causada por este microorganismo
en vacas y terneras de establo lechero, tiene una marcada incidencia estacional, y por esta
razón, es conocida como la mastitis del verano. Se piensa que las moscas, son vectores
importantes del microorganismo(l6).
El C. Dvoaenes causa mastitis del tipo agudo con inflamación, producción de exudado
seropurulento, purulento o con sangre(l8).
La enfermedad puede ser aislada o afectar a muchos animales del hato. Los cuartos
infectados suelen tener daño extenso y permanante. En ocasiones C. ovoaenes,daña las
ubres inmaduras de las terneras jóvenes, que se encierran juntas y que han desarrollado el
hábito de mamarse las ubres unas a otras. En estos animales, la infección secundaria de las
articulaciones, puede ocasionar artritis supurativa, que generalmente conduce a la muerte.
C.pvoqenes vive en las membranas mucosas de animales sanos,este microorganismo
es oportunista, en las terneras, se abre paso a través del ombligo y en el adulto por heridas
y abrasiones de la piel. Con frecuencia es un invasor secundario en tejidos desvitalizados por
infecciones bacterianas o virales(l6).
El patógeno causa una inflamación cuyas características incluyen formación de
exudado profuso, purulento, de mal olor, causado por el micrococo Peptococcus asaccharo-
Ivticus, que normalmente está asociado al anterior( 1 9).
Este microorganismo grampositivo,tiene forma de bastón, delgado, aunque la tinción
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suele ser irregular,la morfología microscópica puede no ser característica en el frotis, que no
es ácido resistente. Su longitud es de 1.5 a 5 urn y de ancho 0.5 a 1 um. Es un organismo
aerobio facultativo. En geiosa sangre,las colonias son pequeñas, elevadas, translúcidos y
grisáceos(22).
Diferenciación de algunas de las especies del género Corynebacterium
C. rwoaenes C. bovis
hemólisis + - Leche Torn ACP(Peptonizaci6n) sin cambio Glucosa + - íactosa + - Maltosa + -
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Diagnóstico y control
Para el diagnóstico de la mastitis, se realiza un análisis de las muestras de leche en
busca de células somáticas, para ello se hace la prueba de California, análisis físico-químico
y bacteriológico. Para el control de ésta, se prueba la sensibilidad de los microorganismos
encontrados, a fármacos específicos (Antibiograma) (1 8).
Existen varios procedimientos para el diagnóstico de la mastitis que varían en sensibilidad,
eficiencia y costo, entre ellas se encuentran: las pruebas de California, Wisconsin, Catalasa,
Albúmina cérica, y la de Whiteside. Se debe realizar un programa rutinario de muestreo,
durante todo el año, cada 15 o 30 días. La prueba de California, es la más utilizada, ya que
es más sensible, económica y más fácil de realizar que otras(4), con ésta se puede estimar
el contenido celular de la leche con bastante eficacia (14).
.
Schalm, y sus colaboradores, iniciaron la prueba de mastitis en California, E.U.A.,
demostrando ser más sensible para detectar leche con contenido celular anormal, que la de
Whiteside; utilizaron para ella, un detergente no-iónico (Alkil sulfonato de sodio). En las
investigaciones realizadas acerca de la naturaleza de la reacción, se ha llegado a la conclusión,
de que el principio activo en la leche que procede de vacas con mastitis, es el ácido
desoxirribonucléico (D.N.A) de los núcleos de las células somáticas; el detergente rompe la
membrana celular de las células somáticas, liberando el D.N.A.nuclear con el cual forma un gel,
cuya viscocidad es proporcional al número de células somáticas presentes en la leche.
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Interpretación de la prueba de California (23)
Símbolo Significado Descripción Reacción Interpretación células/ml
Negativo Mezcla líquido O-200,000
3
Traza
Débil
Positivo
Altamente positivo
150,000-500,000
400,000- 1 , 500,000
800,000-5,000,000
Formación viscosa casi inapreciable
Mezcla viscosa sin formación de gel
Tiende a formar rá- pidamente gel,la mez- cla suele depositarse en el fondo.
Formación de gel muy viscoso, que se incre- menta con el mov. de la paleta y se adhiere a las paredes.
El número de células es de 5,000,000
Análisis fisico-químicos de la leche. Cuando la glándula mamaria es dañada, la leche
va a sufrir alteraciones de acuerdo a la severidad de la infección.Existen dos posibilidades
fisiológicas que explican estos cambios:
a).- Lesión de las células sintetizadoras de los componentes de la leche; en este caso estos
componentes disminuyen en concentración.
b).- Hay cambios en la permeabilidad de las membranas que permiten un aumento en el flujo
de componentes de la sangre y la leche, por lo que éstos, que normalmente no existen o están
en bajas concentraciones, aumentan.
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A continuación se describen algunos parámetros físico-químicos:
Proteína. Comúnmente se considera que la proteína de la leche disminuye al dañarse
la glándula mamaria, pero existen evidencias de que algunas proteínas aumentan como la
lactoglobulina. En general, las que son sintetizadas en la glándula disminuyen, como la
caseína, y las provenientes de la sangre aumentan.
Grasa. La mayoría de los investigadores reportan que hay disminución en el porcentaje
de grasa de la leche debido a la mastitis; en general se considera que desciende en un 10%.
Además de la disminución en la concentración, también se realizan cambios en la composición
de la grasa, que se cree, es a causa de una reducida síntesis por el daño o destrucción de las
células alveolares.
Acidez. El pH de la leche normal es alrededor de 6.6 que se torna más alcalino debido
a la mastitis, 6.9. Rara vez la leche extraída del pezón es ácida. Esto puede deberse a la
influencia de la dieta, por ejemplo cuando se consume ensilaje, o bien, cuando hay una
multiplicación rápida de StrePtococcus aaalactiae, bacteria que convierte la lactosa en ácido e
Iáctico(4).
Análisis bacteriológoco. El análisis bacteriológico de la leche, constituye una herra-
mienta importante en un programa para el control de mastitis en un hato lechero. Deben
efectuarse muestras de leche de los cuartos afectados individualmente, y se realiza el cultivo
en diferentes medios, en éstos, los microorganismos se pueden conservar, por un tiempo
prolongado, ya que contiene los nutrientes necesarios, además se controla la temperatura,
aireación, pH, etc.(24).
Cuando ya hay crecimiento en los diferentes medios de cultivo, se eligen las colonias
sospechosas, de acuerdo a su morfología colonial y microscópica, posteriormente se
realizan las pruebas bioquímicas para la identificación de los microorganismos. Simuitaneamente
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se corre la prueba de sensibilidad a los antibióticos, ésta es de suma importancia para el
control de la infección(31).
Antibiograma
Los antimicrobianos o antibióticos, son sustancias producidas por organismos vivos,
que son inhibitorios o letales para otros microorganismos, y se utilizan en el tratamiento de
enfermedades infecciosas(29).
Mecanismo de acción de los antimicrobianos:
SULFONAMIDAS. Para muchas bacterias el ácido paraaminobenzóico (PABA), es un
metabolito indispensable para la síntesis del ácido fólico, el cual se requiere para la síntesis de
las purinas; las sulfonamidas son compuestos análogos del PABA, que originan la formación
de análogos no funcionales del ácido fblico.
PENICILINAS. lnhiben la síntesis de la pared celular de ios microorganismos susceptibles;
el protoplasma de estas bacterias, crece hasta reventar la membrana citoplasmática, la cual
produce lisis y muerte bacteriana. La penicilina inhibe a las enzimas responsables de los
enlaces entre las capas del péptido glucano. O
Las penicilinas sintéticas, tienen la ventaja de que resisten a la acción destructiva de la
enzima penicilinasa (B-lactamasa), ciertas penicilinas como la cloxacilina y meticilina, se
combinan con la enzima, protegiendo a las penicilinas hidrolizables, como la ampicilina, ésta
es ácidorresistente y es más activa sobre las bacterias gramnegativas que las penicilinas
naturales.
CEFALOSPORINAS. Se derivan del moho Cefalosporium, poseen un núcleo similar al
del de la penicilina, siendo bactericida de baja toxicidad. Poseen las ventajas: 1) resistencia a
la penicilinasa 2) amplia diversidad de destrucción y 3) no producen tantas reacciones
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alérgicas como la penicilina.
AMINOGLUSIDOS. Se obtienen de las especies de Streatomvces, todos tienen los
rtiismos mecanismos de acción, se combinan con la subunidad ribosómica más pequeña
dando como resultado una alteración en la codificación de las proteínas y, por consiguiente,
inbiben la elongación de las cadenas peptidicas, ejemplos de éstas: estreptomicina, neomi-
cina, kanamicina, gentamicina,etc, que son similares en sus características químicas y
farmacológ icas.
TETRACICLINAS. Su mecanismo de acción está basado en la unión con la subunidad
ribosomal, causando inhibición de la función del RNA. Son bacteriostáticos y su acción es
reversible.
CLORAMFENICOL Es bacterioctático y actúa combinándose con la subunidad ribosomal,
inhibiendo así la síntesis de las proteinas, hay que tener cuidado con el uso de éste, debido
a su toxicidad potencial.
ERITROMICINA,LINCOMICINA. lnhiben la síntesis de proteínas al combinarse con la
subunidad ribosomal, son activos para muchos microorganismos resistentes a la penicilina.
ACID0 NALIDIXICO. Este compuesto sintético inhibe la síntesis del DNA sin afectar la
síntesis del RNA.
NITROFURANOS. Estos compuestos resultan fuertemente bactericidas, inhiben una
gran cantidad de sistemas enzimáticos bacterianos, pero aún se desconocen los mecanismos
de acción primaria(29).
Estos son los principales antibióticos, que se utilizan en la prueba de disco, la cual se
utiliza de manera rutinaria.
La utilización de los antimicrobianos en la terapéutica de las enfermedades infecciosas
cuando se ha efectuado el diagnóstico clínico-bacteriológico, plantea la necesidad de saber
cual es el antibiótico que se debe utilizar para eliminar al microorganismo que está provocando
la infección.
El papel que juega en este caso el laboratorio es muy importante, ya que al determinar
la susceptibilidad de los microorganismos in vitro, dará la pauta a seguir, sobre cual es el
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antibiótico que se debe usar en íos diferentes procesos infecciosos(28).
A continuación se plantean los objetivos que se persiguen en este proyecto de
investigación, en base a la informacibn anteriormente descrita.
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Objetivos
-Verificar los cambios que presentan los principales elementos constitutivos de la leche
como : Caseína y Grasa.
-Determinar las variaciones de pH en la leche de animales con diferentes grados de
mastitis.
-Aislar e identificar las cepas de los principales microorganismos causantes de la
mastitis: Staphvlococcus aureus, StreDtococcus aaalactiae, StreDtococcus dvsaalactiae,
Escherichia coli y Corvnebacterium Dvoaenes, mediante pruebas bacteriológicas.
-Realizar antibiogramas de los microorganismos de las cepas aisladas, para encontrar
el(los) antibiótico(s) de elección para el control de la mastitis.
Material
MEDIOS
-Base Gelosa Sangre -Base Gelosa Sangre AUda de Sodio
-Agar Sal y Manitol -Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI) -Agar Mueller-Hinton
PRUEBAS BlOQUlMlCAS
. -Agar Mac Conkey
-Leche con Azul de Metileno al 1% -Agar Hierro y Lisina (LIA) -Agar Hierro y Triple Azúcar (TSI) -Caldo Hipurato -Leche Tornasolada -Agar Levine con Eocina y Azul de Metileno (EMB) -Caldo Mucato -Caldo Rojo de Fenol con Lactosa, Maltosa, Glucosa.
SOLUCIONES
REACTIVOS GRAM
- Cristal Violeta - Safranina - Alcohol-Acetona - Lugol
REACTIVO PRUEBA DE CALIFORNIA
- Alkil Sulfonato de Sodio
REACTIVOS PRUEBAS
- Sln. Alcohólica de Fenoítaleína
FlSlCOQUlMlCAS
- Hidróxido de Sodio (NaOH) 0.1 N - Formaldehído Neutralizado - Acido Sulfúrico 80% - Alcohol Amfiico
MATERIAL BIOLOGIC0
- Sangre de Carnero - Leche
Página 19
- Plasma Humano
MATERIAL DE PLASTIC0
- Cajas de Petri Desechables - Jeringas
MATERIAL DE VIDRIO
- Cajas de Petri - Tubos de Ensaye - Portaobjetos - Matraces Erlenmeyer - Embudo - Vasos de Precipitados - Pipetas Pasteur - Bureta - Matraces Aforados - Pipetas graduadas - Lactobutirómetro
e OTROS
- Mechero de Gas - Gradilla - Pinzas de Sujeción - Soporte Universal - Espátulas - Termómetro - Autoclave - Incubadora - Baño María - Balanza - Centrífuga
Pagina 20
Esquema de trabajo (15)
MUESTRA
ANALISIS BACTERIOLOGIC0 ANALISIS FlSlCOQUlMlCO
Sembrar por estría en:
-MAC CONKEY ACIDEZ -SAL Y MANITOL CASEINA -G.SANGRE AL 5% GRASA -G.SANGRE AilDA DE SODIO 5% sangre
Incubar a 37OC / 36 Hrs.
Colonias sospechosas resembrar en:
-GELOSA SANGRE -BHI con extracto de levadura 1%
37OC / 24 Hrs. ,,..-,--------- > Morfología---> ANTIBIOGRAMA Microscópica
CATALASA Y TlNClON DE GRAM
Catalasa( +) Catalasa (-) O
Bacilos G(-) Cocos G(+) Cocos G(+) Bacilos G( +/-)
Identificación del m.o.por pruebas fisiológicas y bioquimicas
TSI LIA EMB Mucato
Coagulasa Leche Tornasolada Hemólisis Glucosa Azul de Met. Leche Torn
CAMP FERMENTACION Hemólisis (glucosa,lac- (anaerobiosis) tosa,maltosa) Hipurato Gelatina
PIgina 21
Metodología
El muestre0 se realizó en el rancho GUADALUPE, en Querétaro, que se localiza
geográficamente en la parte oriente, del Territorio Nacional, entre los paralelos 22O y 20° de
latitud norte y los meridianos 99O y 1 0 1 O de longitud oeste.
El sistema de produción donde se va a trabajar, es intensiva, la sala de ordeño es tipo
tandem, con 8 máquinas de ordeño.El ganado que tiene en su sistema de producción es de
la raza Holstein- Friesian, importado de Canadá.
Quincenalmente, durante cinco meses, se realizó la prueba de California, para detectar
los reactores positivos de mastitis, se calificaron los diferentes grados, con una escala de O a
3, considerándose, O libre de mastitis, que se utilizó como control, 1 Sospechoso, 2 Subclínica
y 3 Clínica(9). Esta prueba, se realiza:
l).-Mezclar 2 ml de leche, con 2 ml del detergente (nota: si se agrega poco reactivo, se
impide el desarrollo de las reacciones positivas, mientras que un ligero exceso, no altera
significativamente los resultados.
2).-Se colecta la leche de cada uno de los cuartos, y se coloca en una charola de plástico
que contiene cuatro compartimientos, los cuales corresponden a cada uno de los pezones de
la glándula mamaria.Se inclina la charola, para derramar el exceso de leche, dejando
aproximadamente 2 ml de ésta, en cada compartimiento.Se agrega el reactivo, tratando que
sea la misma cantidad que la leche agregada en la charola.
o
3).-La mezcla se hace girar con un movimiento circular de la charola en posición
horizontal, la óptima reacción se obtiene en los primeros 1 O segundos, es el momento en que
se debe hacer la lectura, ya que las reacciones débiles, desaparecen rápidamente (4,23).
Con esta prueba se puede observar el pH aproximado de la leche. Cuando la reacción
es alcalina (pH 7 o más) se observa un color púrpura, indicando una depresión en la actividad
secretora. Cuando la leche es ácida, se observa de color amarillo (pH 5.2), que indica que hay
fermentación en la lactosa, esta reacción es debido al púrpura de bromocresol(23).
Se tomaron muestras de leche, de estas diferentes escalas, estableciendo lotes de 4
Página 22
animales en cada ocasión; dando al final 11 muestras control,21 subclínicas y 9 clínicas,
trabajando en total con 41 animales. Previo a la toma de las muestras se procedió a la
desinfección de los pezones con una solución dorada; se obtuvo entonces, la leche en un
frasco estéril y se transladó en refrigeración al laboratorio para su estudio; éste consistió en
hacer: Análisis Bacteriológico y Annálisis Fisicoquimicos. (1 1 ).
AI llegar al laboratorio, se siembran por estría, las muestras de leche. en las cajas de
Petri, previamente preparadas con los medios de cultivo enriquecidor ( Gelosa Sangre) y
selectivos (Gelosa Sangre Azida de Sodio, agar Sal y Manitol y agar Mac Conkey)(ver
apéndice)), se incuban a 37OC durante 24-36 Hrs.
AI pasar el tiempo de crecimiento, se eligen las cepas, que de acuerdo a su morfología
colonial, correspondan a las buscadas (Escherichia coli, StreDtococcus aaalactiae y dvscialactiae,
Corvnebacterium Dvoaenes y Staphvlococcus aureus), se siembran por estría en gelosa
sangre y BHI para obtener crecimiento masivo.
Se realiza las prueba de Catalasa, enzima que parece estar relacionada con la
capacidad de un organismo para utilizar el oxígeno. Esta cataliza la degradación del agua
oxigenada en agua y oxígeno; no se encuentra en los organismos anaerobios. La prueba
consiste en poner una gota de agua oxigenada en una caja de Petri, se toma una asada de
las colonias y se observa si hay reacción (20).
Junto con la prueba anterior se observa morfología microscópica por medio de la
Tinción de Gram, ésta es una tinción biológica, de carácter diferencial entre una especie y
otra.
Técnica de Tinción de Gram se realiza:
1).- Se toma una pequeña porción de la colonia y se distribuye en una gota de agua destilada,
o previamente colocada en un portaobjetos.
2).- Fijar el frotis con calor.
3).- Cubrir con una solución de cristal violeta y dejarlo durante un minuto.
4).- Lavar con agua corriente.
5).- Cubrir con lugol y dejarlo un minuto.
6).- Lavar con agua hasta quitar el colorante.
7) .- Decolorar con alcohol-acetona 30 segundos.
8).- Lavar con agua
9).- Cubrir con la solución de Safranina y dejar solo 20 segundos.
1 O) .- Lavar con agua perfectamente,
1 I).- Cuando se ha secado, se observa en el microscopio con el objetivo de inmersión.
( Ver Apéndice)
En función de la prueba de catalasa y morfología microscópica se hacen las pruebas
bioquimicas y fisiológicas adecuadas para la identificación de los microorganismos. Para
- coli, LIA, Mucato y TSI, se siembran en los tubos de ensaye, ya preparados con anterioridad,
se ponen a incubar 24 Hrs. y se observa el crecimiento y sus características,
En St. aureus, se hace la prueba de coagulasa y fermentación de la glucosa. Para la
prueba de coagulasa, se necesita plasma humano con citrato de sodio para que no se
coagule. Cuando se ha aislado alguna cepa sospechosa, se inocula en el plasma, se incuba
a 37OC durante 4 Hrs, Staphvlococcus aureus va a invertir la acción del anticoagulante y
deberá observarse un coágulo en el centro del plasma(20). Para la prueba de fermentación
de glucosase inocula el medio y se incuba durante 24 Hrs.
Vire del indicador Resultado
amarillo + naranja rojo -
(+) se incuba 24 Hrs.
Para Str. aaalactiae v dvsaalactiae, se hacen las pruebas de Leche tornasolada, azul
de metileno, CAMP Hemólisis e Hidrólisis del Hipurato. Prueba de CAMP, esta prueba
muestra el sinergismo formado por la hemolisina beta del StaRhyiococcus aureus y del
StreRtococcus aaalactiae, para lisar mejor los glóbulos rojos en la zona de combinación de
estas hemolisinas en forma de media luna; se efectuó sembrando una estría de Star>hvloco-
ccus aureus en todo el diámetro de una placa con agar tripticaseína con sangre de carnero
al 1 O %, las cepas sospechosas de Streptococcus se sembraron perpendicularmente a éste
D
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* sin que quedaran en contacto, se incubaron a 37OC durante 48 Hrs dentro de un frasco
cerrado herméticamente con una vela (anaerobiosis), se observa a las 24 Hrs.
Prueba de Hemólisis El microorganismo produce toxinas y enzimas extracelulares,
algunas de las cuales, pueden ser de importancia en la patogenia de la enfermedad. Para esta
prueba, se sembraron por estría las cepas sospechosas y se incubó en anaerobiosis a 37OC,
durante 24 Hrs. Se pueden observar 3 tipos de hemólisis: Hemolisina alfa, produce ruptura
de los lisosomas de los leucocitos, produciendo una hemólisis completa; hemolisina beta,
produce una hemólisis incompleta, de los eritrocitos, y la gama, no produce hemólisis.
Hidrólisis del Hipurato, se inoculó el microorganismo, y se pone en Baño María a
37OC durante 2 Hrs. Se agregó ninhidrina sin agitar y se dejó en el Baño durante 1 O minutos.
la prueba es positiva cuando se observa un color violeta.
En Coervnebacterium Pvoaenes, se realizaron las pruebas de: fermentación de
glucosa, lactosa y maltosa, hemólisis y leche tornasolada, al igual que las anteriores se toma
una asada, se introduce en los tubos de ensaye con las pruebas bioquímicas y se incuba
durante 24 Hrs.
El antibiograma, se hizo a partir del cultivo puro, obtenido en la placa de BHI y GS con
los multidiscos grampositivos y gramnegativos. Esta prueba se fundamenta en colocar discos
impregnados con determinada cantidad del antimicrobiano sobre el medio inoculado con
bacterias, el antimicrobiano se difundirá formándose un gradiente de concentración, el cual
inhibirá o permitirá el crecimiento de la bacteria(28,30).
Se prepara previamente el medio agar Mueller- Hinton (apéndice),éste favorece el
crecimiento de casi todos los microorganismos, para los más exigentes se les puede agregar
sangre de carnero desfibrinada al 5%.Se inocula la placa de manera homogénea. Tomar los
discos con una pinza estéril y se coloca en el medio en un tiempo menor a 15 minutos de haber
sido inoculada la placa, los discos deberán presionarse ligeramente para asegurar un
contacto con la superficie. Después de 15 minutos de colocado el disco, se invierte la caja de
Petri y se incuba a 35OC, por 16 a 18 Hrs. AI paso de este tiempo se miden los halos de
inhibición, cuando se observa la completa inhibición del crecimiento, éste será el antibiótico
Página 25
al que el microorganismo es susceptible (30).
. Los multidiscos contienen:
GRAMPOSITIVOS mg
Cefotaxima(CTX) 30 Ampicilina(AMPI) 1 O Cefalotina(CEFA) 30 Dicloxacilina(CL0X) 1 .O Eritromicina( ERI) 1 5 Gentamicina(GENTA) 1 O Lincomicina(LINC0) 2 Kanamicina( KAN) 30 Penicilina(PEN1) 10 Estreptomicina(STREP) 1 O Trimetoprim-Sulfametoxazol (ST) Tetraciclina
25 30
GRAMNEGATIVOS mg
Ampicilina(AMPI) 10 Cefalotina(CEFA) 30 Cloranfenicol (CLOR) 30 Ac.Nalidixico(NALI) 30
Nitrofurantoína(FUf3A) 300 Gentamicina(GENTA) 1 O Cefotaxima(CTX) 30 Amikacina(AK) 30 Estreptomicina(STREP 1 O Tetraciclina(TET) 30 Trimetoprim-Sulfametazol (ST) 25
Carbenicina(CB) 1 O0
Las pruebas fisicoquímicas, que se realizaron son: Acidez, Caseína y % de Grasa . Estas pruebas se realizan después de hacer la siembra del análisis bacteriológico, para que
no se contamine la muestra.
Acidez. Se miden con la pipeta 9 mi. de la leche.que se vierten en un pequeño matraz
Erlenmeyer y se le agregan 3-5 gotas de la solución alcohólica de fenoítaleína al 1 %. Se titula
la acidez con NaOH 0.1 N, previamente valorado, hasta el viraje neto al color rosa persistente
durante algunos minutos. La lectura del gasto en la bureta revela directamente gramos de
ácido láctico por litro de leche.
Caseha.( Método de Casadevante). La leche neutralizada como en el método de la
acidez,se le adicionan 2 ml de formaldehído, previamente neutralizado, se agita unos minutos
y se revalora con NaOH 0.1 N hasta obtener un nuevo viraje al color rosa.
1 ml de NaOH 0.1 N corresponde a 16.4 g de caseína por litro
Grasa. Se miden en el lactobutirómetro 1 O ml de ácido sulfúrico al 80% p/p, se agregan
11 mi de leche, cuidando que se deslice por la pared al caer, para formar dos zonas sin
Página 26
mezclarse, enfriar en baño de hielo y posteriormente se agrega Icc de alcohol arnílico y se
enrasa a la base del cuello con unas gotas de agua destilada. Se tapa herméticamente con el
tapón de hule, se sacude vigorosamente el lactobutirómetro hasta que la mezcla quede
homogénea. Después se centrífuga (2000-3000 rpm), durante 5 minutos, la lectura se hace
colocando el lactobutirómetro, durante 5 minutos en un Baño María, el cual debe estar a
65OC,la mantequilla se separa en el tallo, que es donde está la graduación, si no queda en el
tallo, se mueve el tapón hasta que quede en la división. Estas dan directamente el porcentaje
e de grasa(l3).
Página 27
Resultados
Para facilitar el análisis de los resultados, se realizaron tablas separadas con sus
diferentes grados de mastitis.
A.- Control
B.- Subclínica
C.- Clínica
En la tabla I, se observan los resultados del análisis fisico-químico, relacionándolos con
el aislamiento de las bacterias, para comparar los microorganismos con las alteraciones de los
componentes de la leche.
La tabla II, muestra la media y la desviación estándar de los componentes de la leche, * realizados en este estudio, además de analizarlo con el rango que reporta la literatura.
Los microorganismos aislados de las diferentes muestras están contenidas en la tabla
II, dicha tabla, contiene el porcentaje de aislamiento de
cada microorganismo, en relación al número de muestras trabajadas, siendo el Staphvloco-
ccus aureus el de más alto porcentaje.
AI realizar los antibiogramas de los diferentes microorganismos aislados encontramos
los resultados que se muestran en la tabla 111, donde se observa un plano general de lo
obtenido.
Para encontrar el(los) antibióticos de elección, se agruparon los microorganismos y
sus antibiogramas, en la tabla IV, se eligió la Cefalotina para G (+), Nitrofurantoína y
Cefalotaxima para G (-) por ser los mejores inhibidores del crecimiento bacteriano.
Página 28
Análisis físico-químicos y bacteriológicos
Control I
Muestra cepas encontradas OD pH Caseína % grasa
v (5) S.aureuc 19.734 - 29.42 3.0
VI1 (7) Sin microbiól. 21 528 - 26.48 2.8
xi1 (49) No hubo crec. 15.249 6.15 26 .48 2.1
xiv (2 33) F E .coli . 5 7.65 S.aureus Staphylococcus cpp Otras bacterias
xv (2 31) E.coli 22.425 5.96 29.42 1.7
(1 07) S.aureus 20.631 6.06 26.48 8.5 Coliforme Otras bacterias
)(XI1 (141) No hubo crec. 17.940 6.22 23.54 2.5 . 111 (163) S.aureus 18.837 6.22 26.48 7.3
Strep.dysgalactiae Coliforme Otras bacterias
xxx (22) Coliforme 24.21 9 5.90 29.42 2.3
VI (1 93) S-aureus 16.91 O 6.03 30.89 1.3
XL ( 263) t.coli 15.249 6.02 27.95 2.4
,
Páglna 29
Tabla I
Análisis físico-químicos y bacteriológicos
Su bclinica
- OU PH Caseína % grasa Muestra Cepa -
S.aureus 13.455 - 23.54 2.8 I (1)
No hubo crec. 21.455 - 30.89 2.5 11 (2)
111 (3) S.aureuc 33.970 - 33.83 4.3 ~~
No hubo crec. 10.764 - 19.12 4.0 iv (4)
Sin microbibl. 16.146 - 29.42 2.5 VI (6)
Vlll (8) E.coli 17.043 - 26.48 3.5 Strepspp Coliforme
1x (9) No hubo crec. 14.352 - 23.54 3.5
)< (101 S.aureuc 17.940 - 29.42 3.1 . . Strep.spp
x ( .coli 5.45 30.89 2.4 S.aureus Otras bacterias
Xlii (61) t.coli 17.940 5.85 38.25 1.6 Strep.ag alactiae S.aureus Staphylococcus spp
Strep.piogénico S.aureus
. xvi ( 291) E. coli 31.395 5.20 29.42 2.0
xix ( 16) t .coli 27.807 6.2 32.36 3.0 Staphylococcus spp
)M (67) S.aureus 31.395 6.15 23 .54 2.8
XXVI (3850) S. au reus 16.1 46 6.30 29.42 2.1 Staphylococcus cpp
Página 30
II €* .coli -4 S.aureus Stre p.dy sg alactiae Otras bacterias
S.aureus Staphylococcus spp
t. coli
(1 26)
111 t.coli 16.1 46 6.08 22.07 2.3 (1 29)
(1 46) IV 18.837 6.15 27.95 1.7
t.coli 17.043 6.35 22.42 2.0 Strep.d ysgalactiae
II Strep.dysgalactiae 9.867 6.25 31 .72 I .6
IX S.aureus 19.734 6.08 26.48 1.8
(21 1)
(239) Staphylococcus spp
XLI (26 8) t.coli 25.1 16 6.01 2 5.01 1.7 S.aureus
Tabla I
Análisis físico-químicos y bacteriológicos
M. Clínica
Muestra Cepa OD pH Caseína % grasa
II (30 4) t.coli 8.073 7.22 27.95 0.8 Enterococos Strepdycgalactiae S.aureus
Strep.viridans Strep. piogénico Staphylococcus cpp Otras bacterias
111 t.coli 14.352 5.74 29.42 1.4 (305)
IV - S.aureus 17.940 6.28 27.95 (3430) Staphylococcus spp
(3566) S.aureus
(3850)
E.coli 14.352 5.96 23 .54 7.0
VI1 Otras bacterias 17.940 6.20 26.48 2.4
Ill t.COli 13.455 6.49 30.89 1.7 Strep.agalactiae Strep.dycgalactiae
(4229)
IX t.coli 16.146 6.35 3U.89 2.8 (4325) S.aureus
Strep.piogénico Enterococo
I t.coli 10.764 6.31 1 6.'18 2.4 S.aureus Enterococo
(1 6)
Vlll t.COli 8.073 6.08 14.71
.
Página 32
Tabla I I
Media y desviación estándar de las pruebas físico-químicas
Rango reportado CONTROL SUBCLINICA CLlNlCA en la literatura
Acidez
x +/- 18.335 +/- 20.109 +/- 13.45+/- 16-1 9 OD D.E. 4.21 6.72 3.78
n= 1 1 n= 21 n= 9
PH x +/- 5.82 +/- 6.013 +/- 6.29 +/- 6.6-6.8 D.E. 1 .O8 0.334 0.41 U.de pH
n= 9 n= 13 n= 9
Caseína
x +/- 26.75 +/- 27.44 +/- 25.34 +/- 25 g / It. D.E. 3.65 4.023 0.05
n= 1 1 n= 21 n= 9
Grasa
x +/- 3.18 +/- 2.459 +/- 2.64 +/- 2.5-5.0 % D.E. 2.4 0.83 2.039
n= 1 1 n= 22 n= 7
Página 33
Tabla 111
Microorganismos encontrados en las muestras
M.O. S.aureus S.agalactiae S.dysgalactiae E.coli
e Total 34(36.17%) 3(3.20%) 6(6.40%) 1 9(20.21%)
Otros M.O. Str.spp G (+) G (-1
Total 7(7.40%) 1 1 (1 1.70%) 1 5( 1 6%)
-No. de microorganismos ( % de aislamiento)
ANTlBlOTlCOS DEL MULTIDISCO (abreviaturas)
CTX.-Cefataxima LINC0.-Lincomicina CL0R.-Cloranfenicol AMPI.-Ampicilina KAN.-Kanamicina NAL1.-Ac.Nalidíxico CEFA.-Cefalotina PEN¡.-Penicilina CB.-Carbenicina CL0X.-Dicloxacilina STREP:-Estreptomicina FUFW.-Furantoína ER1.-Eritromicina ST.-Trimetoprim- AK. -Am i kaci n a GENTA.-Gentamicina Sulfametazol TET.-Tetraciclina
SUSCEPTIBLE
* INTERMEDIO
** RESISTENTE
- NO HUBO INHIBICION
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Página 38
Tabla V
Susceptibilidad a los antibióticos para los microorganismos aislados.
Staphylococcus aureus
C A C C E G L K P S S T T M E L R E I A E T T E X P F O I N N N N R T
I A X T C I E R A O P A
Muestra Cepa
I 1.
Ill 1.
XI 5.
3. 4.
4. 6.
3. 4. 5.
2.
1. 2. 3.
XXI 2.
XXlll 3. 5. 6.
XXlV I .
XJll
XIV
XVI
XIX
xx
2. xxv 2. 3.
XXVl 2.
XXlX 4.
XXXl 2. 3. 5. 6.
6
Página 39
Tabla V
xxxl I 4.
xxxlli 2. 4. 5.
XXXVl 2. 3. 4.
XXxlX 1.
XL 2.
XLI 2. 3.
9 2 - 5 -
7 1 - 5 2 - 6 2 -
6 -
Streptococcus spp
C A C C E G L K P S S T T M E L R E i A E T T E X P F O I N N N N R T
I A X T C I E R A O P A
Muestra cepa
XVI
XVlll (Viridans)
XVIII
2. - - 2. 10 8 -
-
3. XL
*
Streptococcus agalactiae
A111 2.
XXVlll 2.
XL 3.
Pdglna 40
Tabla V
Streptococcus dysgalactiae
c A C C E G L K P S S T T M E L R E I A E T T E X P F O I N N N N R T
I A X T C I E R A O P A
Muestra cepa
Enterococos
OTRAS BACTERIAS GRAMPOSITIVAS catalasa negativa
Escherichia coli
C A C C k G L K P S S f T M E L R E I A E T T E X P F O I N N N N R T
I A X T C I E R A O P A
Muestra cepa
823422 Página 41
XI 1.
Xlll 1.
XIV 1.
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XVI 1.
xvll 1.
xvlll 1.
XIX 1.
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Mvlll
1. XXXl
1. XXXll
1. XXXlll
1. XXXlV
1. XXXV
1. Xxxvlll
1. XL
1. XLI
1.
OTRAS ENTEROBACTERIAS
C A C C t G L K P S S T T M E L R E I A E T T E X P F O I N N N N R T
I A X T C I E R A O P A
Muestra cepa
Página 42
OTRAS BACTERIAS GRAMNEGATIVAS catalasa positiva
xiv - - - 2. 6 5 3 5 4 - 4 -
catalasa negativa t
Xi 3.
xvll 2.
Página 43
Discusión
Se hicieron las pruebas fisicoquímicas, acidez, normalmente se obtiene por medio del
ácido láctico, se obtiene en grados Dornic, que expresan el contenido de ácido láctico ( 1 OD=
1 mg de ácido láctico en 1 Occ de leche), cuyo valor normal es de 16-1 9OD; pH, en general, la
leche tiene una reacción débilmente ácida, comprendido entre 6.6 y 6.8, como consecuencia
de la presencia de caseína y de los aniones fosfórico y cítrico, principalmente, este valor varía
por influencia de la alimentación, ciclo de lactancia,etc.; caseína, es un complejo de proteínas
fosforadas y constituye la parte nitrogenada de la leche, no existe ninguna sustancia parecida,
es una proteína insoluble, la leche contiene 25 g/lt. de caseína total y 32 g/k. de prótidos totales;
y por último la grasa, su contenido en la leche varía dependiendo de la raza de 2.5-5%. Estas
pruebas se hicieron para ver si realmente hay notorias alteraciones en la composición de la
leche; se puede observar en los resultados, que por medio de estas pruebas, no se puede
hacer un diagnóstico confiable de la enfermedad, ya que no varían mucho los componentes,
como por ejemplo, en el caso de la proteína algunos elementos protéicos disminuyen y otros
aumentan, en la grasa baja su porcentaje y composición, que se cree es por una reducida
síntesis de las células alveolares; el pH. la mayoría de las veces hace que la leche sea alcalina,
aunque dependiendo de la cantidad de gérmenes, puede acidificarla; en este caso se
obtuvieron valores menores al rango de pH, quizás se debió a que el pH,se tomó 3 días
después de obtener las muestras y a que algunos microorganismos presentes, indujeron la
producción de ácido 1áctico;en cuanto a la acidez, si se encontraron diferencias en su
contenido total en la mastitis clínica, probablemente por la cantidad de gérmenes, la leche
resultó más ácida.
Para un diagnóstico y control de la mastitis se recomienda realizar el aislamiento del
agente etiológico y hacer las pruebas de sensibilidad a los antibióticos, para controlar la
enfermedad.
A partir de la leche con mastitis, se pudieron aislar los microorganismos: Staphvloco-
ccus aureus, éste fue el que se encontró con mayor frecuencia, en un 36.1 7%, Escherichia
- coli, con 20.21 % , Streptococcus dvsnalactiae 6.40%, Streptococcus agalactiae 3.20%, se
Página 44
encontraron otros microorganisrnos, en un 11.70% de G(-)y 16% en G(+), no se encontraron
Corvnebacterium pvoqenes. En base a estos porcen<'es, se puede afirmar que el Staphylococcus
aureus, tiene una gran importancia en la etiologia de la enfermedad, que concuerda cgn lo
indicado en la literatura.
Con respecto a los gérmenes aislados, se observó una elevada ocurrencia de
Staphylococcus aureus y baja de Staphylococcus SRR, ésto puede deberse a que el
Streptococcus no presenta mucha resistencia a los antibióticos().
Escherichia coli, fue el segundo microorganismo que se encontró con mucha frecuencia,
puede ser por contaminación externa.
Los antibióticos se dividen en dos grandes grupos en base a sus efectos generales
sobre las poblaciones bacterianas: 1).- Bactericidas, que poseen acción letal rápida, como por
ejemplo: penicilina, cefalosporinas, estreptomicina,etc. 2).- Bacteriostáticos, son los que
logran nulificar el crecimiento bacteriano, como por ejemplo: tetraciclinas, sulfonamidas y
cloranfenicol.
0
Comparando los resultados obtenidos por Alcayde J.C. en 1982, se puede ver que los
microorganismos han creado resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en los
Sistemas de Producción como son: penicilina, estreptomicina, ampicilina,lincomicina,etc.,
actualmente se deben administrar dosis mayores de éstos o cambiar a los nuevos
quimioterapéuticos, como son: Gentamicina, Cefalotina, Cefataxima, Dicloxacilina,etc.. Están
también los productos con sensibilidad variable, entre ellos se encuentran: Tetraciclinas,
Eritromicina,etc., para usarlos se necesita saber, que gérmen es sensible a él.
Para probar la sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos, se utilizaron los
multidiscos con 12 antimicrobianos para grampositivos y para gramnegativos, en el medio
Mueller-Hinton cuyo pH final deberá ser de 7.2 a 7.4.
La sensibilidad de los antibióticos IN VITRO, no necesariamente se observa IN
VIVO, ya que en este caso,se pueden distribuir adecuadamente en la glándula mamaria,
debido al uso de un vehículo inadecuado o bien a la pérdida de concentración de dicho
fármaco por inactivación, como es en el caso del pus(32).
.
Página 45
Tomando ésto corno base, se ve la importancia que tiene el diagnóstico precoz de la
mastitis, evitando así que los cuartos sean tratados cuando ya son clínicamente observables.
El tratamiento de la mastitis generalmente lo hacen , sin conocer debidamente el
problema al que se enfrentan, aunado a la falta de higiene y manejo en general, lo que da
porcentajes de reinfección muy altos (33).
- - -
Página 46
Conclusiones
I).- La prueba de California es la más apropiada, para identificar los cuartos infectados
por el agente causal, esta prueba da los resultados más confiables en el diagnóstico de la
mastitis.
2) .-La prueba de la acidez( g de ácido láctico/ litro) y de la caseína (g de caseína/litro)
son rápidas y sencillas.
3).-Para la prueba de la grasa se requiere experiencia en la utilización del lactobutirómetro,
una vez obtenido ésto, es adecuada, ya que es muy confiable.
4).-El pH se midió en el potenciómetro, esta prueba tiene la desventaja de alterarse si
la leche no es fresca o no ha tenido una buena refrigeración, y &o es difícil de lograrlo, debido
al transporte de la leche.
5).- Quizás sería interesante aumentar el tamaño de la muestra, ya que algunos datos
hacen que la desviación estándar sea muy grande, y la frecuencia de éstos podrían dar datos
sobre las diferencias en la composición.
o
6).-Los medios de cultivo selectivos y enriquecidos, fueron los adecuados, para el
aislamiento de los gérmenes buscados.
7) .-Se encontraron en las diferentes muestras varios agentes etiológicos, posiblemente
se puede considerar al Staphylococcus aureus, el principal agente infeccioso.
8).-En ocasiones la Escherichia coli, ya que es un microorganismo oportunista, que por
- -
Página 47
medio de la desinfección de los pezones y por lo tanto, la muerte de los gérmenes primarios,
entra a la teta causando la enfermedad.
9) .-Se utilizaron pruebas bioquímicas para identificar los géneros de los gérmenes que
causan la enfermedad.
lo).- La muestra XIV (control), resultó con todas las características de mastitis con
grado 3, probablemente hubo un error en la toma de esa muestra.
11).-Se comprobó IN VITRO que las cepas probadas fueron sensibles a: Gentamicina,
Cefalotina, Cefataxima, Nitrofurantoína, principalmente.
12).-La penicilina, tetraciclina, ampicilina, etc, IN VITRO no fueron capaces de inhibir
el crecimiento de las cepas.
13).-La inhibición del crecimiento por la Cloromicetina, Eritromicina, etc, es muy
variable.
14).-Se recomienda a todo Médico Veterinario Zootecnista realice el diagnhstico de la
mastitis mediante la prueba de California, y un control, con el aislamiento del agente etiológico
y pruebas de sensibilidad a los antibióticos.
- - -
Página 48
Resumen
La mastitis es una enfermedad que, debido a su efecto nocivo sobre el animal y a las
alteraciones fisicoquímicas y bacteriolbgicas que provoca en la leche, causa serias pérdidas
económicas al Sistema de Producción Lechera, por lo que se debe hacer un diagnóstico
precoz, o en caso de que se presente, tratarlo con el antibiótico adecuado.
Se trabajaron 41 muestras, de las cuales 1 1 fueron controles, 21 mastitis subclínica y
1 1 mastitis clínica; a las que se les realizó previamente la prueba de California.
La enfermedad causa ciertas alteraciones en la leche, para confirmarlo se realizaron
las pruebas de acidez,pH, caseína y grasa.
Los resultados de estas pruebas son:
Mastistis Control Subclinica Clinica Rango reportado en la literatura
acidez 18.355 20.1 O9 13.45 16-1 9OU pH 5.82 6.013 6.29 6.6-6.8 U.de pH caseína 26.75 27.44 25.34 25 gllt. grasa 3.18 2.459 2.64 2.5- 5%
Para el diagnóstico, se sembraron en medios de cultivo enriquecidos: Gelosa Sangre,
para microorganismos de difícil crecimiento (Corvnebacterium woaenes) , Agar Mac Conkey
en el aislamiento de coliformes, Agar Sal y Manitol para Staphvlococcus aureus y Gelosa
Sangre mida de sodio, en el crecimiento de Streptococcus ,aqalactiae y Streptococcus
dvsciaiactiae. Para la identificación de éstos, se hicieron pruebas bioquímicas y fisiológicas.
Resultados: De las muestras anteriormente mencionadas se aislaron los siguientes
microorganismos:
. Pdgina 49
NO. DE MICROORGANISMOS ( % DE AISLAMIENTO )
M.O. S.aureus Str.aaalactiae Str.dvsaalactiae E.coli % % % %
No.totai 34 (36.17) 3(3.20) 6(6.40) 19 (20.21)
Después de la identificación de las bacterias, a todas las cepas aisladas se les realizó
la prueba de sensibilidad a 17 agentes quimioterapéuticos para organismos grampositivos y
gramnegativo que son: Acido Naiidíxico, Ampiciiina, Cefalotina, Cloranfenicol, Eritromicina,
Estreptomicina, Gentamicina, Kanamicina, Lincomicina, Cefataxima, Dicloxacilina, Tetraciclina,
Trimetcprim-Sulfametazol, Carbenicina, Nitrofurantoha, Amikacina y Penicilina. Los resultados
más significativos de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos, con respecto a las bacterias
fueron: S.aureus es sensible a Cefalotina, E.coli a Cefalotaxima, Str.acialactiae a Gentamicina,
Str.dvsaalactiae a la Cefaiotaxima y para otras G ( +) Tetraciclinas y G(-) Gentamicina.
Pdgina 50
Apéndice
Preparación de Medios de Cultivo y Reactivos
MEDIOS DE CULTIVO
AGAR INFUSION CEREBRO CORAZON (BHI).Medio sólido, rico en nutrientes,
adecuado para el cultivo de microorganismos exigentes y de difícil desarrollo, entre los cuales
se encuentran, diversos tipos de bacterias, hongos y levaduras.
Fórmula:
Infusión de cerebro de ternera
infusión de corazón de res
Mezcla de peptonas
Fosfato dipotásico
Cloruro de sodio
Dextrosa
Agar
Extracto de levadura
200.0 g
250.0 g
10.0 g
2.5 g
5.0 g
2.0 g
15.0 g
1%
Suspender 52 g del medio deshidratado, en un litro de agua destilada. Remojar de 1 O
a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente, y hervir durante un minuto. Esterilizar a 121 OC
(15 Ibs. de presión) durante 15 minutos (31).
AGAR MAC CONKEY. Medio empleado, para aislar e identificar selectivamente
enterobacterias, como Salmonella. Shiciella v Coliformes a partir de heces fecales, orinas,
aguas negras y diversos alimentos.los gérmenes grampositivos son inhibidoc por las sales
baiaresy el cristal videta Las erltefobacmas . femmtadoras de la iactosa, bajan el pH del
medio, que es detedado por el Micador rojo neutro, donde se observan cdonias rojas o
rosadas, como es el caso de la E . d . Las no femientadoras, dan donias transparentes,
Peptonadegekitina 17.0 g
Mezdade*onas 3.0 g
: L a c m a 10.0 g
Mezcladecalesbiliares 1.5g
clon#OdeSOdiO 5.0 g
Asar 13.5 g
ROjOneutrO 0.03 g
0.001 g
suspender5ogddmedio enunlitrodeaguadestiladaodesionízada debuena
caüdad. Remojar bien entre 1Oy 15 minutos ywientara ebulición agitando continuamente.
Hervirdurantewiminuto.~~en~a121°C,durante 15minutosEnfriara45-500C
yvacíaren cajas de Petri, unos 2Omipor placa. ü e j a r s o i i i y luego invertir tas cajas, para
evitar se deposíte el exceso de hwnedad en ia superficie del medio(31).
AGAR SALYMANITOLEsunniedioselectivomuyempleado,paraaislarectafiloco-
---de- ' dínicos, orina, heridas, exudadoa, etc. También se utiliza en la
industria alimenticia, en leche productos iácteos, came, etc. con los mismos fines.
Debido a su alto contenido de dmro de sodio, puede hacerse una siembra masiva
pegina 52
del material en estudio.lac colonias de estafilococos patógenos, son fermentadoras del
man¡td, se observan colonias grandes y rodeadas de una zcna amarilla (31).
Fórmula:
Extracto de carne 1.0 g
Mezda de peptonas 10.0 g
Cloruro de sodio 75.0 g
D-manitol 10.0 g
Agar 15.0 g
Rojo de fenol 0.025 g
' Suspender 1 1 1 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y remojar unos
15 minutos. Mezclar, calentar a ebullición. Esterilizar en autodave a 121 OC durante 15 minutos.
Vaciar en cajas de Petri (31).
GELOSA SANGRE. La base de agar sangre es adecuada para aislar y cultivar
diversos mimoorganismos de dificil crecimiento. Al añadir sangre, se enriquece el medio.
Fórmula:
Infusión de músculo cardiac0 375.0 g
Peptona de carne 10.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Asar 15.0 g
Sangre de carnero 50.0 ml
Agua destilada
Página 53
1OOO.O ml
Suspender 40 g del medio deshidratado en I It. de agua destilada. Remojar de 5-10
minutos. Hervir durante 1 minuto.Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en
autoclave. Esterilizar a 121O C (1 5 Ib de presión) durante 15 minutos. Enfriar a 45-50° C y añadir
del 5-1 0% de sangre desfibrinada estéril, homogeneizar y vaciar en cajas de Petri estériles. No
es recomendable usar sangre humana, de preferencia debe ser de conejo o de carnero.Esperar
a que se solidifique el medio para poder hacer el inóculo(31).
GELOSA SANGRE =IDA DE SODIO. Es un medio selectivo para aislar
estreptococos.Puede ser usado solo o con adición de sangre.
Fórmula:
Mezcla de peptonas 10.0 g
Extracto de carne 3.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Azida sódica 0.2 g
Agar 15.0 g
Agua destilada 1OOO.O ml
Suspender 33 g del medio deshidratado. Remojar 5-1 O min. Cuando se obtenga una
suspensión uniforme, calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto.Distribuir y
esterilizar en autoclave a 121O C ( 15 Ib de presión) durante 15 minutos(31).
Página 54
PRUEBAS B I OQU I M ICAS
PRUEBA DE AZUL DE METILENO AL 0.1 %. Se utiliza para diferenciar organismos por
su capacidad enzimática de reducir el azul de metileno en un medio con leche, entre ellos están
enterococos y estreDtococos.El azul de metileno, sal básica, es un indicador de la óxido-
reducción, indica cambios en el potencial de oxidación y reducción producidos par el
microorganismo (27).
I .-Leche descremada
2.-Agua destilada 1000 ml
1 O0 g
Mezclar los ingredientes hasta la total dilución de la leche.
3.-Preparar azul de metileno en solución acuosa al 1 % (1 g de azul de metileno en 1 O0
ml de agua.
Para 1 O0 ml. Se ponen 90 ml de la sln. 1 y 1 O ml de la sln. 2. Ajustar a un pH de 6.4(27).
AGAR HIERROY LlSlNA (LIA). Es un medio muy útil para diferenciar tempranamente
cepas de Salmonella Y Arizona de Citrobacter. Se basa en la descarboxilación de la kina, que
alcaliniza el medio dando un color azul-púrpura, formación de sulfuros y fermentación de
glucosa. Se puede detectar, también la desaminación del aminoácido lisina (27). 0
Fórmula:
Peptona de gelatina 5.0 g
Extracto de levadura 3.0 g
Dextrosa 1.0 g
L-liina 10.0 g
Ciato de Amonio FémcO 0.5 g
Tiosulfuro de sodo 0.04 g
Púrpura de b r m d 0.02 g
Agar-0 13.S g
Suspender 33 g del medio deshidratacjo en un litro de agua destilada Remojar unos
minutos. Calentaraiidadosamenteagitandoconfieaienaayhennrduranteunminutoo hasta
la disolucíón completa del agar. Distribuir en tubos con tapón de rosca. Estefllizar a 121OC.
Enfriar en posición indinada. Cerrar con cuidado las tapas a fin de evitar pérdidas de agua por
evaporación.
AGAR HIERRO Y TRIPLE AZüCAR mi). Es un medio diferencial muy usado en la
identificación de enterobacterias pat6genas y saprófitos. Es un medio en el que se observa,
la femientación . de los tres azúcares, y ad seleccionar o exduir ics microorganismos que
femienten la glucosa, la superficie no cambia de color, rojo, y el fondo se vuelve amarillo; o los
que fermentan glucosa y ladosa, dando la superficie y el fando amarillo, como en el caso de
la Ecoli, que a d d ¡ ¡ el medio (27).
Fórmula:
Mezcla de peptoms 20.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Lactosa 10.0 g
* sacarosa 10.0 g
Dextrosa 1.0 g
Suifato de amonio fémco 0.2 g
. Página 56
Tiosulfato de sodio 0.2 g
Rojo fenol 0.025 g
Agar 13.0 g
Suspender 59.4 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar 15
minutos. Hervir durante un minuto hasta la completa disolución. Distribuir en tubos de 13 x 1 O0
mm. Esterilizar a 121 OC durante 15 minutos. Los tubos se deben enfriar en posición inclinada,
de manera que el fondo del tubo alcance una profundidad de 1.5 a 2.0 cm.
CALDO HIPURATO.( técnica con ninhidrina) Identificación y diferenciación de Strep-
tococcus.
Fórmula:
Hipurato de sodio 1 .O g
Agua destilada 100.0 mi
Distribuir en tubos estériles de 15 x 125 ml con tapón de rosca, con 0.4 ml cada uno.
Guardar en refrigeración o congelar a -2OOC.
Ninhidrina. Disolver 3.5 g de ninhidrina en 1 O0 mi de una mezcla 1 :1 de acetona y
butanol. Guardar en un frasco obscuro a 4OC.
PRUEBA DE LECHE TORNASOLADAES un medio diferencial que se emplea para
detemínarvaRacfunciones metabóli de unorganismo: l).- Fermentaubn de la lactosa, 2).-
Reducción del tornasol, indicador de pH, 3).- Coagulación de la caseína, 41.- Peptonizach y
51.- Fomiaci6n de gas, cada una cie las funciones metabólicas, es propia de una especie
determinada, ayudando así a ia identifbah ’ baderiana(;l0).
A).- 8n. de púrpura de tKomocxesor al 02% en una solución de dand-agua
B).- Sin. de ieche deccremada al 10%
Si se preparm 100 ml de ski. B agregar f ml de la slnA ( 1% de la solución de púrpura
de bromocresd} Ajustar el pH a 7.0. Esterilizar a 7 ibs de presión durante 1 O mín y guardar en
refrigeración(27).
AGAR LEVINE CON EOSINAY AZUL DE METlLENO (EMB). Es un medio selectivo
para la investigación y diferenciación de bacilos entéfiws y microorganisms coliformes. Las
caracteBsticas de las colonias de E. coli, es que son de 2 a 3 rnm de diámetro, azul-negras en
la parte central y bordes daros a la luz transmitida. Presentan un brillo verde metálico a la luz
reflejada.
Fórmula:
Peptona de gelatina 10.0 g
Página 58
Lactosa 10.0 g
Fosfato dipotásico 2.0 g
Agar 15.0 g
Eosina 0.4 g
Azul de metileno 0.065 g
1 Suspender 37.5 g del medio deshiciratado en un litro de agua destilada. Mezclar bien.
Calentar agitando, hasta la ebullición y disolución total del medio. Esterilizar a 121OC. Se
distribuye en tubos antes de esterilizar y se enfría de forma inclinada (31).
CALDO MUCATO. Esta prueba sc3 utiliza, para identificar E.coli, por producción de
ácido.
Fórmula:
Peptona 10 9
Acido múcico 109
Azul de bromotimol (Sin.0.2%) 12 ml
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar a ebullición por lo
menos 30 minutos. Agregar NaOH 5 N o ‘IO N a la solución caliente, hasta ajustar el pH a
7.4. Distribuir en tubos con 3 o 4 ml. Esterilizar a 12loC, durante 10 minutos. La prueba
positiva se manifiesta por la producción de ácido, con vire del indicador, que va de azul a
amariiio(27). 6
!
Página 59
CALDO ROJO DE FENOL CON CARBOHIDRATOS (lactosa,maltosa,
glucosa)
Es un medio usado para determinar las reacciones de fermentación. La aparición
del color amarillo es el inicio de la fermentación(27).
Fórmula:
Peptona de caseína 10.0 g
Cloruro de codio 5.0 g
Carbohidratos 5.0 g
Rojo de fenol 0.018 g
o
Disolver 20 g del medio deshidratado en 1 It. de agua destilada. Esterilizar a 116-
118OC no más de 12 Ibs. de presión, durante 15 min. No sobrecalentar. pH.7.4+/- 2 (31).
MEDIO PARA ANTIBIOGRAMA
AGAR MUELLER-HINTON
Fórmula:
Infusión de carne de res 300.0 g
Peptona de caseína ácida 17.5 g
Almidón 1.5 g
Agar
Página 60
17.0 g
Suspender 33 g del medio deshidratadlo en un litro de agua deshidratado. Remojar de
1 O a 15 minutos. Mezclar bien agitando constantemente. Hervir durante un minuto y esteril-
izar a 121 OC por un tiempo no mayor de 15 min. Enfriar a 40- 45OC y vaciar en cajas de
Petri. Si se desea se puede preparar agar chocolate, previa adición de sangre de
carnero, calentando a Baño María a 8OoC durante 10 min. No sobrecalentar el medio(31).
TlNClON DE GRAM. Se compone de 4 reactivos: Cristal Violeta, da color a todo el
frotis, el segundo, sln. yodo-lugol, refuerza la unión del colorante y su sustrato, alcohol-
acetona, es un decolorante, disuelve y arrastra fuera de las células el primer colorante,
aunque hay algunos que lo retienen (grarnpositivos), ésto se debe a que su pared celular
es más sensible a la deshidratación por alcohol, y cierra los poros impidiendo salga el
colorante, el cuarto, es la safranina, es un colorante aplicado para los microorganismos
desteñidos (gramnegativos) (20).
o
=Cristal-violeta
S1n.A. Cristal-violeta 2.0 g
Etano1(95%) 20.0 g
Disolver el cristal-violeta en el etanlol.
S1n.B. Oxalato amónico Q.P.
Agua destilada 810.0 ml
Se disuelve el oxalato en el agua destilada.
Después de preparar las dos soluciones, se vierte una sobre la otra, agitando
0.8 g
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hasta que se mezclen perfectamente. Filtrar. 828422
=Safranins:
Safranina 0.25 g
Etanol (95%) 10.0 ml
Agua dest. 100.0 ml
Disolver la safranina en el etanol mezclando bien. Se agrega el agua destilada y se
vuelve a agitar. Filtrar la solución con papel filtro.
=Alcohol-acetona. Se debe hacer una solución del 30% de alcohol y 70% de
acetona.Se mezcla bien.
=Lugol: Yodo (I) 1.0 g
Yoduro de potasio (KI)
Agua destilada 300.0 ml
2.0 g
O
Mezclar en un mortero, el yodo y el KI, hasta molerlos muy finamente. Añadir una
pequeña cantidad de agua para lavar el material, agregar el resto del agua. Agitar bien
(20) *
REACTIVOS PARA PRUEBAS FlSlCOQUlMlCAS
=NaOH 0.1 N:
NaOH 4 9
Agua destilada I It.
Mezdar perfectamente hasta la tfíiución
VALORAR: con ftalato ácido de potass-
Se titula el NaOH en wiasolucióni deftaiato de pOIasi0, se ponen 2oooO g del
ftaiato, con agua destilada, en un matraz adorado de 100 ml. Se toman 10 mi de esta &u-
Ciónyseagregan 2gotasdesoluciónciefenoffaleina all %,hastaelvirajealcdorrosa,
dividiendo 9.8 entre el gasto (mi de NaOiH), se obtendrá la normalidad.
= Sln. de Fenoftaleína al 1 % :
Fenoftaleína l g
Etandconc. 50 ml
Agua dest. 50 ml
Se mezcla la fenaftaleha en una CdUCión alcdiblica 1 :1, el color final debe ser
transparente.
=FormawzhSdo neutralúado: Se le agrega ai fomialdehído 2-3 gotas de sln. de
fenoftaieína y se titula con NaOH 0.1 N
hasta el viraje neto al rosa, En caso que weiva ai transparente, hay que volver a titular.
.
Pdgina 63
Eli bliografia
1 ).- González, J.F. Síntesis Lechera. Introducción Ed.Año dos mil.Vol.1 N O . ~ Nov.
México,D.F. 1986
2).- Berenguer,F. Industrializaciónde la Leche. Facultad de Medicina Vet. y Zootecnia.
U.N.A.M. Vol.1 México, D.F.
3).- Avila Téllez,S. Producción Intensiva del Ganadolechera. Ed.C.E.C.S.A., M6xic0,D.F.
1988
4).- Pérez Dominguez, M. Manuei sobre Ganado Productor de Leche. Ed. DwTexcoco,
Edo. de Méx., 1986
5).- Baker, J.S. La Mastitisen la Vaca Lechera en: Proceeding National Council 21 st.
Annual Meeting. E.U.A.,1982
6).- Gran Enciclopedia del Mundo. Dir. Ramón Menéndez Ed.DURVAN. Bilbao, Es-
paña, 1971
7).- Santivañez Morales, J. Enfermedades del Ganado Bovino. Imprenta B. Franklin,
México,D.F. 1961
8).- Avila Téllez, S. Frecuencia de la Mastitis Subclínicaen Ganado Explotado bajo
Sistema a Libre Pastoreo en el Trópico Húmedo. Facultad de M.V.Z., U.N.A.M. Vol,XIX México,
D.F., 1988.
e
9) .- Spinelli, J. Manual de Farmac:ologia Veterinaria. Ed. Interamericana. edi~ibn.2~.
.. - ’ Tomo i,México,D.F.1987.
10).- Puis Sánchez, F.C. Aislamiento e Identificación de la flora Aerobia de Abcesoc
Subartáneos de Cerdo. I.P.N.Tesis Méxilco,D.F. 1984.
1 1)-- Tnijill0,F. Calidad de Leche F’roduada durante las diferentes épocas del aíio con
Ganado Bovino en el área de influencia del Centro de Invest¡gación,Ensefianza y Extensión en
Ganadería Tropical, Martínez de la Twe Veracruz. Famitad de M.V.Z. U.N.A.M. Vol.XM,
México, D.F.1988
12).- Davis,R. La Vaca Lechera, !;u cuidado y explotación Ed. UMUSA, México,D.F.
1988.
13).- Ruk- Mm’nez, C. Análicic QuímbBromatoIógims Escuela de Ciencias Quími-
cas de la Universidad Autónoma de SLP., México, 1973.
. 14).- Más vale prevenir que remediar. La Mastitis: El problema Sanitario número uno
de la Industria Lechera. En: GANADERO Voi.7 No.4 Julio-Agosto, México,D.F. 1982
15).- Tapia, R. Streptococcus de origen Porcino I. Aislamiento, Identificación y
Agrupación Serológica. Tesis de Licenciatura. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del
I.P.N. México, D.F. 1986.
16).-Howard,J. Enfermedades Infcmiosas de los Animales Domésticos. Ed. La Prensa
Médica Mexicana. edición 4a.México, D.F. 1983.
13.- Blood, D.C., et. al. Medicina Veterinaria.Ed. Interamericana. edición 6a. México,
D.F. 1988.
181.- Flores Farah,R. Manual de klasüüs Bovina Departamento de Produccibn Animal.
Rumiantes. Facultad de M.V.Z. U.N.A.M. México,D.F. 1987.
. 19).- El Manual Mera de Veterinaria. Ed. CENTRUM. edición 3a en español. Madrid,
España. 1988.
20).- Bradshow Jack, L Microbiología de Laboratorio. Ed.EI Manual Moderno. México,
D.F. 1976.
21).- iinsser. et al. Microbiología. Ed. Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
1983.
Z!).-Aiteaga Veloz, J A Prueba de Galifomia para el Diagnóstico de Mastitis Bovina.
TESIS. Facuitad de M.V.i. U.NAM. Mé:ucO, D.F. 1983.
24).-GavíñO, Gonzalo, et al. Técnicas Biológicas selectas de laboratorio y de campo.
Ed. UMUSA. México,D.F. 1985
25) .-Pérez Dorantes,C.A.Evaluación de la oxitetraeidína lentamente soluble, adminis-
trada por vía subcutánea para el tratamiento de mastrtis subclínica.TESIS. Facuitad de M.V.Z.
U.N.A.M. M6xic~D.F. 1984
261.- Arteaga Vidaies,J. Manual de Prácticac de Veterinaria. Eccuela Nacionalde
Ciencias Biológicas. üepto. de Microbiología del IPN. México, D.F.1984.
Pdgina 66
27).- Mc Fadin, J.F. Pruebas Bioquímicas para la identificación de Bacterias de
Importancia Clínica. Ed. Panamericana. México, D.F. 1984. 128422
28) .- Manual de Laboratorio de Bacteriología Medica. Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas del IPN. México, D.F. 1983.
29).- Carter, G.R. Bacteriología y Mitología Veterinaria Ed. El Manual Moderno.
Méxic0,D.F. 1985.
30).- Instructivo de uso de Multidiscos grampositivos y gramnegativos por: Bigaux
Diagnóstica S.A. México, D.F.
31 ) .- Medios de Cultivo y Reactivos de Diagnóstico. Catálogo BIOXON
32) .- Alcayde Orranca,J.C. Estudicl Comparativo de los Principales Agentes Causan-
tes de Mastitis en la Zona de la Laguna, Ocurrencia de Cuartos Afectados y Sensibilidad a los
Agentes Quimioterapéuticos. U:N.A.M. Falcultad de M.V.Z. (tesis). México, D.F., 1982.
33).-Metzgan Bejarano,R. Determinación de la Sensibilidad a Diferentes Antibióticos
IN VITRO de Cepas de Streptococcus agalactiae Aislados de Cepas que no Curaron con
Penici1ina.U.N.A.M. Facultad de M.V.Z.(tesis). Méxic0,D.F. 1962.
34).-Charles Alais. Ciencia de la Leche. Principiosde Técnica Lechera. Ed. C.E.C.S.A.
México, D.F.1988.
35)Aantos Moreno,A. Leche y SUtj Derivados. Ed. Trillas. México, D.F. 1987.
Página 67
36) .-Koeslag H.,J. Manuales de educación agropecuaria. Bovinos de Leche. Ed.
Trillas. México, D.F. 1987.
