hidrólisis de la carne de alpaca

1

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA CARNE DE ALPACA MEDIANTE LA PAPAINA

Ing. Abel Foraquita Choque

Mayo 2013

Puno -----o------Perú

2

RESÚMEN INTRODUCCIÓN

CAPÍTULO I

GENERALIDADES, OBJETIVOS, JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN............................................................................................1

1.1.- Generalidades.........................................................................................2

1.2.- Objetivos.................................................................................................2

1.2.1.- Objetivos generales..............................................................................3

1.2.2.- Objetivos específicos............................................................................3

1.3.- Justificación de la investigación..............................................................2

1.3.1.- De investigación...................................................................................3

1.3.2.- De tecnología.......................................................................................3

1.3.3.- Ecológico..............................................................................................3

1.4.-Hipótesis de trabajo..................................................................................2

1.4.1.-Consideraciones del problema..............................................................3

1.4.2.-Hipótesis................................................................................................3

1.5.-Diseño de la investigación........................................................................2

1.6.-Algoritmo del trabajo de investigación......................................................2

CAPITULO IIINVESTIGACIÓN BIBLIOGRÁFICA...............................................................7

2.1.- Generalidades........................................................................................8

2.2.- Materias primas.....................................................................................2

2.2.1.- Fuentes de materia prima de enzimas.................................................3

2.2.1.1.- Definición de enzimas.................................................................3

2.2.1.2.- Propiedades de las enzimas.......................................................3

2.2.1.3.- Sitio activo de una enzima...........................................................3

2.2.1.4.- Clasificación del (IEC).................................................................3

2.2.1.5.- Especificidad de las enzimas proteolíticas del grupo de las proteinazas......................................................................................................3

2.2.2.- Papaya.................................................................................................3

2.2.2.1.- Definición.....................................................................................3

2.2.2.2.- Variedades..................................................................................3

2.2.2.3.- Especificaciones..........................................................................3

3

2.2.2.4.- Características físicas.................................................................3

2.2.2.5.-Composición química de la papaya..............................................3

2.2.3.-Papaína.................................................................................................3

2.2.3.1.- Definición ....................................................................................3

2.2.3.2.- Composición................................................................................3

2.2.3.3.- Estructura del sitio activo de la papaína......................................3

2.2.3.4.- Estabilización de la papaína .......................................................3

2.2.3.5.- Características físicas.................................................................3

2.2.3.6.- Características químicas.............................................................3

2.2.3.7.- Activación de la papaína.............................................................3

2.2.3.8.- Métodos de extracción................................................................3

2.2.3.9.- Usos y aplicaciones.....................................................................3

2.2.4.- Materias primas para hidrólisis.............................................................3

2.2.4.1.- La carne fuente de proteínas.......................................................3

2.3.- Hidrólisis de proteínas..........................................................................2

2.3.1.- Hidrólisis enzimática de proteínas........................................................3

2.3.1.1.- Introducción.................................................................................3

2.3.1.2.- Fundamento de la acción enzimática..........................................3

2.3.1.3.- Mecanismos de hidrólisis para la papaína- rotura del enlace.....3

2.3.1.4.- Parámetros..................................................................................3

2.3.1.5.- Equipos........................................................................................3

2.4.- Métodos de determinación...................................................................2

2.4.1.- Métodos de determinación de proteínas..............................................3

2.4.2.- Métodos de determinación de aminoácidos.........................................3

2.4.3.- Velocidad de hidrólisis..........................................................................3

2.4.4.- Equipo para análisis.............................................................................3

CAPÍTULO IIIDESARROLLO EXPERIMENTAL................................................................10

3.1.- Generalidades......................................................................................11

3.2.- Objetivos de la experimentación.........................................................8

3.3.- Metodología...........................................................................................2

4

3.4.- Algoritmo de la estrategia experimental.............................................2

3.5.- Trabajo experimental previo.................................................................2

3.5.1.- Extracción de la papaína......................................................................3

3.5.1.1.- De la materia prima.....................................................................3

3.5.1.2.- Del proceso.................................................................................3

3.5.1.3.- De la purificación.........................................................................3

3.5.1.4.- Diagramas de flujo.......................................................................3

3.5.1.5.- Estabilización y activación de la papaína....................................3

3.5.2.- Preparación del sustrato.......................................................................3

3.5.2.1.- Maduración de la carne de alpaca..............................................3

3.5.2.2.- Eliminación del color de la carne.................................................3

3.5.2.3.- Influencia de la temperatura........................................................3

3.6.- Selección de variables a investigar...................................................11

3.7.- Diseño estadístico de la experimentación..........................................8

3.7.1.- Diseño estadístico factorial...................................................................3

3.7.1.1.- Introducción.................................................................................3

3.7.1.2.- Obtención de tablas matriciales para la planificación de experimentos y cálculos de los efectos.........................................................3

3.7.1.3.- Diseño factorial aplicado a nuestra investigación........................3

3.7.1.3.1.- Obtención de la tabla matricial y cálculos de los efectos3

3.8.- Desarrollo experimental........................................................................2

3.8.1.- Selección de la muestra estándar........................................................3

3.8.1.1.- Especificidad de la papaína.........................................................3

3.8.1.2.- Preparación de la solución estándar...........................................3

3.8.1.3.- Determinación colorimétrica de aminoácidos..............................3

3.8.2.- Experimentación de la hidrólisis enzimática de carne de alpaca.........3

3.8.2.1.- Diagrama de flujo general: Hidrólisis de carne de alpaca...........3

3.8.2.2.- Preparación de las ocho muestras..............................................3

3.8.3.- Determinación cuantitativa de la actividad de la papaína.....................3

3.8.3.1.- Determinación espectrofotométrica de aminoácidos...................3

3.8.3.2.- Demostración de la ley de Beer- determinación de la ley de absorbancia.....................................................................................................3

3.8.3.3.- Determinación de las muestras problema...................................3

5

CAPÍTULO IVTRATAMIENTO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS...........................1

4.1.- Generalidades......................................................................................11

4.2.- Estadística de resultados.....................................................................8

4.2.1.- Transformación de variables................................................................3

4.2.2.- Formulación de la tabla factorial para análisis de datos.......................3

4.2.3.- Determinación de los coeficientes de regresión...................................3

4.2.4.- Validación de resultados (Análisis de varianza)...................................3

4.2.4.1.- Análisis de significancia de los coeficientes................................3

4.2.5.- Bondad de ajuste de la ecuación de regresión.....................................3

4.2.6.- Evaluación del efecto curvatura...........................................................3

4.2.7.- Expresión del modelo matemático en escala natural...........................3

4.3.- Análisis de los resultados....................................................................2

4.3.1.- Influencia de la concentración de la papaína......................................3

4.3.2.- Influencia del pH................................................................................3

4.4.- Análisis del diseño factorial.................................................................2

CAPÍTULO VCRONOGRAMA Y COSTOS DE LA INVESTIGACIÓN...............................4

5.1.- Costos generales de la investigación.................................................1

5.1.1.- Generalidades......................................................................................2

5.1.2.- Recursos materiales.............................................................................2

5.1.3.- Costos de los recursos materiales.......................................................2

5.1.4.- Financiamiento.....................................................................................2

5.2.- Cronograma de actividades.................................................................1

5.2.1.- Actividades a desarrollar......................................................................2

5.2.2.- Cuadro de actividades..........................................................................2

CONCLUSIONES............................................................................................1

BIBLIOGRAFÍA...............................................................................................4

ANEXOS.........................................................................................................4

6

ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS Y TABLAS

Cuadro 2.1.- Especificaciones de la papaya.................................................10

Cuadro 2.2.- Características físicas de la papaya.........................................10

Cuadro 2.3.- Contenido de 100 gr de parte comestible de carica papaya.....10

Cuadro 2.4.- Composición elemental de la papaína cristalina.......................10

Cuadro 2.5.- Vitaminas de la carne...............................................................10












Tabla 2.1.- Características físicas de la papaya............................................10

Tabla 2.2.- Contenido de 100 gr de parte comestible de carica papaya.......10

Tabla 2.3.- Composición elemental de la papaína cristalina.........................10

Tabla 2.4.- Vitaminas de la carne..................................................................10

Tabla 3.1.- Especificaciones de la papaya....................................................10

Tabla 3.2.- Características físicas de la papaya............................................10

Tabla 3.3.- Contenido de 100 gr de parte comestible de carica papaya.......10

Tabla 3.4.- Composición elemental de la papaína cristalina.........................10






7




Figura 2.2.- Vitaminas de la carne.................................................................10

Figura 2.3.- Especificaciones de la papaya...................................................10


Figura 2.5.- Vitaminas de la carne.................................................................10





Gráficas de superficie....................................................................................10

Graficas de superficie....................................................................................10

1

CAPITULO I

INTRODUCCIÓN

1.1. GENERALIDADES:

Las proteínas son sustancias complejas, que constituyen la materia

fundamental de los seres vivos. Estas se hidrolizan en menor o mayor

grado por los ácidos, por los álcalis y por los fermentos, produciendo

aminoácidos.

Es lógico pensar que cuando se pretende utilizar los hidrolizados de

proteínas, por su valor nutritivo en la preparación de dietas elementales

para la alimentación infantil o nutrición enteral, debe respetarse al máximo

la estructura de los componentes separados, no sólo para mantener su

valor biológico, sino también para evitar la contaminación de los

hidrolizados obtenidos por los productos de degradación de estos

componentes, de ahí la necesidad de recurrir a la hidrólisis

enzimática.

El tema de investigación comprende el estudio de la papaína, sus fuentes

naturales (origen vegetal), así como su estabilización posterior.

2

En este trabajo, dedicado a la hidrólisis enzimática de las proteínas de la

carne de alpaca por actividad enzimática de la papaína, tiene como

finalidad conseguir un mayor grado de hidrólisis y demostrar la

importancia de enzimas proteolíticas como la papaína.

1.2. OBJETIVOS.-

1.2.1. OBJETIVO GENERAL

Mejorar la hidrólisis de proteínas mediante la aplicación tecnológica de

biocatalizadores ó enzimas.

1.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar el grado de hidrólisis óptima de la carne

de alpaca, mediante el uso de la enzima papaína.

2. Determinar las mejores condiciones de las variables

del proceso de hidrólisis a nivel laboratorio y mediante

un diseño experimental que conlleve a un modelo

matemático.

1.3. JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

1.3.1. DE INVESTIGACIÓN

En la actualidad y en el futuro el mejorar el

3

Porcentaje de digestibilidad de los alimentos que consumimos es una de

las metas más importante, y más aún si se trata de las proteínas que es el

grupo de alimentos que más carencias tiene la población.

Por eso con esta investigación se quiere contribuir a solucionar en parte

este problema. La papaína es una enzima proteolítica muy activa. Es la

enzima más termoestable conocida. La papaína se encuentra en el fruto,

en las hojas y en el tallo, se extrae del látex coagulado de la papaya. En las

enfermedades digestivas, se utiliza como medicamentos en las

insuficiencias de la segregación estomacal, por sus propiedades similares a

la pepsina pues actúa sobre las proteínas produciendo aminoácidos libres.

1.3.2. DE TECNOLOGÍA

La producción industrial de hidrolizados enzimáticos de alimentos no se ha

desarrollado tecnológicamente hasta este siglo, en el que han sido

favorable dos factores: por una parte, la disponibilidad comercial de las

enzimas adecuadas y, por otra, la demanda en la industria alimentaria de

estos productos.

En cuanto a la disponibilidad comercial de enzimas, cabe destacar que la

producción y el uso industrial no se produjo hasta 1890.

La demanda de hidrolizados enzimáticos en la industria alimentaria ha sido

función de la necesidad de sustituir determinados alimentos, bien por

razones económicas, bien por razones de escasez, o de la necesidad de

obtener alimentos más asimilables por el cuerpo humano.

La hidrólisis enzimática es uno de los procesos que se usa actualmente a

nivel mundial para obtener aminoácidos en EE.UU, México, (Fermax),

Japón (Kyowa Hakko, Suntory) países que usan esta tecnología.

4

Además estos hidrolizados desecados se utilizan en preparados sólidos,

para alimentos pre cocidos de niños.

Laboratorios mundialmente conocidos como Bayer, Parke Davis y otros han

perfeccionado los métodos hidrolítícos. La hidrólisis enzimática,

industrialmente se lleva a cabo en tanques agitados con la enzima en

disolución, aunque parece existir una tendencia creciente hacia la

utilización de reactores de lecho fijo o fluidizado con enzimas

inmovilizadas.

1.3.3. ECOLÓGICO

El presente tema de investigación, está enmarcado dentro de la industria

por mantener el medio ambiente ya que utiliza materias primas naturales

(papaya) dándole un mayor valor agregado y el proceso de hidrólisis

(industria silenciosa, sin humos y sin reactivos tóxicos) revelan que el tema

tiene para seguir investigando sin dañar la naturaleza.

Las precauciones que se deben tomar con respecto al uso de la papaína es

que no debe consumirse sólida, sino diluida y el

5

organismo deberá tener previamente un sustrato sólido

principalmente proteínico.

1.4. HIPÓTESIS DE TRABAJO

1.4.1. CONSIDERACIONES DEL PROBLEMA

- Constantes: - Temperatura

- Concentración del Sustrato

(Carne de alpaca)

- Variables: - Concentración del Enzima

- pH

- Tiempo

1.4.2. HIPÓTESIS

Se pretende demostrar experimentalmente que existe una relación entre el

pH y el tiempo y que ambas variables se relacionan en una ecuación

empírica que parametrisa el proceso. Además, la concentración óptima del

enzima está en el intervalo de 2,5 - 5 % con respecto al sustrato.

1.5. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

La presente investigación se lleva a cabo mediante la siguiente estrategia:

a. Esté trabajo se abocará a la investigación de los

parámetros de hidrólisis enzimática de la carne de alpaca por el

enzima del látex de la papaya.

b. Los parámetros que se han mantenido constantes con el

fin de hacer más fácil el sistema de estudio son:

6

Concentración del sustrato, temperatura.

c. Las pruebas se realizan tomando como sustrato la carne

de alpaca.

d. El tipo de hidrólisis a llevar a cabo es un método basado

en la acción de enzimas proteóliticas, usando como enzima

papaína.

e. El análisis del hidrolizado obtenido es determinado por

espectrofotometría.

f. Los datos que deben tomarse al respecto son:

-Concentración del sustrato.

-Concentración del enzima papaína.

-pH.

-Temperatura.

-Tiempo de hidrólisis.

-Absorbancia.

g. Analizar y recomendar rangos de los parámetros tomados

para este proceso.

1.6. ALGORITMO DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

INICIO

DEFINICIÓN DEL PROBLEMA: HIDRÓLISIS DE LA CARNE

7A

SELECCIÓN DEL MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO

¿EL MÉTODO ES

EL MEJOR?

VARIABLES A DETERMINAR pH, Tiempo, (enzima), Absorbancia

FIN

FIJACIÓN DE VARIABLES Y PARÁMETROS FINALES

¿SON LAS CORRECTAS

METODOLOGÍA

OBJETIVOS DE LA EXPERIMENTACIÓN

DESARROLLO EXPERIMENTAL (INVESTIGACIÓN)

EXPERIMENTOS PREVIOS

VALIDACIÓN DE DATOS

CONSISTENCIA DEL MODELO

EXPERIMENTOS FINALES

OBTENCIÓN DE DATOS

¿SON ACEPTABLES?

INTERPRETACIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS

NO SI

SINO

NO SI

8

CAPITULO II

INVESTIGACIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. GENERALIDADES

Esta revisión bibliográfica incluye la papaína: forma de extracción,

purificación, estabilización, activación, propiedades físicas y

químicas, usos y aplicaciones.

Nos ocuparemos también, de las proteínas, aminoácidos,

propiedades y composición de la carne de alpaca.

9

Por otra parte, se ha revisado la hidrólisis enzimática de proteínas, y los

diferentes factores que puedan influir en el complicado proceso, para

poder seleccionar las condiciones de operación.

Por último, los métodos de determinación de proteínas y aminoácidos.

Toda esta bibliografía revisada, nos dará una base bien clara, para poder

comprender el proceso de hidrólisis enzimática de proteínas.

2.2. MATERIAS PRIMAS

2.2.1. FUENTES DE MATERIA PRIMA DE ENZIMAS

2.2.1.1. DEFINICIÓN DE ENZIMAS

Los enzimas son proteínas producidas en las células con la finalidad de

catalizar las reacciones químicas que se dan en los organismos vivos.

Un catalizador es cualquier sustancia que acelera una reacción en ambos

sentidos, sin consumirse en ella, sin formar parte de los productos y que

experimenta solo un cambio físico ó químico transitorio.

Los catalizadores Biológicos son vitalmente necesarios para bajar la

cantidad de energía de activación que requieren las moléculas para

reaccionar en los seres vivos; estos son los Enzimas, y capacitan a la célula

para realizar sus actividades con máxima rapidez y eficacia en las

condiciones que son compatibles con la vida. La sustancia sobre la que

actúa el enzima se llama sustrato.

Existen proteínas no enzimáticas, como los citocromos, que tienen

propiedades catalít icas pero

10

actúan como transportadores de electrones, y no activando otra sustancia.

Los enzimas actúan activando a los sustratos.

2.2.1.2. PROPIEDADES DE LOS ENZIMAS

• ESPECIFICIDAD

La gran mayoría de enzimas tiene la capacidad de catalizar reacciones

específicas; es decir, su intervalo de acción se limita a un determinado tipo

de sustrato que debe reunir ciertas características para que pueda ser

utilizado como tal. La especificidad de los enzimas es una propiedad que

los hace muy diferentes a muchos catalizadores no biológicos, y que se ha

dividido en cuatro grandes grupos:

- ESPECIFICIDAD ESTEREOQUÍMICA

Normalmente los enzimas utilizan D o L isómeros como sustrato: Casi

todos los monosacáridos en la naturaleza son D mientras que los

aminoácidos pertenecen a la serie L.

- BAJA ESPECIFICIDAD

Se presenta cuando los enzimas atacan un determinado tipo de enlace

químico sin importar la naturaleza del sustrato.

- ESPECIFICIDAD DE GRUPO

Actúan sobre un sustrato que contiene un determinado enlace y un grupo

químico específico al lado de dicho enlace.

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- ESPECIFICIDAD ABSOLUTA

Es la más común, consiste en que el enzima utiliza una sola y muy

específica sustancia como sustrato.

2.2.1.3. SITIO ACTIVO DE UN ENZIMA

Es aquella porción de aminoácidos de la proteína que participa en el

proceso catalítico; es decir el sitio activo está formado por ciertos

aminoácidos que forman un microambiente catalizador dentro de la propia

molécula del polipéptido.

La participación de los aminoácidos del sitio activo en la reacción

enzimática, implica en algunos casos, la formación de un compuesto

intermediario enzima-sustrato unido covalentemente; no se ha demostrado

que esto suceda con todos los enzimas, pero sí en algunas hidrolasas

como la quimotripsina, la tripsina y la papaína, en las que se forman

intermediarios covalentes que son posteriormente hidrolizados por la acción

nucleófila del agua. En el sitio activo de muchos enzimas hidrolíticas

participan aminoácidos nucleófilos, cuya característica principal es la

tendencia a donar un par de electrones; los grupos más importantes son el

hidróxilo de la serina, el sulfhidrilo de la cisteína, el imidazol de la

histidina y el carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico.

Las estructuras conformacionales de los enzimas están estabilizadas por

puentes de hidrógeno, uniones iónicas e hidrófobas, y en algunos casos

enlaces disulfuro.

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La acción de temperaturas extremas (altas o bajas), de disolventes, de

condiciones drásticas de pH y fuerza iónica, y de varios agentes químicos,

produce la desnaturalización del enzima, lo que origina la pérdida de su

actividad; cuando el efecto del agente desnaturalizante no es muy fuerte, el

enzima puede nuevamente regenerar su actividad al adquirir otra vez su

estructura tridimensional de origen.

A temperaturas cercanas a los 30°C y de bajas concentraciones de los

reactivos, catalizan limpiamente con gran eficacia y dan productos

secundarios, reacciones muy específicas que con los métodos de la

química orgánica no se pueden realizar.

Se auto regulan en respuesta a cambios de concentración de los reactivos

o productos y su conformación no es rígida sino flexible.

Ciertas enzimas requieren de ciertos compuestos orgánicos, termoestables

para poder cumplir con su función catalítica, estas moléculas se denominan

coenzimas, generalmente tiene bajo peso molecular y suelen ser claves en

el mecanismo catalítico. La apoenzima unida a la coenzima constituye la

holoenzima. Estas moléculas termoestables generalmente son vitaminas o

metales.

Según el tipo de reacción que catalizan las enzimas se dividen en 6 clases

o grupos:

2.2.1.4. CLASIFICACIÓN DE LA COMISIÓN INTERNACIONAL DE

ENZIMAS:

Cuando el número de enzimas conocidas se hizo mayor, fue necesario

ordenar la nomenclatura y establecer una clasificación. La que se acepta

universalmente es la Comisión Internacional de Enzimas (IEC) que las

agrupa en seis clases según el tipo de reacción que catalizan, cada una de

éstas seis clases se divide en subclases y subsubclases, en donde

indicamos la clase subclase y subsubclase de las Hidrolasas.

13

CLASES DE ENZIMAS

1. OXIDORREDUCTASAS

2. TRANSFERASAS

ESTERASAS

CARBOHIDRASASNUCLEASAS

3. HIDROLASAS

3.4. ENZIMAS PROTEOLITICAS (PROTEASAS)

3.4.4. PROTEÍNASAS

ENDOPEPTIDASAS FICINA

3.4.4.10. PAPAÍNA *

BROMELINA

ENDOPEPTIDOSAS

PEPSINA

RENNINA

QUIMOTRIPSINA

CATEPSINA

TRIPSINA

PEPTIDASAS

3. LIASAS

4. ISOMERASAS

5. LIGASAS

* Papaína: Código EC 3.4.4.10

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2.2.1.5. ESPECIFICIDAD DE LOS ENZIMAS PROTEOLITICOS DEL

GRUPO DE LAS PROTEÍNASAS:

a. PROTEÍNASAS ENDOPEPTIDOSAS:

Contienen serina e histidina en el centro activo y son inhibidas por el

diisopropilfluorofosfato. La Catepsina, Tripsina, Pepsina, Rennina y

Quimotripsina son enzimas de origen animal de tanta importancia en la

fisiología humana y animal, ya que éstos producen la autólisis de los tejidos

después de la muerte de los animales y tienen enorme importancia en

bromatología.

b. PROTEÍNASAS ENDOPEPTIDASAS:

Tienen cisteína en el centro activo y son inhibidas por yodoacetato, p-

cloromercuribenzoato y metales pesados, y activadas por el ácido

cianhídrico.

La Papaína, Bromelina y Ficina; estos tres enzimas vegetales son

semejantes en su especificidad y atacan a los enlaces peptídicos en los

que participan aminoácidos básicos, leucina o glicina, así como sus

esteres y amidas, poseyendo por lo tanto un margen de actuación más

amplio que la Tripsina y la Quimotripsina.

2.2.2. PAPAYA

2.2.2.1. DEFINICIÓN

El papayo o "Carica Papaya" pertenece a la familia de las "caricáceas". Su

raíz es de origen embrionario, posee un tallo esbelto y erecto coronado por

un racimo de hojas planas de pedúnculo que van desde medio metro hasta

metro y medio de largo.

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El fruto es de forma esférica u ovoide, su cascara es delgada, lisa, su color

es verde cuando está inmadura y amarilla-anaranjada cuando se encuentra

en estado maduro.

La pulpa tiene un color anaranjado y es de un espesor de 2.5 a 5cm. y

rodea a una cavidad, en cuyas paredes laterales existen membranas a las

que están adheridas las semillas redondas y negras, éste grosor de la

pulpa varía según la variedad.

2.2.2.2. VARIEDADES

Las más importantes son:

a. VARIEDAD SOLO:

Es de color amarillo claro y sabor muy dulce, contiene gran cantidad de

materia carnosa comestible, esta variedad abunda en los trópicos.

b. VARIEDAD TALLO AZUL:

Tiene la forma oblonga, cascara verde oscura y carne espesa y sabor

agradable, esta variedad se produce abundantemente en Florida.

c. CARICA PAPAYA NARA:

Es de fruto muy pequeño y de forma alargada, de color amarillo brillante en

su madurez, esta variedad se produce abundantemente en Chile.

Teniendo en cuenta la inflorescencia y la forma de la fruta se puede

clasificar e identificar dos tipos:

- El dioico o de fruta redonda, y

16

- El monoico o de fruta alargada

Dentro de estos tipos fundamentales, hay una serie de variedades que se

caracteriza por diversas formas del fruto, debido tanto a la variabilidad de

los hábitos de esta planta como a su edad, notándose que después del

tercero o cuarto año de crecimiento, comienza a detenerse y las hojas y

frutos disminuyen de tamaño, en nuestro departamento se cultiva las

variedades de papaya común y las denominadas "Colombianas", para el

presente Trabajo de Investigación se utilizará la variedad de "Papaya

Común" que es procedente de la selva puneña.

2.2.2.3. ESPECIFICACIONES CUADRO 2.1.

Reino Vegetal

División Angiospermas

Clase Dicotiledónea

Sub Clase Archiclamydae

Orden Viólales

Familia Caricaceae

Género Carica

Especie Carica papaya L.

FUENTE: Eficacia antioxiurotica de Cucúrbita máxima (Zapalla), Carica

papaya, Portulaca olerácea (verdolaga) en escolares del nivel primario.

Tesis-UNSA, 1997. Pág.25, Biblioteca Biomédicas

En México se le conoce con el nombre de zapote y melón, mamón en

Argentina, mamao en Brasil, papaw en Inglés e higo de mastuerzo en

España.

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2.2.2.4. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS

CUADRO 2.2.

Cascara 7.2 %

Semilla 4.7 %

Pulpa 88.06%

Peso promedio de la papaya 1.2 kg.

Humedad total de la pulpa 90.6%

Dimensiones de la papaya promedio :

- Diámetro longitudinal

- Diámetro transversal

- Espesor de la pulpa

28.0 cm.12.0 cm. 3.4

cm.

FUENTE: Molina Q. "Deshidratación Industrial", 1973.

2.2.1.1. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA PAPAYA

CUADRO 2.3.Contenido en 100 gr. de parte comestible de carica papaya l.

Humedad 90,8 gr

Cenizas 0,5 grProteínas 0,4 gr.Grasas 0,1 gr.Hidrato de Carbono 8,2 gr.Fibra 0,4 gr.Vitamina C (Ac.Ascórbico) 47,7 mg.Caroteno (Pro-vitamina A) 0,27 mg.

Calcio 23,0 mg.Fósforo 14,0 mg.Hierro 0,00 mg.

Tiamina (Vitamina B-1) 0,02 mg.Rivoflamina (Vitamina B-2) 0,07 mg.Niacina (Vitamina B-5) 0,41 mg.

FUENTE: Folleto Titulado "Composición de los Alimentos Peruanos" del Ministerio de Salud. 1963.

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2.2.3. PAPAÍNA

2.2.3.1. DEFINICIÓN

El enzima papaína se obtiene del látex del fruto del papayo (Carica papayo

L), bien desarrollado pero aún no maduro, en forma de polvo de color

crema; pudiendo también extraerse de los tallos de dicha planta.

Hidroliza la mayor parte de las proteínas, proteosas y peptosa hasta dar

lugar a los péptidos y los aminoácidos, requiere un pH ligeramente ácido.

2.2.3.2. COMPOSICIÓN

La composición elemental de la papaína cristalina está dada por los

resultados de tres laboratorios diferentes que se muestran a continuación:

CUADRO 2.4.

INVESTIGADORES NITRÓGENO % SULFURO%

Balls y Lineweaver 15.5 1.2

Cióse, Moore, y Bigwood

16.4

Kimmel y Smith 16.1 1.22

FUENTE:Advances in Enzymology. Volumen XIX, 1957. pág. 282;

Biblioteca Biomédicas - UNSA. Cód. SO142800017

El contenido de aminoácidos de la papaína ha sido determinado

independientemente por Cióse, Moore y Biwood y Pousmith, Stockell y

Limmel.

19

Las mediciones cuantitativas en las fracciones de efluente fueron hechas colorimétricamente con ninhidrina, el triptófano y cisteína fueron estimados separadamente. Los datos de ambos laboratorios están dados en la siguiente tabla:

TABLA 2.1. COMPOSICIÓN Y PESO MOLECULAR DE LA PAPAÍNA

AMINO ACID Amino acid. G./100 g. Protein (155)

N as % of total

Amino acid. residue, g./100g protein3

Assumed Number of residue

wt. Cale, mol a

CaleNumereOfresiduesfrom av.mol.wt.of20,289

Aspartie acid 9.90 11.32 7.40 9.79 17 19,992 17.3

Threonine 3.67 3.89 2.84 3.30 7 21,448 6.6

Serine 5.03 5.89 4.89 4.90 11 19,588 11.4

Glutamic acid 11.35 12.89 7.35 10.91 17 20,111 17.2

Proline 4.50 5.89 3.86 4.31 9 20,277 9.0

Glycine 8.32 8.89 9.97 6.54 23 20,079 23.2

Alanine 4.67 6.89 5.94 4.85 13 20,524 12.8

Valine 7.51 8.89 6.26 7.13 15 20,850 14.6

Isoleucine 5.66 6.89 4.01 5.22 9 19,521 9.4

Leucine 5.75 6.89 4.05 5.26 9 19,368 9.4

Tyrosine 12.75 14.89 7.06 13.25 17 20,944 16.5

Fenilalanina 2.67 3.89 1.66 2.82 4 20,880 3.9

Histidine 0.95 0.89 1.43 0.75 1 18,293 1.1

Lysine 5.12 5.89 6.75 4.97 8 20,632 7.9

Ammonia 1.98 1.89 8.19 1.51b 19b 20,140 1 9.1 b

Arginine 7.62 7.89 15.18 6.95 9 20,223 9.0

Triptoftona 4.40 4.89 3.99 4.27 5 21,8°5 4.7

Cisteina 2.14 3.89 2.58 3.01 6 20,532 6.0

Total -- -- 103.71 98.23 180 20,289 --

a Tomado solamente de. los datos de Smith, Stockell, y kimmel (155)

b Omitido total .

FUENTE :Avances in Enzymology. Volumen XIX, 1957, pág. 283. Biblioteca Biomédicas - UNSA. Cód: SO142800017

20

Donde ambos grupos usaron columnas de intercambio iónico debido

a las discrepancias en los casos de estos aminoácidos utilizaron los

factores de corrección para la destrucción durante la hidrólisis.

Las características más notables de la composición de papaína son

el alto contenido de tirosina y glicina, la presencia de un solo residuo

de histidina y la ausencia de metionina.

El contenido de cistina de la papaína es de considerable

importancia debido a la naturaleza tiol del enzima.

No se ha encontrado fósforo o carbohidrato. La papaína contiene

ocho átomos de sulfuro por mol de papaína.

El peso molecular de la papaína calculado de la composición de

aminoácidos es 20,406.

El volumen específico parcial de papaína determinado es 0.724.

Este enzima está compuesto por una cadena polipeptídica sencilla

de 212 aminoácidos. Estudios cinéticos han demostrado que el sitio

activo puede acomodar siete aminoácidos, cuatro en el lado del acilo

del enlace escindido (S4 - S1) y tres en el lado amino (S*1 - S'3).

La papaína es específica para aminoácidos hidrofóbicos en el sitio

S2. Los esteres, y presumiblemente los péptidos, se hidrolizan a

través de un camino con acilenzima, con la excepción de que se acila

la Cys - 25.

Si denotamos la histidina "Im" y la c iste ína "RSH", la forma

iónica [RSH.HIm+] es inactiva a pH bajo, mientras que la forma

iónica [RS-lm] es inactiva a pH elevado. La forma catalíticamente

activa a pH neutro es uno de los tautómeros [RSH.Im] o

[RS".HIm+] : no se puede distinguir entre dos estados iónicos

que son portadores de la misma carga neta examinando la

21

dependencia respecto al pH.

FIGURA 2.1 Mecanismo de reacción ( enzima + sustrato)

5.2.3.3. ESTRUCTURA DEL SITIO ACTIVO

DE LA PAPAÍNA

En la estructura cristalina, la molécula está formada por dos

dominios con una brecha profunda entre ellos. Ahí se observa lo

siguiente:

a. El sitio de fijación para el sustrato se encuentra a horcajadas de

esta brecha, aunque la Cys-25 y la H¡s-15S están en contacto

próximo, se encuentran en lados opuestos de la brecha. La bolsa

relativamente honda de. sitio S2 de los aminoácidos hidrofóbicos

está formada con las cadenas laterales hidrofóbicas de la Tyr-67,

Pro-68 y

SH

E

Im

O O

RCX R-CR

H2O

E RCO2H+

Im

+

SH

E

Im

22

Trp-69 de un dominio y las de la Phe-207, Ala-160, Val-133 y Val-157

del otro.

El bajo pKa de la histidina se debe probablemente a que está

parcialmente enterrada en una región hidrofóbica.

Los residuos D-aminoácidos no se pueden acomodar en los subsitios

debido a interferencia esférica con la masa del enzima.

El enzima no es exopeptidasa porque el carboxilato libre del sustrato

estaría a sólo 3-4 Á del carboxilato del Asp-158 con la consiguiente

repulsión electrostática.

Análogos del sustrato que tienen un grupo estéricamente pequeño en

la posición del grupo saliente se fijan de una forma considerablemente

más fuerte que los que tienen residuos más voluminosos.

La especificidad para restos hidrofóbicos grandes en el subsitio S2 se

manifiesta en valores de Kcat más elevados y no en fijación más

fuerte.

Se encontró un movimiento hacia fuera de las paredes de la hendidura

en la estructura cristalina del enzima inhibida por el derivado

clorometilcetona de la N-benciloxicarbonil-L-fenilalanina-L-alanina.

Esta estructura demuestra que hay un sitio de fijación para el oxígeno

carbonílico del enlace peptídico escindible.

La naturaleza exacta de la catálisis ácido-básica en el sitio activo no

es conocida.

La etapa determinante de velocidad en la hidrólisis de amidas y de

anilinas parece ser la ruptura del intermedio tetraédrico por

catálisis acida general.

23

k. Se ha encontrado que en sistemas químicos sencil los la

combinación de una base B y un tiol RSH reaccionan en forma de

RS- y BH+.

FIGURA 2.2. Etapa de Acilación Estado de Transición

2.2.3.4. ESTABILIZACIÓN DE LA PAPAÍNA

Los componentes proteolíticos del Látex de papaya son inusualmente

estables con relación a los extremos de temperatura y pH. La

papaína resiste a 50°C por 30 minutos sin pérdida significativa de

actividad, encima de 75°C ocurre la inactivación.

El enzima es muy estable a 30°C en el rango de pH 5 a 7, encima de

pH 7 la actividad es lenta y encima de pH 11 la pérdida de actividad

es más rápida, debajo de pH 3 la enzima es rápidamente inactivada.

24

La papaína cristalina es remarcablemente estable en soluciones de urea.

La exposición a al:as concentraciones de urea produce pequeños cambios

configuracionales en la papaína.

2.2.3.5. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS

- La papaína pura es un polvo amorfo, de color blanco grisáceo

(crema) o pardusco.

- Ligeramente higroscópico.

- Poco soluble en agua y en la mayoría de los solventes orgánicos.

- Soluble en alcohol etílico y metílico.

- Su punto isoeléctrico aparente es 8.8.

- La papaína es termoestable.

- La temperatura de inactivación está entre 75° y 83°C.

- Pierde de 3 a 4 % de su actividad por mes a temperaturas

ordinarias.

2.2.3.6. CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS

- Es una enzima proteolítica considerada en la clasificación de los

enzimas como Papainasa, del grupo de las Proteinasas y su

propiedad enzimática está dada por la presencia de SH.

- Ataca a las sustancias proteicas y no a los polipéptidos.

- En la oscuridad puede conservarse por un año.

- La proteólisis es rápida a 40 - 50°C, actuando mejor a un pH

próximo a la neutralidad.

25

La ventaja de la papaína sobre la pepsina es que puede actuar en medio

alcalino o neutro y hasta ligeramente ácido.

Desdobla las proteínas hasta peptonas y aminoácidos.

Está sujeta a activación mediante agentes reductores y es inactivada por

agentes oxidantes.

Pueden emplearse como activadores la cisteína, el glutatión, el cianuro de

sodio, el tioglicolato de sodio y los sulfitos.

En la práctica parece que se añaden bisulfitos durante la preparación del

enzima comercial. Casi todos los agentes oxidantes, incluso el oxígeno

atmosférico inactivan la papaína en solución. Se ha demostrado la

presencia de inhibidores "bioquímicos" en las harinas de soya y de trigo.

La papaína seca con 5-10 % de humedad, es bastante estable.

2.2.3.7. ACTIVACIÓN DE LA PAPAÍNA

El HCN ejerce un efecto activador en la acción proteolítica del látex de la

papaya. El H2S es también efectivo y se sugirió que este agente activante

funciona como coenzima.

Todos los activadores conocidos de la papaína son capaces de reducir los

enlaces disulfuro, la papaína es reversiblemente oxidada con agentes

oxidantes tales como l2, H202 y por exposición al aire la inactivación pudo

ser parcialmente revestida por adición de agentes reductores, se puede

decir que la activación de la papaína es el resultado de una reacción de

reducción.

26

Varios investigadores postularon que la papaína inactiva existía como

disulfuro (PaSSPa) y a la reducción como (PaSH) se hacía activo.

Las investigaciones hechas han demostrado sin embargo que la papaína

no era activada completamente por alguno de los agentes reductores

usuales. Análisis con a-Benzoil-L-Argininamida (BAA) como sustrato se

observaron efectos iónicos específicos marcados en la actividad de la

papaína, cuando la cisterna sola, era el agente activante, la combinación

de Verseno-L-etilendiamino Tetra acetato, con algún reductor simple

facilita la activación producida por este reactivo.

La combinación de la Cisteína y el Verseno dieron una actividad especifica

máxima.

Las observaciones demuestran que un agente reductor es requerido,

presumiblemente para la reducción de enlaces disulfuro a grupos Tiol libres

que son esenciales para la actividad.

Es importante enfatizar que aunque la papaína requiere activación, la

presencia continua del activador no es requerida, esto es la prueba más

conclusiva de que la Cisteína, HCN, etc. no funcionan como coenzimas.

2.2.3.8. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

a. PRECIPITACIÓN FRACCIONADA:

Con alguna sal como S04(NH4)2 la diálisis y la precipitación de más

proteínas mediante calentamiento moderado con algún ácido o con

concentración moderada de alcohol o acetona.

27

POR ADSORCIÓN:

Con sustancias inorgánicas como los hidróxidos férr ico y alumínico

coloidales.

PRECIPITACIÓN DEL EXTRACTO:

Del látex de papaya (papaína cruda) con cloruro de sodio, por

centrifugación en forma directa, seguido por la afinidad cromatográfica del

precipitado redisuelto, para su posterior obtención en polvo.

2.2.3.9. USOS Y APLICACIONES

a. ALIMENTOS:

Se le emplea para ablandar las carnes duras y con este fin se le mezcla

con la sal y demás sazonadores, con este mismo fin se le usa en

inyecciones para colocárseles a los animales vivos antes del sacrificio: Por

su propiedad digestiva puede usarse en recetas de dietas fácilmente

digestibles. Se usa también para reducir la viscosidad de la clara del huevo

y así helarla sin que gelatinice. Los hidrolizados ("lisados") de proteínas

han sido muy utilizados en la práctica médica como reconstituyentes, a la

que esporádicamente retornan de tanto en tanto. Actualmente se

acrecienta su aplicación como aditivos alimentarios, pero si bien en algunos

casos suelen utilizarse enzirnas proteolíticas en su preparación, es mucho

más común que se apele a la hidrólisis clorhídrica. Naturalmente que así se

destruyen algunos aminoácidos (tirosina y especialmente triptofano), por lo

que en los hidrolizados destinados a uso terapéutico o a la elaboración de

peptona (triptona) para ,ensayo microbiológicos se recurre a la hidrólisis

enzimática.

28

b. INDUSTRIA CERVECERA:

Aplicada cuando la malta está hirviendo, impide que en la cerveza se forme

una bruma cuando esté puesta en refrigeración. Las proteínas de alto peso

molecular que se disuelven primero en la cerveza en presencia de oxígeno

forman compuestos insolubles y la papaína hace que estas se

descompongan en unidades más pequeñas, fácilmente solubles y que no

precipiten.

c. INDUSTRIA DE CUEROS:

Otro proceso industrial importante en el que se emplean enzimas

proteolíticas es la manufactura de cueros, ya sea en la etapa previa de

depilación de la piel, como en la posterior del ,."batido", cuyo objetivo es

preparar el cuero para el teñido y que consiste en la remoción de restos de

pelos, glándulas, células epiteliales y tejidos superficiales no separados por

los tratamientos previos. En este caso la más utilizada es la pancreatina,

proteasa de origen animal, pero también se ha ensayado el uso de

papaína,

d. LAVANDERÍA:

Es un detergente blanqueador, además ayuda a preservar la ropa de la

grasa y suciedad.

e. EN MEDICINA:

Apoya la digestión enzimática. El amplio sector de pH en que la papaína

desarrolla su actividad proteolítica ha de considerarse como ventaja,

digiere proteínas provenientes de los alimentos.

f. EN LECHERIA:

Como agente de maduración de quesos.

29

f. EN FOTOGRAFÍA:

Para l a separación de la plata de las películas fotográficas.

g. EN LA INDUSTRIA TEXTIL :

En e l desgomado de la seda y el tratamiento de lanas. Para eliminar el

apresto de la seda, el acetato, cuando aquél está hecho a base de gelatina

o caseína.

h. EN FARMACOPEA :

En los polvos dentífricos, como sustituto de la pepsina diferenciándose de

asta por ser activa en estado neutro o alcalino, por lo que está muy

difundida en terapéutica. La papaína pura se usa como vermífugo

destruyendo los parásitos intestinales al desintegrar su cutícula

queratinosa, que los protege de la acción de los jugos digestivos. Es así

como destruye los oxiuros, áscaris, tricocéfalos y anquilostomas de la

familia de los nematodos.

i. OTROS:

Es usada también como antihelmíntico, , en la industria del tabaco,

bacteriología, cosmetología, radiología, etc.

2.2.4. MATERIAS PRIMAS PARA LA HIDRÓLISIS

a. PROTEÍNAS

Cuando se solubilizan son de dimensiones coloidales tienen propiedades

anfotéricas, su hidrólisis completa produce una mezcla de aminoácidos.

Por su función biológica, se las conoce con el nombre de biopolímeros.

Debido a que están constituidas por aminoácidos, las proteínas desarrollan

una carga neta que depende de la

30

influencia de los diferentes grupos R ionizables y del pH al que se

encuentren:

Es decir, pueden tener una carga positiva y negativa o bien no tener

carga cuando se llega a su punto isoeléctrico

b. AMINOÁCIDOS

Son los monómeros y los principales constituyentes de las proteínas

por lo que su distribución y concentración determinan

fundamentalmente las propiedades de cada proteína. Exceptuando

la hidroxiprolina y la prolina, que son consideradas como a-

iminoácidos, los demás aminoácidos son ácidos a-amino carboxílicos

con carácter anfotérico debido a la presencia de los grupos amino y

carboxilo. Son a-aminoácidos porque los grupos carboxilo y amino se

encuentran en el carbono a de la molécula mientras que en los a-

iminoácidos el nitrógeno del grupo amino interacciona de tal manera

que se forma un anillo heterocíclico de cinco miembros. Con

excepción de la glicina que tiene un átomo de hidrógeno como

radical R, todos los a-aminoácidos presentan un carbono asimétrico

y por lo tanto existen en dos formas ópticamente activas: D y L

isómeros. De acuerdo con la estructura química del gliceraldehído,

los aminoácidos que se encuentran en la naturaleza, y que tienen

actividad biológica son los de configuración L. Las de la serie D se

encuentran en las mezclas racémicas de aminoácidos producidos a

través de distintos procesos químicos y no son aprovechados por el

organismo humano en la síntesis de proteínas, sino que en la

mayoría de los casos sirven únicamente como fuente deenergía.

31

R R

│ │NH2--------------------C-------COOH HOOC ------C-------NH2

│ │

N H

L- Aminoácido D- Aminoácido

FIGURA 2.3. Isómeros de los a-aminoácidos

c. PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS

Solubilidad. Dependen en gran parte del pH, el efecto del medio ácido o

alcalino determinan que el aminoácido esté presente en forma

predominante positiva o negativa, la cual favorece la solubilidad, también

se aumenta ésta subiendo la fuerza iónica de la solución, aunque, cuando

es excesivo el aumento los aminoácidos tienden a precipitarse.

Absorción de Luz Ultravioleta. Los aminoácidos con radicales cíclicos

como la tirosina, absorben luz ultravioleta, con máximo de absorción a 275

milimicras, hecho que permite hacer análisis de proteínas, basándose en

que estos aminoácidos constituyen un índice de la proteína total en vista de

estar presentes de modo constante en las proteínas.

32

Actividad óptica. Los aminoácidos son ópticamente activos y algunos de

ellos desvían la luz polarizada hacia la derecha y otros hacia la izquierda.

Las propiedades químicas más importantes son: Reacción con ácido

nitroso, Titulación con formol, N-arilación, Reacción de la ninhidrina.

2.2.4.1. LA CARNE FUENTE DE

PROTEÍNAS

De acuerdo con su función las proteínas de origen animal se han dividido

en proteínas contráctiles (miofibrilares), sarcoplásmicas y de tejido

conectivo o estroma; el porcentaje de cada fracción depende de la especie

animal que se trate. Por ejemplo, en el ganado vacuno se obtiene una

distribución de aproximadamente 50%, 35% y 15% respectivamente, las

proteínas solubles de los tejidos animales son las miofibrilares y las

sarcoplásmicas, mientras que las del tejido conectivo son muy insolubles,

las principales características de las proteínas solubles son su poder

emulsionante y su capacidad de absorción de agua, por la que evitan

pérdidas de humedad durante el proceso de cocción de los cárnicos y sus

derivados, además tienen la capacidad de coagular formando geles de una

textura que es desecada en varios alimentos.

La carne es uno de los alimentos más ricos en nutrientes y fuente excelente

de proteínas de alto valor biológico, de vitaminas de complejo B y de

sustancias minerales, particularmente hierro.

El valor biológico puede reducirse si la carne contiene cantidades

importantes de tejido conectivo, ya que este, prácticamente no contiene

metionina y tr iptófano.

2.2.4.2. LA CARNE DE ALPACA (Lama pacos).

La carne de alpaca se caracteriza por su bajo nivel de grasa

33

intramuscular y un contenido de minerales, aminoácidos y ácidos grasos

comparables a los encontrados en carne de vacuno y ovino. Sin embargo,

la carne de alpaca muestra un cociente de ácidos grasos n-6/n-3 más

favorable que el de la carne de vacuno u ovino y una baja concentración de

vitamina E. La caracterización de la carne de alpaca en lo que respecta a

los parámetros que determinan su calidad tecnológica también ha sido

reforzada con el presente trabajo. La nueva información aportada por este

estudio ha sido la determinación de los parámetros del color (CIELab) y el

contenido en mioglobina. En relación a los valores de pH, dureza y CRA

fueron coincidentes con los encontrados por otros autores en carne de

alpaca, y en su defecto en carne de otros camélidos u ovinos, de similar

tamaño y/o edad de sacrificio. (Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ

2009)

2.2.4.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA Y VALOR NUTRITIVO DE

LA

CARNE DE ALPACA

La materia prima principal para la investigación presente es la carne de

alpaca. La importancia de este animal radica en su carne, su fibra y su piel.

En la producción de carne se puede estimar que una alpaca pesa unos 50

kg obteniéndose un promedio de carne de unos 25 kg aproximadamente.

Las cualidades de este producto son excelentes: muy magro, alto contenido

proteico, gran suavidad y apta para ser consumida en fresco, seca o

preparada en embutidos.

COMPONENTES QUÍMICOS DE LA CARNE

- Agua

Es el componente de mayor cantidad, variable entre límites muy ostensibles

según la edad y principalmente el estado de nutrición.

La carne físicamente tiene estado sólido, pero presenta la propiedad de

34

tixotropía, esto es que las propiedades sólidas de la estructura desaparecen

con la destrucción de las uniones celulares por trituración fina, la carne

entonces fluye como un líquido viscoso. Este hecho se aprovecha en la

industria, en el relleno de tripas para la fabricación de embutidos.

La anexión de algunas sales, como cloruro de sodio, aumenta la capacidad

fijadora de agua por parte de la carne, ya que se forman enlaces entre el

agua y los iones disueltos. Este hecho es aprovechado para la fabricación

de embutidos escaldados.

-Proteína

Es el componente más importante de la carne, que entra en constitución de

todas las partes del cuerpo y en todas las sustancias que regulan las

funciones del organismo.

La proteína de la carne esta constituida por varias cadenas de aminoácidos,

los cuales se clasifican de acuerdo a su importancia en la nutrición humana

en aminoácidos esenciales, por lo que el valor biológico de las proteínas es

muy alto, solo superado por la leche y los huevos.

-Grasa

Se distinguen tres tipos de grasa: la extracelular, intermuscular e

intramuscular. En el primer grupo se encuentra el tejido adiposo localizado

debajo de la piel y los demás depósitos de grasa del organismo. La grasa

muscular es de constitución constante y específica y su composición

depende de la alimentación.

-Minerales

Los minerales en la carne se encuentran distribuidos irregularmente entre el

jugo muscular, los compuestos celulares y el resto de líquidos

extracelulares. La carne y órganos son buena fuente de potasio y fósforo,

contienen cantidades moderadas de sodio y magnesio, y cantidades bajas

de calcio. También contienen microelementos como: zinc, hierro,

35

manganeso, yodo, flúor, cobalto, estroncio y selenio.

-Carbohidratos

Los carbohidratos contenidos en la carne tienen un rol específico en cuanto

a la acidez y conservación de la carne pero desde el punto de vista nutritivo

carece de importancia.

-Vitaminas

En comparación con los vegetales y las frutas la carne posee poco

contenido en vitaminas.

Las carnes ricas contienen vitaminas liposolubles (A, D y algo de E). Las

carnes no presentan vitamina C.

-Enzimas

Las enzimas son de gran importancia en los procesos de transformación de

las sustancias nutritivas, fundamentales para los fenómenos post morte que

sufre la carne.

COMPONENTES ORGANOLÉPTICAS DE LA CARNE

Los factores que influyen en las características organolépticas son la

especie, edad, tipo de alimentación, actividad del animal y la forma de

beneficio.

-Olor y sabor

El aroma es una sensación compleja que influye en el olor, sabor, textura,

temperatura y pH; de estos los más importantes son el olor y sabor.

Algunas características determinantes del aroma son de naturaleza

hereditaria. Otro factor es el estado bioquímico de los músculos, cuanto

más elevado es el pH final menor es su aroma. La duración y temperatura

36

de cocción influyen en la naturaleza e intensidad de olor y sabor de la

carne; la cocción prolongada determina una intensa degradación de la

proteína y una disminución del aroma.

La presencia de testosterona en machos adultos tiene mucha influencia en

este sentido.

-Color

El aspecto que ofrece la superficie de la carne al consumidor no solo

depende de la cantidad de mioglobina presente, sino también del estado

químico y físico de otros componentes, entre ellos la hemoglobina.

El color normal de la carne es rojo cereza claro que estará dado por la

presencia de pigmentos como hemoglobina (sangre) y mioglobina

(músculo).

Este color puede variar por factores intrínsecos como la cantidad, estado

químico, especie, raza, edad y alimentación; y por factores extrínsecos

como grado de desangrado de la carne, grado de conservación, tipo de

transformación, contaminación, descanso, ayuno, condiciones de beneficio

y estado patológico.

-Textura

La textura es más basta al aumentar el animal de edad, y en los músculos

de los animales machos el tejido es más duro que en las hembras.

COMPARACIÓN ENTRE COMPOSICIONES QUÍMICAS DE DISTINTAS

CARNES

Cuadro N° 1: Comparación entre distintas carnes

EESPECIE HHumedad (gr/100 gr de muestra original)

PProteína (gr/100 gr de muestra original) (Factor: 6,25)

GGrasa (gr/100 gr de muestra original)

AALPACA 68,0 24,2 6,6

37

LLlama 69,2 24,8 3,7

VVacuno 66,0 17,5 22,0

OOvino 72,2 18,9 6,5

PPorcino 42,0 14,5 37,3

PPollo 72,1 18,3 9,3

CCuy 70,6 20,3 7,8

(Fuente: Análisis en el Instituto de Certificación, Inspección y Ensayos de

La Molina, Lima)

La carne de alpaca se caracteriza por ser un alimento apto para el

consumo. Además posee características similares con respecto a otras

carnes rojas. Es una carne de color rojo purpúreo, suave en animales

jóvenes, consistentes y fibrosos al contacto. La carne de los camélidos tiene

mayor nivel proteico en relación a otras especies. La carne de llama y

alpaca no presenta un nivel suficiente de carbohidratos, pero ese déficit se

ve compensado por la grasa animal. Con respecto a esta grasa diferentes

científicos

(Garnica, 1985), han medido el colesterol sérico en alpacas, encontrando

que en cada 100 ml de suero sanguíneo hay entre 20,43 mg a 52,22 mg de

colesterol. Estas cantidades son muy inferiores si las comparamos con las

de ovino y vacuno que van de 200 mg a 300 mg/100 ml.

Las carnes de los camélidos andinos nos proporcionan apreciables

cantidades de vitaminas del complejo B, algo de vitamina A y las restantes

solo en las vísceras. En el charqui de llama o alpaca, que es la forma como

ha sido aceptada mayormente, si fue curada al sol pierde parte de vitamina

A, pero si se enriquece en la vitamina D.

En cuanto a la chalona de alpaca comparada con la de ovino, obtenemos

los siguientes resultados:

- Chalona de alpaca: 57.7 % proteína, 3.6 % grasa.

38

- Chalona de cordero: 50.3 % proteína, 11.7 % grasa.

Con estos análisis se deduce que la carne de alpaca debido al manejo del

animal es ecológica, nutritiva y sana.

(ING: ARANTXA URSÚA ANDRÉS (e)k “ PROYECTO DE PLANTA DE

EMBUTIDOS Y CHALONA, CON CARNE DE ALPACA, EN PILPICHACA,

PERÚ” 2004 Universidad Pública de Navarra)

El conocimiento de la composición química de la carne de alpaca es

importante para el entendimiento de su valor nutritivo, así como también

para interpretar su calidad sensorial y aptitud para el tratamiento industrial.

En la bibliografía internacional solo se ha encontrado un estudio sobre los

componentes mayoritarios de la carne de alpaca (en músculo L. dorsi)

realizado por Cristofanelli et al. (2004) con animales de 25 meses criados

de forma tradicional en Perú. En dicho estudio se manifiesta que la carne de

alpaca es baja en grasa y presenta un contenido de proteínas elevado con

respecto a carne de rumiantes más convencionales y de cerdo. Además

estos autores han observado una composición similar entre carne de alpaca

y llama, a excepción de las cenizas que son mayores para el caso de la

alpaca. Adicionalmente se puede observar la composición química de la

carne proveniente de la pierna (sin considerar la grasa subcutánea) de

alpaca, cerdo y cordero, donde resalta el bajo contenido graso de la carne

de alpaca y mayor contenido de proteínas, con respecto a la carne de las

otras especies. En el estudio de Cristofanelli et al. (2004), anteriormente

mencionado, también se determinó el contenido en colesterol de la carne

(L. dorsi) de las alpacas y las llamas, obteniendo valores de 51 mg/100 g

para las alpacas y de 56 mg/100 g para las llamas. Coates y Ayerza (2004),

también estudiaron en Llamas argentinas el contenido de colesterol en el

músculo L. dorsi y grasa renal, encontrando valores en torno a 52 mg/100g

en el músculo y 93 mg/100g en la grasa renal, estableciendo así la

diferencia en el contenido de colesterol entre ambos tejidos (graso y

muscular), lo que podría ser extrapolable a la alpaca. Los valores de

colesterol de la carne de alpaca y llama (músculo L. dorsi) son al menos

39

10-30 mg/100g inferiores que los valores encontrados en la carne (músculo

L. dorsi) de vacuno u ovino (Badiani et al., 1998; USDA, 2008;) y porcino

(USDA, 2008); sin embargo, tiene valores similares a los encontrados en

pechuga de pollo y pavo sin piel (Chizzolini et al., 1999; USDA, 2008).

En cuanto al perfil de ácidos grasos de la carne de alpaca, no se han

encontrado en la bibliografía trabajos previos al respecto; sin embargo, se

tienen referencias de estudios en carne de llama – animal que presenta

similitudes con la alpaca en cuanto a que también es un camélido

sudamericano y que se cría extensivamente compartiendo lugares de

pastoreo con las alpacas – realizados por Coates y Ayerza (2004) y Polidori

et al. (2007b). Estos autores determinaron el perfil de ácidos grasos en el

músculo Longissi us thoracis y lumborum de llamas argentinas (5-8

años de edad) y peruanas (2 años) y encontraron un porcentaje de ácidos

grasos saturados sobre ácidos grasos totales entre 46 y 50%, de ácidos

grasos monoinsaturados Introducción: Carne de alpaca 17 entre 38 y

42% y de poliinsaturados entre 4,5-7,2%. De acuerdo a esos autores, en

términos generales, la composición de ácidos grasos de la carne de llama

puede ser comparada con datos obtenidos en experimentos previos sobre

vacuno y cordero (Chan, 2004), aunque la carne de llama presentó mayores

cantidades de ácidos grasos poliinsaturados que los hallados en la carne de

dichos rumiantes (4,3 – 5,0 % del total de ácidos grasos). Se puede

observar que los ácidos grasos mayoritarios de la carne de llama fueron el

ácido oleico (C18:1 cis), seguido del palmítico (C16:0) y esteárico (C18:0).

También es importante mencionar que, debido a que el sistema de

explotación de las llamas se basa en el pastoreo, su carne tiene un

contenido importante de ácido linolénico C18:3 n-3 (en torno al 1%),

comparado con los valores promedios encontrados en carne de vacuno y

ovino, aunque similar al hallado en vacunos jóvenes que pastan (Enser et

al., 1998). El contenido en minerales de la carne de alpaca (en el músculo

L. thoracis) ha sido determinado por Polidori et al. (2007a). Estos autores

analizaron la carne de 20 llamas y 30 alpacas machos criadas en Perú y

sacrificadas a los 25 meses de edad. A partir de los resultados se concluye

que los contenidos minerales de la carne de alpaca y llama son

40

comparables al de otras carnes. El contenido aminoacídico de la carne de

alpaca no ha sido encontrado en las referencias bibliográficas revisadas. No

obstante, Bustinza et al. (1993) estudiaron la calidad nutritiva de la

proteína de la carne de alpaca en experimentos con animales de

laboratorio, determinando el índice de digestibilidad (D), el valor biológico

(VB), la utilización neta de proteína (UNP) y la conversión y eficiencia

alimenticia. Las muestras de carne consistieron en una mezcla por partes

iguales de carne de cuello, brazuelo, costillar, lomo y pierna de seis alpacas

Huacaya procedentes del departamento de Puno (Perú). También se

observan los resultados obtenidos en esos ensayos, realizados sobre carne

de alpaca cruda y carne hervida en agua a 100 ºC durante 45 minutos.

Comparando dichos resultados con los obtenidos en carne de vacuno

(Organización para la Agricultura y la Alimentación FAO, 1981), estos

autores afirman que en términos generales, la carne de alpaca tiene

aproximadamente un 10% más de valor biológico, menos de un 10% de

digestibilidad y un UNP similar. Finalmente, en cuanto al contenido de

vitaminas no se han reportado estudios en carne de alpaca.

(Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ 2009)

a. PROTEÍNAS DE LA CARNE

PROTEÍNAS MIOFIBRILARES

Estas proteínas representan, aproximadamente la mitad de todas las

proteínas del músculo y sus componentes más importantes son: La miosina

y la actina, que constituyen a su vez, el 50% y 25% respectivamente, de las

proteínas miofibrilares.

Se caracterizan porque son insolubles en agua y en soluciones salinas muy

diluidas, consiguiéndose su solubilización con soluciones salinas más

concentradas y a pH superiores a 5,5. La miosina es una proteína fibrosa

de estructura helicoidal cuyo peso molecular es del orden de 500,000 la

miosina es rica en glutámico y lisina.

Una caracterización bioquímica especial de la miosina es que cataliza la

hidrólisis de la unión fosfato terminal del ATP, transformando la energía

liberada en trabajo mecánico.

La actina se puede encontrar como actina globular (G-act¡na) y como actina

41

fibrosa (F-actina), la G-actina tiene un peso molecular de aproximadamente

50000 contiene unos 450 aminoácidos. La F-actina es un polímero

consistente en una doble hélice de monómeros de G-actina, en número de

500 a 600 y su peso molecular de muchos millones. La molécula de la

actina es mucho más simple que la miosina y, como otras proteínas

musculares fibrosas, es rica en aminoácidos dicarboxílicos.

Se han aislado cantidades relativamente pequeñas de otras proteínas que

están asociadas a las miofibrillas, entre ellas, Tropomiosinas, Troponinas

y Actininas. Estas proteínas están íntimamente asociadas a los filamentos

de actina y miosina de la contracción-relajación muscular.

42

PROTEÍNAS SARCOPLÁSMICAS:

Las proteínas sarcoplásmicas, también denominadas miogeno, son muy

numerosas y complejas. Principalmente están constituidas por los

sistemas enzimáticos del metabolismo celular.

Representan aproximadamente el 35% de las proteínas musculares y

están constituidos en su mayor parte por albúminas y globulinas. Estas

proteínas se caracterizan porque son solubles en agua y en soluciones

salinas diluidas, en especial el pigmento respiratorio mioglobina que es

responsable del color de la carne.

PROTEÍNAS DEL ESTROMA:

Las proteínas del estroma representan la fracción proteica insoluble de

las proteínas del tejido conectivo y se distribuyen ampliamente por todo el

organismo animal, formando parte del esqueleto y de la estructura de

órganos, tendones y nervios.

El principal componente es el colágeno y en menor proporción, elastina y

reticulina. Estas proteínas son las responsables más directas de la dureza

de la carne.

El colágeno es la proteína más abundante del organismo animal, su

composición en aminoácidos, parece ser muy similar en la mayoría de las

especies de los mamíferos.

El colágeno es muy resistente a la acción hidrolítica de los enzimas del

tubo digestivo.

b. AMINOÁCIDOS DE LA CARNE

45

C. ESTRUCTURA DE LOS AMINOÁCIDOS

47

FUENTE: M. EN C. ISRAEL VELÁZQUEZ MARTÍNEZ

48

D. VITAMINAS DE LAS CARNES

CUADRO 2.5VITAMINA FUENTES

VITAMINA A

Antixeroftálmica

Trazas

VITAMINA B,

Tiamina

En los tejidos animales abunda, más en la carne de cerdo, y en

distintas visceras.

VITAMINA B2

Riboflavina

Carne magra.

Acido Nicotinico Carne de res y cerdo.

Acido

Pantoténico

Carne de res, de cerdo y de aves.

BiotinaLa función más importante en la que participa, aunque el mecanismo

exacto se desconoce, es la de fijación del C02.

Acido Fólico Existe en las visceras de los vacunos y porcinos. Se destruye

parcialmente con la cocción al preparar los alimentos.

VITAMINA B6

Piridoxina

Son fuentes útiles las visceras y las carnes de res y pescado.

VITAMINA B12

Cobalamina

En general, la cantidad de vitamina Cobalamina en los alimentos es

baja; las fuentes más ricas son las visceras, sobre todo el riñon y el

hígado.

VITAMINA C Tejidos animales; en la leche de vaca,

VITAMINA D Las fuentes dietéticas de la vitamina más ricas son los hígados y las

visceras de los peces y de otros animales.

49

e. CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE SEGÚN INDECOPI

La presente Norma Técnica establece los requisitos generales que

deben cumplir las carnes para el consumo humano. (Ver Anexo 1)

También existe el Reglamento Tecnológico de Carnes (Decreto

Supremo N° 22-95-AG), el mismo que consta de Ciento Tres

Artículos, Once Títulos, Cuatro Disposiciones Complementarias,

Tres Disposiciones Transitorias y Doce Anexos.

Este Reglamento norma el beneficio de ganado, el proceso de

industrialización y comercialización de las carnes y menudencias

de los animales de abasto, así como las apropiadas condiciones

Técnico - sanitarias de los establecimientos y de otros medios

empleados para tal fin, en provecho del consumidor.

El SENASA (Servicio Nacional de Sanidad Agraria), es el organismo

encargado de hacer cumplir este reglamento.

50

TABLA 2.3.

COMPOSICIÓN EN AMINOÁCIDOS DE LAS CARNES FRESCAS, EN

PORCENTAJE DE LA PROTEINA BRUTA

AMINOÁCIDO CLASE CARNE DE

VACUNO

CARNE DE

CERDO

CARNE DE

CORDERO

Isoleucina Esencial 5,1 4,9 4,8

Leucina Esencial 8,4 7,5 7,4

Lisina Esencial 8,4 7,8 7,6

Metionina Esencial 2,3 2,5 2,3

Cistina Esencial 1,4 1,3 1,3

Fenilalanina Esencial 4,0 4,1 3,9

Treonina Esencial 4,0 5,1 4,9

Triptófano Esencial 1,1 1,4 1,3

Valina Esencial 5,7 5,0 5,0

Arginina Esencial para niño 6,6 6,4 6,9

Histidina

Esencial para niño 2,9 3,2 2,7

Alanina No esencial 6,4 6,3 6,3

Acido aspártico No esencial 8,8 8,9 8,5

Acido glutámico No esencial 14,4 14,5 14,4

Glicina No esencial 7,1 6,1 6,7

Prolina No esencial 5,4 4,6 4,8

Serina No esencial 3,8 4,0 3,9

Tirosina No esencial 3,2 3,0 3,2

FUENTE : SCHWEIGERT y PAYNE, 1956.

51

TABLA 2.3.1.

CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS EN CARNE DE ALPACA COMPARADA CON LA CARNE DE CORDERO Y CAMELLO (Expresados en porcentaje respecto al total de aminoácidos)

MAGRO DE CORDERO USDA (2008)

MAGRO DE

CAMELLO Kadim

et al. (2008)

LT de ALPACA

Äcido glutámico 15,52 16,91 16,61

Äcido aspártico 9,41 9,09 12,06

Isoleucina+ Leucina 13,48 13,64 11,40

Lisina 9,44 8,45 11,05

Histidina + Treonina 7,96 8,73 7,63

Alanina 6,43 6,25 7,30

Arginina 6,35 7,38 6,90

Glicina 5,22 5,95 5,97

Fenilalanina + Triptófano 5,60 4,84 5,17

Serina 3,98 3,63 4,76

Valina 5,77 5,16 3,33

Prolina 4,49 5,39 3,27

Tirosina 3,60 3,23 2,36

Metionina 2,75 2,41 2,19

FUENTE : Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ“CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE Y CHARQUI DE ALPACA (Vicugna pacos)”

52

TABLA 2.4. CONTENIDO DE VITAMINAS DE DIVERSAS CARNES CRUDAS

VITAMINA(unidades/100 g

de carne cruda)

CARNE

VACUNACARNE DE

TERNERA

CARNE DE

CERDO"

BACON CARNE DE CORDERO

HÍGADO

(bovino)

A(U.I.) trazas trazas trazas Trazas trazas 20.000

B1 (tiamina) (mg) 0'7 0'10 1'0 0'40 0'15 0'30

B2 (riboflavina) (mg) 0'20 0'25 0'20 0'15 0'25 3'0

Acido nicotínico(mg) 5 7 5 1'5 5 13

Acido pantoténico(mg) 0'4 0'6 0'6 0'3 0'5 8

Biotina (/^g) 3 5 4 7 3 100

Acido fólico( jUg) 10 5 3 0 3 300

B6 (mg) 0'3 0'3 0'5 0'3 0'4 0'7

B12 ( j U g ) 2 0 2 0 2 50

C (ácido ascórbico)

(mg)

0 0 0 0 0 30

D(U.I.) trazas trazas trazas Trazas trazas 45

FUENTE : Mc.CANCE Y Widdowson

53

TABLA 2.4.1CONTENIDOS DE LOS ELEMENTOS MINERALES EN CARNE DE ALPACA (EXPRESADOS EN MG/100G).

Base húmeda (n=20) Base seca (n=20)

Promedio ± SD

Rango Promedio ± SD Rango

Rango

K 419,40 ± 47,85

325,95 485,29

1495,24 ± 128,42 1248,30 - 1711,90

P 295,13 ± 30,09

226,59 341,18

1082,25 ± 91,96 910,38 - 1211,81

Na 88,41 ± 15,25 68,86 126,30

339,80 ± 52,56 266,48 - 443,57

Mg 33,85 ± 4,11 19,94 32,65

105,65 ± 10,94 80,10 - 119,53

Ca 10,72 ± 4,03 5,49 17,24 33,88 ± 13,76 19,72 - 70,00

Zn 4,41 ± 2,14 2,00 8,97 13,80 ± 6,04 8,10 - 31,51

Fe 2,69 ± 0,96 1,10 3,74 8,41 ± 2,90 4,31 - 14,11

Cu <0,10 - - - - -

Mn <0,025 - - - - -

FUENTE : Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ“CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE Y CHARQUI DE ALPACA (Vicugna pacos)”

2.3. HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS

La acción de los ácidos, álcalis o enzimas hidrolizan las proteínas. Sin

embargo, el método más utilizado para el estudio de la composición en

aminoácidos de las proteínas es la hidrólisis ácida. En este caso, se

somete la proteína a la acción

54

de una solución de ácido clorhídrico al 20.5% durante 17-20 horas a reflujo.

Se puede reducir este tiempo a 8-10 horas aumentando la temperatura

hasta 120°C. Con este tipo de hidrólisis no se provoca la racemización y,

por tanto, se obtiene una solución de L-aminoácidos. No obstante, se corre

el riesgo de que en tratamientos muy prolongados los ácidos minerales

descompongan al triptófano.

Se induce también la formación de ácidos aspártico y glutamico a partir de

asparagina y glutamina y, además, cabe que los aminoácidos sulfurados

experimenten cierta oxidación.

Por otro lado, la hidrólisis alcalina origina, en primer lugar, la

racemización de los aminoácidos y, debido a ello, los alimentos así

elaborados tienen un valor nutritivo menor. Para practicar esta hidrólisis

se suele utilizar una solución 6N de hidróxido de Sodio o de Bario. Este

método ocasiona la destrucción de la argínina y parcialmente de la Usina,

mientras que por el contrario, el triptófano permanece incólume.

Por último, también se logra la hidrólisis completa de las proteínas

mediante la aplicación de métodos basados en la acción de enzimas

proteolíticos. A diferencia de los métodos de hidrólisis acida ó alcalina,

estos no modifican los grupos funcionales de la proteína.

2.3.1. HIDRÓLISIS ENZIMATICADE

PROTEÍNAS

2.3.1.1. INTRODUCCIÓN

Los enzimas, catalizadores

55

biológicos de naturaleza proteica que regulan las muchas reacciones que

tiene lugar en los seres vivos, han sido utilizados desde la antigüedad en

algunos procedimientos alimentarios, si bien de forma empírica e indirecta

utilizando microorganismos enteros o extractos de tejidos vegetales o

animales.

La hidrólisis enzimática presenta indudables ventajas frente a la tradicional

hidrólisis química, acida o alcalina, entre las que cabe mencionar las

siguientes:

a. SELECTIVIDAD:

Las enzimas son específicas para un tipo determinado de enlace y, por

tanto, no es frecuente la aparición de productos de degradación.

b. CONDICIONES MODERADAS DE TEMPERATURA Y PH:

La hidrólisis enzimática transcurre a temperaturas próximas a la ambiente,

generalmente en el intervalo de 40° a 60°C, y pH comprendido entre 4-8.

c. NO SE AÑADEN SUSTANCIAS EXTRAÑAS:

Salvo la enzima.

d. SE MANTIENE EL VALOR NUTRITIVO:

Ya que no se produce degradación de los componentes separados.

56

2.3.1.2. FUNDAMENTO DE LA ACCIÓN ENZIMATICA

La acción catalítica de una enzima se produce por unión de la enzima

con las proteínas que van a reaccionar y que, en el lenguaje bioquímico, se

llaman sustratos, aunque generalmente, son moléculas mucho más

pequeñas que la de la enzima.

La unión se produce en un sitio preciso de la molécula proteica enzimática,

llamado sitio activo. La conformación de la enzima, en el sitio activo,

encaja perfectamente con las moléculas de proteína (sustrato) de modo

que las sitúa, orienta y activa

En el complejo enzima-sustrato (ES) ocurren varias cosas:

ENZIMA

FIGURA.2.4. Acople-enzima-sustrato en el sitio activo

57

1. La concentración (vecindad) de las substancias reaccionantes se

hace muy grande en el sitio activo de la enzima.

2. En los puntos de unión ES, las fuerzas de atracción activan las

moléculas reaccionantes, de tal manera que la energía Térmica

de activación se hace innecesaria o se reduce mucho.

3. En el lugar de la reacción se produce una fuerte disminución de la entropía

(mayor concentración, mayor ordenación, mayor orientación de las

moléculas). Por estas tres razones, las reacciones enzimáticas transcurren

con velocidades altas, a bajas concentraciones y temperaturas bajas, ya

que las moléculas que reaccionan son activadas en un punto con

proximidad y la orientación adecuada y, allí, son activadas.

La reacción enzimática transcurren en tres fases.

E + S ES EP E + P

Siendo el paso ES EP el que exige mayor activación.

58

FIGURA. 2.5. Coordenadas de reacción para una reacción catalizada por

un enzima en comparación con otra no catalizada.

Donde:

1. Energía de Estabilización de E+S -------------► ES

2. Energía de activación de ES

3. Energía desprendida ES —► EP

4. Energía desprendida EP —► E + P

5. Energía desprendida en la reacción enzimática

E + S ---------------------► E + P

6. Energía de activación de la reacción no enzimática.

60

2.3.1.4. PARÁMETROS

a. VARIABLES INDEPENDIENTES

- CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA

La unidad usual de actividad enzimática es la cantidad de enzima que

cataliza la transformación de 1 mol de sustancia por minuto en

condiciones preestablecidas. Sin embargo, por lo que respecta a los

enzimas alimentarios comerciales, las unidades de actividad no se

ajustan necesariamente a la definición citada, la mayoría de los

enzimas utilizados en los sistemas alimentarios no son puros y no es

posible medir la cantidad de proteína enzimáticamente activa

responsable de la transformación del sustrato.

- pH

En general, los enzimas son activos en un rango limitado de pH.

Usualmente cada enzima tiene un pH óptimo porque, al igual que otras

proteínas, los enzimas poseen muchos grupos ionizables de forma que

los cambios de pH pueden alterar su conformación, su capacidad de

unión con el sustrato y la actividad catalítica de los grupos que forman

el centro activo. Los efectos pueden deberse a un cambio en la

velocidad de reacción máxima (Vmax.). Un cambio en la afinidad del

enzima por el sustrato (Km) o una alteración en la estabilidad del

enzima. La estabilidad depende del tiempo que el enzima haya sido

mantenido a un pH desfavorable. De forma similar, los grupos

ionizables del sustrato pueden verse afectados por el pH, lo que puede

ser importante a la hora de formar el complejo enzima-sustrato. En

general todos estos efectos tienen lugar simultáneamente, aunque

también se pueden producir de forma aislada.

Cuando se observa una gran amplitud del rango de pH óptimo, por

ejemplo, en la invertasa, se debe usualmente a que el sustrato no

61

puede ionizarse. En muchas reacciones enzimáticas industriales el pH

no es constante sino que cambia a lo largo de la reacción,

dependiendo de la capacidad tamponante de los sustratos y los

productos implicados. El pH también afecta a la estabilidad del enzima

de forma que el pH óptimo de trabajo se calcula estableciendo un

compromiso entre los efectos en la actividad y estabilidad del enzima.

(Ver 2.2.3.4.)

- TIEMPO

(Ver 3.6.)

b. VARIABLE CONTROLABLE

- TEMPERATURA

Cabe señalar que en los puntos de unión enzima-sustrato (ES), las

fuerzas de atracción activan las moléculas reaccionantes, de tal modo

que la energía térmica de activación se reduce mucho, además se

produce una fuerte disminución de la entropía.

Estas son unas de las razones, por las cuales las reacciones

enzimáticas, transcurren con velocidades altas, a bajas

concentraciones y temperaturas bajas. Esto trae como consecuencia la

utilización de condiciones moderadas de temperatura: la hidrólisis

enzimática transcurre a temperaturas próximas a la ambiente.

62

c. VARIABLE DEPENDIENTE (VARIABLE RESPUESTA)

- GRADO DE HIDRÓLISIS

El grado de hidrólisis tiene importancia científica y tecnológica y viene a ser la

formación de productos, en presencia de la enzima, con concentraciones y

condiciones adecuadas y definidas.

2.3.1.5. EQUIPOS

Un reactor enzimático es, básicamente, el recipiente en el cual se lleva a cabo

una reacción catalizada por enzimas o células libres o inmovilizadas, junto con los

mezcladores, equipos de toma de muestra y aparatos de control. El papel que

cumple el reactor es el de obtener un producto específico a una velocidad dada a

partir de unos reactantes concretos y con un costo mínimo. Los reactores

enzimáticos se diferencian de los reactores químicos en que trabajan a

temperaturas y presiones bajas y comparativamente consumen o generan poca

energía durante la reacción. Se diferencian de los fermentadores en que no se

comportan de una forma autocatalítica, ya que en estos últimos las células en

crecimiento se están regenerando continuamente por sí mismas. Al igual que con

los reactores químicos, los reactores enzimáticos se valoran en función de su

productividad y especificidad.

Los reactores se clasifican en homogéneos y heterogéneos, en función de que su

contenido sea homogéneo, con una sola fase, o heterogéneo, si coexisten varias

fases. En los reactores heterogéneos frecuentemente hay un sustrato líquido

continuo y un sólido discontinuo inmovilizado que es la fase catalítica. Los

reactores también se pueden clasificar en función de que la reacción se produzca

de forma continua o discontinua o como reactores abiertos o cerrados, según que

el catalizador salga del reactor durante su uso o no. La clasificación más

importante es la que tiene en cuenta la extensión de la mezcla alcanzada dentro

del reactor, y así se habla idealmente de reactores de mezcla completa o de flujo

pistón. El perfil de concentración de los reactantes dentro de los reactores de

63

distintas formas varía apreciablemente. En los reactores de mezcla completa las

moléculas de reactante se mantienen en un estado de agitación constante,

mientras que en los reactores de flujo pistón los elementos de fluidos previos o

subsecuentes añadidos al reactor. Por tanto, en los reactores discontinuos de

mezcla completa la composición de los reactantes varía a lo largo de la reacción,

aunque permanece constante a través del reactor. En un reactor agitado

continuamente la composición del contenido del reactor del estado estacionario es

uniforme y no varía con el tiempo en ausencia de inactivación enzimática. En los

reactores de flujo pistón la composición de los reactantes es invariable con el

tiempo aunque varía a lo largo de la longitud del reactor. Los perfiles de

concentración pueden influir tanto en la actividad como en la estabilidad de los

enzimas inmovilizados; por ejemplo los inhibidores producidos endógenamente

son constantemente extraídos de los reactores continuos con objeto de no

alcanzar altas concentraciones que pueden resultar críticas. Por tanto, en los

reactores de flujo pistón el factor de eficacia es alto cerca del inicio de éste y

más bajo en la salida del reactor, debido a que la

concentración de sustrato disminuye a medida que los reactantes atraviesan el

reactor. En los reactores discontinuos, el factor de eficacia es uniforme en todo el

reactor. Sin embargo, en la práctica, a pesar del cuidado en el diseño y operación,

los reactores reales sólo se aproximan, en muchos casos estrechamente, a los

sistemas mezclados ideales. En particular, en las columnas empaquetadas el flujo

no ideal es un hecho habitual, especialmente en las que se utilizan a gran escala.

2.4. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN

2.4.1. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE

PROTEÍNAS

PRINCIPIOS VENTAJAS LIMITACIONES

64

ABSORCIÓN DEL ULTRAVIOLETA(280nm)

La mayoría de las proteínas

absorben en el UV a 280nm, debido

básicamente a grupos cromóforos

de tirosina y triptófano. Si

se considera que la cantidad de

estos dos aminoácidos es

siempre constante, la

absorvancia debe ser proporcional

a la concentración de proteína.

Es el método más rápi do;

requiere muy poca cantidad

de proteína. El sulfato de

amonio no interfiere,

mientras que en la

mayoría de los métodos si

existe inter ferencia. La

muestra no se destruye y

puede ser usada en

otros análisis.

Se puede hacer una co

rrección por presencia de

ácidos nucleicos, ya que

estos tienen absor ción

máxima a 260 nm. Si se

conoce la relación de

absorción de la pro teína a

280/260 nm es fácil

distinguir la interferencia

de ác.Nucleicos. Varía

la cantidad de

aromáticos entre

proteínas.

BIURET

Las sustancias que contienen dos

ó más enlaces peptídicos forman

un complejo púrpura violeta con

sales de cobre en soluciones

alcalinas. Es posi. ble que el color

se desarrolle por la formación de

un ion coordinado tetracúprico

con dos grupos -CO-NH-

adyacentes.

El más simple para medir

proteína total. Muy pocas

interferen cias de otros

compues tos en el desarrollo

de color.

Se requiere de 20-40mg de

proteína. Existen varios

pigmentos que absorben a

540 nm de longitud de onda.

La presencia de NH4 Ínter

fiere con la reacción. El

desarrollo de color es

diferente.

Interfieren lípidos y

carbohidratos por forma ción

de complejos con el ion

coordinado.

65

La intensidad de color es

determinada espectroscopica

mente a 540 nm con una curva

patrón.

LOWRY

Se basa en el desarrollo de un

color azul debido a: 1)Reacción de

Biuret. 2) Re ducción del reactivo

de fosfg molibdeno tungstato por

aminoácidos como tirosina y

triptófano presentes en las

proteínas. Este método ha sido

modificado muchas veces. La

absorbancia se mide a 750nm

(alta sensibilidad) o a 500nm

(baja sensibilidad) para

proteínas concentradas. Se

requiere de una curva patrón que

es recomendable hacer con la

misma proteína. La sens[ bilidad

es desde 0.2 ug. hasta 300 ug.

TURBIDIMETRICO

Las proteínas se pueden

precipitar con ác.Tricloroacé tico,

sulfosalicíl ico o ferro cianida

de potasio en ácido acético. Se

produce turbidez que puede ser

estandarizada a una temperatura,

concentra ción y tiempo de

reacción para medirse a 600 nm.

Se requiere de curva estándar. El

intervalo recomendado va de 0.5

a 1.5 mg de proteína.

KJELDAHL

Es el método más sensible,

100 veces más sensible que el

Biuret. Relativamente rápido (1

hora)

El método mas rápido

(10 - 15)

Requiere de muchos cuidados

en la estandarización ya que:

1) La intensidad de color varía

entre proteínas.

2) El color no es siempre

proporcional a la

concentración. Existe

interferencia de saca rosa,

lípidos, amort igua dores de

pH, monosacáridos y hexosar

-55 .3 que reacciona^ ce- es

reactivos de Lev. E sulfato de

arr.c" : es sulfihidros y ¡os

fos-'a tos también interf ieren

en la determinación.

Tiene muchas limita ciones

ya que no todas las proteínas

precipitan en una misma

forma. Otras sustancias como

los ác. nucleicos tarn bien

precipitan en presencia de

ácidos.

66

Determina nitrógeno total tanto

orgánico (nitrógeno ami no y

amido) como nitrógeno no

proteico (urea, aminoád dos,etc.)

El método consiste en la

digestión de la muestra con -

H2S04 y la formación de NH4OH

que es recibido en ác. para

finalmente titularlo con á lcaüs

de una concentración

Conocida.

DUMASMide nitrógeno total después

de la combustión de la

muestra (700-900°C). La

medición de nitrógeno

elemental desprendido se

hace volumétricamente en un

nitrómetro.

Es el método más común y por

lo tanto permite comparar fácil

mente resultados con otros

laboratorios. De termina todo

el con tenido de nitrógeno del

alimento. El nitrógeno no

proteico puede ser analizado

después de

Precipitar la proteína con acido

tricloro acético

Se puede hacer análisis hasta

diez minutos con los equipos

automatizados que existen en

el mercado

Puede haber pérdidas de

nitrógeno debido a la

temperatura de digestión y al

catan zador. El contenido de

nitrógeno en la proteína puede

variar considerablemente y

por lo tanto el factor usado

para convertir ni t rógeno

a Proteína. El nitrógeno no

proteico se debe

tomar en cuenta ya que éste

se mide junto con el

proteico. Se usan

reactivos y condiciones un

tanto peligrosas. El método

es largo.

Se requiere de equipo muy

costoso.

La presencia de hidrogeno no

proteico interviene en las

determinaciones

67

2.4.2. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS

a. MÉTODOS GRAVIMETRICOS:

Ocasionalmente algunos reactivos precipitan a un aminoácido de manera

específica y cuantitativa. Un caso bien conocido es el de la Determinación

de la arginina por medio de su precipitación en forma de flavianato

insoluble.

68

b. MÉTODOS COLORÍMETRICOS:

Hay reactivos que producen compuestos coloreados específicos con

determinados aminoácidos que pueden utilizarse con fines

cuantitativos.

En estas ocasiones es el radical R del aminoácido el responsable directo

de la reacción, entre los casos más conocidos se encuentran los

siguientes:

-Reacción de Millón

-Reacción de Xantoproteica

-Reacción de Hokins-Cole

-Reacción de Nitroprusiato

-Reacción de la Ninhidrina

- REACCIÓN DE LA NINHIDRINA

Es una de las reacciones del grupo a-amino más características y más

ampliamente utilizada, que puede utilizarse para valorar los aminoácidos

cuantitativamente en cantidades muy pequeñas.

La calefacción de un a-aminoácido con dos equivalentes de ninhidrina da

un producto intensamente coloreado. En la reacción con la ninhidrina

aparece un color azul con todos los aminoácidos y péptidos que poseen

grupos a-amino libres, mientras que la prolina y la hidroxiprolina, en

69

las que el grupo a-amino se haya sustituido, rinde derivados algo

diferentes que poseen un color amarillo característico.

El grupo a-amino de los aminoácidos al reaccionar con la ninhidrina se

oxida, para formar amoníaco, C02 y el aldehido (que se obtiene por

pérdida de un carbono del aminoácido original). En dicha reacción, un

equivalente de ninhidrina actúa como oxidante del aminoácido para

formar los productos mencionados.

α-Aminoácido Ninhidrina (hidrato de Tricetohidrindeno)

ninhidrina reducida

Un segundo equivalente de ninhidrina reacciona entonces con la

ninhidrina reducida y el NH3 que se forma elaborándose un producto muy

coloreado que tiene la siguiente estructura.

70

Ninhidrina oxidada Ninhidrina reducida

Producto Azul

Este compuesto coloreado (azul) que se forma, cuya intensidad es

proporcional a la concentración del aminoácido presente es muy

utilizado en la cuantificación de éstos. Este complejo de color azul,

tiene una absorción de luz de aproximadamente 570 nm - 690 nm.

71

c. MÉTODOS CROMATOGRAFICOS

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN:

Si una serie de compuestos absorbidos en un sólido se desplazan sobre

la superficie de este sólido debido a la acción de un líquido apropiado,

su velocidad de movimiento dependerá de la fuerza con que estén

absorbidos al sólido y del grado en que se disuelven en la fase líquida.

Se tiene con este método, uno de los más sencillos procedimientos para

la separación cuantitativa de compuestos químicos de estructura muy

parecida, los sólidos para absorber la sustancia son de materiales de

distinta naturaleza dentro de los más usados se encuentra el almidón, el

papel, el oxido de aluminio, los geles de sílice, el carbón, etc.

CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL:

Sobre papel ó sobre lámina delgada, que permite identificar los

aminoácidos existentes en la mezcla por comparación con los factores de

retraso (Rf) de los aminoácidos en las mismas condiciones.

ANÁLISIS CROMATOGRAFICOS DE AMINOÁCIDOS EN COLUMNA:

Los aminoácidos son absorbidos primeramente en una columna que

contiene una resina de intercambio catiónico, en forma sódica, que retiene

con más fuerza los aminoácidos más básicos. Fijada la mezcla de

aminoácidos en la cima de la columna, se elude con un

72

tampón de pH y fuerza iónica crecientes. A pH bajos son eluidos los

aminoácidos de punto isoeléctrico más bajo y a pH altos los más

básicos; de este modo, por la base de la columna salen los aminoácidos

separados.

MÉTODOS DE DILUCIÓN CON ISÓTOPOS:

Para el cuanteo de aminoácidos en hidrolizados de proteínas, aunque

requiere un equipo especializado.

SÍNTESIS MICROBIOLOGICA:

Numerosos gérmenes, para manifestar crecimiento óptimo, requieren

medios de cultivo con distintos aminoácidos, vitaminas, etc. Si se quita

del medio de cultivo uno de los aminoácidos necesarios para el

crecimiento del microorganismo, éste deja de desarrollarse, pero al

añadir nuevamente al medio cantidades progresivas del aminoácido en

cuestión, se obtienen crecimientos progresivos y proporcionales a la

cantidad añadida del aminoácido en estudio. De está manera es posible

cuantear en forma rápida y precisa, diversos aminoácidos en hidrolizados

u otros productos.

MÉTODOS ENZIMATICOS:

Algunas enzimas específicas permiten el cuanteo de los aminoácidos,

midiendo indirectamente determinados productos de la reacción. Así, la

enzima arginosa libera urea del aminoácido arginina y de está manera.

determinando urea, se puede conocer la cantidad del aminoácido, a

partir de diversos gérmenes se han purificado descarboxilosas

específicas de ciertos aminoácidos que, al actuar sobre ellas ponen en

libertad CO2 que se suele medir por métodos manométricos.

73

2.4.3. VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS

La actividad de un enzima se determina a partir de la concentración del

enzima, la concentración del sustrato y su disponibilidad, la

concentración de los cofactores y/o los efectores alostéricos, la

presencia, concentración y tipo de inhibidores, y la fuerza iónica, el pH y

la temperatura del medio. La cinética enzimática estudia la forma en

que todos éstos parámetros influyen en la actividad enzimática,

proporcionándonos un conocimiento de la reacción en estudio y

permitiéndonos su control.

Para un único sustrato(S) y un único producto (P) se puede aplicar el

siguiente esquema de reacción:

S+E E+S E+P

Cuando la concentración de sustrato es mucho mayor que la del enzima

(E), la velocidad de reacción es de orden cero respecto a los reactantes,

es decir, depende solamente de la concentración de enzima presente.

Por tanto, la velocidad de reacción es esencialmente constante

hasta que haya reaccionado casi todo el sustrato, momento en que

pasa a depender de la concentración de sustrato existente y es de primer

orden con respecto a la concentración de sustrato.

La mejor forma de describir la cinética enzimática es mediante la

ecuación de Michaelis-Menten, que presupone la formación de un

complejo enzima-sustrato:

V =

Ec. 2.1

K1 K2

K-1

K2 E S

S + Km

K-1 + k2

74

Donde Km =

Y representa la concentración máxima (Constante de Michaelis)

V= Velocidad inicial de la reacción

Por tanto, cuando la concentración de sustrato es diez veces el valor de

Km la reacción se produce a un 91% de la velocidad máxima de reacción

(Vmax ), y si es 100 veces el valor de Kmás la reacción se produce al 99%

de la Vmax , con tal que no tenga lugar la inhibición por el exceso de

sustrato y no se produzcan inhibidores durante la reacción enzimática.

En este caso,

Vmax =K2 [E]

Donde : V max = Velocidad máxima Ec. 2.2

K1

75

La cinética de Michaelis-Menten supone que tanto el sustrato como el

enzima son solubles y están mezclados de forma homogénea, lo que

no siempre ocurre en los procesos industriales donde a menudo se

emplean sustratos muy concentrados y viscosos e incluso a veces

sólidos. En este último caso, el área de las partículas de sustrato es un

término con frecuencia más útil que el de la concentración,

particularmente cuando algunos enzimas, por ejemplo las lipasas parecen

absorberse en su superficie.

2.4.4. EQUIPO PARA ANÁLISIS

2.4.4.1. EL ESPECTROFOTÓMETRO

Cabe recordar que el término espectrofotometría se refiere al uso de la luz

para medir las concentraciones de sustancias químicas. Existen dos

procesos fundamentales: la absorción y la emisión de luz por las

moléculas, estas se utilizan en el análisis cuantitativo.

Cuando una muestra absorbe luz, la potencia radiante del haz de luz

disminuye de manera que P(potencia radiante emergente) < P0 (potencia

radiante incidente).

La transmitancia T, se define como la fracción de la luz incidente que sale

de la muestra

P

T = -------------------------------------------------- Ec. 2.3.

Po

Una magnitud física más útil es la absorbancia (A), que se define como:

A = log 10 = - log T Ec. 2.4

Esta varía de 0-2. La

P

Po

76

importancia de la absorbancia estriba en que es directamente

proporcional a la concentración de especie absorbente en la muestra :

Ec. 2.5.

A α cDonde : A = Absorbancia (adimencional)

C = Concentración

CC = coeficiente de proporcionalidad

La ecuación 2.5. es fundamental para aplicar la espectrofotometría en

química analítica, se denomina ley de Beer - Lambert.

El espectrofotómetro es un equipo para medir la absorción de luz. La luz

de una fuente continua pasa a través de un monocromador, que

selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente.

Esta luz monocromática atraviesa una muestra de espesor b, y se mide la

potencia radiante de la luz que sale.

Para medir la Absorbancia de luz visible en nuestra investigación se ha

utilizado el espectrofotómetro PERKIN ELMER, que se muestra en la Fig.

2.6.

En este instrumento, la fuente de luz es una lámpara de wolframio cuya

emisión cubre el espectro visible completo. La luz es dispersada en las

diferentes longitudes de onda que la componen mediante una rejilla, y

sólo una banda estrecha de longitudes de onda pasa a través de la

muestra.

Es un espectrofotómetro de doble haz, la luz pasa alternadamente por las

celdas de muestra y referencia. Este equipo para investigación está

equipado para realizar el barrido automático de longitud de onda y el

registro de la absorbancia.

77

Fig. 2.6 ESPECTRÓMETRO, ULTRAVIOLETA PERKIN ELMER WALLAC MODELO: LAMBDA BIO

78

CAPITULO III DESARROLLO EXPERIMENTAL

3.1. GENERALIDADES

El trabajo experimental de la presente investigación puede ser muy

amplio, ya que la biotecnología implicada es muy diversa y compleja, por

lo que nos circunscribimos a tres puntos principales:

a. Investigación para obtener la papaína

b. Investigación acerca del sustrato

c. Cuantificación de la hidrólisis enzimática

79

Para la obtención de la papaína se ha utilizado Papaya común procedente

de la selva puneña, y posteriormente se llevó a cabo la limpieza, la

desinfección, extracción y purificación con Sulfato de Amonio y Cloruro de

sodio, observándose un mejor rendimiento con la primera sal. Finalmente

se procedió a centrifugación y desecación. De esta manera se aseguraba

una mejor pureza del enzima.

En la preparación del sustrato se tuvo que tomar en cuenta: la calidad o

valor nutritivo del mismo (lomo de carne), rigidez y pH debido a la

formación del ácido láctico. Cabe destacar la eliminación del color de la

carne. Ensayos preliminares de hidrólisis determinaron los problemas que

ocasionarían durante las determinaciones colorimétricas, es por eso que

la carne se tuvo que lavar con agua fría varias veces hasta la eliminación

total del color rojizo.

La temperatura factor muy importante en un proceso de hidrólisis se fijó

en 32° C para evitar desnaturalización notoria y que la velocidad

transcurra en un tiempo adecuado.

La concentración de la enzima es de 2,5 a 5% con respecto al sustrato (10

gr.)

El pH fue de 5 - 6, teniendo presente el rango de actividad de la enzima.

Se utilizó el diseño factorial para determinar el número mínimo de

experimentos a realizar con todas las combinaciones posibles, resultando

8 pruebas como mínimo.

Posteriormente se realizó la preparación de las soluciones estándar con

los aminoácidos que libera el enzima, considerando las concentraciones

máximas en las que se encuentra en la carne. Estas muestras patrón

tuvieron un peso total de: 1,298 gr.; 1,105896 gr.; 1,0384 gr.; y 0,98648 gr.

80

La preparación de las 8 muestras han sido diseñadas con los parámetros

anteriormente mencionados y aplicando el diseño factorial respectivo.

Luego de transcurrido el tiempo de hidrólisis, se determinó

cuantitativamente la actividad de la papaína, con el método de la

ninhidrina para su posterior lectura en el espectrofotómetro (Longitud de

Onda 680 nm) de la Absorbancia

El potencial de las bioconversiones enzimáticas en la industria de las

carnes, es enorme y se quiere lograr que los nutrientes biodisponibles de

la carne estén al alcance de una mayoría.

3.2. OBJETIVOS DE LA EXPERIMENTACIÓN

1. Obtener la papaína de la papaya y lograr su estabilización.

2. Preparar la carne de alpaca en las condiciones más óptimas para

que sea hidrolizada por las enzimas.

3. Determinar cuantitativamente la actividad enzimática de la

papaína sobre la carne de alpaca.

3.3. METODOLOGÍA

Para llevar a cabo la experimentación principal, el cual es la hidrólisis

enzimática de las proteínas de la carne de alpaca, se ha tenido que

desarrollar experimentos previos, para disponer de la enzima y para

adecuar el sustrato para su consiguiente hidrólisis.

81

3.4 ALGORITMO DE LA ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

¿ HA SIDO MEJORADA?

¿ES BUENO EL MÉTODO?

¿ÉSTE MÉTODO ES EL MÁS CORRECTO PARA EL USO DEL

¿ HA SIDO MEJORADA?

¿CUMPLE NORMA INDECOIPI?

SELECCIÓN DEL MÉTODO

AMINOÁCIDOS DE HIDRÓLISIS

INVESTIGACIÓN

HIDRÓLISIS DE LA CARNE

EXTRACCIÓN DE LA PAPAÍNA COMPRAR CARNE DE ALPACACOMPRAR LOS AMINOÁCIDOS

PRUEBA PRELIMINAR

APLICAR A LA MUESTRA PATRÓN

HIDRÓLISIS PREVIAS

BUSCAR FORMULACIÓN DE LA CARNE

APLICAR FORMUL A LA CARNE DE ALPACA

SELECCIÓN DE LA PAPAYA

MÉTODO DE EXTRACCIÓN

ANÁLISIS DEL HIDROLIZADO

FIN

FIN

DETERMINACIÓN DEL FACTOR DE CALIBRACIÓN

DETERMINACIÓN ESPECTROFOTÓMETRICA (ABSORBANCIA?

DETERMINACIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA

PREPARAR LA MUESTRA PATRÓN

SELECCIÓN DEL MÉTODO DE ANÁLISIS M NINHIDRINA

DETERMINACIÓN DEL # DE

EXPERIENCIAS FINALES

BUSCAR FORMULACIÓN

UTILIZAR SÓLO PARA PRUEBAS PRELIMINARES

EXTRACCIÓN

COMPRAR PAPAYA

PAPAYA DE MAYOR PUREZA

¿LA CANTIDAD ES SUFICIENTE?

FIN ¿ ESTAS COMPRUEBAN LA INFORMACIÓN

SELECCIÓN MEJORES PARÁMETROS

SELECCIÓN DE PARÁMETROS

HIDRÓLISIS MEJORADAS

SELECCIÓN PARÁMETROS FINALES

SN

S

S N

N

S

S

N

N

S

S

N

N

82

A

1

B

FIN

ANALIZAR RESULTADOS Y ESTABLECER MODELO

SELECCIÓN DEL NÚMERO DE EXPERIMENTOS, METODO FACTORIAL CON TRES REPLICAS EN EL PUNTO

¿CORRESPONDE?

¿SON LAS NECESARIAS SEGÚN EL M. FACTORIAL?

CONSISTENCIA DEL MODELO MATEMÁTICO

APLICACIÓN DISEÑO EXPERIMENTAL

HIDRÓLISIS DE PRUEBAS FINALES

DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE NIVELES Y FACTORES

ANÁLISIS DEL HIDROLISADO

DETERMINACIÓN DEL MODELO FACTORIAL

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE LOS HIDROLIZADOS

DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA Y ESPECTROFOTOMÉTRICA DE

B

N

S

N

S

83

3.5. TRABAJO EXPERIMENTAL PREVIO

3.5.1. EXTRACCIÓN DE LA PAPAÍNA

3.5.1.1. DE LA MATERIA PRIMA

La enzima se obtiene del fruto verde de la papaya, pudiendo también

extraerse del tallo de la planta.

Para ello se ha utilizado la variedad de papaya común procedente de la

selva puneña

La limpieza y desinfección se realiza de la siguiente manera:

Se ha utilizado los frutos verdes y de tamaño normal dispuestos en forma

vertical sobre bandejas de vidrio.

Se quita el polvo con paño humedecido y con cuidado.

Se desinfecta con el sulfito de sodio en solución, (Ver Anexo 2) y que a la

vez actúa como preservante y reductor.

3.5.1.2. DEL PROCESO

Extracción del látex: El proceso de obtención se ha empezado temprano

en la mañana en un ambiente fresco, haciendo incisiones poco profundas

(de 2 mm.) en sentido longitudinal en la piel de la papaya.

El líquido lechoso que gotea se recibe en las bandejas de vidrio: Se

continúa en las incisiones, cada vez más profundas y más

cercanas, durante varios días, mientras que el fruto esté todavía

verde y no se descomponga.

El Látex extraído se le seca en aire caliente (no más de 40°C), el

84

contenido en humedad de (a papaína bruta desecada es del 5 - 8 %.

3.5.1.3. DE LA PURIFICACIÓN

Se ha experimentado su purificación ensayando con dos sales: Sulfato

de amonio, y cloruro de sodio en solución 1 M. (ver Anexo

2)

Esta purificación consiste en disolver y precipitar del látex, la proteínasa

como un sólido puro. Para ello al ayudar la precipitación con las dos sales

mencionadas, se ha observado que hay mayor rendimiento de papaína, al

usar el SO4(NH4)2

Luego se ha procedido a la centrifugación y filtración en papel Wathman

N° 40 y posterior desecación; por último se ha envasado en frascos de

vidrio oscuros. De esta manera se ha asegurado la pureza de la papaína.

3.5.1.4. DIAGRAMA DE FLUJOS

PAPAYA

85

H2O

NaHSO3

PAPAÍNA CRUDA

(NH4)2SO4

PAPAÍNA DE PAPAÍNA DE

MAYOR PUREZA MAYOR PUREZA

3.5.1.5. ESTABILIZACIÓN Y ACTIVACIÓN DE LA PAPAÍNA

Como se ha indicado, la papaína como una sulfhidrilproteínasa es una

enzima que tiene cisteína (ácido L-α -amino y β-mercaptopropiónico) en

LIMPIEZA

EXTRACCIÓN DEL LÁTEX

DESINFECCIÓN

SECADO

SECADO

CENTRIFUGACIÓN FILTRACIÓN

PRECIPITACIÓN

SECADO

CENTRIFUGACIÓN FILTRACIÓN

PRECIPITACIÓNNaCl

DE LA MATERIA PRIMA

DEL PROCESO

DE

LA

PURI

F

ICA

Tiempo=varios días

86

el centro activo, y por lo tanto posee un grupo SH reactivo que tanto en

los péptidos como en las proteínas se deshidrogena en forma reversible

formando puentes disulfuro.

La papaína puede ser inhibida por agentes oxidantes como: yodo acetato,

p-cloromercuribenzoato, y metales pesados. Puede ser activada por

agentes reductores como el ácido cianhídrico, la císteina, glutation, etc.

que forman complejos con los metales pesados.

La forma de representar la activación y desactivación

Papaína – SH + HS – Papaína Papaína – S – S - Papaína

Papaína – S¯ + ¯S – Papaína 2(Papaína S¯ )Me+²

ACTIVA INACTIVA

-2H

+Me+²

+2H

-Me ²ˉ

COOˉ COOˉ COOˉ

H3N — C — H H3N — C — H H3N — C —N

87

Por lo tanto los estabilizadores son los que tienen grupo sulfhidrilo o

azufre como es el caso del sulfato de amonio que se le ha agregado para

precipitarla y al mismo tiempo estabilizarla.

3.5.2. PREPARACIÓN DEL SUSTRATO

3.5.2.1. MADUREZ DE LA CARNE DE ALPACA

Para la investigación se ha usado el lomo de la carne de alpaca y lo que

nos interesa es la calidad comestible de este músculo así como su

comportamiento en el procesado, porque se sabe que cuando muere la

alpaca cesa el transporte de oxígeno a sus músculos, lo que ocasiona que

las proteínas filamentosas (miosina, actína) entrecruzadas se tornen

rígidas. Esta rigidez y sus efectos colaterales son muy importantes en la

tecnología de las carnes. Otro cambio importante es el descenso del pH

(de 7 a 5) por la formación de ácido láctico.

La carne en estado de rigidez no solo resulta muy dura sino también

menos jugosa, dado que para la mayor parte de las proteínas del

músculo, el punto isoeléctrico y por lo tanto la mínima capacidad de

hidratación ocurre a pH cercanos a 5.5.

La dureza de la carne es máxima a las 24 horas de sacrificada. Luego

proviene un ablandamiento o enrojecimiento natural debido a la hidrólisis

de las proteínas catalizadas por enzimas proteolíticas presentes

naturalmente en el músculo como son:

Proteasa pH

Proteasa neutra activada

por el calcio 6,5 a 8

88

Proteasa similares a

tripsina (serina) 6,5 a 8

Catepsinas B 3 a 6

Catepsinas H 5 a 7

Pero la acción de estas enzimas solo llega a ablandar ligeramente a las

carnes más no a la hidrólisis hasta aminoácidos.

3.5.2.2. ELIMINACIÓN DEL COLOR DE LA CARNE

En ensayos preliminares de hidrólisis se observó que el color rojo de la

carne iba a ocasionar problemas en determinaciones colorimétricos, se

estudió la manera de eliminarlo. La mioglobina es una proteína conjugada.

Está compuesta por una proteína globular (globulina) y un grupo

prostético (hem) que es un anillo porfirinico con Fe.

C C

│ ││

C — N N —

Fe — H2O

C = N N —

│ │

FIGURA 3.1. Grupo Hemo en la Hemoglobina

89

Esta proteína tiene mucha afinidad por el 02 y oxidantes y para iniciar el

proceso de hidrólisis de la carne es conveniente el menor grado de

oxidación y crecimiento microbiano, por lo que se procedió de la siguiente

manera :

1. Refrigerado a temperaturas de 0°C, para luego manipular con

tranquilidad.

2. Trozado : el tamaño de partícula, también ha sido optimizado

porque si era muy pequeño no se podía observar superficialmente

la hidrólisis.

3. Lavado : con agua helada y en operaciones repetidas hasta

eliminar totalmente el color rojizo.

3.5.2.3. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA

La temperatura en un proceso de hidrólisis enzimática es una propiedad

muy importante, y que puede considerarse como variable a fijar en un

proceso. Pero en este caso, por las referencias bibliográficas que indican

un rango de 20 - 32°C para que actúe la papaína, quedando desactivada

completamente a 70°C.

Para optimizar el proceso de hidrólisis se requiere establecer un menor

rango de temperatura, para lo cual se han hecho experimentos previos

para definir como variable controlable la temperatura (Ver Anexo 3)

90

FIGURA. 3.2. Efecto de la Temperatura en la hidrólisis (Experimental)

En esta experimentación preliminar se observó claramente que la

temperatura óptima está alrededor de 30 - 35°C.

La temperatura de las carnes tiene gran influencia en la estructura física y en

el valor nutritivo de las proteínas de la carne.

Así al aumentar la temperatura se produce la desnaturalización (coagulación)

ocasionando una destrucción de las uniones de valencia secundaria

responsables de su conformación.

En cuanto al valor nutritivo sucede que:

La digestibilidad disminuye porque los compuestos insolubles formados por el

calor, no pueden ser desdoblados por las enzimas digestivas.

Rango de experimentación

Ensayo Ensayo 2

1 +T Temperatura del Proceso -T°

Lenta 20 30 32 35 40 Mal olor 80

91

A temperaturas elevadas se destruye la cadena peptídica y por lo tanto

los aminoácidos se caramelizan y/o se destruyen.

Por lo tanto para evitar una desnaturalización notoria y para que la

velocidad de hidrólisis enzimática transcurra en un tiempo adecuado se

seleccionó la temperatura del sustrato en 32°C.

3.6. SELECCIÓN DE VARIABLES A INVESTIGAR

De las experimentaciones anteriores, cabe señalar que ahora el problema

queda circunscrito a la hidrólisis de las proteínas de la carne de alpaca

por medio de la papaína.

a. VARIABLES INDEPENDIENTES

1. CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA

La cantidad de enzima versus el sustrato es una variable de entrada

independiente, que determinará el rendimiento de hidrólisis, la velocidad

de la reacción enzimática.

El agua como disolvente de los alimentos es uno de los componentes más

importantes. Porque no solo se trata de una mezcla de agua con

sustancias inertes que no interactúan en modo alguno, y es que las

proteínas absorben parte del agua de la solución fuertemente en su

superficie, llamándose a estos "agua ligada". Entonces la disponibilidad

de agua medida como actividad del agua posee una fuerte influencia

sobre la actividad enzimática, al difundir el sustrato sobre el enzima.

Para seleccionar los niveles de variables, se ha tenido referencia

bibliográfica y se observa que no hay un valor fijo, porque en una reacción

enzimática, todas las variables están interrelacionadas. Se ha tomado las

concentraciones de 2.5 a 5 % con respecto al sustrato y el grado de

92

dilución del agua es de 5 a 1. (Ver Anexo 4)

2. INFLUENCIA DEL PH

La acción catalítica de la papaína, tiene lugar dentro de pH estrechos.

Cada reacción enzimática posee un pH óptimo, sin embargo este pH

depende del sustrato, de su concentración y de las condiciones de

reacción. En el caso de la papaína, como su centro activo tiene -SH, el

grado de ionización de este grupo depende del pH. Y resulta que un pH

muy alto o muy bajo por lo general lleva a una desnaturalización

irreversible de la papaína. Por ello que se experimentara entre pH 5 y 6.

(Ver Anexo 5)

3. TIEMPO DE LA REACCIÓN

Esta variable tiene mucho que ver con la temperatura del sustrato.

Para la mayoría de las reacciones enzimáticas, un cambio lineal en la

temperatura provoca un cambio logarítmico a la velocidad de reacción. Se

trata de encontrar un tiempo óptimo aunque no es tan crítico como el pH,

ya que si se le deja más tiempo, a una concentración definida de enzima,

el grado de conversión permanece constante. Para seleccionar el nivel de

esta variable se ha hecho dos ensayos preliminares tomando como

valores fijos la temperatura, la concentración baja; y tomando dos

tiempos: a 12 horas y a 5 horas y se observó que el grado de hidrólisis era

parecido. Por lo que se escogió el rango de 3 a 6 horas. Pero como se ha

dicho este rango depende de los otros y para ello no hay información

bibliográfica definitiva.

b. VARIABLE DEPENDIENTE

1. GRADO DE HIDRÓLISIS DE LA CARNE DE ALPACA

La acción de la papaína, a un pH, a una temperatura, concentración y a

93

un tiempo definido, trae como consecuencia que la energía de activación

de la reacción hidrolítica de proteínas disminuye enormemente. Por ello

es que se ha seleccionado esta variable respuesta y se trata de evaluar

cuantitativamente esta reacción. La papaína descompone a la proteína en

fragmentos peptídicos más pequeños. Ataca principalmente al sistema

miosina-actina hasta en un 38 %, y también llega a hidrolizar al colágeno

y elastina hasta en un 50 % . Este hecho se manifiesta en un

ablandamiento notorio de la carne, que sino es controlado, puede

convertir en un puré de carne al sustrato, con sustancias secundarias que

pueden afectar el sabor de la carne. La papaína es una enzima

proteolítica tan activa que llega a obtener aminoácidos individuales, ya

que ataca a los enlaces peptídicos, a sus esteres, a sus amidas

poseyendo por tanto un margen de acción más amplio que la tripsina y la

quimiotripsina.

94

3.7. DISEÑO ESTADÍSTICO DE LA EXPERIMENTACIÓN

Para llevar a cabo la experimentación principal de esta investigación, se

ha usado el método estadístico, para lograr información total acerca de la

influencia cuantitativa de las tres variables independientes,

interaccionadas con la variable respuesta. La estadística nos proporciona

las armas necesarias para realizar la experimentación de una manera

lógica y ordenada.

3.7.1. DISEÑO ESTADÍSTICO FACTORIAL

3.7.1.1. INTRODUCCIÓN

El diseño factorial es una Técnica estadística de planificación, que permite

al investigador minimizar el esfuerzo experimental a realizar para obtener

una información dada, y al ingeniero aprovechar la información existente

sobre un proceso para analizar la influencia que ejercen los distintos

parámetros y, de esta forma, poder actuar en consecuencia para su

mejora.

En definitiva, la misión del diseño factorial consiste en determinar la

influencia o "efecto" que ejerce cada variable independiente (factor) sobre

la variable dependiente seleccionada (respuesta).

El análisis de la influencia de las distintas variables sobre los resultados

obtenidos en los distintos experimentos realizados mediante planificación

efectuada, según el método de diseño factorial, permite desarrollar un

modelo matemático reduciendo estadísticamente

95

los resultados a una función de regresión de tipo polinómico,

de la forma:

El método factorial simboliza las variables en "niveles", correspondiendo

cada nivel a un valor numérico de la variable en consideración. Por

ejemplo para nuestra investigación, una de las variables es el pH, y son

dos los niveles de ensayo 6 y 5, estos valores se simbolizan como +1 para

el nivel superior (6) y -1 para el nivel inferior (5). Al valor medio 5,5 le

corresponde e! valor simbólico 0 (Nivel "central").

Para la estimación de los coeficientes b0, b¡, b¡j (i*j), solo son necesarios

dos niveles que codificaremos a partir de ahora "+" (+1), y "-" (-1).

Para más de un factor, cada experimento planificado, según un diseño

factorial, está definido como una combinación de los niveles de los

factores. Para el caso de dos factores, el mínimo número de experimentos

a realizar será cuatro. En general, el diseño factorial completo requiere un

número de experimentos N:

Donde: m = número de niveles

n = número de factores a considerar

n n n

2 Y = b○ + Sr² = ∑ (bixi + ∑ ∑ ( bijxixj + ………………….Ec. 3.1

N = mⁿ Ec. 3.2

96

3.7.1.2. OBTENCIÓN DE LAS TABLAS MATRICIALES PARA

LA PLANIFICACIÓN DE EXPERIMENTOS Y CÁLCULOS DE LOS

EFECTOS

Para el caso más simple de dos variables Xi, X2 a dos niveles. En la

notación que emplearemos pondremos la letra correspondiente

cuando la variable esté a su nivel superior, y no la pondremos cuando

esté a su nivel inferior. Por ejemplo, rX1 es el valor de la

respuesta cuando X1 está a su nivel superior (X1+), y X2 a su nivel

inferior (X2-) si ambas están a su nivel inferior, subindicaremos la

respuesta con 1 (n).

TABLA 3.1.X₂₋ X₂₊

X₁₊ rX₁ rX₁X₂ rX₁ + rX₁X₂X₁₋ r₁ rX₂ r₁ + rX₂

rX₁+r₁ rX₁X₂ + rX₂ TOTAL

Por lo tanto, la tabla de indicadores de nivel para la planificación de

experimentos correspondiente a un diseño factorial 22 será la que muestra

la tabla 3.2.

TABLA 3.2 NIVELES

EXP № x₁ x₂ RESPUESTA1 − − r₁2 ⁺ − rX₁3 − ⁺ rX₂4 ⁺ ⁺ rX₁X₂

De la suma de las filas y columnas (tabla 3.1), se obtendría:

97

Efecto del factor x1, cuando x2+: rx1- rx2 Efecto del

factor x1, cuando x2-: rx1- r1

Sumando ambos efectos, obtendremos el efecto principal del factor X1:

EX₁ = ( rX₁X₂ - rX₂) + ( rX₁ - r₁ )= rX₁X₂ + rX₁ - rX₂ - r₁

De igual forma, obtendremos el efecto

principal del factor x2:

EX2 = rX1X2 – rx1 + rx2 – r1,

Interacción entre X1 X2 :

X₁X₂ = (rX₁X₂ - rX₂) – ( rX₁ - r₁ ) = rX₁X₂-rX₁ - rX₂ + r₁

98

Representando en forma matricial, los efectos principales e interacción,

obtenemos la correspondiente tabla matricial para el cálculo de los efectos

de un diseño 22 (Tabla 3.3).

TABLA 3.3.

rx1x2 rX1 rx2 r1

Ex1 +1 +1 -1 -i

Ex2 +1 -1 +1 -1

EX1X2 + 1 -1 -1 +1

3.7.1.3. DISEÑO FACTORIAL APLICADO A NUESTRA

INVESTIGACIÓN

Las variables experimentales son: Concentración, Tiempo de Reacción, pH.

Con estas variables independientes (factores) podremos analizar la

influencia que presenta éstas sobre la concentración de aminoácidos

(Absorbancia) que viene a ser la respuesta.

Para este caso particular de 3 factores, el mínimo número de experimentos a

realizar será:

99

De la ecuación 3.2

Donde: m = 2 (niveles)

n = 3 (factores)

Por lo tanto: el número de experimentos (N):

N = 2³

N = 8

En el cuadro 3.1. Se indica cada variable experimental, con sus respectivos niveles y el nombre que cada variable adopta.

CUADRO 3.1.

VARIABLE 0 FACTOR EXPERIMENTAL

NIVEL DEL FACTOR NOMINACIÓN

Concentración de Enzima 2.5 - 5 X1

Tiempo de Reacción 3 - 6 x2

pH 5 - 6 x3

FUENTE : Elaboración Propia.

N = mⁿ

100

3.7.1.3.1. OBTENCIÓN DE LA TABLA MATRICIAL Y

CÁLCULO DE LOS EFECTOS

Se procede de la misma forma que para el diseño factorial 22

Para 3 factores tenemos: TABLA 3.4.

X3- X3+

x2- x2+ x2- x2+

x1 -

x1 +

r₁ rx1 rx2 rx1x2 rx3

rx1x3

rx2x3

rX1X2X3

En la Tabla 3.5. Se presenta los indicadores de nivel para el diseño 23:

TABLA 3.5.

EXP N° Niveles RESPUESTA

101

X1 x2 x3

1 - - -

r1

2 + - - rx1

3 - + - rx2

4 + + - rx₁x2

5 - - + rx3

6 + - + rX1X3

7 - + + rx2x3

8 + + + rX₁X₂X₃

Los efectos correspondientes son:

EX₁ = r X₁X₂X₃ - rX₂X₃ + rX₁X₃ - rX₃ + rX₁X₂ - rX₂ + rX₁ - r₁EX₂ = r X₁X₂X₃ + rX₂X₃ - rX₁X₃ + rX₃ + rX₁X₂ + rX₂ - rX₁ - r₁EX₃ = r X₁X₂X₃ + rX₂X₃ + rX₁X₃ + rX₃ + rX₁X₂ - rX₂ - rX₁ - r₁EX₁X₂ = r X₁X₂X₃ - rX₂X₃ - rX₁X₃ + rX₃ + rX₁X₂ - rX₂ - rX₁ + r₁EX₁X₃ = r X₁X₂X₃ - rX₂X₃ + rX₁X₃ - rX₃ - rX₁X₂ + rX₂ - rX₁ + r₁EX₂X₃ = r X₁X₂X₃ + rX₂X₃ - rX₁X₃ - rX₃ - rX₁X₂ - rX₂ + rX₁ + r₁EX₁X₂ X₃ = r X₁X₂X₃ - rX₂X₃ - rX₁X₃ + rX₃ - rX₁X₂ + rX₂ + rX₁ - r₁

Expresando los efectos En forma matricial obtenemos la Tabla 3.6.

102

TABLA 3.6.

rX₁X₂X₃ r X₂X₃ r X₁X₃ r X₃ rX₁X₂ r X₂ rX₁ r₁

E X₁ +1 -1 + 1 -1 +1 -1 +1 -1

E X₂ +1 + 1 -1 -1 +1 +1 -1 -1

E X₃ +1 + 1 + 1 +1 -1 -1 -1 -1

EX₁X₂ +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 + 1

E X₁X₃ +1 -1 + 1 -1 -1 +1 -1 + 1

E X₂X₃ +1 + 1 -1 -1 -1 -1 + 1 + 1

EX₁X₂X₃ +1 -1 +1 + 1 -1 + 1 + 1 -1

Finalmente obtenemos la Tabla 3.7. Tomando como respuesta Y en

lugar de r, para hacer sencilla nuestra Tabla.

103

TABLA 3.7. DISEÑO FACTORIAL 23

EXP N° PRUEBA

X0 X₁ x2 x3 X₁x2 X₁X3 X2X3 X₁X2 X₃ Y

1 + 1 -1 -1 -1 +1 +1 + 1 -1 Y,

2 + 1 + 1 -1 -1 -1 -1 + 1 + 1 Y2

3 + 1 -1 + 1 -1 -1 + 1 -1 + 1 Y3

4 + 1 + 1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 Y4

5 + 1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 + 1 Y3

6 + 1 + 1 -1 + 1 -1 + 1 -1 -1 Y6

7 + 1 -1 + 1 + 1 -1 -1 + 1 -1 Y-

8 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 Y8

3.8. DESARROLLO EXPERIMENTAL

3.8.1. SELECCIÓN DE LA MUESTRA STANDARD

3.8.1.1. ESPECIFICIDAD DE LA PAPAÍNA

En cuanto a aminoácidos, la especificidad de la papaína es muy estrecha,

ocasionando el rompimiento de la cadena peptídica en los siguientes

puntos:

COO⁻

|

1. Arginina H₃N — CH — CH₂ — CH₂ — CH₂ NH

104

En estos 5 aminoácidos el ataque es en el grupo carboxilo COO", liberando

de esta manera a los aminoácidos esenciales y no esenciales. De esta

manera al hidrolizar la carne con papaína no solo se está ablandando la

carne, sino que se esta elevando su valor nutritivo al aumentar

disponibilidad de aminoácidos.

COO⁻

|

1. Arginina H₃N — CH — CH₂ — CH₂ — CH₂ NH

105

3.8.1.2. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN ESTÁNDAR

Parte importante del presente trabajo ha sido el de conseguir estos

aminoácidos para hacer la muestra patrón. Para ello se ha considerado

las concentraciones máximas en las que se encuentran en la carne de

alpaca. Se ha preparado 100 ml. de solución.

Tomando en cuenta el cuadro de composición de aminoácidos en la carne

de alpaca (Tabla 2.3.1.) y considerando que se tomará como muestra de

carne 10 gr. se tiene las siguientes masas: (Ver Anexo 6)

CUADRO 3.2.

PARA 25 % DE PROTEÍNA

AMINOÁCIDO LIBERADO PESO (gr)

Acido Glutámico

Argimina

Lisina

Leucina

Glicina

0.415

0.1725

0.27625

0.285

0.14925

Total 1,298

106

CUADRO 3.3. PARA 21,3 % DE

PROTEÍNA


Acido Glutámico

Argimina

Usina

Leucina

Glicina

0.35358 0.14697

0.235365 0.24282

0.127161

Total 1.105896

CUADRO 3.4. PARA 20 % DE

PROTEÍNA


Acido Glutámico

Argimina

Lisina

Leucina

Glicina

0.332 0.138

0.221

0.228

0.1194

Total 1.0384

107

CUADRO 3.5.

PARA 19 % DE PROTEÍNA


Acido Glutámico

Argimina

Lisina

Leucina

Glicina

0.3154 0.1311

0.209950.216

6

0.11343

Total 0.98648

3.8.1.3. DETERMINACIÓN COLORIMÉTR[ CA DE AMINOÁCIDOS

Se ha seleccionado el método de coloración con la ninhidrina. La ninhidrina

es el tricehidridenhidrato que con la mayoría de los aminoácidos da color

violeta en caliente y a pH 5 - 6.

El aminoácido se deshidrogena, se descarboxila y se desamina, con lo que

se forma el C02, el NH3, el aldehido y Ninhidrina reducida. Luego se

condensan el NH3, y la Ninhidrina reducida dando el color violeta.

La determinación cuantitativa es en base a una muestra patrón de

concentración conocida, evaluando la intensidad del color.

108

3.8.2. EXPERIMENTACIÓN DE LA HIDRÓLISIS ENZIMATICA DE

LA CARNE DE ALPACA

109

3.8.2.1. DIAGRAMA DE FLUJO GENERAL HIDRÓLISIS DE LA CARNE DE ALPACA

MUESTRA

ABSORBANCIA (LECTURA)

HIDRÓLISIS

FILTRACIÓN

DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA

ENFRIAMIENTO

REFRIGERACIÓN

DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA

ENFRIAMIENTO 80º C

Carne no hidrolizada

HCL

PAPAÍNA CARNE

Ninhidrina

pH

TºC = 32

PRODUCTO AZUL

0º C

20º C

PRODUCTO AZUL

110

99

3.8.2.2. PREPARACIÓN DE LAS OCHO MUESTRAS

Estas muestras han sido diseñadas en base a lo indicado en 3.7 (Tabla

3.7.)

- Se pesa 10 gr. de carne de alpaca previamente decolorada.

- Se agrega la papaína diluida en agua destilada.

- Según sea el caso de pH 5 ó 6 se agrega gotitas de solución de HCI

0,1 N hasta llegar al pH adecuado y controlando con papel indicador.

- Los depósitos previa agitación y bien tapados se someten a

calentamiento en una cocina con termostato controlado a 32°C.

- Después del tiempo transcurrido, se somete a filtración y se refrigera

hasta la medición respectiva. (Ver Anexo 7)

3.8.3. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD

DE LA PAPAÍNA

Puede hacerse de varias maneras:

1. Determinando la cantidad de proteína precipitable con ácidos

tricloroacético, antes y después de la acción del enzima,

disminuyendo a medida que se hidroliza.

2. Usando el método Kjeldahl al inicio y siguiendo una secuencia de

mediciones. Igualmente irá disminuyendo.

3. Reacciones colorimétricas con biuret o con ninhidrina. *

4. Por titulación directa de los grupos COOH liberados por la hidrólisis

de los enlaces peptídicos, siempre que se elimine previamente el

efecto electrostático de los grupos NH2 liberados simultáneamente.

* Método elegido, debido al uso del espectrofotómetro.

111

:::

3.8.3.1. DETERMINACIÓN ESPECTROFO TOMÉTRICA DE

AMINOÁCIDOS

Se ha utilizado un

espectrofotómetro UV-Visible marca "PERKIN ELMER". (Ver

figura 2.6.)

Para una longitud de onda, previa elección mide absorbancia. (Ver

Anexo 8)

Para medidas de concentración se procede de la siguiente manera :

1. Utilizando el factor de calibración: consiste en hacer una medición de

Absorbancia a una concentración conocida y de allí se determina el

factor :

Donde: F: Factor de calibración

A: Absorbancia

%: Concentración

3.8.3.2. DEMOSTRACIÓN DE LA LEY DE BEER Y

DETERMINACIÓN DEL FACTOR ABSORBANCIA

1. Se selecciona una longitud de onda a la cual la absorbancia del

compuesto coloreado esté dentro de la escala. El valor es de 680nm.

%

F = Ec. 3.3.

112

2. Se calibra el aparato con agua destilada que se coloca en la cubeta de cuarzo.

3. Se añade a la solución patrón, preparada en la sección 3.8.1.2. (2 ml.) de

solución de ninhidrina al 1%.

4. Se procede a calentar por 3 min. en baño María y luego se enfría a 20°C.

5. Se coloca la solución en la cubeta del espectrofotómetro y se procede a la

medición de la absorbancia. (Ver Anexo 8)

El valor de Absorbancia para cada muestra patrón se muestra en el cuadro 3.6.

CUADRO 3.6.

PATRONES DE AMINOÁCIDOS

MUESTRA

PATRÓN

CONCENTRACIÓN

(PORCENTAJE)

ABSORBANCIA (A) VOLUMEN SOLUCIÓN

1 0,649 0,116 5 ml.

2 0,5229 0,100 5 ml.

3 0,5192 0,094 5 ml.

4 0,4932 0,088 5 ml.

113

0,649 0,134 FIG 3.3. CURVA DE CALIBRACIÓN QUE MUESTRA LA VALIDEZ DE LA LEY DE BEER PARA EL0,552 0,115 COMPLEJO AZUL QUE SE USA PARA LA DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS

0,519 0,1080,493 0,101

Xi Yi

f(x) = 0.21 x − 0R² = 0.996568586642448

Series2Linear (Series2)

CONCENTRACIÓN Xi

ABSO

RBAN

CIA

Yi

114

Evaluación de la Incertidumbre

Cálculos para el análisis de Mínimos cuadrados

Yi

Xi

YiXi X²

Xi-pro Xi

Yi - proY

(Xi-proX)(Yi - proY)

(Xi-proX)2 Di Di2

0,134

0,649

0,086966

0,421201

0,09575

0,0195

0,00186713

0,00916806

-0,00043023

0,000000185

0,115

0,552

0,06348

0,304704

-0,00125

0,0005

-6,25E-07

1,5625E-06

0,00044216

0,000000196

0,108

0,519

0,056052

0,269361

-0,03425

-0,0065

0,00022263

0,00117306

0,00020287

0,000000041

0,101

0,493

0,049793

0,243049

-0,06025

-0,0135

0,00081338

0,00363006

-0,00147051

0,000002162

0,458

2,213

0,256291

1,238315

0,0029025

0,01397275

-0,00125571

0,000002584

115

X1 = Concentración (%)

Y1 = Absorbancia

Realizando cálculos se tiene que la pendiente y la ordenada al origen de la mejor recta son:

∑Y 0,458 ∑X 2,213 m 0,2077 pendient ∑XY 0,256291 b -0,000424 constante∑X2 1,238315 Sy 0,0011367 varianza

n 4 Sy20,00000129

2desviacion estándar de y

prom X 0,55325 Sm20,00009247

1

prom Y 0,1145 Sb20,00002862

7d 0,055891 Sm 0,0096162A 0,622 Sb 0,00535044

Por lo tanto la mejor línea recta que pasa por los puntos de la fig. es:

Y=mX+bMejor Ec. De la recta Y=0,2077X-0,000424

Realizando operaciones y combinando resultados para m, σm, b, σb se

puede escribir

m = 0,20772 ± 0,009616205

= 0,208 ± 0,009

b = -0,000424 ± 0,00535043

= -0,0004 ± 0,005

116

Luego para la primera prueba del valor de la Absorbancia A= 0,622

Entonces despejando X en la Ec. de la recta, tenemos que

Luego para la primera prueba del valor de la Absorbancia A= 0,622

Entonces despejando X en la Ec. de la recta, tenemos que Remplazando

datos tenemos como resultado

F = 4.8167 (± 4,33)

Y b

X =

F = 4,86 ± 0, 208

117

3.8.3.3. DETERMINACIÓN DE LAS

MUESTRAS PROBLEMA

Para la lectura en el espectrofotómetro se ha procedido de la misma

manera que la anterior; es decir se toma 2ml. de la solución hidrolizada

con la enzima y se le agrega la solución de ninhidrina, se calienta en baño

maría y se enfría. Los resultados son los siguientes:

CUADRO 3.7. DETERMINACIÓN DE LAS MUESTRAS

PROBLEMA

N°

PRUEBA

CONCENTRA CION

DE ENZIMA

TIEMPO pH ABSOR

BANCIA

CONCENT

RACIÓN

INCERTIDUMBRE

N° X1 x2 x3 A %GR.

1 2.5 3 5 0.622 3,0229 ±0,1308

2 5,0 3 5 0,734 3,5672 ±0,1544

3 2,5 6 5 0,887 4,3108 ±0,1866

4 5,0 6 5 1,060 5,1516 ±0,2230

5 2,5 3 6 0,265 1,2879 ±0,0557

6 5,0 3 6 0,295 1,4337 ±0,0620

7 2,5 6 6 0,418 2,0314 ±0,0879

8 5,0 6 6 0,448 2,1772 ±0,0942

FUENTE : Elaboración Propia

118

CAPITULO IV

TRATAMIENTO E INTERPRETACIÓN DE

RESULTADOS

4.1. GENERALIDADES

En este capítulo realizaremos la interpretación y el tratamiento

estadístico de resultados, estimaremos el modelo matemático,

haremos su análisis de varianza, la evaluación del modelo

matemático y gráficos del diseño.

4.2. ESTADÍSTICAS DE RESULTADOS

Los experimentos factoriales permiten conocer la importancia

relativa de las interacciones de tres variables con respecto a Y.

119

110

Los resultados obtenidos y anotados en 3.8.3.3 serán evaluados

estadísticamente en un Programa Estadístico (statistics). Para ello

se ponen las pruebas en forma factorial:

TABLA 4.1.

C* t* P* A*N° PRUEBA CONCENTRACIÓN

ENZIMA

TIEMPO PH ABSORBANCIA

1 2,5 3 5 0,622

2 5,0 3 5 0,734

3 2,5 6 5 0,887

4 5,0 6 5 1,060

5 2,5 3 6 0,265

6 5,0 3 6 0,295

7 2,5 6 6 0,418

8 5,0 6 6 0,448

9 3,75 4,5 5,5 0,950

10 3,75 4,5 5,5 0,900

11 3,75 4,5 5,5 1,000

FUENTE : Elaboración Propia ^

*Abreviatura de cada variable

120

1114.2.1. TRANSFORMACIÓN DE VARIABLES

A continuación se ejemplifica el procedimiento de transformación. El

procedimiento es el mismo para cada variable.Para C :

Cálculo de promedio Pm = (2,5 + 5,0)/2 = 3,75

Cálculo de diferencia D = (5,0 - 2,5)/2 = 1,25

Cálculo de Variable Xt = (C - 3,75)/1,25 .. Ec4.1.Luego si

C = 2,5 —> X! = -1 C = 5,0 —> X! = +1 C = 3,75 —> Xi

= 0Para t :

Cálculo de promedio Pm = (3 + 6)/2 = 4,5

Cálculo de diferencia D = (6 - 3)/2 = 1,5

Cálculo de Variable X2 = (t - 4,5)/1,5 ... Ec 4.2.

Luego si :

t = 3 —> X2 = -1

t = 6 —> X2 = +1

t = 4,5 —> X2 = 0

Para P:

Cálculo de promedio Pm = (5 + 6)/2 = 5,5

Cálculo de diferencia D = (6 - 5)/2 = 0,5

Cálculo de Variable X3 = (P - 5,5)70,5 ... Ec 4.3.

121

112Luego si:

P = 5 —> X3 = -1

P = 6 —> X3 = +1

P = 5,5 —> X3 = 0

4.2.2. FORMULACIÓN DE TABLA FACTORIAL PARA ANÁLISIS

DE DATOS

Este cuadro será introducido en la computadora (Ver

sección 3.7.1.)CUADRO 4.2.

MUESTRA EFECTO PRINCIPAL EFECTO INTERACTIVOXo X1 x2 x3 X1X2 X1 X3 X2 X3 X1 X2 X3 Y

1 + 1 -1 -1 -1 + 1 +1 +1 -1 0.622

2 + 1 + 1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 0,734

3 + 1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 + 1 0,887

4 + 1 + 1 + 1 -1 + 1 -1 -1 -1 1,060

5 + 1 -1 -1 +1 + 1 -1 -1 +1 0,265

6 + 1 + 1 -1 +1 -1 +1 -1 -1 0,295

7 + 1 -1 + 1 +1 -1 -1 +1 -1 0,418

8 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 +1+1

+ 1 0,448

9 0 0 0 0 0 0 0 0 0,950

10 0 0 0 0 0 0 0 0 0,900

11 0 0 0 0 0 0 0 0 1,000

FUENTE: Elaboración Propia.

122

:::-

4.2.3. DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE

REGRESIÓN

MODELO MATEMÁTICO

El diseño factorial, permite desarrollar un modelo matemático

reduciendo estadísticamente los resultados a una función de regresión

de tipo polinómico, de la forma :

n n ny = b0 + 2∑ b¡x¡ +....... ∑ ∑b¡j x¡ Xj

i=i i=i j=Í

Ver (3.7.1.) Ec. 3.1.

Por el método matricial, se determina los coeficientes del modelo

matemático. Como se muestra en la Ec. 4.4.

b = (xTx)ֿ 1xTy ........................ Ec. 4.4.

Donde : b = vector de los coeficientes del modulo matemático

x = Matriz de diseño

xT = Traspuesta de la matriz de diseño

Y = Los datos observados (respuestas)

Los coeficientes de regresión se calculan a partir de la ecuación:

bj = 2 ∑xj¡y¡ / ∑ x2j¡ Ec. (4.5.)

Estos se pueden observar en el cuadro que se presenta a

continuación y que son realizados por el programa de computadora.

En el Anexo 9 se puede observar como fueron calculados.

123

Coeficientes Error típico Estadístico t Probabilidad Inferior 95% Superior 95%(Constant) ,592 0,03385016 -10,5612 0,008847 -0,50404548 -0,21275452

X1 ,043 0,01767767 2,4042 0,138066 -0,03271087 0,11941087X2 ,112 0,01767767 6,3640 0,023813 0,03613913 0,18826087X3 -,235 0,01767767 -13,1522 0,005731 -0,31066087 -0,15853913

X1X2 ,008 0,01767767 0,4243 0,712652 -0,06841087 0,08371087X1X3 -,028 0,01767767 -1,5556 0,260060 -0,10411087 0,04801087X2X3 -,036 0,01767767 -2,1213 0,167950 -0,11176087 0,04036087

X1X2X3 -,008 0,01767767 -0,4243 0,712652 -0,08371087 0,06841087

Estadísticas de la regresiónCoeficiente de correlación múltiple

0,99708445

Coeficiente de determinación R^2

0,99417741

R^2 ajustado0,9708870

5Error típico 0,05Observaciones 11

ANÁLISIS DE VARIANZAGrados de

libertadSuma de

cuadradosPromedio de los

cuadrados FValor

crítico de FRegresión 8 0,85372425 0,106715531

42,6862124 0,02308774

Residuos 2 0,005 0,0025Total 10 0,85872425

124

:: =

Así, el modelo matemático para el diseño en escala codificada es el

siguiente :

Y = 0,592+0,043X1+0,112x2-0,235x3 +

0,008x1x2- 0,0028x1x3 -0,36 x1X2- 0,008x1X2x3

4.2.4. VALIDACIÓN DE RESULTADOS (ANÁLISIS DE LA

VARIANZA)

4.2.4.1. ANÁLISIS DE SIGNIFICANCIA DE LOS COEFICIENTES

Para determinar la significancia de cada uno de los coeficientes de la

ecuación de regresión se emplea la prueba t de student definido por :

tj = /bj// Sbj ... Ec. 4.6.

La desviación estándar es :

Sbj = Se/√N ... Ec. 4.7.

Donde : Se2 = varianza estimada N = número de

pruebas

La varianza estimada es :

Se2 = E(y¡0 .Yo)/(C-1) ... Ec. 4.8.

Donde: Y0 = promedio aritmético de los puntos centrales

C = número de repeticiones en el punto central

Finalmente se verifica que : tj>tp

125

:: -f

Donde : tp = estadístico de student obtenido de Tablas para (C-1) grados

de libertad y una probabilidad dada (usualmente del 95 %). En este caso

el coeficiente bj correspondiente tiene significancia estadística.

Aplicando las fórmulas anteriores:

- CÁLCULO DE LA VARIANZA ESTIMADA

Cálculo de promedio : Y0 = (0,95 + 0,90 + 1,00)/3 = 0,95 Cálculo de

desviaciones cuadráticas : SDC = (0,95 - 0,95)2 + (0,90 - 0,95)2 +

(1,00 - 0,95)2 SDC = 0,005

Cálculo de varianza :

Se2 = SDC/ (3-1) = 0,0025

Cálculo de desviaciones estándar : Se = 0,05

Este valor se puede observar en los cuadros A y B realizados por el

computador.

En el Anexo 9 se encuentra como fue calculado: la varianza y los

estadísticos tj

Para la determinación de la significancia se encuentra la t de student de

Tablas para (C-1) = 2 grados de libertad. 95 % de confianza

Donde : tp = 4,303

Finalmente, los valores tj que sean menores a tp no tienen significación y

por lo tanto no participan en la ecuación de regresión. Ver Anexo 9 y

Cuadros A y B.

126

::~

Por lo tanto el Modelo Matemático es:

Y = 0,59 + 0,11X2 + 0,24X3

4.2.5. BONDAD DE AJUSTE DE LA ECUACIÓN DE REGRESIÓN

Este paso verifica que efectivamente la ecuación obtenida represena los

datos que le dieron origen. Para este propósito se utiliza la prueba F de

Fisher.

- Varianza Residual (Sr2). Mide la desviación de los valores calculados

de los experimentales.

Sr2 = ∑(y¡ -Ay¡)2/(N-K) Ec. 4.9

Donde : K = Número de coeficientes significativos

Ay¡ = Valores calculados de y¡

Luego : F = Sr2/Se2 Ec. 4.10

Finalmente se verifica la condición : F < Fp

Donde : Fp = estadístico de Fisher, se encuentra en Tablas, con un nivel

de probabilidad de 95 %, con fi = (N-K) y f2 = (C-1) grados de libertad.

Esto indica que efectivamente existe bondad de ajuste de la ecuación de

regresión generada.

NOTA : Si no hay bondad de ajuste con el modelo lineal es muy probable

que exista efecto curvatura significativa.

127

Aplicando las ecuaciones anteriores se tiene:

Cálculo de las desviaciones cuadráticas entre el valor experimental y el

valor calculado con la ecuación de regresión.SDC

absorbancia valor calculado de la Ec. de regresiondiferencia elevado

0,62 0,70 -0,08 0,006052840,73 0,70 0,03 0,001183360,89 0,92 -0,03 0,001062761,06 0,92 0,14 0,019824640,27 0,24 0,03 0,000635040,30 0,24 0,06 0,003113640,42 0,46 -0,04 0,001747240,45 0,46 -0,01 0,00012544

0,03374496

SDC = 0,03374496

Cálculo de varianza residual Sr2 = SDC/(N-K) =

0.0337 = 0,00624 =0,00674

8-3

Cálculo del estadístico de Fisher

F = Sr2 /Se2 = 0.00674

0,0025 F = 2,699

La determinación de F de Tablas para probabilidad de 95 % con

fi = 5 y f2 = 2 grados de libertad es : Fp (5,2) = 19,30

Por lo tanto existe bondad de ajuste en: 2,699 < 19,30

4.2.6. EVALUACIÓN DEL EFECTO DE CURVATURA

Se determina la diferencia entre el promedio de los puntos centrales Y0 y

el promedio de los puntos factoriales Y¡

128

La significancia estadística de este efecto se determina con la prueba t de

student. El intervalo de confidencia se calcula así :

EC + tSe √1 ∕ N +1 ∕ C Ec. 4.11.

Si el cero se encuentra en este intevalo, significa que el efecto curvatura

no es significativo.

Aplicando lo anterior : Promedio de los experimentos factoriales

4.74 = 0,5925

8

Promedio de los puntos centrales = 0,95

Efecto Curvatura = 0,95 - 0,59 = 0,36

Intervalo de Confidencia =

= 0,36 ± (4,303) (0,05) V1/8 + 1/3 = 0,36±

═0,36 ± 0,14

4.2.7. EXPRESIÓN DEL MODELO MATEMÁTICO EN ESCALA

NATURAL

El modelo matemático se procede a descodificar según las ecuaciones

siguientes :

Para el término independiente

k ka0 = b 0 -∑b¡є¡ +.... ∑ biuє¡єu Ec. 4.12.i=i i,u =1

Donde a0 = Término independiente del modelo matemático en escala

natural.

129

:::Para los términos lineales

a¡ = Coeficiente de los términos lineales del modelo en escala natural

€¡ = Coeficiente de dividir el centro del diseño (Zj0) y el radio del diseño

(Zj)Para los términos de interacción

Aplicando las ecuaciones para el modelo obtenemos la ecuación en

términos de las variables originales.

Esta ecuación de regresión generada representa a los datos

experimentales que le dieron origen y describe el sistema en reacción bajo

estudio.

bi biu€i€u

aizi = ¯ j = u =…. K-1 Ec. 4.13

∆zi ∆zi

bii

Aiizizi = Ec. 4.14

Y = 2,70 + 0,0748t - 0,4692 P

131

4.3. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

4.3.1. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE

LA PAPAÍNA

De la experimentación se observa que tiene interacción directa con el

tiempo de hidrolizado, y cualquier exceso no ocasionaría problema

alguno, ya que es inocua. Pero con estas cantidades preliminares de

concentración se puede continuar las investigaciones para determinar la

I.U. (unidad enzimática), es decir, cantidad de enzima que cataliza la

conversión de 1 micromol de sustrato en 1 minuto, en condiciones

óptimas.

Por lo que para las metas propuestas para el presente trabajo se prefiere

la de mayor concentración (5 %).

4.3.2. INFLUENCIA DEL pH

Esta es una variable importantísima que se ha logrado fijar ya que

sabemos por el carácter anfótero de las proteínas, solo hay un pH en el

cual la actividad de la papaína es máxima y es de pH = 5.

Habiéndose distinguido además otro pH: el pH = 6 de estabilidad, por lo

que se ha podido manipular la enzima en condiciones adecuadas.

Lo demuestran los resultados de hidrólisis, donde los rendimientos son

mejores a pH = 5, disminuyendo notoriamente a pH = 6.

132

4.4. ANÁLISIS DEL DISEÑO FACTORIAL

1. La matriz de variable independiente se obtiene agregando un

vector columna 1 que consiste en signos(+), el cual es usado

para estimar la media, los otros vectores columna se

generan a partir de la matriz diseño.

2. Una vez hecho los coeficientes de regresión con un nivel de

significancia de 95% se hace efectos e interacciones.

El rango de las variables ha sido convenientemente elegido, y por

ello las conclusiones pueden extenderse a variaciones del proceso.

133

CAPITULO V

5.1.- COSTOS DE LA INVESTIGACIÓN

5.1.1.- GENERALIDADES:

Este capítulo trata sobre los costos generales que demanda la

investigación (como material y equipo, reactivos, servicios, etc).

5.1.2.- RECURSOS MATERIALESRUBRO CANTIDAD UNIDAD COSTO

UNITARIOSUB TOTAL SI.

MATERIAL DE VIDRIO

Termómetro 1 Unidad 100,20 100,20Vaso precipitado (100 mi)

2 Unidad 16,70 33,40

Matraces 8 Unidad 30,93 247,43

Pipetas 1 Unidad 16,70 16,70

Tubos de Ensayo 8 Unidad 2,01 16,03

Embudos 2 Unidad 15,03 30,06

Bandejas de vidrio 1 Unidad 80,39 80,39

TOTAL 524,21

134

RUBRO CANTIDAD UNIDAD COSTO

UNITARIO

SUB TOTAL SI.

OTROS MATERIALESDE LABORATORIO

Papel filtro 1 Pliegos 2,00 2,00

Bandeja Porcelana 3 Unidad 7,01 21,04

Papel Indicador de 1 Unidad 51,10 51,10

0,5 - 14

TOTAL 74,14


UNITARIO

SUB TOTAL SI.

REACTIVOS E INSUMOS

Acido clorhídrico al 33 % 10 mi. 0,835 8,350

Cloruro de Sodio 90% 1 Kg. 4,340 4,340

Sulfato de Amonio 0,10 Kg. 167.000 16,700

Ninhidrina 10 mi. 94,500 94,500

Sulfito de Sodio 0,5 Kg. 4,940 2,470

Acido glutámico 1 gr- 43,700 43,700

Arginina 1 gr. 50,300 50,300

Lisina 1 gr- 50,100 50,100

Leucina 1 gr. 40,800 40,800

Glicina 1 gr. 57,100 57,100

Papaína 10 % 20 gr. 8,031 160,620

Agua Destilada 5 gr. 1,000 5,000

Papaya 10,3 Kg. 1,300 13,390

Carne 1 Kg. 12,000 12,000

TOTAL 559,66

135

5.1.3.- COSTOS DE LOS RECURSOS MATERIALES

RUBRO SUB TOTAL S/.

Análisis Espectrofotométrico

Material de Vidrio

Otros Materiales de Laboratorio

Reactivos e InsumosCostos Indirectos

150,00 (*) 524,21

74,14 559,31651,60

TOTAL 1959,32

(*) Costo no Incluido en la Investigación (Gratuito)

5.1.4.- FINANCIAMIENTO

Los recursos económicos necesarios para llevar a cabo esta investigación son

aporte propio.

5.2.- CRONOGRAMA DE LA INVESTIGACIÓN


UNITARIO

SUB TOTAL SI.

COSTOS INDIRECTOS

Información Total 200,00 200,00

Material Escritorio Total 20,00 20,00

Copias y Adquisicig Total 180,16 180,16

nes de libros

Fotografías Total 26,50 26,50

Gastos Generales Total 225,00 225,00

TOTAL 651,66

136

5.2.1.- Actividades a desarrollar:

a) Recolección de la información

b) Evaluación de la información

c) Clasificación de información y obtención de conclusiones

d) Asesoría profesional

e) Formulación de objetivos y planteamiento de hipótesis

f) Planteamiento de las pruebas

g) Disponibilidad de materias primas y equipo de laboratorio

h) Inicio de pruebas de laboratorio

i) Evaluación de las pruebas de laboratorio

j) Elaboración de conclusiones y sugerencias en base de las pruebas

5.2.2.- Actividades a desarrollar:

Act i v idades

Mayo Jun io Ju l io Agos to

Sept iembre

Octubre

Nov iembre

A x x xB x x xC x xD x x xE xF xG x xH xI xJ x

137

BIBLIOGRAFIA

BARMAN, HEILDERBERG. Manual de Enzimas, 1975

BARRADO MARCOS, A. Ciencia de la carne. Editorial Acriba Zaragoza, 1977.

BRAVERMAN JBS. Bioquímica de los Alimentos.

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PEARSON D. Técnicas de laboratorio. Editorial Acribia, 1976

PRIMO YUSERA. Eduardo. “Química orgánica y Aplicada a la molécula de la Industria”, 1995

WIHITAKER, J.R. Principio de Enzimología para la Ciencia de los Alimentos. Editorial Dancel Dekker, 1972

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SALVÁ RUIZ, Bettit Karim “CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE Y CHARQUI DE ALPACA (Vicugna pacos)”

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138

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CHAVERRI ÁLVAREZ, Alejandra Tesis: Comparación de la Actividad Proteolítica de la Papaína Secada por Diferentes Métodos. Universidad de Costa Rica.

RICARDO BENÍTEZ, ALBERT IBARZ , JORDI PAGAN Hidrolizados de proteína, procesos y aplicaciones

SABINO, CARLOS Cómo hacer una tesis Ed. Panapo. Caracas 1994

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BRANDAN, LLANOS, BARRIOS, ESCALANTE, RUÍZ. ENZIMAS Facultad de Medicina UNNE

BUTTAZZONI MARTA S. Y CAFFINI NESTOR O. Panorama actual de las Enzimas Proteolíticas Vegetales. Cátedra de Botánica Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata

GUÍA PARA LA COMPRA DE ENZIMAS Enzyme Development Corporation

139

ANEXOS

hidrólisis de la carne de alpaca

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