hacia el entendimiento del mecanismo de la …
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Tesis presentada para el titulo de Maestría en Química
HACIA EL ENTENDIMIENTO DEL MECANISMO DE LA SUPEROXIDO DISMUTASA DE MANGANESO
SUPERVISOR: JAMES F. WESTON [email protected]
OSCAR GENARO GARCIA BAUTISTA 201110183
BOGOTÁ, COLOMBIA 2012
DECLARACION
Esta tesis es el resultado de una investigación llevada a cabo durante el mes de
octubre del 2011 y el mes de noviembre del 2012, en el departamento de química,
facultad de ciencias, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia.
Excepto dentro de lo especificado de manera explícita, el material presentado en
esta tesis es, dentro de mi conocimiento, original y no ha sido presentada parcial o
totalmente para obtener un título en ninguna universidad.
OSCAR GARCIA
Diciembre, 2012
CONTENIDO
1. Introducción 1
1.1 Especies Reactivas de Oxígeno 1
1.2 Superóxido Dismutasa 2
1.3 Mecanismo General de Dismutación 4
1.4 Manganeso Superóxido Dismutasa 5
2. Propuesta de Trabajo 9
3. Preguntas Abiertas sobre la MnSOD 10
4. Análisis Estructural 14
5. Diseño del Modelo 19
5.1 Reducción Progresiva de Tamaño 19
5.2 Secuencias Potenciales para Péptido-biomimeticas 23
6. Exigencias del Ión Metálico Central 29
6.1 El Comportamiento Redox en la MnSOD 29
6.2 Flexibilidad de la Primera Esfera de Coordinación 31
6.3 Configuraciones Electrónicas posibles para el Manganeso 33
6.4 Consideraciones Teóricas 36
7. Modelo Mínimo 37
7.1 Exploración de la Hipersuperficie del Modelo Mínimo 38
7.2 Posibilidad Bidentada 42
7.3 Puntos de Consideración 46
7.3.1 Análisis Potencial de Reactividad 46
7.3.2 Flexibilidad Rotacional 50
7.3.3 Posibles Reacciones Secundarias 53
7.4 Extensión del Modelo 55
8. Trabajo Futuro 60
9. Conclusiones 66
10. Sumario 68
11. Metodología 69
11.1 Nivel de Teoría Empleado para los Cálculos Computacionales 69
11.1.1 Teoría del Funcional de Densidad 69
11.1.2 Funcional Híbrido Becke-Perdew 70
11.1.3 Conjunto de Base de Dunning 71
11.2 Programas Computacionales para la Ejecución de Cálculos Mecanocuánticos
75
11.2.1 Turbomole 6.4 75
11.2.2 Gaussian 09W 81
11.2.3 Envío de Jobs por PBS-Server 84
11.3 Limitantes en el Análisis Computacional de la Manganeso Superóxido
Dismutasa 88
12. Referencias
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Especies Reactivas de Oxígeno
Las especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en ingles), son moléculas altamente
reactivas que se producen de manera natural como subproductos del metabolismo normal
celular de organismos basados en oxígeno [1-6]. La principal fuente de las ROS son las
mitocondrias y en menor proporción el retículo endoplasmatico, peroxisomas, lisosomas y
cloroplastos (en el caso de las plantas) [7]. Las especies reactivas de oxígeno son necesarias para
los organismos porque son moléculas claves en procesos de la señalización intracelular [8].
Además, las ROS cumplen un papel vital en la protección contra microorganismos invasores
como algunas bacterias y hongos [9-11].
Cuando la concentración de las ROS se incrementa por la alteración de las funciones celulares
normales, a causa de un desbalance entre la producción de estas especies reactivas transitorias
y la habilidad antioxidante de las células, se desencadena el estrés oxidativo [12-17]. Este
fenómeno provoca daño oxidativo en las macromoléculas celulares [18] generando un alto
riesgo tanto en animales como en plantas [19-21]. Este aumento no controlado en la
concentración de las ROS contribuye a un número de procesos patológicos en seres humanos
incluyendo envejecimiento [22-24], apoptosis [25], cáncer [26]; enfermedades neuro-
degenerativas [27]; inflamaciones crónicas [28] y lesión celular durante isquemia y reperfusión
[29-32].
El radical anión superóxido (O2.-) es la más importante de las ROS (Figura 1.1); proviene del
oxígeno molecular mediante la adición de un electrón [33]. Este radical anión es altamente
reactivo en ambiente hidrofóbico como el interior de la membrana [34]; pero carece de
habilidad para penetrar membranas lipídicas y por consiguiente queda en el compartimento
celular donde es producido [35-38]. La alta reactividad química y bajo peso molecular de O2.-
2
permite que reaccione con cualquier biomolécula; en altas concentraciones produce daños que
conllevan a la principal causa del daño oxidativo en las células [39], además es la molécula
precursora de otras especies como H2O2 que pueden penetrar membranas.
En vivo, O2.- se produce tanto enzimáticamente como no-enzimáticamente. Fuentes enzimáticas
incluyen NADPH oxidasas localizadas en la membrana mitocondrial de células
polimorfonucleares, macrófagos, y células endoteliales [40-42]. La producción no enzimática de
O2.- ocurre cuando un solo electrón se transfiere directamente al oxígeno por coenzimas
reducidas a grupos prostéticos o por xenobióticos previamente reducidos por ciertas enzimas
[43]. Aunque O2.- se produce como subproducto metabólico, las cantidades en un organismo
pueden ser sorprendentemente altas. Bajo condiciones de estrés ambiental, la concentración
momentánea de este radical anión puede alcanzar hasta 1-5 % del oxígeno consumido por los
seres humanos [44].
1.2 Superóxido Dismutasa
Para protegerse, los organismos han desarrollado una familia de metaloenzimas denominadas
las superóxido dismutasas (SOD) que son capaces de captar y detoxificar el O2.- [45]. Las SODs
actúan como la primera línea de defensa en contra de las ROS, captando el O2.- y catalizando su
dismutación a oxígeno molecular y H2O2 [46]. Se encuentran las SOD en todas las formas de vida
conocidas y su evolución fue probablemente provocada por la producción de O2 en organismos
fotosintéticos alrededor de dos billones de años atrás [47]. Las concentraciones más grandes de
las SODs se encuentran en las mitocondrias y en los cloroplastos; además los organismos
superiores también acumulan SODs en otros compartimentos donde la producción metabólica
de O2.- es relativamente alta (microsoma, peroxisoma, glioxisoma, matriz extracelular y citosol).
Esto es importante porque O2.- es impermeable a la membrana y debe ser detoxificado en el
mismo compartimento donde es formado [48]. Esta clase de enzimas es tan importante, que ha
evolucionado por lo menos tres veces de manera independiente dando origen a tres familias
extremadamente heterogéneas y basadas en secuencias peptídicas muy distintas [49]. Hoy en
día, se clasifica estas enzimas según las estructuras de sus sitios activos y los diferentes
cofactores metálicos que contienen: (Cu/Zn), Ni y (Fe, Mn) SOD.
Las cobre-zinc superóxido dismutasas (Cu/ZnSODs) se encuentran en todas las especies aerobias
y algunas bacterias anaerobias, son típicamente homodímeros y el núcleo de la estructura
proteica presenta una conservación muy definida, algo aplanada con β-pliegues antiparalelos
*50+. El sitio activo se ubica en el lado externo del β-pliegue para cada subunidad, y en la parte
inferior de un estrecho canal definido por dos unidades de proteínas que unen a dos iones
metálicos Cu y Zn mediante un ligando imidazol de la histidina [51] (Figura 1.2). El puente
3
imidazol es el ligando clave para mantener la estabilidad del centro bimetálico y es un motivo
estructural único en la naturaleza. El ion cobre cicla entre los estados CuI y CuII durante la
catálisis y es el centro de la actividad redox [52]. El cobre tiene un ambiente de coordinación
distorsionado con cuatro histidinas formando la base de una pirámide cuadrada. Una unión
débil con una molécula de agua forma la punta de la pirámide. El ion zinc exhibe su
coordinación tetraedral natural y junto con la histidina del puente, presenta dos ligandos
histidina y un aspartato. El zinc no contribuye directamente a la actividad catalítica y su papel
parece estar ligado a mantener la independencia del pH, además contribuye considerablemente
a la estabilidad estructural. Mutaciones que desestabilicen o remuevan el zinc son directamente
conectados a la enfermedad genética de Lou Gehrig en seres humanos [53].
La segunda familia de las SODs contiene un ión níquel como cofactor y fue la última familia en
ser descubierta en 1996 [54]. El ión níquel se encuentra rodeado y cubierto por el sitio activo,
poniéndose al fondo de un estrecho canal que tiene una profundidad de 20 Å [55]. Este limita el
acceso al sitio activo a moléculas muy pequeñas como O2.-, O2, y H2O2. Estudios
espectroscópicos muestran que el metalocentro en la NiSOD cicla entre estados diamagnético
Ni(II) y paramagnético NiIII; cambiando el número de ligandos como una función del estado de
oxidación [56]. El níquel en su estado reducido (NiII) tiene geometría cuadrada planar y el ión
metálico coordina dos átomos de nitrógeno del esqueleto (His 1 y Cys 2); así como los grupos
4
tiolatos de Cys 2 y Cys 6 (Figura 1.2). En la forma oxidada (NiIII), un imidazol (que proviene de la
cadena lateral de la histidina) funciona como un quinto ligando axial flexible, el cual encierra
una geometría de coordinación piramidal cuadrada. Una característica de las NiSODs es que el
ambiente de coordinación establece que las estructuras en fase sólida contienen una mezcla
NiII/NiIII en relación 50/50 [57]. Hasta el momento, se conocen las estructuras de solamente dos
variantes de la NiSOD; aunque ambas tienen el mismo sitio activo, las características del canal
electrostático difieren significativamente en ambas estructuras [58]. Una de las estructuras
posee un sistema guiado de tres residuos de Lisina cargados positivamente, mientras que la otra
estructura no evidencia guía electrostática [59]. En ambas estructuras de la NiSOD, el sitio de
unión del níquel es localizado en la parte inferior del canal y se compone de una secuencia de
nueve aminoácidos His1-Cys2-X3-X4-Pro5-Cys6-Gly7-X8-Tyr9. Esto se conoce como el “gancho
de níquel”, siendo seis de los nueve aminoácidos altamente conservados en la estructura
proteica de esta familia de las superóxido dismutasas [60].
Las hierro y manganeso superóxido dismutasas (FeSOD y MnSOD) están presentes en células
eucariotas y en algunas bacterias. Se consideran una sola familia debido a su alto grado de
homología estructural. En bacterias son típicamente homodímeros, los cuales pueden contener
ambos iones Fe y Mn [61]. Una forma tetramérica se encuentra en seres superiores; la mayoría
de las plantas prefiriendo FeSOD y la mayoría de los animales MnSOD [62]. Durante la catálisis,
el ion metálico central cicla entre los estados MII y MIII. En ambos estados de oxidación el ion
metálico prefiere un ambiente trigonal bipiramidal y es unido a tres hístidinas, un aspartato y
una molécula de agua ó ligando hidroxilo (Figura 1.2).
1.3 Mecanismo General de Dismutación
Aunque las diferentes familias de las SODs son bastantes heterogéneas desde el punto de vista
estructural, todas las SODs conocidas empelan el mismo mecanismo general redox tipo “ping-
pong” [63] (Figura 1.3). En la primera semireacción, la forma oxidada de la enzima intercepta un
anión radical O2.- y extrae un electrón para provocar la formación de oxígeno molecular:
[SODM(n+1)] + O2-. [SODM(n)] + O2 [SODM(n+1)] + O2-. [SODM(n)] + O2
Esto resulta en la reducción del centro metálico Mn+1 hasta Mn. Esta etapa redox depende solo
de la unión del sustrato con el ión metálico y subsecuentemente de la transferencia electrónica
y es favorable cinéticamente [64]. En la segunda semireacción, otro radical superóxido es
reducido a H2O2 y conlleva a la re-oxidación del centro metálico (Mn Mn+1). Este requiere la
presencia de una fuente de dos protones para convertir el radical anión superóxido en peróxido
de hidrógeno [65]:
5
[SODM(n)] + O2-. + 2H+ [SODM(n+1)] + H2O2 [SODM(n)] + O2-. + 2H+ [SODM(n+1)] + H2O2
En ausencia de la catálisis enzimática, esta semireacción es extremadamente desfavorable [66].
No obstante, mediante el suministro de protones el sitio activo de la enzima se promueve y
acelera significativamente esta etapa [67].
Este mecanismo global “ping-pong” no es del todo satisfactorio, debido a que se forma H2O2
como producto intermedio en la segunda semireacción. Esta especie forma parte de las ROS y
actúa también de manera dañina para la célula. El anión radical superóxido O2. - es una molécula
cargada y, por ende, es impermeable a la membrana celular (como se menciono en el sección
1.1), mientras que el peróxido de hidrógeno es neutro y en altas concentraciones penetra la
membrana causando daños en la estructura interna de la célula por difusión. Estas especies
reactivas de oxígeno actúan por velocidades de difusión y el control de la concentración de
estas en la célula resulta fundamental para salud celular. Para detoxificar el H2O2, las superóxido
dismutasas normalmente trabajan en conjunto con otro grupo de enzimas, conocidas como las
catalasas [68].
A pesar de conocer el mecanismo general de la superóxido dismutasas, los procesos
moleculares que determinan las reacciones químicas individuales aun son poco conocidos.
También se carece en los estudios de un análisis completo de las interacciones específicas que
ocurren en el sitio activo de la enzima.
1.4 Manganeso Superóxido Dismutasa
Durante la última década, se ha estudiado el mecanismo de reacción de las MnSODs reportando
alrededor de 1500 publicaciones en solo el componente de química. Esas investigaciones
multidisciplinarias incluyen estudios cristalográficos, mutaciones selectivas, estudios cinéticos,
Figura 1.3 Mecanismo global redox “ping-pong” característico de todas las superóxido dismutasas conocidas. Tomado de la literatura [62].
6
uso de inhibidores, medición de los potenciales estándar de reducción y simulaciones
computacionales, entre otros [69]. Aunque estamos todavía muy lejos de entender este sistema
de forma global, la Figura 1.4 contiene el modo de acción de la MnSOD como se entiende
actualmente.
En el banco de proteínas (PDB, por sus siglas en ingles) existen actualmente 45 estructuras
cristalinas para la manganeso superóxido dismutasa [70]. Todas las estructuras proteicas
concuerdan que el sitio activo de la enzima tiene un ambiente trigonal bipiramidal con dos
histidinas y un aspartato en el plano ecuatorial y una histidina y una molécula de solvente (agua
o hidroxilo) en el eje axial (Figura 1.2). Bajo condiciones fisiológicas, la forma preferida de la
enzima es la estructura A en la Figura 1.4 con el ión central en su estado oxidado MnIII [71].
Aunque no se puede diferenciar entre un ligando hidroxilo y un ligando de agua en una
estructura en fase sólida (rayos X), estudios computacionales indican que el ligando hidroxilo
está presente en la forma oxidada A [72].
El ciclo catalítico empieza cuando la especie A acepta de manera reversible un O2·- para formar
7
un sistema hexacoordinado [MnIII(OH)O2·-SOD] (Especie B, Figura 1.4). Estudios
espectroscópicos e investigaciones teóricas demuestran que la esfera de coordinación del Mn
en A es flexible y la forma pentacoordinada puede aceptar fácilmente un ligando adicional para
formar la especie hexacoordinada B [73]. Soporte experimental adicional para la especia B es la
existencia de varios complejos de la MnSOD con inhibidores pequeños como F- y N3- [74].
Estructuras en fase sólida demuestran la presencia de MnIII hexacoordinado con el inhibidor (F-,
N3-) ocupando un sitio de coordinación ecuatorial. Este es el sitio de coordinación que se postula
para el O2·- [75].
La transferencia de un electrón del sustrato hacia el MnIII resulta en la reducción del manganeso
con liberación de oxígeno molecular. Este restablece la geometría trigonal bipiramidal preferida
(Especie C, Figura 1.4). La reducción/oxidación reversible de la MnSOD es posible usando
métodos electroquímicos y el potencial estándar de la pareja MnIII/MnII en la MnSOD está en el
orden de 1.01V [76]. También existen estructuras de la forma reducida C en fase sólida [77].
Estudios computacionales indican que el ligando de solvente en este intermediario es
probablemente H2O debido a un decrecimiento en la fuerza de enlace MnII-Osolv en comparación
con un enlace MnIII-Osolv [78]. La fuente exacta del protón requerido está bajo investigación;
varios estudios consideran que el grupo hidroxilo de una tirosina en la segunda esfera de
coordinación en la enzima es el intermediario que otorga el protón [79-80].
Se inicia la segunda semireacción cuando la forma reducida C acepta otro O2·- de manera
reversible con una constante de velocidad k3≈k2 para formar un intermediario D [81]. Todavía
no es clara la estructura del intermediario D. Muy probablemente esto tiene un esférico de
coordinación octaédrica; algunos estudios espectroscópicos/computacionales indican que un
ambiente octaédrico bajo la teoría del campo cristalino posee simetría en los orbitales y por
ende estabilidad en el sistema (Figura 1.5). De todas maneras, existe una competencia cinética
entre el complejo pentacoordinado C y la especie D [82].
Estudios espectroscópicos también indican la presencia de un segundo equilibrio que involucra
el intermediario D. Este está en equilibrio con una forma hexacoordinada inactiva E (Figura 1.4)
[83], que lentamente vuelve a su forma activa para seguir el ciclo catalítico redox. En este
momento surge la pregunta si el O2·- coordina de manera asociativa en el plano ecuatorial del
ambiente octaédrico; o por el contrario se desplaza el ligando de solvente, volviendo el ión
metálico a su ambiente trigonal bipiramidal. Una alta concentración del radical anión
superóxido promueve la formación de la especie E desplazando aun más el equilibrio hacia la
forma inactiva, con una reducción importante en la concentración de la especie D [84]. Este
equilibrio entre una forma activa y una forma inactiva es particular para la MnSOD, y es una de
las pocas diferencias que tiene con las FeSODs [85]. En el caso de FeSOD no hay reporte de la
8
forma inactiva por adición del sustrato al ion metálico central en estado reducido [86-87]. De
todas maneras; la forma activa D acepta dos protones para formar H2O2 bajo transferencia de
un electrón desde el ion metálico hacia el sustrato. Estudios cinéticos indican que esta etapa
probablemente representa el paso limitante del ciclo catalítico [88]. El origen de los protones
aun no es claro, se presentan diversas hipótesis soportadas por cálculos computacionales que
provienen de la segunda esfera de coordinación [89]. Residuos de la cadena polipeptídica en la
segunda y tercera esfera como tirosina, glutamina, y triptófano son claves para suministrar los
protones [90]. Otro aspecto alternativo bajo discusión para la protonación son las moléculas de
solvente que rodean el sitio activo [91].
Otro enfoque del desarrollo momentáneo en este campo se dedica a la pregunta: ¿Por qué la
sustitución de Mn por Fe (o viceversa) en la mayoría de las SODs resulta en la pérdida total de la
actividad catalítica [92] cuando las estructuras del sitio activo (primera esfera de coordinación
del ión metálico central) son idénticos [93]? Solo un pequeño conjunto de enzimas
denominadas “cambialisticas” funcionan con ambos iones metálicos *94+. Las primeras
indicaciones para una explicación posible de este fenómeno se basan en una modulación en el
potencial estándar de la pareja MnIII/MnII producido por efectos en la segunda y tercera esfera
de coordinación donde empiezan las diferencias estructurales entre las MnSODs y las FeSODs
[95].
Aunque el desarrollo de las investigaciones ha dado mucha información relevante, resultando
en el modo de acción general ilustrado en Figura 1.4, todavía falta mejor comprensión sobre
detalles críticos en la acción de la MnSOD.
9
2. PROPUESTA DE TRABAJO
La investigación se enfoca en:
1. Analizar la literatura actual sobre las MnSODs, con enfoque especial en la carencia de
detalles específicos del modo de acción y las preguntas abiertas sobre este.
2. Analizar las estructuras conocidas en fase sólida de las MnSODs que están depositadas
en el banco de datos de proteínas (PDB).
3. Diseñar un modelo teórico adecuado del sitio activo.
4. Estudio teórico soportado en cálculos mecanocuánticos DFT.
5. Seguir explorando la hipersuperficie de energía potencial de la MnSOD, contribuyendo
de esta manera a nuestro conocimiento de los detalles mecanísticos de esta clase de
metaloenzimas.
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3. PREGUNTAS ABIERTAS SOBRE LA MnSOD
La manganeso superóxido dismutasa tiene un sitio activo protegido por los residuos de las
subunidades proteicas, manteniendo interacciones no-covalentes por enlaces de hidrógeno
entre las moléculas de solvente y los aminoácidos de la segunda esfera de coordinación. Los
ligandos de la esfera interna se mantienen estables durante el mecanismo redox y se cree que la
entrada del sustrato se hace en un sitio específico dirigido por el canal electrostático.
Infortunadamente, debido a la velocidad extrema en el límite de difusión de este sistema
todavía no hay métodos instrumentales que tengan la sensibilidad suficiente de analizar in vivo
ó en vitro el enlazamiento de O2·- de manera directa. Por este motivo, se realizan simulaciones
computacionales que permitan ver los cambios geométricos y electrónicos en la esfera interna y
externa de la MnSOD.
El mecanismo de reacción para la dismutación para MnSODs indica una dependencia alta del
ambiente de coordinación del ion metálico central. Como el manganeso cicla entre un ambiente
trigonal bipiramidal y octaédrico puede darse cuatro tipos de mecanismo básicos [96]:
asociativo, segunda esfera, sustitución directa y disociativo-asociativo (Figura 3.1).
El mecanismo asociativo es la unión directa del radical anión superóxido a la especie
pentacoordinada A. Este resulta en una especie hexacoordinada B (Figura 3.1) bajo expansión
de la esfera de coordinación [97]. Algunos estudios computacionales reportan que, en este
mecanismo el sustrato se posiciona en el plano ecuatorial suministrando un electrón al ion
metálico para cambiar el estado de oxidación de MnIII a MnII [98-99].
El mecanismo de la segunda esfera involucra fragmentos moleculares de los aminoácidos de la
segunda esfera de coordinación; la interacción del radical anión superóxido con el ion metálico
central no es directa (estructura C en Figura 3.1). Se piensa que la red de enlaces de hidrógeno
entre las cadenas laterales de los aminos positivamente cargados en el canal electrostático
forma una “bolsillo” en la segunda esfera capaz de aceptar y fijar O2.- [100]. Entre los
aminoácidos capaces de participar en esto son la tirosina (Tyr), triptófano (Trp), histidina (His) y
glutamina (Gln). Se ha observado espectroscópicamente que la modificación geométrica de
estos aminoácidos reduce críticamente la actividad catalítica [101]. Además mutaciones de
estos residuos alteran la protonación del radical anión superóxido [102].
El mecanismo de sustitución directa es el reemplazamiento del ligando de disolvente por el
sustrato O2.-. Esto podría ocurrir en una etapa para formar la especie D en Figura 3.1. No
obstante, un mecanismo alternativo de dos etapas (disociación/asociación) es la pérdida del
ligando de disolvente bajo coordinación de grupo carboxilato perteneciente al ácido aspártico
11
para generar especie E, que es un complejo pentacoordinado con un ligando bidentado. Luego
entra el sustrato para formar la especie D. Este mecanismo posible ha sido poco estudiado,
porque no se comprende claramente el cambio de un ambiente de coordinación trigonal
bipiramidal a una piramidal cuadrado [103], que en cualquiera de las dos opciones modificaría
las interacciones electrónicas en el ión central por un cambio de la geometría. Aunque se
desconoce con exactitud en qué posición pueda unirse el sustrato, varios estudios
computacionales lo ubican en el plano ecuatorial [104].
Una complicación adicional en estos mecanismos básicos es la posibilidad de dos modos
diferentes con que el sustrato (O2·-) pueda interactuar con el ión central. La entrada del sustrato
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puede ser de tipo “side-on”, que es el enlazamiento de los átomos de oxígeno al ion metálico
en posición ecuatorial (Figura 3.2) [105]. Esta interacción, dejaría una especie heptacoordinada
en el sitio activo, que sería poco accesible para investigaciones experimentales. El otro modo de
coordinación es tipo “end-on” (Figura 3.2). Todas las estructuras en fase sólida de la MnSOD (y
de la FeSOD) de complejos con inhibidores como F-, N3-, etc., muestran esta coordinación “end-
on”, que tiene un oxígeno terminal por la interacción directa del sustrato con el ión metálico
[106]. Este modo ha sido estudiado de manera computacional [107]; falta completamente en la
literatura computacional un estudio de la posibilidad del enlazamiento tipo “side-on”. Es posible
que la existencia de una especie inactiva E en equilibrio con la especie activa D podría ser
debido a un intercambio reversible entre estos modos de coordinación.
Un fenómeno que aun no es claro es la protonación del sustrato (O2·-) en la segunda etapa
redox. Este requiere la transferencia de dos protones. Esta transferencia podría ocurrir a la vez
[108] ó, por el contrario, podría ser un mecanismo de transferencia sucesiva. En el último caso,
la transferencia de un protón resultaría en la formación del radical HOO· que probablemente
está ligado al ión central en el modo “end-on”. Un estudio computacional indica que un metalo-
intermedio tipo HOO-Mn es un intermedio viable en el ciclo catalítico [109]. Transferencia del
segundo protón resulta en la formación del H2O2. La fuente de estos dos protones también es
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incierta; se cree que uno de estos es transferido de los residuos en la segunda esfera de
coordinación y el otro se origina de la molécula de agua enlazada al ion metálico.
Un problema en analizar el mecanismo de la metaloenzima son los enlaces de hidrógeno que
son fundamentales para el arreglo geométrico adecuado a la sintonización de la molécula de
sustrato (O2·-) en cualquiera de las rutas dadas para la dismutación a H2O2 y O2. Por la
conservación de la geometría de la esfera interna de la MnSOD, se considera que la naturaleza
bidentada del ligando carboxilato en el ácido aspártico promovería la eliminación previa del
solvente para mejorar la sintonización directa del O2·- al ión metálico.
14
4. ANALISIS ESTRUCTURAL
De las 45 estructuras de la manganeso superóxido dismutasa depositado en el banco de datos
proteína PDB [110], 28 corresponden a eucariotas y 17 son para bacterias. Separándolas por
organismos, 27 corresponden a Homo sapiens, 11 a Escherichia coli, y el resto corresponde a
otras bacterias (T. thermophilus, D. radiodurans, A. fumigatus, Nostoc sp. PCC 7120 y V.
halodenitrificans). En seres humanos, la MnSOD existe en forma de un homotetrámero de 22
kDa (Figura 4.1). En contraste a esta, las bacterias prefieren una configuración homodimérica.
Aparte de esta particularidad; la homología en la secuencia proteica y la estructura del sitio
activo es tanto que igual si provienen de la forma humana o bacteriana, son altamente
conservadas en la región del cofactor metálico.
Una superposición de todas las estructuras conocidas revela que esta homología se extiende a
la tercera esfera de coordinación (Figura 4.2). En la forma reducida (MnIISOD) y oxidada
(MnIIISOD), la primera esfera de coordinación permanece intacta y el ión metálico central
prefiere una geometría trigonal bipiramidal. La única diferencia entre las formas reducidas y
oxidadas es una modificación del ligando de solvente (H2O vs OH) [111]. El sitio activo de la
MnSOD se encuentra encapsulado en una forma de bolsillo al fin de un canal electrostático muy
estrecho; de este modo, solo se permite el acceso a pequeños aniones por la naturaleza de los
residuos de la esfera externa de coordinación en la secuencia peptídica.
Aparte de los ligandos de la primera esfera de coordinación (His26, His74, His163, Asp159)1, hay
1 En este trabajo se utiliza la numeración de la secuencia en la forma mitocondrial humana de la MnSOD. Otras formas (bacteriana, FeSOD, etc) contienen los mismos residuos pero con otra numeración
Figura 4.1 Estructura de la manganeso superóxido dismutasa. En la izquierda es la forma dímerica bacteriana (1JR9). En la derecha es la forma tetrámerica humana (1PL4)
E. coli humanos
15
ocho residuos extremadamente importantes y altamente conservados en la MnSOD (Gln143,
Tyr34, His30, Trp123, Tyr166, Gly70, Ile22, Leu25, Tyr176) que alinean el canal electrostático y
forman una especifica red de enlaces de hidrógeno para la sintonización con el radical anión
superóxido [112]. Se sospecha que esta red funciona como donor de protones, transportando
protones del medio al sitio activo según sea necesario [113].
Hay dos interacciones estabilizantes entre el ligando de solvente en la primera esfera de
coordinación y residuos peptídicos en la segunda esfera. Estos son puentes de hidrógeno con el
carboxilato de Asp159 y con el grupo amida de Gln143. Gln143 es un residuo llave; mutación
específica (Gln143 Asn143) resulta en una inhibición casi total de la MnSOD [114]. Esta es
acompañada con cambios estructurales pequeños pero significativos. El grupo amido es
desplazado 1.7 Å mas distante que en la enzima nativa y además el grupo hidroxilo de la Tyr 34
ubicado en la cadena lateral también se desplaza hasta 0.6 Å mas distante del metal [115]. La
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glutamina (Gln) es una base débil con un pKa de 9.13, esto se debe a que tiene un grupo amido
adicional que le lleva a ser receptor de protones del medio. Esta consideración es importante
porque puede guiar la red de enlaces de hidrógeno para estabilizar la carga del sitio activo.
Por otra parte, se sospecha que la Tyr34 es el residuo que otorga uno de los protones necesario
para la formación de H2O2 en la segunda etapa del círculo catalítico [116]. Mutación selectiva de
este aminoácido (Tyr Phe) también resulta en una inhibición total de la enzima [117-118]. El
residuo de Tyr34 juega un papel estructural y catalítico importante. Sustituciones de Tyr34 con
cinco diferentes aminoácidos retienen la estructura básica del sitio activo [119], pero causan un
sustancial decrecimiento en la constante de velocidad para la reducción del superóxido. Las
estructuras del estado sólido para la MnSOD muestran una molécula de agua situada en la
segunda esfera entre Tyr34 e His30. Se postula que esta H2O otorga (junto con Tyr34) el otro
protón necesario para la producción de H2O2 [120]
Un residuo conservado adicionalmente es Trp123, el cual se posiciona a un lado de la cavidad
del sitio activo. Este residuo no es importante para la primera semireacción (oxidación) pero ha
demostrado que contribuye de manera significativa de la segunda semireacción (reducción)
[121]. Su aparente rol es ayudar a la disociación del producto (H2O2) del sitio activo; mutaciones
de este residuo exhiben un gran incremento en la concentración de la especie inactiva E (Figura
3.1). Interesantemente, mutación de His30 y Tyr166 en MnSOD elimina la producción de la
forma inactiva E. En adición, estas mutaciones tienen potentes efectos antitumorales [122].
Otro residuo altamente conservado es la Gly70 que hace un puente de hidrógeno con el anillo
imidazol de la His74 en la primera esfera de coordinación. Se sospecha que su papel es la
estabilización del centro metálico.
Además existen interacciones adicionales que ayudan a comprender una parte de los enlaces de
hidrógeno entre los aminoácidos altamente conservados. Leu25 y Ile22 direccionan dos
moléculas de agua hacia el ligando primario de His26 [123]. Al otro lado del sitio activo, Tyr166 y
Tyr176 bloquean efectivamente el canal electrostático, limitando el ingreso a solamente
moléculas muy pequeñas como el sustrato O2·- e inhibidores como F- o N3- [124]. Esta
característica es muy importante para idear un mecanismo de dismutación. Del mismo modo, el
oxígeno del grupo carboxilato del ligando primario His26, tiene una interacción con el hidrógeno
de un grupo α-metileno con respecto al anillo imidazol de la His30. Este protón ligeramente
ácido sintoniza el residuo His30 para acercarlo al centro metálico. Las interacciones de
heteroátomos como oxígenos y nitrógenos a hidrógenos enlazados al átomo de carbono se
denominan enlaces de hidrógeno no clásicos (Figura 4.3).
La homología estructural entre la MnSOD y la FeSOD va mas allá de la primera esfera de
coordinación [125], aunque la actividad catalítica se ha demostrado de ser especifica al metal;
17
Figura 4.3 Tipos de enlace de hidrógeno
es decir la sustitución de Mn por Fe (o viceversa) destruye completamente la actividad catalítica
*126+. Esto puede explicarse por un efecto “fine-tuning” en el potencial redox del ión metálico
central, causado por diferencias sutiles pero importantes en la estructura del sitio activo en la
Figura 4.4 Solapamiento de los modelos del sitio activo de FeIIISOD (oscuro) y Mn(III)SOD
(claro). Tomado de la literatura [125]. Se utilizó la numeración de la secuencia
MnSOD mitocondrial humana.
18
Segunda esfera de coordinación [127].
Un solapamiento del sitio activo de las estructuras en la fase sólida de la MnSOD y la FeSOD
(Figura 4.4) demuestra que el residuo Gln 143 se encuentra 0.17 Å más distante del ión metálico
en la MnSOD que en la FeSOD [128]. Un estudio computacional indica que este cambio
estructural mínimo es probablemente suficiente para inducir un cambio relativamente alto en el
potencial redox del ión metálico. Los resultados del intercambio de ion hierro por el ion
manganeso tiene un potencial medio redox (E0) bastante bajo. Al contrario manganeso
sustituyendo hierro tiene E0 bastante alto [129]. Los dos casos impiden la sintonización del O2-·
al centro metálico en la enzima.
No obstante, existe un pequeño conjunto de enzimas denominadas “cambialisticas” (muy raras
en la naturaleza) donde los cofactores metálicos (Mn/Fe) son intercambiables [130]. Un estudio
atribuye este fenómeno a que hay una pseudo-sustitucion y no se altera el potencial redox
dramáticamente [131]. Es decir, que los ligandos mantienen la distancia de enlace como en la
enzima nativa, aunque se incremente o disminuya el aporte de la esfera interna y la segunda
esfera de coordinación por las características electrónicas del ion metálico.
19
5. DISEÑO DEL MODELO
5.1 Reducción Progresiva del Tamaño
La manganeso superóxido dismutasa es una biomolécula relativamente grande. En la secuencia
peptídica de cada subunidad proteica de la MnSOD hay 3098 átomos que pertenecen a los
aminoácidos y 680 moléculas de agua (Figura 5.1). Debido a su tamaño, un modelo
computacional que incluye todos los residuos pertinentes para la catálisis es imposible a
realizar.
La investigación de mecanismos químicos a nivel molecular requiere un método computacional
relativamente sofisticado; para obtener resultados de confianza, por lo menos se requiere el
uso de un método de funcional de densidad (DFT). Aun con acceso a los mejores recursos
computacionales, esto restringe el sistema bajo consideración a solamente algunos cientos de
átomos. Para este trabajo, los recursos disponibles limitó el estudio a cerca de 100 átomos, una
fracción muy pequeña de la MnSOD. Por eso, se analizó la estructura en fase sólida de la
MnSOD de una forma que permitió el desarrollo de un modelo pequeño del sitio activo.
Figura 5.1 Subunidad proteica de la manganeso superóxido dismutasa (PDB, 1PL4). Los puntos rojos indican moléculas de agua
20
Primero se hizo un corte esférico con radio 8.3 Å centrado en el cofactor metálico. De esta
manera, se redujo el sistema hasta la cuarta esfera de coordinación (Figura 5.2). Este contiene
437 átomos que pertenecen a los aminoácidos rodeando el ión metálico y 9 moléculas de agua.
La cuarta esfera se toma como un tamaño suficiente para analizar los cambios geométricos y
electrónicos del sitio activo de la MnSOD por una compleja red de interacciones no covalentes
como enlaces de hidrógeno. Adicionalmente a todos los residuos conocidos de ser involucrados
de una manera u otra en el círculo catalítico: los ligandos primarios (His26, His 74, His 163 y
Asp179) y los residuos altamente conservados en la segunda y tercera esfera de coordinación
(Gln143, Tyr34, His30, Trp123, Tyr166, Gly70, Ile22, Leu25, Val160 y Tyr176); la cuarta esfera de
coordinación contiene cinco residuos adicionales (Glu162, Ile158, Ser121, His27 y Asn142).
Estos aminoácidos pertenecen a la cadena peptídica de esferas internas. Por esta razón, ayudan
a sintonizar la entrada del sustrato (O2·-) o pequeños aniones, en un canal de entrada cargado
positivamente en la esfera interna.
Siendo todavía demasiado grande para un estudio computacional, se redujo el tamaño de corte
a 6.7 Å. Este pertenece a la tercera esfera de coordinación que contiene 274 átomos (Figura
5.2). El cierre molecular completo del sitio activo de la MnSOD se logra a partir de la tercera
esfera de coordinación [132]. Todavía se incluye la pared aromática producida por la presencia
Figura 5.2 Esferas de coordinación de la manganeso superóxido dismutasa. Visualización en Molegro Virtual Docker (versión de prueba)
21
de Phe77 y Trp78 pero las interacciones no covalentes de la cuarta esfera (Glu162, Ile158,
Ser121, His27 y Asn142) con la tercera esfera se eliminaron.
Un corte adicional 6.7 Å 4.5 Å comienza a discutirse. Este corte todavía incluye una pared
aromática producida por la presencia de Trp123 pero con la eliminación de los residuos de la
tercera esfera de coordinación (His31, Gly70, Asn73, Phe77, Trp78 y Val160) se interrumpe la
red estabilizante de enlaces de hidrógeno que forma parte intrínseca del canal electrostático
que conecte el sitio activo con la superficie de la enzima. Ni siquiera, este corte todavía contiene
las interacciones estructurales-electrónicas más importantes para la realización de la catálisis.
Este corte contiene 176 átomos y representa un modelo computacional ideal para la MnSOD,
aunque constituye el límite para cálculos DFT. Por ser un sistema todavía extremadamente
grande, es recomendable reducirlo aun más para estudios iniciales de la hipersuperficie.
Un corte adicional (radio 2.2 Å) redujo el sistema a solamente los cuatro aminoácidos de la
esfera primaria de coordinación, (Figura 5.3). Tomando esto como un punto de partida para el
desarrollo de modelos computacionales adecuados para dar inicio a un estudio teórico del
modo de acción de la MnSOD, se eliminó todas las cadenas alifáticas para considerar solamente
un ion de manganeso con ligandos imidazoles e ión acetato (Modelo M1 en Figura 5.4).
Optimizaciones iniciales usando métodos DFT del modelo M1 (Figura 5.4) con los recursos
computacionales disponibles resultaron bastante extensos.
Para analizar el mecanismo redox disociativo entre la MnSOD y O2·-, se requiere un sistema que
converja suficientemente rápido para hallar todas las conformaciones moleculares estables y
finalmente considerar las interacciones especificas en todos los intermediarios, estructuras
transicionales y productos. Teniendo en cuenta la flexibilidad del ión metálico en cambiar su
Figura 5.3 Sistema de la primera esfera de coordinación de la manganeso superóxido
dismutasa
22
Figura 5.4 Los modelos mínimos empleados en este trabajo para iniciar un estudio computacional de la manganeso superóxido dismutasa
ambiente de coordinación para formar especies pentacoordinadas, hexacoordinadas y hasta
heptacoordinadas se necesita un modelo para cálculos relativamente rápidos con los recursos
disponibles.
Se puede optimizar el modelo M1 (Figura 5.4) aun más desde el punto de vista computacional y
la necesidad para la convergencia rápida en los cálculos iniciales. Lo que interacciona
directamente con el ión metálico es el nitrógeno de hibridación sp2 del imidazol y por
consiguiente, se puede reemplazar los anillos imidazoles con amoniaco porque esta sustitución
no modifica el ambiente de coordinación del manganeso. Además de puede reemplazar el ión
acetato por un ión formiato resultando en el modelo mínimo M2 (Figura 5.4).
En el trabajo presente esto será el modelo inicial de exploración de la hipersuperficie de energía
potencial, que daría algunas predicciones de las contribuciones de los ligandos hacia el ion
metálico. Además, permitirá la estimación de la estabilidad relativa de los intermediarios,
estructuras transicionales y productos hallados en la hipersuperficie en dependencia de ciertas
características fundamentales del ión metálico central (estado de oxidación, multiplicidad,
ambiente coordinativo, campo electrostático, estado de protonación (OH- vs H2O), etc.).
Presenta tres ligandos de amoniaco (uno en posición axial y dos en posición ecuatorial), un
ligando formiato (en posición ecuatorial) y un ligando agua o hidroxilo (en posición axial). En
trabajos futuros en el marco de un trabajo doctoral, se extendería este modelo mínimo sobre
M2 hasta incluir tantos residuos e interacciones adicionales como sean posibles en el corte
enzimático con radio de 4.5 Å.
23
5.2 Secuencias Potenciales para Péptido-biomimeticas
En el caso de la níquel superóxido dismutasa (NiSOD), todos los residuos importantes en la
coordinación del ión central (Ni) y en la catálisis de dismutación del O2·- vienen de una secuencia
muy corta de aminoácidos altamente conservados *133+. Conocido como el “gancho de níquel”,
peptidomímeticos basados en esta secuencia son biomimeticos funcionales de la NiSOD [134].
En contraste a esto, péptidobiomimeticos funcionales son desconocidos para la MnSOD. No
existe en la actualidad reportes de un compuesto con actividad SOD con base en el cofactor
metálico y una secuencia corta peptídica. A diferencia de la NiSOD, los residuos de la primera
esfera de coordinación y los residuos conservados responsables para las interacciones
esenciales en la segunda y tercera esfera de coordinación vienen de diferentes partes de la
secuencia peptídica. Un ejemplo son los residuos Ile22 y Tyr176. El plegamiento peptídico
posiciona estos residuos en el sitio activo, aunque hay 154 aminoácidos de separación entre
ellos en la secuencia peptídica.
Existe en el grupo de trabajo del Profesor Weston un interés grande en el desarrollo de
secuencias peptídicas cortas capaces de ser “ganchos” para manganeso como en el caso de la
NiSOD. Se requiere secuencias únicas que interactúan (acomplejan) con un ión manganeso,
creando así la esfera interna del sitio activo y tantas de las interacciones secundarias que sean
necesarias para generar una actividad SOD. El diseño de una secuencia adecuada representa un
desafío grande.
El primer criterio para un gancho es el diseño de una secuencia peptídica corta que ofrece las
tres histidinas y el ácido aspártico necesario para establecer la esfera primaria de coordinación
(Figura 5.5). Naturalmente, lo más sencillo era simplemente tomar una secuencia de estos
cuatro aminoácidos tipo: His-His-His-Asp, His-His-Asp-His, etc. Tomando las cuatro
permutaciones posibles, en este trabajo se evaluó sus capacidades de interactuar con el ión
manganeso desde el punto de vista de consideraciones estéricas. Aunque cálculos al nivel de
mecánica molecular no son adecuados para la investigación de fenómenos químicos, si dan una
revisión estructural conveniente para estimar si los efectos estéricos permitirían la construcción
de un ambiente coordinativo del ión manganeso.
24
Escogiendo el método de mecánica molecular (MM) [135] y algoritmo (UFF) [136]
implementado en el programa MacMol (versión libre) [137], se investigó la hipersuperficie de la
interacción con MnIII con la secuencia His-His-His-Asp (y todas las permutaciones posibles),
buscando configuraciones estables. Todas estas optimizaciones resultaron en complejos muy
rígidos y poco estables. Estas secuencias tan cortas simplemente no dan una flexibilidad
estructural suficiente para permitir el establecimiento de la coordinación trigonal bipiramidal
requerido por el manganeso. En consecuencia es necesario expandir la secuencia para incluir
residuos enlazantes para:
1. Garantizar la flexibilidad necesaria para establecer la primera esfera de coordinación
preferida de ambiente trigonal bipiramidal del manganeso.
2. Incluir residuos adicionales importantes de la segunda esfera de coordinación.
En este trabajo, se enfocó en el punto 1; el desarrollo de secuencias capaces de acomplejar MnIII
en un ambiente trigonal bipiramidal tipo His-His-His-Asp (y permutaciones) para dar origen a
una generación primaria de biomimeticas. Trabajos siguientes en el futuro, muy probablemente
necesitaría enfocarse más en el punto 2, la inclusión de residuos importantes de la segunda
esfera. Eso porque es conocido que interacciones secundarias (como Gln143; Figura 4.3) tiene
un impacto grande en el “fine-tuning” del potencial redox de ión central *138+. Además, un
estudio bioinorgánico (lo único en la literatura química) logró la síntesis de un complejo de
Figura 5.5 Sitio Activo de la MnSODs. Izquierda: Ion metálico con los ligandos y sus posiciones. Derecha: posibles conexiones entre los ligandos para diseñar la estructura biomimetica
25
manganeso a base de ligandos orgánicos que duplicó la primera esfera de coordinación [139].
Este complejo metaloorgánico no demostró ninguna actividad SOD [140]; otra indicación para la
importancia de interacciones de la segunda esfera, en efectuar la catálisis.
Tomando la estructura del sitio activo de la MnSOD (Figura 5.3) se desarrollo en este trabajo un
modelo que se llama “el modelo de aminoácido vecino”. En esto, se toma en cuenta el
aminoácido en la secuencia primaria previa y posterior del ligando. La estrategia de este modelo
es: 1) asumir que dos de los ligandos primarios quedaran en los extremos (N-terminal y C-
terminal) de la secuencia en desarrollo y 2) incluir residuos adicionales dentro de la cadena
peptídica necesarios para mejorar la flexibilidad y aproximar tanto como sea posible los
residuos en la segunda esfera de coordinación.
26
Aun cuando cuatro de los residuos son predeterminados (His-His-His-Asp y sus cuatro
permutaciones posibles) y si se incluye solamente un aminoácido entre estos residuos en
secuencias posibles tipo His-X-His-X-His-X-Asp (y sus permutaciones) queda un número bastante
grande de secuencias que hay que evaluar. En el caso de los aminoácidos desconocidos X se
podría considerar todos los 20 aminoácidos. Esto da origen a 4 · 20 · 20 · 20 = 2400 secuencias
posibles. Aunque en este trabajo, se emplea un método mecánico molecular muy rápido,
resulta imposible evaluar la estabilidad potencial de todas estas combinaciones. Sabiendo
también que efectos de la segunda esfera de coordinación son bastantes importantes, se limitó
la consideración de X a solamente los aminoácidos “vecinos” ilustrados en la Figura 5.6:
Ser, Asn, Ala, Glu, His, Leu, Val e Ile
Aun con estos ocho residuos quedan 224 secuencias posibles. Se puede restringir las
combinaciones posibles aun más si se mantienen la identidad específica de los aminoácidos
vecinos. En este caso, el número N de combinaciones posibles es:
N = 4 · 4 · 4 · 4 = 128
Donde el número de combinaciones de la original secuencia tetrapeptídica son cuatro (His-His-
His-Asp y sus permutaciones) y además existen cuatro permutaciones para cada uno de los tres
aminoácidos X que funcionan como “linkers” flexible para dar origen a 128 permutaciones
donde la secuencia:
His-Ser-His-Asp-His-Leu-Asp,
es un ejemplo de una permutación posible. Usando el método de cálculo MM/UFF, se evaluó
cada una de estas permutaciones con respecto a su capacidad estérica a dar la flexibilidad
necesaria a establecer un complejo con un ión de manganeso; es decir si mantiene el ambiente
de coordinación natural de la enzima y si las longitudes de enlace entre los ligandos no
presentan tensión relativamente grande. De estas permutaciones, dos secuencias se destacaron
con una flexibilidad ideal:
His-X-His-Val-Asp-Ala-His
His-X-His-Gly-Asp-Ala-His
Un análisis mostró que el aminoácido X no es necesario para mantener la flexibilidad. También
existe la posibilidad de eliminar Ala sin afectar la estabilidad (Figura 5.7). Resultaron cuatro
secuencias potenciales:
27
His-His-Val-Asp-Ala-His
His-His-Gly-Asp-Ala-His
His-His-Val-Asp-His
His-His-Gly-Asp-His
Debido a que peptidobiomimeticos tampoco existen en el caso de las FeSODs, este análisis se
repitió usando la secuencia peptídica de las FeSOD (que tiene diferencias pequeñas pero
potencialmente significativos en la identidad de los aminoácidos vecinos). De este análisis
salieron dos secuencias “lideres”:
Asp-Ala-His-Val-His-Tyr-His
Asp-Gly-His-Val-His-Gly-His
Y una familia de secuencias:
Asp-Gly-His-X-His-Gly-His
Donde se puede eliminar el aminoácido X sin afectar la estabilidad:
Figura 5.7 Posible secuencia peptidobiomimética (His-His-Val-Asp-Ala-His) a base del modelo del aminoácido vecinal para la manganeso superóxido dismutasa
28
Asp-Gly-His-His-Gly-His
Un resumen de estos resultados se encuentra en la Tabla 5.1 y dará inicio a un trabajo sintético
futuro en el grupo del profesor Weston.
Clase Sitio activo Posible secuencia peptídica biomimetica
MnSOD
His-His-Val-Asp-Ala-His
His-His-Val-Asp-His
His-His-Gly-Asp-Ala-His
His-His-Gly-Asp-His
FeSOD
Asp-Ala-His-Val-His-Tyr-His
Asp-Gly-His-Val-His-Gly-His
Asp-Gly-His-His-Gly-His
Tabla 5.1 Secuencias propuestas para el diseño de estructuras peptidobiomimeticas de las hierro y manganeso superóxido dismutasas
29
6. EXIGENCIAS DEL ION METÁLICO CENTRAL
Antes de comenzar con el estudio teórico basado en el modelo mínimo M2, es necesario
entender las exigencias especiales presentadas por iones metálicos transicionales involucrados
en reacciones redox como se presenta en la MnSOD. Estas consideraciones adicionales incluyen:
a) su comportamiento redox, b) flexibilidad en la primera esfera de coordinación, c)
configuraciones electrónicas posibles y d) consideraciones teóricas para el logro de la
modelación de los puntos anteriores.
6.1 El Comportamiento Redox en la MnSOD
Bajo los metales transicionales, el manganeso es un elemento que presenta un comportamiento
redox bastante complejo. Tiene la capacidad de presentar siete estados de oxidación (Figura
6.1). En este estudio, solo se necesita considerar los estados MnII y MnIII, los cuales son los
únicos presentes en la MnSOD [141]. El estado más estable es MnIII, razón por la cual las
estructuras del estado sólido para MnSODs presentan este ión en su forma oxidada, aunque se
Figura 6.1 Potenciales estándar de reducción (E0/V) de manganeso. Tomado de la
literatura [141].
Condiciones Ácidas
Condiciones Básicas
30
puede reducir la enzima en el laboratorio para obtener la forma MnIISOD [142].
Es conocido que la ventana de potencial redox de la pareja MnIII/MnII es una función del pH en
medio acuoso [143]. En condiciones acidas, la reducción MnIII MnII tiene un potencial de 1.5 V
[144]. Esta varía hasta un potencial de 0.25 V en condiciones básicas medidos en óxidos de
manganeso [145]. En la enzima, el manganeso es colocado al fondo de un estrecho canal
electrostático y el pH en su vecindad es controlado por los aminoácidos de la primera esfera de
coordinación y los residuos que alinean el canal electrostático, siendo la mayoría de pH neutral.
De esta manera la enzima logra un efecto “fine tuning” y el potencial redox de la pareja
MnIII/MnII se mantiene constante con un valor de 1.01 V [146].
La familia grande de las MnSOD y FeSOD presenta semejanzas estructurales-electrónicas
grandes en el sitio activo (Figura 4.4). No es inmediatamente obvio como los efectos “fine
tuning” que provienen de la segunda y tercera esfera de coordinación logran optimizar el
potencial estándar de las parejas MnIII/MnII y FeIII/FeII. Por ejemplo, se reportó por medio de
titulaciones redox que el potencial estándar de la pareja MnIII/MnII (1.01 V [145]) es casi idéntico
con el de la pareja FeIII/FeII (1.0 V [146]) en la FeSOD y ambas son optimas para la sintonización
de la dismutación de O2·-; mientras que las enzimas donde se intercambiaron los iones metálicos
Figura 6.2 Potenciales medios de reducción (Ems) de enzima nativa y metal sustituido. Limites superiores e inferiores aceptables para el cambio catalítico. Tomado de la literatura [125].
31
(Mn(Fe)SOD; 0.83 V y Fe(Mn)SOD; 0.47 V [147]) poseen potenciales demasiados altos y bajos,
respectivamente (Figura 6.2). Cualitativamente, este resultado se entiende por el considerable
incremento en el potencial redox III/II de complejos de Mn relativo a sus análogos de Fe,
requiriendo que la MnSOD deprima el potencial en su sitio activo que es mucho más grande
que en la FeSOD.
6.2 Flexibilidad de la Primera Esfera de Coordinación
Un ion de manganeso (MnIII o MnII) interactúa con cadenas laterales peptídicas específicas en la
secuencia de la MnSOD para establecer el sitio activo de la enzima, lo cual se puede entender
como un complejo de coordinación. Complejos de coordinación son caracterizados por sus
interacciones semi-covalentes entre el ión central y los ligandos orgánicos en la primera esfera
de coordinación. Debido a que la fuerza de estas interacciones está en el mismo orden que la
fuerza de interacción del ión metálico con agua, existe la posibilidad de varios equilibrios de
coordinación:
El sitio activo restringe el acceso de H2O al centro metálico (la presencia del estrecho canal
electrostático) y no se espera un intercambio reversible entre H2O y los cuatro ligandos
orgánicos en la primera esfera de coordinación. La interacción entre MnIII/ MnII y los residuos
orgánicos (anillos imidazoles de las histidinas y el grupo carboxilato del ácido aspártico) se
Figura 6.3 Esquema simplificado del sitio activo de la manganeso superóxido dismutasa
32
mantiene intacta (Figura 6.3).
Pero, las cosas se complican, porque MnIII y MnII se conocen por tener una flexibilidad
relativamente grande en la geometría de la esfera coordinativa [148]. Existe complejos de MnIII/
MnII con geometría cuadrado piramidal (5 ligandos), trigonal bipiramidal (5 ligandos), octaédrico
(6 ligandos) y (en casos raros) heptacoordinada:
Todas estas posibilidades dependen de la identidad de los ligandos que están coordinando al
centro metálico y de sus capacidades de formar interacciones monodentadas y bidentadas.
En la MnSOD, los anillos imidazol que provienen de las histidinas en la primera esfera de
coordinación son donores π conjugados que cambian sus características donantes en respuesta
a la demanda electrónica de la pareja MnIII/MnII. Por esta razón, estos tres anillos imidazol
coordinados al ion metálico en el nitrógeno sp2 no tienen la capacidad de conformar un ligando
bidentado. Únicamente se ha reportado coordinación bidentada de los oxígenos en el grupo
carboxilato del ácido aspártico [149]. Complejos de Mn con ligandos carboxilato bidentados son
bien conocidos en la literatura química [150].
Más tarde, en la investigación de mecanismos posibles, se necesitaría evaluar la interacción
adicional de sustrato (O2·-) e inhibidores pequeños (F-, N3-) con el ión central. En este caso existe
la posibilidad de diferentes modos de coordinación (“end-on” vs “side-on”):
33
Aunque el modo “end-on” parece lo más estable (solo se han reportado estructuras en fase
sólida de la MnSOD con N3- como inhibidor que muestran la conformación “end-on” [151]), no
se puede descartar la posibilidad de un intermediario clave metaestable tipo “side-on” en el
mecanismo de dismutación.
6.3 Configuraciones Electrónicas posibles para el Manganeso
El ión de manganeso, adicionalmente a presentar diferentes estados de oxidación (MnIII, MnII) y
una flexibilidad grande en el ambiente de coordinación (lo más común siendo las geometrías
trigonal bipiramidal y octaédrica); presenta también una variación grande en su configuración
electrónica. La configuración electrónica básica de los iones MnIII y MnII (átomos aislados en fase
gaseosa) es MnIII = [Ar] 3d4 y MnII = [Ar] 3d5. Esta configuración electrónica se cambia en la
Ión Alto Espín Bajo o Intermedio Espín
MnIII
NA
MnII
Figura 6.4 Arreglos electrónicos para el ambiente de coordinación trigonal bipiramidal en
manganeso superóxido dismutasa
34
presencia del campo electrostático generado por los ligandos en un complejo de coordinación,
dando origen a diferentes estados posibles de espín electrónico (los estados de espín bajo y
espín alto).
Aun cuando se suponga que la enzima mantiene constante sus cuatro ligandos primarios (His,
His, His y Asp), esta flexibilidad en los estados de espín abre las puertas para la existencia
potencial de numerosos intermediarios, especies metaestables y estructuras transicionales
cuando el ión metálico interactúa con un sustrato (el O2.-). Aunque es un modelo relativamente
simple, se puede usar el efecto Jahn-Teller [152] para llegar a una visualización de los diferentes
estados de espín electrónico en dependencia del grado de oxidación y la geometría de
coordinación.
Ión Alto Espín Bajo Espín
MnIII
MnII
Figura 6.5 Arreglos electrónicos para el ambiente de coordinación octaédrico en
manganeso superóxido dismutasa
35
Considerando un campo electrostático trigonal bipiramidal con cinco ligandos (Figura 6.4), la
degeneración de los orbitales d desaparece con la estabilización de cuatro orbitales dxz, dyz, dxy,
dx2
- y2. Esta estabilización es una función del campo electrostático y da origen a diferentes
estados del espín electrónico. Para el estado de oxidación MnIII, como se presenta en la
estructura preferida de la MnSOD en fase sólida, no se ha reportado estados de espín alto. Pero
existe la posibilidad de dos estados de espín diferentes; un estado de espín intermedio con
multiplicidad 5 donde todos los cuatro electrones no son apareados y un estado de espín bajo
(multiplicidad 1) donde los electrones son apareados en los dos orbitales más estables.
En el caso del estado de oxidación reducido (MnII) existe un estado de espín alto (multiplicidad
6) y un espín intermedio (multiplicidad 2) dando origen en total hay cuatro diferentes estados
de espín para la pareja MnIII/MnII en un ambiente trigonal bipiramidal. Cuando el manganeso en
un ambiente trigonal bipiramidal acepta un ligando adicional (una interacción bidentada del
grupo carboxilato), esta resulta en una expansión del ambiente coordinativo a un complejo
Figura 6.6 Esquema simplificado de los mecanismos posibles de la interacción del anión
radical superóxido con el sitio activo de la manganeso superóxido dismutasa
36
octaédrico. Esta produce cambios grandes en el campo electrostático y cambios
correspondientes a la estabilidad relativa de los orbitales d (Figura 6.5). Un campo octaédrico se
caracteriza por tener tres orbitales de bajo espín (dxz, dyz, dxy) que tiene simetría de grupo
puntual t2g y dos orbitales de alto espín (dx2
- y2, dz
2) que tiene simetría de grupo puntual eg [153].
En este caso, existe la posibilidad de estados de espín alto y bajo para ambos estados (MnIII y
MnII). El cambio del ambiente de coordinación cambia completamente los estados de espín para
cada complejo del modelo mínimo, lo que hace más grande el sistema a evaluar y exigiendo
mayor recursos computacionales.
Como se indicó en la discusión en Capitulo 3, se espera una dependencia mecanistica alta del
ambiente de coordinación del ión metálico central. La flexibilidad coordinativa hace varios
mecanismos generales posibles para la interacción del sustrato con el sitio activo: mecanismos
asociativos, segunda esfera, sustitución directa y disociativo-asociativo (Figura 6.6). Un estudio
computacional de la MnSOD tiene que investigar todas estas posibilidades; algo que es
imposible realizar en el marco de un trabajo de maestría. Por eso, se escoge iniciar una
investigación que se concentre en el mecanismo disociativo-asociativo.
6.4 Consideraciones Teóricas
Para ejecución de los cálculos presentados en este trabajo, se utilizó el funcional de intercambio
Becke [154] y el funcional Perdew [155] de la teoría del funcional de densidad (DFT) como están
implementados en el método BP86 [156]. Este nivel de teoría con los funcionales Beck-Perdew
ha sido implementado en los últimos 15 años con éxito para cálculos de la actividad en solución
acuosa en un modelo de la manganeso superóxido dismutasa [157]; cálculos electrostáticos en
el ambiente de la MnSOD [158]; potenciales redox acoplados de reacciones cinéticas entre la
FeSOD y la MnSOD; estudios de aductos de azida de la MnSOD [159]; estudios del mecanismo
de reacción de las MnSODs y las FeSODs con el O2·- [160]; análisis de la estructura de la MnSOD
en la forma oxidada y reducida; y descomposición de compuestos de coordinación Mn(II) [161].
Para cálculos de optimización y frecuencias en este nivel de teoría se dispone de un conjunto de
bases de Dunning modificado de acuerdo a cada elemento en el modelo. Para el manganeso, se
utilizó una base Triple Zeta Valence con doble polarización (cc-TZVPP) debido a la presencia de
electrones en los orbitales 3d [162]. Los átomos pesados (C, N y O) fueron modelados usando la
base (cc-TZVP) [163] que incluye efectos de polarización. En el caso de hidrógeno, se utilizó la
base simple TZV [164] sin ninguna polarización. Los cálculos fueron ejecutados usando los
paquetes estándares Turbomole 6.4 [165] y Gaussian 09W [166]. Detalles se encuentran en la
metodología (Capitulo 10).
37
7. MODELO MÍNIMO
En la literatura computacional, se ha reportado varios estudios teóricos que se enfocaron en
detalles específicos de la MnSOD. Por ejemplo, cálculos de soporte para estudios
espectroscópicos (detección de aductos de azida e ión nitrosilo [167-168], sintonización de la
segunda esfera [169-170], complejos de peroxomanganeso [171]) Común a todos estos estudios
es una falta total de un estudio extensivo de la hipersuperficie de los modelos computacionales
empleados. Los estudios partieron de la estructura en fase sólida, se optimizaron un pequeño
fragmento de esta proteína, y se utilizo este para estudiar un comportamiento específico.
Solo porque existe una estructura (o estructuras) en fase sólida no implica que es (son) la
especie/las especies reactiva(s) en el modo de acción de la MnSOD. Más bien es importante
extender la hipersuperficie completa de todas las posibilidades geométricas/reactivas porque
una especie metaestable o transitoria podría ser una clave esencial para el entendimiento del
modo de acción. El modelo más pequeño escogido para dar inicio a este estudio consiste en un
cofactor metálico de manganeso en un ambiente de coordinación trigonal bipiramidal y los
estados de oxidación del manganeso bajo consideración son MnII y MnIII. Se representa los
ligandos orgánicos con residuos extremadamente simplificados: tres moléculas de amoniaco
(dos ecuatoriales, una axial) para las histidinas y un ión formiato (ecuatorial) para el ácido
aspártico. También se incluye una molécula de hidroxilo/agua para completar la primera esfera
de coordinación.
Este modelo corresponde a un sistema artificial que busca analizar las interacciones primarias
entre los hetero-átomos (N y O) quelantes y el centro metálico. Este sistema modelo es
relativamente inestable debido que los ligandos son pequeños y les falta las interacciones
estabilizantes que provienen de la segunda esfera de coordinación que tiene la enzima nativa.
Por esta razón, hay que explorar la hipersuperficie de este sistema; teniendo en cuenta, los
posibles enlaces de hidrógeno, la rotación de los ligandos, la forma de la molécula de solvente
(OH vs OH2) y los estados posibles de espín en dependencia del estado de oxidación (MnII vs
MnIII). Con estos resultados, se puede indicar cual especie es más estable y cual especie
calculada es la que mejor representa a la estructura en fase sólida de la enzima.
38
7.1 Exploración de la Hipersuperficie del Modelo Mínimo
Considerando los diferentes estados de oxidación (MnII vs MnIII), la posibilidad de espín bajo y
espín alto y la identidad del ligando de disolvente (OH- vs H2O), se espera, por lo menos, ocho
especies estables diferentes en la hipersuperficie del modelo mínimo. Optimizaciones usando el
método BP86/cc-TZVPP(Mn); cc-TZVP(C, N, O); TZV(H) resultaron en los ocho puntos
estacionarios en la hipersuperficie ilustrados en la Figura 7.1. Cálculos de las frecuencias
vibracionales confirmaron que todos los ocho complejos son conformaciones estables en la
hipersuperficie. La Tabla 7.1 contiene las energías absolutas obtenidas y energías relativas
pertinentes a la siguiente discusión.
El modelo mínimo es extremadamente simplificado; por eso, presentamos solamente una
revisión sobre las conformaciones/especies posibles en la hipersuperficie de la MnSOD. Aunque
se hace una discusión de las energías relativas, se debe tener en cuenta que interacciones
secundarias presentes en la enzima modificaría en gran extensión las energías relativas de las
conformaciones individuales.
Es bastante interesante que los estudios computacionales de la MnSOD se concentren en
investigar detalles específicos de la forma reducida MnII [172] ó la forma oxidada MnIII [173] ó
intermediarios específicos encontrados y postulados [174]. Información sobre la estabilidad
relativa de ambos estados oxidado (MnIII) y reducido (MnII) es muy difícil de sacar de estos
estudios. Es conocido que el estado oxidado MnIII, es el más estable en la enzima. En absoluto
contraste a eso, los cálculos presentados en este trabajo (Tabla 7.1) indican lo contrario. Todas
las cuatro conformaciones de MnII son significativamente más estables que las conformaciones
correspondientes de MnIII (Figura 7.1).
¿De dónde viene esta discrepancia? Un estudio computacional (DFT) del sistema MnII/III acuoso
reveló que el estado reducido MnII acuoso es lo más estable [175]. Obviamente, el “fine-tuning”
presente en la estructura extendida de la MnSOD tiene efectos grandes que no pueden ser
eliminados de una consideración mecanística. Trabajos futuros tendrán que: 1) identificar estos
efectos y 2) incluirlos en el modelo computacional.
Para determinar la estabilidad relativa de los mínimos locales hallados para el modelo, se
analizan las energías relativas. Para especies de un mismo sistema que tiene la misma cantidad
de átomos, la energía relativa es la diferencia de la energía total de cada una de las especies
químicas (puntos locales en la hipersuperficie) con el menor valor de energía que proviene de
una especie molecular del sistema (mínimo global en la hipersuperficie):
39
Figura 7.1 Geometrías optimizadas de las ocho especies estables hallado inicialmente en la
hipersuperficie del modelo mínimo M2. Calculado usando el nivel computacional
BP86/cc-TZVPP(Mn); cc-TZVP(C, N, O); cc-TZV(H)
40
En el modelo mínimo hay dos sistemas: a) el sistema que comprende los complejos que tienen
un ligando hidroxilo, y b) el sistema que contiene todos los complejos que tienen un ligando de
agua. Usando la ecuación 7.1, se calculó las energías relativas para estos dos sistemas (Tabla
7.1).
Los resultados indican que MnII prefiere claramente el estado de “high-spin”; esto es
independiente de la identidad del ligando de disolvente (hidroxilo; Mn(II)-1a ó agua; Mn(II)-1c). El
estado de “low-spin” (conformación Mn(II)-1b y Mn(II))-1d) es 38.9 kcal/mol más inestable que el
estado “high-spin”.
La forma oxidada, MnIII es mucho más inestable que la forma reducida MnII (Mn(III)-1a = 130.6
kcal/mol y Mn(III)-1b = 245.9 kcal/mol). Eso en contraste a la enzima que prefiere el estado
oxidado [176], pero en acuerdo con un ión de manganeso en soluciones acuosas que prefiere el
estado reducido, MnII [177]. La razón de este comportamiento, es que el MnII es estable en una
ventana grande de pH, mientras que MnIII solo se encuentra en solución ácida (condiciones de
pH por debajo de 4.0).
El estado oxidado, MnIII prefiere el estado “high-spin”; las conformaciones (Mn(III)-1a y Mn(III)-1c)
son 43.3 y 50.0 kcal/mol más estables que las conformaciones correspondientes de “low-spin”.
En la enzima, la geometría del ión central es trigonal bipiramidal con el ligando OH/H2O en
posición axial y el grupo carboxilato en posición ecuatorial. La mayoría de las conformaciones
calculadas (Figura 7.1) reproducen esta geometría. En el modelo mínimo M2 ocurre intercambio
7.1
Espín Multiplicidad Ea ∆Eb,c ∆Ed,c
Mn(III) OH- Mn(III)-1a 4/2 5 -1586,010088 130,6 -
OH- Mn(III)-1b 0 1 -1585,941121 173,9 -
H2O Mn(III)-1c 4/2 5 -1586,204916 - 245,9
H2O Mn(III)-1d 0 1 -1586,125176 - 295,9
Mn(II) OH- Mn(II)-1a 5/2 6 -1586,218197 0 -
OH- Mn(II)-1b 1/2 2 -1586,156266 38,9 -
H2O Mn(II)-1c 5/2 6 -1586,596782 - 0
H2O Mn(II)-1d 1/2 2 -1586,534728 - 38,9
a: Energía absoluta en hartrees (1h = 627.51 kcal/mol);
b: Energía relativa de las especies tipo “OH
-“
c: kcal/mol;
d: Energía relativa de las especies tipo “H2O”
Tabla 7.1 Conformaciones estables con geometría trigonal bipiramidal hallados en la hipersuperficie del modelo mínimo. Calculado usando el nivel computacional BP86/cc-TZVPP(Mn); cc-TZVP(C, N, O); cc-TZV(H)
41
en estas posiciones para algunas de las especies los dos complejos de la forma reducida (MnII-
1a, -1b) y en un complejo de la forma oxidada (MnIII-1b). En el caso de las formas reducidas
(MnII-1a, -1b) con un ligando hidroxilo, cada intento a hallar una conformación con un grupo
hidroxilo en una posición axial fallo.
En todas las especies, el ligando bidentado formiato establece un enlace de hidrógeno con el
ligando OH/H2O formiato para formar un intermediario cíclico de seis miembros de alta
estabilidad:
Conformaciones alternativas (no mostradas) donde el ligando formiato hace una interacción
estabilizante con un amoniaco son más inestables en la hipersuperficie, y por eso no fueron
incluidos en el trabajo. La única excepción fue la conformación Mn(III)-1a, que resultó
inesperadamente estable.
Cuando el agua interacciona con un ión metálico transicional como ligando, este ión metálico
polariza la molécula de agua, aumentado la concentración de iones hidronio (H+) resultando un
aumento significativo de la acidez. Si otro ligando básico está presente, este abre la posibilidad
de reacciones de autodesprotonación en el ligando de agua, en la primera esfera de
coordinación. Los cálculos demuestra que esté ocurre en el estado oxidado, Mn(III). Las
conformaciones (high spin; MnIII-1c y low-spin; MnIII-1d) transfieren un protón de la molécula de
agua al oxígeno no coordinado del ligando formiato. Conformaciones estables donde el agua se
mantiene intacto no fueron hallados en la hipersuperficie.
Las conformaciones del estado oxidado (Mn(III)-1c, -1d) hacen transferencia de un protón de la
molécula de agua al oxígeno no coordinado del ligando formiato. Esta energía de
desprotonación del ligando de agua y la inmediata protonación del ligando formiato son
discutidos en la sección 7.3.2. La molécula de agua al ser neutra puede romper un enlace O-H,
para quedar un ión hidroxilo que es estabilizado por la contribución de carga al ión manganeso
en su forma oxidada sin que haya cambio en el ambiente de coordinación trigonal bipiramidal.
Estos resultados muestran una clara dependencia del estado de oxidación del ion manganeso
(MnIII vs MnII). Es posible hallar la energía relativa de este proceso de autodesprotonación, ∆Edep
usando un equilibrio termodinámico y las energías calculadas:
42
Usando la especie MnII-1a como la forma “Mn-OH” y la especie MnIII-1c (high spin) en ecuación
7.2. Se calculó la energía relativa de este proceso de autodesprotonación, lo cual es +49.2
kcal/mol (high-spin). La posición de este equilibrio es altamente a favor de las especies
hidroxilo; lo cual está de acuerdo con estudios espectroscópicos/computacionales que predicen
que la forma hidroxilo MnIII-OH está presente en el estado oxidado de la MnSOD [178].
En contraste a esto, las especies correspondiente en la forma reducida (MnII) del modelo M2
(MnII-1c; high spin y MnII-1d; low-spin) no demostraron esta reacción de autodesprotonación.
Conformaciones donde el ión formiato ha captado protón del agua no son estables en la
hipersuperficie. Este en acuerdo con la literatura que postula un “MnII-OH2” en la forma
reducida (MnII) de la enzima [179]. Por falta de una especie high-spin “MnII-OH” con un ligando
hidroxilo, no se evaluó la energía relativa de desprotonación para este sistema reducido.
7.2 Posibilidad Bidentada
Hasta ahora, se ha podido realizar un análisis detallado de las especies diseñadas para el modelo
mínimo, manteniendo complejos pentacoordinados con tres moléculas de amoniaco, un ion
formiato y un ligando de solvente (H2O, OH-). No obstante, la naturaleza del ión formiato
permite que pueda enlazarse al ión metálico por los dos oxígenos; esto debido a que la carga
está repartido en cada átomo de oxígeno indistintamente la posición. Es decir, que el híbrido de
resonancia forma un núcleo de carga negativa en el ángulo O-C-O permitiendo que el ión
metálico pueda coordinarse a los dos oxígenos para formar un complejo hexacoordinado y, por
tanto, modificar el ambiente de coordinación del centro metálico.
Sin embargo se presenta un problema en el tratamiento teórico; la coordinación de los oxígenos
al ión metálico conduce a un ambiente octaédrico distorsionado que tiene diferentes
configuraciones de espín que un campo trigonal bipiramidal (Figura 5.12). Tomando esta nueva
situación en cuenta, se investigó la hipersuperficie de conformaciones posibles octaédricas y se
7.3
7.2
43
hallo nuevas geometrías inestables que son ilustrados en la Figura 7.2. La Tabla 7.2 contiene una
lista extendida de las energías absolutas y relativas de las conformaciones estables en la
hipersuperficie del modelo M2.
Cuando la esfera de coordinación se expande desde trigonal bipiramidal (formiato
monodentada) hasta octaédrico (formiato bidentado), este suele ocurrir de dos maneras
diferentes. El formiato puede coordinarse axial-ecuatorial, desplazando el ligando OH/H2O hasta
el plano ecuatorial:
Independiente del estado de oxidación (MnIII vs MnII) o del estado de espín (alto o bajo), la gran
mayoría (seis) de las configuraciones estables prefieren una coordinación bidentada en el plano
ecuatorial. Se halló solamente una configuración axial-ecuatorial (Mn(III)-2c) en la hipersuperficie
y una configuración trigonal bipiramidal bidentado (Mn(II)-2c) donde una expansión de la esfera
de coordinación no ocurrió; el ión formiato se coordino bajo desplazamiento de agua.
Al revisar los resultados electrónicos-estructurales, se muestra que el complejo Mn(II)-2a es la
estructura con menor energía relativa del sistema. El complejo Mn(II)-2a cambia su ambiente de
coordinación por la eliminación de la molécula de agua, conformando un ambiente piramidal
cuadrado distorsionado; en términos mecanísticos, el complejo Mn(II)-2c se podría utilizar para
un posible mecanismo disociativo con la molécula de sustrato (O2·-). Del mismo modo, se puede
establecer que todos los complejos en la forma reducida MnII son relativamente más estables
comparados con todos los complejos en la forma oxidada MnIII. Con estos resultados
conformacionales, se establece que el ión MnII está más dispuesto adoptar una geometría
octaédrica en alto y bajo espín; mientras que el ión MnIII mantiene la estabilidad en la geometría
trigonal bipiramidal con ligando hidroxilo, del mismo modo, como sucede con la enzima en su
medio natural.
44
Figura 7.2 Geometrías optimizadas y energías relativas (en kcal/mol) de ocho complejos
bidentados del modelo mínimo M2. Calculado usando el nivel computacional BP86/cc-TZVPP(Mn); cc-TZVP(C, N, O); cc-TZV(H)
45
Todos los complejos con ligando hidroxilo (Mn(III)-2a, -2b; Mn(II)-2a, -2b) tienen la mayor energía
relativa del sistema. Esta inestabilidad en complejos con ligando hidroxilo en su forma oxidada y
reducida, se debe a que el ligando hidroxilo que está en posición axial es anión que aporta carga
al sistema. De esta manera se considera fijo por la atracción electrostática Mn-OH; ya sea en
MnII o en MnIII, trabajando en alto o bajo espín. La fuerte tensión que ejerce el ión formiato,
debido a su unión al centro metálico en los dos oxígenos para formar un complejo bidentado
tipo “side-on” aumenta significativamente la energía del complejo.
La posibilidad de que el grupo carboxilato sea estable al coordinar de forma bidentada al ión
manganeso (tipo “side-on”) da origen a cuestionamientos sobre la forma en que se conserva el
ambiente de coordinación del ion MnIII en el sitio activo de la MnSOD cuando captura una
molécula de sustrato O2·- en la primera etapa del mecanismo de dismutación; así mismo, el
desplazamiento lento de la forma inactiva Mn(II)SOD hexacoordinada a la forma activa en la
segunda etapa del mecanismo “ping-pong”
Espín Multiplicidad Ea ∆Eb,c ∆Ed,c
Mn(III) OH- Mn(III)-1a 4/2 5 -1586,010088 130,6 -
OH- Mn(III)-1b 0 1 -1585,941121 173,9 -
OH- Mn(III)-2a(e) 4/2 5 -1586.008094 123.7 -
OH- Mn(III)-2b(e) 1 3 -1585.995898 131.4 -
H2O Mn(III)-1c 4/2 5 -1586,204916 - 245,9
H2O Mn(III)-1d 0 1 -1586,125176 - 295,9
H2O Mn(III)-2c(e) 4/2 5 -1586.222963 - 248.1
H2O Mn(III)-2d(e) 1 3 -1586.213522 - 254
Mn(II) OH- Mn(II)-1a 5/2 6 -1586,218197 0 -
OH- Mn(II)-1b 1/2 2 -1586,156266 38,9 -
OH- Mn(II)-2a(e) 5/2 6 -1586.205225 0 -
OH- Mn(II)-2b(e) 1/2 2 -1586.166684 24.2 -
H2O Mn(II)-1c 5/2 6 -1586,596782 - 0
H2O Mn(II)-1d 1/2 2 -1586,534728 - 38,9
H2O Mn(II)-2c(e) 5/2 6 -1586.618362 - 0
H2O Mn(II)-2d(e) 1/2 2 -1586.570012 - 30.3
a: Energía absoluta en hartrees (1h = 627.51 kcal/mol);
b: Energía relativa de las especies tipo “OH
-“
c: kcal/mol;
d: Energía relativa de las especies tipo “H2O”;
e: Coordinación bidentada del ligando formiato
Tabla 7.2 Conformaciones estables con geometría trigonal bipiramidal hallados en la hipersuperficie del modelo mínimo. Calculado usando el nivel computacional BP86/cc-TZVPP(Mn); cc-TZVP(C, N, O); cc-TZV(H)
46
7.3 Puntos de Consideración
Aparte de conocer las conformaciones estables en la hipersuperficie del modelo mínimo,
determinadas por las energías relativas de cada complejo dependiente del estado de oxidación
(MnII vs MnIII), del ambiente de coordinación (trigonal bipiramidal vs octaédrico), del ligando de
solvente (OH- vs H2O) y del campo (alto espín vs bajo espín); es importante tener en cuenta tres
factores para discutir en el modelo mínimo: 1) la reactividad de estas especies químicas
analizado desde el punto de vista de la energía entre los orbitales de frontera (HOMO-LUMO
gap) y los datos termodinámicos, 2) la flexibilidad rotacional del ligando formiato para conocer
el perfil conformacional y 3) las posibles reacciones secundarias que se dan por los equilibrios e
interacciones enlazantes de hidrógeno entre los ligandos de los complejos del modelo mínimo.
7.3.1 Análisis Potencial de Reactividad
Considerando que la mayoría de interacciones químicas suceden en los orbitales de frontera,
más precisamente en el HOMO (ultimo orbital ocupado) y en el LUMO (primer orbital sin
ocupar) se puede predecir cualitativamente la viabilidad de que los complejos en el modelo
mínimo puedan reaccionar. Es bien conocido que la distancia entre los orbitales de frontera
(HOMO-LUMO) para compuestos organometálicos, es dependiente de las propiedades de los
ligandos que pueden actuar como grupos extractores de carga (EWG, por sus siglas en ingles) o
donores de carga (ERG, por sus siglas en ingles) y del campo del ion metálico [180].La diferencia
de energía entre el HOMO-LUMO se conoce como gap.
Para los complejos estables del modelo mínimo, el aporte electrónico de los ligandos orgánicos
(amoniaco e ión formiato) no es importante, pero, el HOMO-LUMO gap tiene consideración
relevante del análisis electrónico-estructural del sistema. Los resultados de la Tabla 7.3 indican
que la energía HOMO-LUMO gap es función del campo (alto y bajo espín) para todos los
47
complejos del modelo mínimo en su forma oxidada (Mn(III)-1a, -1b, -1c, -1d) y su forma reducida
(Mn(II)-1a, -1b, -1c, -1d). Los valores HOMO-LUMO gap para los complejos de la forma oxidada
MnIII son relativamente más bajos que para los complejos de la forma reducida MnII. Esto se
debe a que la forma oxidada MnIII tiene un electrón menos y por tanto ocupa parcial o
completamente un orbital por debajo del campo del ión metálico.
El complejo Mn(II)-1c tiene la mayor energía HOMO-LUMO gap con un valor 2.603 eV, siendo
comparable como la especie más estable en la hipersuperficie del modelo mínimo. Sin la
interacción de una molécula o campo externo hay poca probabilidad que Mn(II)-1c cambie a otra
conformación por contribución de los ligandos. El complejo Mn(III)-1b tiene el menor valor
HOMO-LUMO gap con un valor de 0.270 y experimentó un intercambio en la posición del
ligando axial en la hipersuperficie del modelo mínimo. Esto indica la dependencia de la
geometría y el intercambio en la posición de los ligandos en los ocho complejos estables del
modelo mínimo con los valores HOMO-LUMO gap.
Todos los complejos con ligando hidroxilo en la forma reducida (Mn(II)-1a, -1b; bajo espín)
experimentaron intercambio en la posición de este ligando. Una explicación a este intercambio
del ligando OH- es el orbital dz2. En principio esta vacio (ningún aporte del MnII en bajo espín) y
luego es parcialmente ocupado por el aporte de un electrón de los iones hidroxilo; mientras que
los orbitales degenerados dx2
-y2 y dxy hacen aporte electrónico completo en MnII por la
transferencia no directa de un electrón del ion formiato y de los ligandos de amoniaco
ecuatoriales. Para el caso de MnIII, estos orbitales dx2
-y2 y dxy también están vacios y la
posibilidad de que haya aporte electrónico de los ligandos ecuatoriales, tendría lugar a un
rearreglo geométrico para estabilizar la energía. Aunque este fenómeno aun no es claro, se
puede solucionar haciendo restricción de las coordenadas internas de los complejos del modelo
mínimo.
Teniendo en cuenta la coordinación bidentada del ligando formiato para los complejos del
modelo mínimo se analizó la reactividad en un ambiente octaédrico. Según los valores de la
diferencia HOMO-LUMO en la tabla 7.3 todos los complejos hexacoordinados en la forma
oxidada MnIII presentan valores HOMO-LUMO gap menores a los complejos de la forma
reducida MnII. Esto se debe al aporte electrónico del otro oxígeno del ion formiato que soporta
carga al ion metálico.
48
El complejo Mn(II)-2c tiene el mayor HOMO-LUMO gap en el modelo bidentado con un valor de
2.60 eV. En la optimización de este complejo experimenta la eliminación del ligando de agua y el
cambio en el ambiente de coordinación del ión MnII. De otro lado, el complejo Mn(III)-2b tiene el
menor HOMO-LUMO gap con un valor 0.56 eV y es razonable porque al estar en bajo espín, los
orbitales dx2-y
2 y dz2 de alto espín están vacios y la transferencia del electrón desde el oxígeno
del ión formiato hacia MnIII permite que haya una transición electrónica MnIII MnII que reduce
significativamente la distancia entre los orbitales de bajo espín y de alto espín.
Complejo HOMO-LUMO gap (eV)
Mn(III)-1a 1.98
Mn(III)-1b 0.27
Mn(III)-1c 2.00
Mn(III)-1d 0.50
Mn(II)-1a 2.09
Mn(II)-1b 0.83
Mn(II)-1c 2.60
Mn(II)-1d 0.73
Tabla 7.3 Diferencia de energías HOMO-LUMO para las especies estables del modelo mínimo
Complejo HOMO-LUMO gap (eV)
Mn(III)-2a 1.21
Mn(III)-2b 0.56
Mn(III)-2c 0.90
Mn(III)-2d 0.57
Mn(II)-2a 2.10
Mn(II)-2b 0.83
Mn(II)-2c 2.60
Mn(II)-2d 0.73
Tabla 7.4 Diferencia de energías HOMO-LUMO para cada especie del modelo mínimo en un
ambiente octaédrico
49
Después de conocer la diferencia HOMO-LUMO de los ocho complejos estables en la
hipersuperficie del modelo mínimo, se comparó las longitudes de enlace del ión metálico y los
ligandos (Tabla 7.4). Determinando que no hay cambios significativos en el enlace Mn-OOH/H2O.
El complejo Mn(II)-1c indicó una distancia mayor de 2Å para Mn-OOH/H2O; y en general para todas
las longitudes de enlace con el ión metálico. Esto establece que en alto espín la repulsión
electrónica es alta porque todos los orbitales d del MnII están semillenos y la transferencia de
Complejo Longitudes de enlace (Å) Datos termodinámicos
Mn-OOH/H2O Mn-OFor Mn-N1eq Mn-N2eq Mn-Naxi ∆H°
(kcal/mol) ∆S°
(kcal/mol K)
Mn(III)-1a 1.786 1.905 2.147 2.258 2.148 33.25 0.12
Mn(III)-1b 1.713 2.049* 2.015 2.016 2.081 38.36 0.11
Mn(III)-1c 1.82 2.06 2.114 2.115 2.098 40.5 0.12
Mn(III)-1d 1.788 1.938 2.031 2.031 2.147 44.93 0.11
Mn(III)-2a 1.81 2.217; 2.014
2.161 2.273 2.124 34 0.12
Mn(III)-2b 1.812 2.053 2.072 2.072 2.129 37.31 0.11
Mn(III)-2c 2.36 1.997; 1.963
2.089 2.105 2.282 39.84 0.12
Mn(III)-2d 2.046 1.988; 1.953
2.077 2.082 2.046 45.96 0.11
Mn(II)-1a 1.946 2.133 2.259 2.341* 2.35 27.56 0.12
Mn(II)-1b 1.821 2.088* 2.154 2.132 2.093 33.4 0.12
Mn(II)-1c 2.197 2.034 2.227 2.224 2.282 32.83 0.13
Mn(II)-1d 1.971 1.989 2.089 2.172 2.093 40.42 0.12
Mn(II)-2a 2.032 2.154 2.38 2.38 2.335 26.05 0.13
Mn(II)-2b 1.93 2.072; 2.069
2.077 2.08 2.111 - -
Mn(II)-2c 3.39 2.103; 2.057
2.21 2.21 2.267 39.6 0.12
Mn(II)-2d 2.121 2.009 2.090 2.1 2.07 43.63 0.11
* Intercambio en la posición del ligando al plano axial, sustituyendo la molécula de solvente para los complejos del modelo mínimo en
ambiente trigonal bipiramidal
Tabla 7.4 Distancias de enlace y datos termodinámicos de los complejos estables para el modelo mínimo y su coordinación bidentada
50
otro electrón a estos orbitales incrementa la energía, que se estabiliza por un incremento en la
longitud de enlace.
A diferencia del complejo Mn(II)-1c, el complejo en la forma oxidada Mn(III)-1b tiene la longitud
de enlace más pequeña Mn-OOH/H2O. Esto es debido, a la estabilidad de la transferencia de un
electrón del oxígeno del hidroxilo unido por enlace coordinativo a MnIII. Se puede concluir que
cinco de los ocho complejos del modelo básico mantienen el ambiente de coordinación del ión
metálico, siendo más estable por energía relativa la forma reducida Mn(II)-1a y la menos estable
la forma oxidada Mn(II)-1b. El intercambio de la posición del ligando axial de solvente (H2O, OH-)
se da en los complejos Mn(II)-1a (sustitución de posición por una molécula de amoniaco), Mn(III)-
1b y Mn(II)-1b (sustitución por el ión formiato). Además, en todos los complejos de la forma
oxidada (Mn(III)-1c, -1d) la optimización de las geometrías están acompañadas por la
transferencia del protón en la molécula de agua hacia el ligando formiato.
Analizando los datos termodinámicos (Tabla 7.4), la entalpia estándar de formación (25 ˚C y 1
atm de presión) corresponde a un mismo sistema que tiene cambios en los modos
vibracionales, rotacionales y de translación. Por esta razón, ningún complejo en su forma
oxidada Mn(III) ó reducida Mn(II) tiene la misma entalpia. Estos resultados son tomados desde
la función de partición Q y puede indicar que en sistemas aislados, lejos de la interacción de un
campo (como sucede en el modelo minimo) los valores corresponden a la energía necesaria
para la formación de las especies desde la diferencia de un estado inicial y un estado final. El
complejo Mn(II)-1a tiene la menor entalpia (27.56 kcal/mol) después de intercambio en la
posición del ligando OH- y el complejo Mn(III)-1d tiene el mayor valor de entalpia (44.93
kcal/mol). La entropía no tiene cambios relevantes, porque corresponde a un mismo sistema
conservando un ambiente de coordinación trigonal bipiramidal para todas las ocho
conformaciones del modelo mínimo en los cálculos de optimización.
7.3.2 Flexibilidad Rotacional
Una característica adicional del ion formiato; aparte de tener la posibilidad de formar complejos
bidentados (Sección 6.3), es la rotación que puede hacer en el plano cuando únicamente esta
enlazado a un átomo de oxígeno (Figura 7.3). Aunque esta rotación es restringida, porque la
densidad de carga en los átomos de oxígeno hace que tenga un comportamiento de interacción
π-d con el ión metálico. No obstante, al ser un enlace de coordinación permite una pequeña
probabilidad de flexibilidad, que pueda indicar la mejor posición energética de este ligando en el
modelo básico.
51
Esta misma flexibilidad la tienen las moléculas de amoniaco (con más libertad), pero la rotación
con el eje de simetría C3 (Figura 7.3) no tendría ningún cambio energético que fuera significativo
para indicar la estabilidad del sistema en el modelo básico. Del mismo modo, los cambios
rotacionales en el ligando H2O/OH- tampoco serian de interés porque el eje axial está muy
alejado de las interacciones con otros ligandos, y seria dependiente de la posición del ion
formiato con quien puede hacer enlaces de hidrógeno.
Teniendo en cuenta los ocho complejos estables del modelo mínimo (Tabla 7.1), se puede
graficar los cambios de entalpia por rotación del ión formiato, cuando el ligando es OH- (Figura
7.4), ó H2O (Figura 7.5). La rotación del ion formiato se realiza a partir de la modificación y
restricción del ángulo de torsión entre Nax-Mn-OFor-CFor.
Figura 7.3 Rotación de los ligandos formiato y amoniaco sobre el eje del enlace de
coordinación
52
En la Figura 7.4 se observa que el perfil de rotación de menor energía es con el complejo Mn(II)-
1d; sin embargo, en todas las rotaciones hay modificación del ambiente de coordinación del ión
metálico y cambio en la posición del ligando hidroxilo. Por esta razón la barrera conformacional
no se puede tener en cuenta. Únicamente el complejo que mantiene el ambiente de
Figura 7.4 Perfil conformacional de las especies con ligando hidroxilo, por la rotación del ión formiato
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
50,00
0 90 180 270
∆H
⁰ (k
cal/
mo
l)
grados de rotación del ión formiato
Figura 7.5 Perfil conformacional de las especies con ligando agua, por la rotación del ión formiato
30,00
35,00
40,00
45,00
50,00
0 90 180 270
∆H
⁰ (k
cal/
mo
l)
grados de rotación del ión formiato
Mn(III)-1b
Mn(II)-1d
Mn(III)-1a
Mn(II)-1c
Mn(III)-1c
Mn(II)-1b
Mn(III)-1d
Mn(II)-1a
53
coordinación sin intercambio en la posición del ligando hidroxilo es Mn(III)-1a. Las rotaciones del
ion formiato para Mn(III)-1a muestran, una disminución de la entalpia a medida que se hace la
rotación cada 90°. Siendo la conformación más estable cuando el ligando formiato tiene una
rotación del ángulo de torsión N-Mn-OFor-CFor de 270 grados.
Por otra parte la Figura 7.5 indica que el complejo Mn(II)-1a es la que tiene menor entalpia en la
rotación del ligando formiato. No obstante, al igual que todos los complejos con el ligando OH-,
existe modificación del campo del ión metálico e intercambio en la posición de la molécula de
agua. Los cambios en las posiciones de la molécula de agua se debe principalmente, a las
interacciones no covalentes del los enlaces de hidrógeno. Estos enlaces son fuertemente
atraídos por el átomo de oxígeno, con interacción en los protones de la molécula de amoniaco y
el protón (o protones) de la molécula de solvente. Además, en la Figura 7.5 se puede observar la
estabilidad en la rotación del ión formiato para el complejo Mn(III)-1d confirmando la estabilidad
del modelo mínimo con el ión MnIII.
7.3.3 Posibles Reacciones Secundarias
En el modelo básico pueden darse equilibrios, debido a la desprotonación en los ligandos. Para
analizar los equilibrios en el modelo básico, se debe calcular cada equilibrio para los ligandos
individuales. Esta comparación de los equilibrios entre cada ligando y las especies en el modelo
básico, indican si el sistema de coordinación permite la desprotonación en un ambiente trigonal
bipiramidal del ión metálico.
Un equilibrio corresponde a la protonación del ión formiato, que en condiciones normales se
hace en medio ácido. En el modelo surge un interrogante ¿Cuál es la fuente del protón para
interaccionar con el oxígeno del ión formiato? Una alternativa es el protón de la molécula de
agua que está coordinando con el ión metálico, esto produciría un ión hidroxilo que aporta
carga al sistema y la molécula de ácido fórmico que extrae carga del sistema para estabilizar la
molécula. Otra alternativa se considera de los protones de la molécula de amoniaco que está
coordinando al ión metálico en el plano axial y en el plano ecuatorial. El problema que presenta
la desprotonación de la molécula de amoniaco es que forma un anión amiduro (NH2-) que es
muy reactivo aportando carga al ión metálico, pudiendo desestabilizar el ambiente de
coordinación del ion manganeso. Además, este posible equilibrio requiere un alto gasto de
energía (por lo que se puede considerar una reacción de desprotonación y no un equilibrio).
54
______________________________________________________
Al protonarse el oxígeno del ligando formiato en el modelo, daría dos posibles rutas para la
estabilización de la carga. La primera ruta es la ruptura del enlace de coordinación con el ión
metálico (Figura 7.6), para producir una molécula de ácido fórmico pura. La eliminación de este
Figura 7.6 Protonación del ligando formiato. A. Ruptura del enlace Mn-OFor, y B. Adición
nucleofílica al carbono.
55
ligando del ambiente de coordinación del ión metálico es muy poco probable porque hay una
contribución muy importante de los oxígenos al ion metálico para mantenerse en el plano
ecuatorial. La segunda ruta es la adición nucleofílica al carbono cambiando la hibridación sp2 a
sp3 sin cambiar la geometría del ion metálico central.
7.4 Extensión del Modelo
7.4.1 Modelo M1
Considerando la expansión del modelo mínimo M2, se realizó cálculos de optimizaciones y
frecuencias vibracionales para el modelo de expansión M1 que tiene coordinados 3 imidazoles
(1 axial, 2 ecuatorial), un ión acetato (ecuatorial) y una molécula de solvente (axial). De forma
sorpresiva se mantuvo la misma tendencia del modelo simplificado M2 porque los complejos de
la forma reducida MnII son más estables que los complejos de la forma oxidada MnIII (Tabla 7.5).
Siete de los ocho complejos conservo la posición original de los ligandos. Solo el complejo Mn II-
3b intercambio el ligando hidroxilo por un imidazol (Figura 7.7).
Espín Multiplicidad Ea ∆Eb,c ∆Ed,c
Mn(III) OH- Mn(III)-3a 4/2 5 -2134.526885 105.1 -
OH- Mn(III)-3b 0 1 -2134.457152 148.9 -
H2O Mn(III)-3c 4/2 5 -2134.800337 - 206.3
H2O Mn(III)-3d 0 1 -2134.742161 - 36.5
Mn(II) OH- Mn(II)-3a 5/2 6 -2134.694387 0 -
OH- Mn(II)-3b 1/2 2 -2134.650460 27.6 -
H2O Mn(II)-3c 5/2 6 -2135.129056 - 0
H2O Mn(II)-3d 1/2 2 -2135.072006 - 35.8
a: Energía absoluta en hartrees (1h = 627.51 kcal/mol);
b: Energía relativa de las especies tipo “OH
-“
c: kcal/mol;
d: Energía relativa de las especies tipo “H2O”
Tabla 7.5 Conformaciones estables con geometría trigonal bipiramidal hallados en la hipersuperficie del modelo extendido. Calculado usando el nivel computacional BP86/cc-TZVPP(Mn); cc-TZVP(C, N, O); cc-TZV(H)
56
Figura 7.7 Geometrías optimizadas y energías relativas (en kcal/mol) de las ocho especies
estables hallado en la hipersuperficie del modelo extendido M1. Calculado
usando el nivel computacional BP86/cc-TZVPP(Mn); cc-TZVP(C, N, O); cc-TZV(H)
57
7.4.2 Esfera Interna de Coordinación de la MnSOD
Tomando el sistema con los aminoácidos de la primera esfera de coordinación de la MnSOD,
ocho especies estables de la hipersuperficie mostraron en siete de ellas la conservación en la
posición de los ligandos. Solo el complejo Mn(III)-4b tiene un cambio en el ligando axial. La
energía relativa de la forma reducida Mn(II) es menor a la forma oxidada Mn(III). Además todos
los complejos de la forma oxidada Mn(III) y reducida (II) son más estables en alto espín.
Se presume que las interacciones de los residuos de la esfera externa en la MnSOD, pueden
estabilizar el cofactor metálico para que inicialmente este en la forma oxidada Mn(III) y que
pueda comenzar la dismutación del O2.- a peróxido de hidrógeno y oxigeno molecular en un
mecanismo redox tipo “ping-pong”. Sin embargo, cálculos computacionales de las
optimizaciones del sitio activo de la enzima con residuos de la esfera externa no se lograrón
ejecutar porque los recursos no son suficientes para un gran número de funciones orbitales con
el nivel de cálculo utilizado en esta investigación.
Espín Multiplicidad Ea ∆Eb,c ∆Ed,c
Mn(III) OH- Mn(III)-4a 4/2 5 -3385.960998 82.4 -
OH- Mn(III)-4b 0 1 -3385.888399 128 -
H2O Mn(III)-4c 4/2 5 -3386.268982 - 186.1
H2O Mn(III)-4d 0 1 -3386.207205 - 224.9
Mn(II) OH- Mn(II)-4a 5/2 6 -3386.092302 0 -
OH- Mn(II)-4b 1/2 2 -3386.040411 32.6 -
H2O Mn(II)-4c 5/2 6 -3386.565580 - 0
H2O Mn(II)-4d 1/2 2 -3386.504120 - 38.6
a: Energía absoluta en hartrees (1h = 627.51 kcal/mol);
b: Energía relativa de las especies tipo “OH
-“
c: kcal/mol;
d: Energía relativa de las especies tipo “H2O”
Tabla 7.6 Conformaciones estables con geometría trigonal bipiramidal hallados en la hipersuperficie de la esfera interna de la manganeso superóxido dismutasa. Calculado usando el nivel computacional BP86/cc-TZVPP(Mn); cc-TZVP(C, N, O); cc-TZV(H)
58
Figura 7.8 Geometrías optimizadas y energías relativas (en kcal/mol) de las ocho especies
estables hallado en la hipersuperficie del modelo extendido M1. Calculado usando el nivel
computacional BP86/cc-TZVPP(Mn); cc-TZVP(C, N, O); cc-TZV(H)
59
8. TRABAJO A FUTURO
Como se había planteado en el modo de acción de MnSODs, un posible camino en la reacción de
dismutación de O2· para la formación de oxígeno molecular en la primera etapa, y peróxido de
hidrógeno en la etapa final del mecanismo “ping-pong”; es el mecanismo disociativo que tiene
la ruptura del enlace Mn-O de la molécula de solvente y que se encuentra en posición axial. Esto
plantea un cuestionamiento porque el ambiente del metal cambia de trigonal bipiramidal a
trigonal piramidal (Figura 8.1). Esta modificación del campo reduce en teoría la energía del
orbital dz2 lo que conlleva a transiciones más restringidas con la transferencia de carga entre el
radical anión superóxido y el ion metálico. Asimismo, se ha reportado que la interacción directa
entre Mn-O2.- se hace en el plano ecuatorial y no en el axial, por restricciones estéricas y de
carga en la segunda esfera de coordinación [181].
El complejo de partida es la estructura 1 donde el metal MnIII coordina cinco ligandos, dos
histidinas y un ácido aspártico en el plano ecuatorial y una histidina y una molécula de solvente
(H2O/OH-) en el plano axial. El ambiente de coordinación de la estructura 1 es idéntico a la
esfera interna de la MnSOD. El siguiente paso es la eliminación de la molécula de solvente como
se muestra en la estructura 2; en este caso, puede ocurrir un comportamiento bidentado del
grupo carboxilato para mantener un complejo pentacoordinado (Capitulo 7, Sección 7.2). Esta
reacción sucede más probablemente en el estado de bajo espín, debido a que la transferencia
de electrones al campo de coordinación metálico es dado solo por los ligandos.
La entrada de sustrato O2·- se hace en la posición axial como se muestra en la estructura 3. El
oxígeno no coordinado es altamente reactivo debido a que es un radical y es estabilizado por la
formación de un enlace entre los dos oxígenos después de la transferencia de un electrón al
centro metálico para tener MnII. Un paso posterior es la sintonización de otra molécula de
sustrato (O2·-) concertado a la liberación de oxígeno molecular (O2).
Las investigaciones presentadas en este trabajo (capitulo 7) hace evidente que el grupo
carboxilo tiene claramente la capacidad de actuar como un ligando bidentado. Por eso, se
necesita considerar una ruta alternativa para la disociación de sustrato con la participación de
este ligando bajo conservación de la esfera coordinativa trigonal bipiramidal (especie 2a en
Figura 8.1). Ataque del sustrato, O2·- tenía como consecuencia en esta posibilidad mecanística la
expansión de la esfera de coordinación octaédrica (especie 3a).
Ambos mecanismos posibles resultan en la producción de oxígeno molecular y la especie
reducida 4. Estas rutas representan la primera semireacción del modo de acción “ping-pong” de
la enzima:
60
Se inicia la segunda semireacción:
Cuando la especie 4 acepta un segundo sustrato para formar la especie 5 (o alternativamente
5a).
Una etapa importante en el mecanismo disociativo propuesto, es la transición del ión metálico
(MnII MnIII) que se considera un equilibrio entre la estructura 4 y 5. Este equilibrio es
dependiente de la protonación en el O2·- que está coordinado a el metal (estructura 6, Figura
8.1). Es decir, que la interacción del protón con O2·- automáticamente produce la estructura 6,
teniendo poco tiempo el intermediario de la estructura 5. Si no hay una fuente de protones el
mecanismo solo alcanzaría el equilibrio entre la estructura 4 y 5 con una constante muy
pequeña.
En un estudio futuro, se incluiría una molécula de H2O y H3O+ en la posición de la Tyr34 en el
modelo como fuente de este protón. Se estudiaría la transferencia de un electrón hacia el ión
central con y sin la presencia de esta fuente del protón. La entrada del segundo protón (otra vez
modelado con un H2O y H3O+ adicional) resulta en la formación de una especie H2O2-Mn (7). Se
investigaría si esta especie es un intermediario metaestable en la hipersuperficie o si la
formación de H2O inicia la disociación. El intermediario formado (8 o alternativamente 8a)
acepta un agua para regenerar la especie inicial 1 del circulo catalítico, terminando así la
segunda semireacción.
En esta semireacción surgen algunas preguntas especialmente con respecto a los mecanismos
de protonación; la coordinación del sustrato (side-on vs end-on) y la identidad del intermediario
inactivo (ver Introducción sección 1.4 para una discusión de esto). Además la concertación de la
reacción entre la estructura 7 para producir de nuevo el compuesto 3 no es clara. Se puede
suponer que este paso incluye más etapas, además de un cambio en el ambiente de
coordinación del ión metálico que modifique la orientación de los orbitales. El
reacomodamiento para que el ión metálico tenga un ambiente octaédrico por interacción con el
sustrato (O2·-) se explora a partir de dos alternativas en la estructura 2: a) coordinación
bidentada del grupo carboxilato rodeando todo el plano molecular (Figura 8.2) entrando el
sustrato O2·- al plano ecuatorial, y b) coordinación bidentada únicamente en el plano ecuatorial
del grupo carboxilato entrando el sustrato al plano axial O2·- (Figura 8.2).
Cada una de las estructuras diseñadas de la Figura 8.1 contiene un número independiente de
funciones de acuerdo a la multiplicidad del sistema, a partir de esto, se diseña un conjunto de
funciones orbitales para eductos y para productos. Un ejemplo estudiado por Srnec y
61
colaboradores, entrega las posibles funciones de las semireacciones de la forma oxidada (MnIII)
y reducida (MnII) en la primera esfera de coordinación de MnSODs [182]. Estas funciones son
reportadas al campo octaédrico en alto espín y tienen sus correspondientes configuraciones
electrónicas y espines (Figura 8.3). Estas funciones se pueden utilizar para ambos ambientes de
Figura 8.1 Mecanismo disociativo propuesto para la dismutación del radical anión
superóxido. En este modelo se utiliza la primera esfera de coordinación de
manganeso superóxido dismutasa.
62
coordinación: octaédrico y trigonal bipiramidal porque tienen la misma distribución en alto
espín. Sin embargo, hay modificaciones para bajo espín en el campo octaédrico (Figura 8.4) por
el apareamiento de los electrones en los orbitales d del ión metálico.
La interacción entre los orbitales d del MnIII con el orbital π* del O2·- puede darse de dos formas:
a) la transferencia del electrón de un orbital π* al ion MnIII con espín en dirección al campo para
dar un sistema de espín 5/2, ó b) la transferencia del electrón de un orbital π* al ion MnIII con
espín en contra a la dirección del campo para dar un sistema de espín 3/2. Independientemente
el camino, el producto es la reducción del metal a MnII y tres maneras posibles de espín para la
formación de O2 triplete. El producto de la primera semireacción tendrá 3 intermediarios con
espín de 3/2, 5/2 y 7/2 respectivamente. Las funciones para esta etapa son:
La función del sistema representa la suma de los espines en la reacción del ión metálico MnIII
con el sustrato O2·- que tiene una función de onda , para producir MnII y O2 triplete con una
función . Las constantes , indica que no hay desplazamiento total en un sentido de la
reacción. Las ecuaciones 8.1 y 8.2 van dirigidas a encontrar la densidad de espín del complejo
y el sustrato en el camino de reacción. En la primera semireacción de la Figura 8.2 hay un espín
de 7/2 en los productos de reacción; no obstante, no se toma en cuenta porque el sistema se
limita a permanecer invariable durante el mecanismo redox.
8.1
8.2
Figura 8.2 Posible reacomodamiento de la estructura 2 para que el ión metálico tenga un ambiente octaédrico por la entrada del sustrato.
63
Para la segunda semireacción hay transferencia de un electrón de un orbital d de MnII a un
orbital π* del O2·-. Al tener una cantidad par de orbitales semillenos se tendrán espines enteros,
que en este caso puede ser 3 cuando el electrón de un orbital π* en la molécula de O2·- tiene la
misma dirección del campo del ión MnII. Por el contrario, el espín será dos cuando el electrón de
un orbital π* en O2·- tiene dirección contraria al campo del ión metálico. El producto formado
tendría el espín de MnIII porque el anión peróxido tiene sus orbitales π* ocupados. La función
para esta etapa es:
Para analizar las funciones en bajo espín para cada semireacción del mecanismo redox (Figura
8.4) el apareamiento de electrones entre el MnIII y el sustrato O2·- tiene dos estados con la
misma función de onda . Este hecho no es común, porque no corresponden a funciones de
onda en estados degenerados sino a estados con la misma suma de espín en los electrones d del
ión MnII con dos orientaciones diferentes en 3O2. Las funciones del sistema en las dos
semireacciones son:
Figura 8.3 Configuraciones electrónicas y correspondientes espines involucrados en las dos reacciones de MnSODs asociado a un ambiente octaédrico (alto espín) del ion metálico central. Basado en la literatura 178
8.3
64
Con todas las consideraciones trabajadas en el marco de esta disertación, las puertas son ahora
abiertas en un estudio detallado teórico de este sistema complicado y se prolongaría con un
trabajo doctoral.
8.4
8.5
8.3
Figura 8.4 Configuraciones electrónicas y correspondientes espines involucrados en las dos reacciones de MnSODs asociado a un ambiente octaédrico (bajo espín) del ion metálico central. Basado en la literatura 178
65
9. CONCLUSIONES
El análisis de los complejos estables para el modelo mínimo, M2 mostró una mayor estabilidad
en las especies de la forma reducida MnII sobre las especies de la forma oxidada MnIII. Estos
resultados contrastaron al comportamiento natural de la enzima que prefiere la forma oxidada
MnIII. Los resultados de las optimizaciones indicaron que el estado reducido MnII prefiere
coordinarse con H2O, mientras que el estado oxidado MnIII prefiere la coordinación con el ión
OH-.
La coordinación bidentada del ión formiato mostró menor energía relativa para todos los
complejos del modelo mínimo M2. La estabilización energética del ambiente octaédrico es
mayor a la estabilización energética del ambiente trigonal bipiramidal del ión manganeso. Por
eso, todos los modelos teóricos reportados de la hipersuperficie de la manganeso superóxido
dismutasa trabajan con funciones del campo cristalino octaédrico.
Se despreció el análisis de tres complejos en el modelo mínimo M2 (Mn(III)-1b, Mn(II)-1a, Mn(II)-
1b) porque la geometría optimizada tiene intercambio en la posición del ligando H2O/OH- axial.
Adicionalmente los complejos MnIII-1c y MnIII-1d experimentan transferencia del protón del
ligando agua al oxígeno terminal del ligando formiato.
La diferencia de energía entre los orbitales HOMO-LUMO fue mayor en los complejos de la
reducida MnII con estado “high-spin”. Esto se debe a que el orbital LUMO no pertenece a un
orbital d del ión manganeso, como si sucede con los complejos MnII en “low-spin” en el campo
cristalino trigonal bipiramidal. Un factor importante para reducir la diferencia de energía entre
los orbitales HOMO-LUMO son ligandos que aporten carga al sistema para que se incremente de
energía del orbital HOMO.
Siete complejos del modelo extendido M1 mantienen la geometría trigonal bipiramidal, el
complejo Mn(II)-3b intercambia la posición del ligando hidroxilo por un ligando imidazol.
Aumentando el tamaño de los ligandos, las especies tienen mayor probabilidad a conservar la
posición de los ligandos. En el modelo extendido M1 se experimenta la estabilización de la carga
por sistemas π-d con la contribución electrónica de los ligandos imidazol.
El mínimo local del modelo extendido M1 es Mn(II)-3c, pero la geometría optimizada mostró un
cambio en el ambiente de coordinación de trigonal bipiramidal a octaédrica distorsionada por
coordinación bidentada del anión acetato. Los cálculos computacionales del modelo mínimo M2
y el modelo extendido M1 indicaron la flexibilidad que tiene el ión manganeso para obtener
complejos estables en ambiente trigonal bipiramidal y octaédrico.
66
Siete especies de la esfera interna de coordinación mantienen el ambiente trigonal bipiramidal
sin intercambio en la posición de ligando OH/H2O. En los tres modelos utilizados en este estudio
se mantiene la tendencia de la estabilidad en los complejos de la forma reducida MnII. Esto
reveló que no es suficiente las interacciones electrónicas hasta la esfera interna de la
manganeso superóxido dismutasa; en los cálculos computacionales es necesario utilizar
residuos de la esfera externa.
No hubo convergencia para el sistema de la esfera externa (2 y 3 esfera de coordinación) de la
manganeso superóxido dismutasa, por lo que se considero que el conjunto de base Dunning
escogido es muy grande para analizar efectos electrónicos/estructurales y no se cuenta con los
recursos computacionales para llevarlo a cabo.
Estudios teóricos reportados indicaron la viabilidad de utilizar modelos reducidos de la esfera
interna y externa de la manganeso superóxido dismutasa tomando solo los grupos reactivos de
los aminoácidos que interaccionan con el ión manganeso [182]. Además se planteo la
posibilidad de ejecutar estos modelos con otro método de cálculo, debido a que la correlación
electrónica no es adecuada a un límite de electrones del sistema [183].
Se calcularon para este estudio 64 optimizaciones con sus respectivas frecuencias vibracionales
y 2 Scan Test, para un total de 130 cálculos implementando métodos de la teoría del funcional
de la densidad (DFT) con el funcional híbrido BP86 y un conjunto de bases Dunning establecidas
para cada átomo del sistema.
67
10. SUMARIO
La manganeso superóxido dismutasa MnSOD es una clase de metaloenzima de la familia de las
superóxido dismutasas SODs. Esta enzima cataliza la dismutación de anión radical superóxido
(O2·-) en peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno molecular (O2) por medio de un conocido pero
simplificado mecanismo redox tipo “ping-pong” donde el ión manganeso cicla de MnIII a MnII.
La interacción de MnSOD con el sustrato O2·- sucede en la esfera interna del sitio activo de la
enzima con una alta conservación de los ligandos histidina y ácido aspártico para un ambiente
preferido trigonal bipiramidal. Para entender las interacciones electrónicas/estructurales se
diseña un modelo muy simplificado con ligandos de amoniaco e ión formiato, con dependencia
del campo (alto espín vs bajo espín), de la molécula de solvente (H2O vs OH-) y del estado de
oxidación (MnIII vs MnII). Aunque se mantiene la preferencia del ligando H2O para especies en el
estado reducido MnII y el ligando OH- para especies en el estado oxidado.
La extensión del modelo a imidazol y acetato mostró el mismo comportamiento. Exploraciones
realizadas en la esfera interna mantienen la estabilidad y posición de los ligandos, aunque los
recursos computacionales no fueron suficientes para analizar las interacciones de la esfera
externa. Estudios posteriores se dirigirán a la inclusión del mecanismo de disociación para
encontrar las especies intermediarias o transicionales claves al entendimiento del modo de
acción de la MnSOD. Todos los cálculos computacionales fueron implementados con métodos
DFT y funcional BP86 utilizando un conjunto de bases de Dunning en optimizaciones y cálculos
de frecuencias vibracionales.
68
11. METODOLOGIA
Este estudio teórico sobre el entendimiento del mecanismo de manganeso superóxido
dismutasa a partir de la comprensión del modelo mínimo, tuvo en cuenta tres factores para su
desarrollo y ejecución:
- Nivel de teoría empleado para los cálculos computacionales
- Programas computacionales para ejecución de cálculos mecano-cuánticos
- Limitantes en el análisis computacional de la manganeso superóxido dismutasa
11.1 Nivel de Teoría Empleado para los Cálculos Computacionales
Para la optimización y cálculo de las frecuencias vibracionales de todos los puntos estacionarios
encontrados en la hipersuperficie del modelo mínimo M2 y su extensión (modelo M1) hasta la
primera esfera de coordinación de la manganeso superóxido dismutasa, se utilizo el método de
la teoría del funcional de densidad (DFT), con el funcional híbrido BP86 y un conjunto de bases
de Dunning establecidas individualmente para los átomos de hidrógeno, carbono, nitrógeno,
oxígeno y manganeso.
11.1.1 Teoría del Funcional de la Densidad
Todos los puntos estacionarios para el modelo mínimo M2 y el modelo extendido M1 fueron
trabajados con la teoría del funcional de densidad DFT [184]. Los métodos DFT computan la
correlación electrónica por medio de funcionales de la densidad electrónica. Estos funcionales
DFT particionan la energía electrónica en varios componentes los cuales son computados
separadamente siendo útiles para complejos metaloorgánicos como los que se trató en esta
investigación. Los componentes de la energía electrónica de los funcionales DFT son la energía
cinética, la interacción núcleo-electrón, la repulsión coulombica y un término de correlación-
intercambio contando para el resto de la interacción electrón-electrón [185].
Se utilizan dos tipos de funcionales: a) funcionales tradicionales y b) funcionales híbridos. Estos
funcionales generalmente se distinguen por el tratamiento que hacen a los componentes de
intercambio y correlación. En el caso de los funcionales tradicionales, el tratamiento local de los
69
funcionales de intercambio y correlación involucra solo los valores de las densidades de espín
electrónico, mientras que, los funcionales de gradiente corregido involucran tanto la densidad
del electrónico como sus gradientes. Los funcionales híbridos definen el funcional de
intercambio como una combinación lineal de Hartree-Fock local y términos de intercambio con
corrección de gradiente.
Tanto los funcionales de intercambio y correlación como los funcionales de gradiente corregido
son suficientemente útiles para el modelo mínimo M2 y su expansión (modelo M1), hasta la
esfera interna porque el sistema es dependiente del ambiente y campo del ión manganeso. Del
mismo modo, todos los cálculos basados en métodos DFT tienen la idea fundamental de hallar
la densidad electrónica que indica la probabilidad de encontrar un electrón cualquiera en un
cierto espacio haciendo que cambie la típica y compleja función de onda por una función de la
densidad electrónica que permite ser más exacta y correlacionada con datos experimentales
como los complejos del modelo mínimo en esta investigación.
11.1.2 Funcional Híbrido Becke-Perdew
Para cada uno de los cálculos de los complejos utilizados en cada modelo del estudio se utilizó el
funcional híbrido BP86. Este consta de un funcional Becke de intercambio de energía con
gradiente corregido desarrollado en 1988 [154]. El funcional Becke contiene solo un parámetro,
que ajusta la energía de intercambio Hartree-Fock exacta de una amplia variedad de sistemas
atómicos con notable precisión que supera el rendimiento de funcionales previos.
Adicionalmente, BP86 contiene un funcional de correlación Perdew que es la mejora del
funcional LM (Langreth, Mehl) [155]. El funcional de correlación Perdew tiene dos objetivos: a)
separación natural entre el intercambio y correlación electrónica dejando que la expansión del
gradiente de la densidad de estos dos funcionales sean recuperados en el límite de variación y
b) simular efectos de heterogeneidad y gas uniforme más allá de la aproximación de fase
aleatoria.
Este funcional híbrido proporciona resultados numéricos cercanos a la energía de correlación
exacta para átomos, iones positivos y superficies. Para todos los puntos estacionarios
encontrados en este estudio de la manganeso superóxido dismutasa se maneja el ión
manganeso en su estado oxidado MnIII y reducido MnII que al ser iones positivos se ajustaron
adecuadamente al funcional híbrido BP86.
70
11.1.3 Conjunto de Base de Dunning
Para los cálculos de optimizaciones y frecuencias vibracionales de los modelos considerados en
este trabajo (M1, M2 y esfera interna), se utilizó un conjunto de bases de Dunning con un
correciones tipo “correlación consistente” (cc) *187]. Este conjunto de bases optimizan a un
nivel mayor para la correlación de cálculos que el nivel Hartree-Fock y fueron diseñadas para
converger rápidamente hacia el completo (infinito) conjunto de la base [188]. A medida que se
aumenta la base, se adicionan funciones en la capa externa del átomo de la forma:
cc-pVXZ
Donde cc son las funciones del conjunto de bases de “correlación consistente”, p es la valencia
polarizada indispensable para los sistemas con metales de transición, y en general para todos
los sistemas con átomos pesados (diferentes a H). X son las bases tipo “zeta” que serán tomadas
en cada uno de los átomos del sistema (X = D, T, Q, 5, 6, 7). Una base cc-pVDZ para el átomo de
carbono consiste de 3s2p1d funciones, mientras que, cc-pVTZ seria 4s3p2d1f funciones y cc-
pVQZ seria 5s4p3d2f1g funciones para este mismo átomo. En esta investigación inicial, no se
utilizó funciones difusas “aug” importantes para reducir el error especialmente en aniones, los
recursos computacionales no fueron suficientes para esta implementación adicional en los
cálculos ejecutados.
El modelo mínimo M2 para la pareja MnIII/MnII coordinada con ión OH- (4 complejos estables,
Figura 7.1), comprende un sistema de 19 átomos con un total de 497 funciones primitivas y 454
funciones contraídas. Se implementó BP86/cc-TZVP (C, N, O); BP86/cc-TZVP*universal (Mn);
BP86/cc-TZV (H) (Tabla 11.1). El conteo de las funciones primitivas (prim) y contraídas (cont)
para cada unos de los átomos del modelo se hace por el conteo de orbitales. Es decir para el
carbono con una base cc-TZVP tiene la expansión [7s3p3d1f|9s3p3d1f]; el lado derecho de la
expansión que está separado por (|) son los orbitales involucrados para el conteo de las
funciones primitivas (orbitales en capas cerradas); mientras que, el lado izquierdo son las
funciones contraídas (descripción de los electrones de valencia).
Si las funciones primitivas del carbono corresponden a la expansión 9s3p3d1f, entonces se
tendrá 9 funciones para orbitales s, 9 funciones para orbitales p (debido a px, py, pz), 15
funciones para los orbitales d (debido a dxy, dxz, dyz, dx2
-y2, dz
2) y 7 funciones para el orbital f. La
suma da como resultado 40 funciones primitivas para el átomo de carbono (el total de las
funciones son el producto de la cantidad del mismo tipo en el sistema) utilizando este conjunto
de base. En el caso de las funciones contraídas con expansión 7s3p3d1f, consiste en, 7 funciones
para orbitales s, 9 funciones para orbitales p, 15 funciones para orbitales d y 7 funciones para
71
orbitales d dando un total de 38 funciones contraídas para el átomo C utilizando este conjunto
de base. El modelo mínimo M2 para la pareja MnIII/MnII coordinada con la molécula de H2O (4
complejos estables, Figura 7.1), comprende un sistema de 20 átomos con un total de 507
funciones primitivas y 463 funciones contraídas. Se implementó BP86/cc-TZVP (C, N, O);
BP86/cc-TZVP*universal (Mn); BP86/cc-TZV (H) (Tabla 11.2). La cantidad de funciones es igual
para la posibilidad bidentada del modelo mínimo M1 (Figura 7.4)
El modelo extendido M1 establece la sustitución de tres ligandos amoniaco por tres anillos
imidazol y un ligando formiato por un ligando acetato. Los cálculos computacionales de este
modelo para la pareja MnIII/MnII coordinada con un ión OH- (4 complejos estables, Figura)
comprenden un sistema de 1065 funciones primitivas y 971 funciones contraídas. Se
implementó BP86/cc-TZVP (C, N, O); BP86/cc-TZVPP (Mn); BP86/cc-TZV (H) (Tabla 11.3).
Adicionalmente, el modelo extendido M1 para la pareja MnIII/MnII coordinada con una molécula
de H2O (4 complejos estables, Figura 7.12) comprende un sistema 1075 funciones primitivas y
980 funciones contraídas. Se implementó BP86/cc-TZVP (C, N, O); BP86/cc-TZVPP (Mn);
BP86/cc-TZV (H) (Tabla 11.4).
Por último se utilizó el conjunto de bases de Dunning híbrido con las funciones de “correlación
consistente” para ocho especies de la esfera interna de la manganeso superoxido dismutasa. La
pareja MnIII/MnII coordinada con un ión OH- (4 estructuras estables, Figura 11.5) para la esfera
interna de MnSOD se calculó a partir de un sistema de 78 átomos con 2165 funciones primitivas
y 2007 funciones contraídas. Se implementó BP86/cc-TZVP (C, N, O); BP86/cc-TZVPP (Mn);
BP86/cc-TZV (H) (Tabla 11.5). Adicionalmente, la esfera interna para la pareja MnIII/MnII
Tabla 11.1 Conjunto de bases utilizadas para la pareja MnIII/MnII coordinado con ión hidroxilo en el modelo mínimo M2. Fragmento del archivo de salida en Turbomole 6.4
72
coordinada con una molécula de H2O (4 complejos estables, Figura) comprende un sistema de
2175 funciones primitivas y 2016 funciones contraídas. Se implementó BP86/cc-TZVP (C, N, O);
BP86/cc-TZVPP (Mn); BP86/cc-TZV (H) (Tabla 11.6).
Tabla 11.2 Conjunto de bases utilizadas para la pareja MnIII/MnII coordinado con una molécula de agua en el modelo mínimo M2. Fragmento del archivo de salida en Turbomole 6.4
Tabla 11.3 Conjunto de bases utilizadas para la pareja MnIII/MnII coordinado con un ión hidroxilo en el modelo extendido M1. Fragmento del archivo de salida en Turbomole 6.4
73
Tabla 11.4 Conjunto de bases utilizadas para la pareja MnIII/MnII coordinado con una molécula de agua en el modelo extendido M1. Fragmento del archivo de salida en Turbomole 6.4
Tabla 11.5 Conjunto de bases utilizadas para la pareja MnIII/MnII coordinado con un ión hidroxilo en la esfera interna de la manganeso superóxido dismutasa. Fragmento del archivo de salida en Turbomole 6.4 para un complejo de la primera esfera de coordinación
74
11.2 Programas Computacionales para la Ejecución de Cálculos Mecanocuánticos
Para los calculos de optimizacion y determinacion de las frecuencias vibracionales de todos los
puntos estacionarios encontrados en la hipersuperficie de los modelos M2 y M1, se utilizarón
los paquetes computacionales Turbomole 6.4 y Gaussian 09W. Las entradas individuales de cada
complejo se convirtieron para cada software a partir de la interfax grafica que maneja
Turbomole 6.4 y Gaussian 09W.
El envio de datos de entrada (jobs) para cada complejo se hizo por medio de PBS-Server que
utiliza un servidor intermedio para que sean calculados en los cluster con que cuenta la
Universidad de los Andes. Esta parte sera explicada con más detalle en la seccion 11.2.3.
11.2.1 Turbomole 6.4
Este programa desarrollado por la Universidad de Karlsruhe y distribuido por Cosmologic
(adquirido por el grupo del profesor Weston) ejecutó cálculos de un sistema molecular por
módulos (Figura 11.1) ubicados en un directorio [188]. Es decir, que no maneja un único archivo
Tabla 11.6 Conjunto de bases utilizadas para la pareja MnIII/MnII coordinado con una molécula de agua en la esfera interna de la manganeso superóxido dismutasa. Fragmento del archivo de salida en Turbomole 6.4 para un complejo de la primera esfera de coordinación
75
de entrada donde tiene toda la información, sino lo particiona en varios archivos con la
información importante para la ejecución de un determinado calculo computacional. Las
características de Turbomole 6.4 son:
- Algoritmos semi-directos con memoria principal ajustable y requerimiento de espacio en
el disco.
- Completo uso de todos los grupos puntuales de simetría
- Evaluación eficiente de integrales
- Redes estables y precisas para la integración numérica.
- Bajo requerimiento de memoria y espacio de disco.
Figura 11.1 Los módulos de Turbomole 6.4 y el principal flujo de datos principales entre ellos. Tomado de la literatura 165
76
Esta programación facilita al usuario que el procesador no tenga volcado de memoria virtual y
real. Los datos de entrada pueden ser creados de dos maneras: a) interacción dinámica con el
programa de cálculo a partir de un comando “define” que suministra todas las opciones para
diseñar una estructura molecular, ó b) construcción molecular desde la interfaz grafica
TmoleXClient 3.3 (última versión, Figura 11.2) para ser enviados directamente al entorno del
programa (encadenado). La que se utilizó en este estudio para todos los modelos, partió de
generar todas las entradas desde la interfaz grafica; debido a que la interacción dinámica tiene
inconvenientes con PBS-Server (Sección 11.2.3). Se generó 64 entradas en TmoleXClient 3.3
para las optimizaciones del modelo mínimo (8 entradas), ambiente octaédrico (8 entradas),
rotación carboxilato (32 entradas), modelo extendido (8 entradas) y primera esfera de
Figura 11.2 Interfaz grafica TmoleXClient 3.3 para la construcción de las entradas que se ejecutaron en Turbomole 6.4
77
coordinación (8 entradas). Del mismo modo, 64 entradas para los cálculos de frecuencias
vibracionales.
Los directorios que contienen los datos de entrada para las optimizaciones de cada uno de los
complejos en Turbomole 6.4 presentan los siguientes archivos:
alpha: Este archivo si extensión contiene la lista no editada de los valores propios α
(eigenvalues) del sistema.
beta: Este archivo si extensión contiene la lista no editada de los valores propios β
(eigenvalues) del sistema.
auxbasis: Tiene la información del conjunto de bases escogidas para cada átomo. Se utiliza solo
si se tiene en cuenta el método RI-J para aproximación del potencial coulombico
(autónoma del programa Turbomole) que es un método rápido de convergencia del
campo autoconsistente. En la investigación todos los complejos estables utilizaron
este archivo.
basis: Tiene la información del conjunto de bases escogidas para cada átomo.
coord.: Presenta todas las coordenadas redundantes en el sistema. Es decir una combinación
de coordenadas cartesianas con las coordenadas internas. Para este estudio, todos los
cálculos fueron ejecutados con coordenadas redundantes porque ayudó a que la
estructura de la primera esfera de coordinación fuera leída en formato *.pdb.
fort7: Archivo exclusivo para las optimizaciones, hace el encadenamiento entre la interfaz
grafica TmoleXClient 3.3 y el entorno de programa Turbomole 6.4.
control: Es el archivo que define la ruta del cálculo (optimización) porque tiene toda la
información condensada en un script que fue leído por el entorno del programa.
Todos los complejos del modelo mínimo, extensión del modelo y esfera interna de
coordinación se ajustaron a 1000 iteraciones del campo autoconsistente (SCF, por sus
siglas en ingles) para garantizar la convergencia de las geometrías de entrada.
Si el directorio no tiene cualquiera de estos siete archivos no se puede ejecutar un cálculo de
optimización. En la creación de directorios para las frecuencias vibracionales se requirió tener
previamente la geometría optimizada para todos los complejos ya que el archivo control de la
especie optimizada introduce el momento dipolar y el hessiano necesarios para hallar todas las
frecuencias del sistema. A diferencia de los archivos generados para la optimización, en un
cálculo de frecuencia no existe el archivo fort7.
78
Se comenzó la optimización de las 64 estructuras llamando el modulo jobex, utilizando
aproximación RI-J (-ri) y 1500 ciclos (-c 1500) para cada uno de los complejos diseñados en la
investigación. En el caso de las 64 frecuencias se invoco el modulo aoforce sin ninguna
extensión. La utilización local de ambos módulos jobex y aoforce, se hace desde el directorio de
entrada para que pueda ser reconocido los archivos:
[Local]:/home/usuario/[directorioopt]> jobex –ri –c 1500
[Local]:/home/usuario/[directoriofreq]> aoforce
Al finalizar cada uno de los cálculos de optimización se verificó la existencia de un archivo con
nombre GEO_OPT_CONVERGED que indicaba la finalización normal. De lo contrario, si aparecía
un archivo con nombre GEO_OPT_FAILED se repetía el cálculo eliminando una línea en el
archivo control ($ last step) y aumentando las iteraciones SCF. El archivo de salida para este
programa tuvo un nombre común job.last que particiona los datos de la optimización en tres
paquetes: a) el paquete rdgrad con los valores del gradiente ejecutado por el programa ridft, b)
el paquete STATPT que actualiza las coordenadas y el hessiano para buscar un punto
estacionario y c) el paquete ridft que es un programa DFT con aproximación RI para la parte de
potencial coulombico. Todos estos paquetes en el archivo de salida job.last fueron finalizados
correctamente confirmado por las líneas:
**** rdgrad : all done ****
**** statpt : all done ****
**** ridft : all done ****
Adicionalmente, para la salida de las frecuencias vibracionales se abre un archivo que tiene el
mismo nombre del directorio; este contiene el paquete aoforce que entrega los resultados de
todos los modos vibracionales de la molécula. La ejecución normal de aoforce en Turbomole es
confirmado por la línea:
**** force : all done ****
79
La visualización de la geometría optimizada y de las frecuencias se hizo desde la interfaz grafica
TmoleXClient 3.3 (Figura 11.3) abriendo el archivo control. Desde TmoleXClient 3.3 se puede
Figura 11.3 Resultados de optimización (arriba) y frecuencias (abajo) para un complejo estable del modelo mínimo visualizado en TmoleXClient 3.3.
80
obtener los datos de superficies 3D en los orbitales, el gradiente de cada una de las
conformaciones hasta llegar a la optimización, los resultados de energía y los momentos
dipolares en un cálculo de optimización. En un cálculo de frecuencias se obtiene adicionalmente
los modos de vibración representados en la molécula, las propiedades termodinámicas y el
espectro infrarrojo en fase gaseosa sin interacción de ningún campo.
11.2.2 Gaussian 09W
El programa Gaussian 09W (licencia académica institucional) es uno de los programas más
robustos en la predicción de propiedades moleculares utilizando aproximaciones
mecanocuánticas [166]. En este estudio se utilizó este programa para la exploración preliminar
de la hipersuperficie a partir de un cálculo denominado Scan Test y la convergencia de las
esferas externas de la manganeso superóxido dismutasa; sin embargo en este caso, el conjunto
de base Dunning utilizado excedió el límite de memoria en los núcleos del procesador para
ejecución en PBS-Server por lo que se dejo de lado y no está presente en este documento. A
diferencia de Turbomole 6.4, el paquete Gaussian 09W tiene una librería de funciones y
propiedades moleculares más completa y se maneja en un solo archivo de entrada que puede
indicar un único tipo de cálculo o un conjunto de cálculos denominado “multi steps jobs”.
Este programa puede hacer procesamiento por lote (varios jobs en un procesador), que es
adecuado para el modelamiento de metaloenzimas como es el caso de esta investigación. La
generación del archivo de entrada se puede hacer de dos formas. La primera es directamente
desde el programa de calculo que genera un archivo de texto no enriquecido con extensión
*.gjf, *.com. No es recomendable porque su utilización depende del sistema operativo del
procesador. La otra forma es el encadenamiento de la interfaz grafica GaussView 5.0.8 (licencia
académica institucional) con el programa de cálculo (Figura 11.4) y/o la conversión de formato
por el aplicativo Newzmat [162].
La entrada de Gaussian 09 consiste de una serie de líneas en un archivo de texto ASCII. La
estructura básica de un archivo de entrada que incluye diferentes secciones:
Comandos base (Link 0 section): Localiza y nombra los archivos de la salida. Aunque puede
ser una línea en blanco se recomienda guardar la comprobación (Chk) y fijar la cantidad de
memoria (Mem) que utilizara por procesador en un cálculo local; viene precedido de un
signo %. En este estudio solo se utilizo la cantidad de memoria para geometrías muy grandes
en un orden superior de 75 MW. Si no se pone la memoria suficiente o se excede se cae el
cálculo por falta de recursos computacionales.
81
Ruta (Route section): Especifica el tipo de cálculo deseado, modelo químico y otras opciones.
No puede estar vacía y se puede componer de varias líneas. Para el escaneo de las
hipersuperficies de energía potencial preliminares, se escogió el tipo de cálculo test (T), el
modelo químico es BP86/cc-TZV y la conformación Scan Test.
Titulo (Title Section): Breve descripción del cálculo, esta sección se requiere en la entrada,
pero no es interpretada por Gaussian 09W. Solamente sirve para propósitos de
identificación y descripción. Tiene un límite de cinco líneas y no puede contener caracteres
especiales como /, #, @.
Geometría (Molecule specification): Es la entrada de coordenadas internas o cartesianas (de
acuerdo al formato) a ser estudiadas. Para los escaneos de las superficies de la esfera
Figura 11.3 Visualización de GaussView 5.0.8 configurando un cálculo de la segunda esfera de la manganeso superóxido dismutasa para encadenarlo a Gaussian 09W.
82
interna y externa de manganeso superóxido dismutasa se implemento las coordenadas
internas.
Opciones adicionales (Optional additional sections): Es la entrada necesaria para tipos de
trabajo específico, se adiciona correcciones de temperatura, presión, entre otros. En este
caso se utilizó para la modificación de la longitud de enlace entre el átomo de manganeso y
el átomo de oxígeno del ligando de solvente.
Con estas líneas se hizo un script básico para la ejecución local de un Scan Test preliminar en la
esfera interna y externa de la manganeso superóxido dismutasa:
Después de tener la entrada del programa Gaussian se ejecuta localmente con la orden g09 y el
nombre que se le dio al archivo:
[Local]:/home/usuario/> g09 job-name
Al finalizar cualquier tipo de cálculo se debe crear un archivo de texto plano con el nombre del
trabajo y la extensión *.log. Al final de la pantalla de este archivo se debe verificar que el trabajo
se completo normalmente, y esto se muestra con una línea:
Normal termination of Gaussian 09W
%Mem=75MW………………………………………………………………………………………………….Link O section # T BP86/TZV Scan…………………………………………………………………………………….. Test Route section Hipersuperficie X………………………………………………………………………………………………… Title section Coordenadas internas de 79 átomos para la forma reducida MnII y 78 átomos para la forma oxidada MnIII No. O………………………………………… ………………………………………………………..Molecule Specification No. H………………………………………… ………………………………………………………..Molecule Specification No. C:……………………………………… ………………………………………………………..Molecule Specification No. N………………………………………… ………………………………………………………..Molecule Specification No. Mn……………………………………… ………………………………………………………..Molecule Specification
83
11.2.3 Envío de Jobs por PBS-Server
Todos los cálculos se enviaron por servidor con el apoyo del departamento de tecnologías de la
información de la Universidad de los Andes. Aunque se cuenta con el servicio GRIDCOLOMBIA
que es la red de procesamiento internacional para cálculos computacionales de alto nivel, no se
pudo ejecutar porque los programas Turbomole 6.4 y Gaussian 09W requieren cambios en el
entorno de programación para subirlo en la capa. No obstante se utilizaron todos los nodos
locales (alrededor de 40 procesadores) con que cuenta la universidad. La infraestructura del
ambiente de cómputo se limito únicamente a PBS-Server (Figura 11.4). Además se comenzó con
los cálculos paralelizados para utilizar todos los núcleos de un mismo nodo utilizando la misma
memoria por procesamiento SMP (multiprocesamiento simétrico) y las pruebas para paralelizar
Figura 11.4 Infraestructura grid de la Universidad de los Andes. Tomado de http://tibana.uniandes.edu.co/wikigrid/lib/exe/detail.php?id=inicio&media=arquitecturawiki_v1.jpg
84
las entradas de cálculos con muchas funciones usando diferentes nodos, con rendimiento
diferente por la memoria local y utilización de disco.
El protocolo que se definió para enviar los cálculos comprende el acceso al servidor tado desde
cualquier sistema operativo del interfaz de usuario (UI, Figura 11.4). Esto se hizo por medio de
SSH Client que es un programa versión libre para acceder a maquinas remotas (Figura 11.5).
Como al servidor tado no se puede ingresar directamente porque están instaladas todas las
aplicaciones de cómputo de la universidad se ingresa un servidor de comunicación denominado
yali por medio de una clave de registro (acceso restringido). Para ejecutar todas las entradas de
los programas Turbomole 6.4 y Gaussian 09W, el ingeniero Daniel Burbano Sefair del DTI diseña
Figura 11.4 Protocolo de ingreso a servidor tado para ejecución de cálculos computacionales en Turbomole 6.4 y Gaussian 09W.
85
dos paquetes de scripts (pbs-turbomole y pbs-g09) para enviar los jobs a los clústers según su
disponibilidad.
Los dos scripts tienen el mismo funcionamiento y se siguió sistemáticamente los siguientes
pasos para directorios en Turbomole 6.4:
Conexión:
[yali] /home/USER >
Se arrastró la carpeta o archivo de la entrada de cada programa mediante el comando
transferencia de archivos del SSH Client.
Se efectuó la siguiente operación:
[yali] /home/USER > ssh tado
Donde se accedió con clave de registro:
[tado] /home/USER >
Se trasladaron los archivos de yali a tado por el comando scp; especificando la ubicación de
donde se encuentra el archivo y hacia dónde va ir, un ejemplo de esto es:
[yali] /home/USER > scp -r [DIR] USER@tado:/home/USER/
Se verifico que la carpeta de cálculo se encontrara en la carpeta proyectos en el servidor de
química:
[tado]/química/pbs-turbomole/USER/proyectos >
Solo en esta ubicación el script desarrollado para automatizar los cálculos funciona de forma
correcta.
Después se direcciona a:
[tado] /home/USER/pbs-turbomole >
Se encuentra la carpeta scripts que tiene cuatro archivos:
commands: Este archivo contiene las líneas de los comandos más utilizados por el programa
para ejecutar optimizaciones y frecuencias.
86
- dscf > dscf.out Es un modulo de optimización rápido para métodos HF, para
poder correr los cálculos con este comando se requiere que no tenga activado la
opción RI en la construcción de moléculas en TmoleX, o en la edición del archivo
control que se encuentra en el directorio que se creó.
- ridft Es un modulo que sirve para calcular energías de la geometría ingresada. Es
para cálculos single point energy
- jobex –ri Es un modulo para la optimización de métodos HF y DFT con mejor
aproximación se puede incluir los ciclos de optimización en otra línea.
La ventaja que tiene este archivo es que se puede editar para incluir los comandos de
cálculo de Turbomole que se requieran sin que afecte la ejecución de los trabajos. Es
recomendable ingresar la línea aoforce que sirve para calcular frecuencias
vibracionales.
HELP: Este archivo entrega información básica de cómo se corren cálculos mediante el
servidor.
PBS-turbomole.sh: Script para la ejecución de cálculos.
pbs-turbomole-template.sh: Script de soporte a PBS-turbomole.sh.
Como el (los) directorio(s) de la molécula ya estaba copiado en la carpeta compartida de
química se pudo enviar jobs al servidor mediante la siguiente operación:
[tado] /home/USER/pbs-turbomole/scripts > ./PBS-turbomole.sh
Donde se apareció la selección del experimento y seguidamente de la opción la selección del
programa para Turbomole 6.4:
Select an experiment:
1) Molecula1.4
#?
Select a program
1) dscf
2) jobex
87
3) ridft
4) aoforce
Dando un ID del job. La revisión en cola de química se hizo por el comando:
qstat –q
Para las entradas de Gaussian 09W tienen las mismas operaciones, a diferencia que no se
trasladan directorios sino archivos, y la selección de programas en el script es diferente.
11.3 Limitantes en el Análisis Computacional de la Manganeso Superóxido Dismutasa
El principal limite en analizar teóricamente la estructura de la manganeso superóxido dismutasa
es el escogimiento del sistema que pueda tener las interacciones electrónicas-estructurales más
importantes para entender en qué posición y bajo qué condiciones logra sintonizar el sustrato
(O2·-). Solo tomando un modelo muy simplificado como el modelo mínimo e implementando un
nivel de teoría y conjunto de bases suficiente a la correlación electrónica, se aumenta
exponencialmente las funciones primitivas y contraídas hasta el punto de carecer de poder de
procesamiento, aun utilizando los recursos computacionales de los servidores. Esto sucede
porque hay un metal de transición (cuarto periodo) y el cómputo de sus funciones lleva más
tiempo del indicado. En estos casos, resulta mejor definido un sistema que comprende un
compuesto orgánico con una cantidad de átomos superior a 150 átomos porque en la mayoría
de los casos los átomos se encuentran en segundo periodo y el cómputo se hace en orbitales p.
Para el estudio de la esfera externa de MnSOD, se presento el límite de cálculo del programa
Turbomole 6.4 para sistemas con más de 100 átomos (segunda esfera de coordinación). La
utilización del método DFT con nivel BP86 y un conjunto de bases mínimo cc-TZV no permitió la
convergencia de estos complejos. Ni siquiera se ejecuto al modificar las iteraciones y ciclos en el
archivo control del directorio de trabajo. Con mucho más soporte Gaussian 09W, trató de
buscar la geometría con mínima energía en la esfera externa de MnSOD, pero requiere de un
tiempo muy grande para la normal terminación. Esto conlleva a aumentar dramáticamente el
periodo de cálculo y a requerir mayor procesamiento que al momento no se tuvo. En los nodos
del PBS-Server no solo se está ejecutando los directorios o archivos de entrada para química,
sino para todos los grupos que manejan un tipo de aplicación científica al desarrollo de sus
propias investigaciones.
88
12. REFERENCIAS
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