guía de laboratorio - química orgánica para biología - parte b

Departamento de Química Orgánica Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

QUÍMICA ORGÁNICA

(CIENCIAS BIOLÓGICAS)

Guía de Laboratorio (Parte B)

2º Cuatrimestre 2015

Profesora: Dra. Adriana Kolender Jefes de Trabajos Prácticos: Dra. Valeria Careaga Dra. Luciana Giordano Dra. Malena Landoni Dra. Andrea Ponce Dra. Olga Tarzi

Dpto. Química Orgánica, FCEyN, UBA.

Química Orgánica (Cs. Biológicas)

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PROGRAMA 1- Estructura y propiedades de los compuestos orgánicos:

Uniones químicas. Orbitales del carbono en los compuestos orgánicos. Hibridación. Forma de las moléculas orgánicas. Longitud, ángulo y energía de enlace. Grupos funcionales. Nomenclatura. Isomería. Isómeros de cadena.

2- Estereoquímica:

Isómeros geométricos e isómeros ópticos. Actividad óptica. Quiralidad. Enantiómeros y diasterómeros. Configuración relativa y absoluta. Nomenclatura de Cahn, Ingold y Prelog. Proyecciones de Fischer, de caballete y de Newman. Mezclas racémicas. Resolución química y enzimática. Cicloalcanos. Isómeros conformacionales.

3- Mecanismo de las reacciones orgánicas. Reacciones y propiedades físicas de los diversos

grupos funcionales: a) Alcanos: Reactividad. Reacción en cadena: radicales libres. b) Alquenos y alquinos: Reactividad. Mecanismos iónicos: adición electrofílica al doble y triple enlace. Estereoquímica de las reacciones de adición. Oxidación de alquenos. c) Hidrocarburos aromáticos: Resonancia. Reacciones de sustitución electrofílica aromática. Mecanismos. Efecto de los sustituyentes. d) Halogenuros de alquilo: Reactividad. Mecanismos de las reacciones de sustitución nucleofílica (SN1 y SN2) y de eliminación (E1 y E2). Concepto de nucleófilo y de base.

e) Derivados orgánicos oxigenados: Alcoholes: reacciones del grupo OH como nucleófilo; deshidratación; oxidación; sustitución. Fenoles: acidez; reacciones. Éteres. f) Aldehídos y cetonas: Reacciones de adición al grupo carbonilo. Oxidación y reducción. Reacciones de reconocimiento y diferenciación. g) Ácidos carboxílicos y derivados: Acidez de los ácidos carboxílicos. Reacciones. Formación de ésteres. Halogenuros de acilo. Otros derivados. Reacciones

4- Espectroscopía:

Espectroscopía de infrarrojo (I.R.): utilidad para identificar grupos funcionales. Espectroscopía de ultravioleta (U.V.) y visible. Cromóforos y auxócromos. Sustancias coloreadas y colorantes.

Nociones de espectroscopía de resonancia magnética nuclear protónica (R.M.N.-1H)

5- Hidratos de carbono: a) Monosacáridos: Propiedades generales. Estructura hemiacetálica. Glicósidos. Mutarrotación. Anómeros. Estereoisomería. Estructuras de Fischer, de Haworth y conformacionales. Aminoazúcares. Desoxiazúcares. b) Disacáridos: Maltosa, celobiosa, lactosa, sacarosa. Determinación de su estructura. Propiedades. c) Polisacáridos: Clasificación. Almidón y celulosa. Propiedades.

6- Lípidos:

Ácidos grasos. Triglicéridos. Grasas y aceites. Índices. Saponificación. Reacciones de caracterización. Jabones y detergentes. Fosfolípidos: lecitinas y cefalinas. Cerebrósidos, glicolípidos. Estructura y propiedades.

7- Aminas, aminoácidos, péptidos y proteínas:

a) Aminas: Basicidad. Reacciones. Formación de amidas. b) Aminoácidos: Clasificación. Estructura. Configuración. Propiedades. Punto isoeléctrico. "Zwitterion".



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c) Péptidos: Unión peptídica. Determinación de estructuras. Marcación de grupos terminales. Síntesis: métodos de protección y de activación.

8) Compuestos heterocíclicos:

Heterociclos con N, O y S de cinco y seis miembros. Pirrol. Furano. Tiofeno. Reacciones y propiedades. Porfina y porfirinas. Hemoglobina, clorofila, vitamina B12. Piridina. Reacciones y

propiedades. Quinolina. Nicotina y piridoxina. Indol. Triptofano y escatol. Pirimidina. Uracilo, citosina y timina. Purinas. Adenina y guanina.

9) Ácidos nucleicos:

Nucleósidos y nucleótidos. Estructura.



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RÉGIMEN DE APROBACIÓN El curso de Química Orgánica para los alumnos de la carrera de Ciencias Biológicas, se dictará en dos cuatrimestres. En el primero (parte A) se desarrollarán los conceptos básicos de la Química Orgánica y los correspondientes a la Química de los Productos Naturales; esto se realizará a través de clases teóricas (4 hs. semanales) y de clases de problemas (4 hs. semanales) de asistencia no obligatoria. En el segundo cuatrimestre (parte B) se llevarán a cabo los trabajos prácticos de laboratorio (7 hs. semanales) de asistencia obligatoria. SISTEMA DE EVALUACIÓN Parte A: Se tomarán dos exámenes parciales sobre los temas desarrollados en las clases teóricas y de problemas. La aprobación de cada parcial requerirá un mínimo de 50 puntos. Los parciales no aprobados podrán recuperarse en un mismo día, al final del cuatrimestre, siempre que la suma de las notas obtenidas en ambos parciales sea igual o mayor a 50 puntos. El ausente será considerado 0 (cero). Las recuperaciones se aprueban con 60 puntos. No se tendrán en cuenta certificados médicos. El alumno que apruebe la parte A estará en condiciones de cursar la parte B el siguiente cuatrimestre. Parte B: Deberán aprobarse los parciales y el laboratorio (ver más abajo). Se tomarán dos exámenes parciales sobre las prácticas realizadas en el laboratorio. La aprobación de cada parcial requerirá un mínimo de 55 puntos. Los parciales no aprobados podrán recuperarse al final del cuatrimestre, siempre que la suma de las notas obtenidas en ambos parciales sea igual o mayor a 55 puntos. El ausente será considerado 0 (cero). Las recuperaciones se aprueban con 60 puntos. Sólo se tendrán en cuenta certificados médicos emitidos por instituciones públicas. APROBACION DE LA MATERIA Promoción: Los alumnos que en ambos exámenes parciales de la parte A obtengan un puntaje igual ó mayor a 75 puntos y en ambos parciales de la parte B un puntaje igual o mayor a 60 puntos, aprueban la materia sin rendir examen final. Firma de Trabajos Prácticos: Los alumnos que aprueben los exámenes parciales y el laboratorio y no estén comprendidos en la promoción, firmarán los trabajos prácticos y deberán rendir examen final. Aprobación de laboratorio: Esto implica aprobar todas las prácticas, para lo cual se requiere: i) la realización satisfactoria de la misma, a juicio del jefe de trabajos prácticos;

ii) aprobación de los interrogatorios respectivos (escritos) iii) aprobación del informe correspondiente INFORMES: En los informes deberá constar: a - nombre/s de el/los alumno/s que realizaron la práctica; b - trabajo realizado: no transcriba lo que figura en la guía, describa todo lo hecho que no

sea según las instrucciones o no figure en ellas, por ejemplo modificaciones de reactivos o volúmenes, solventes empleados, tiempos y temperaturas, etc. etc.

c - resultados esperados (teóricamente) d - resultados obtenidos experimentalmente e - explicación de las diferencias - si es que existen - entre c y d f - observaciones y comentarios sobre el trabajo realizado g - datos físicos y toxicológicos de las sustancias empleadas h - todas las preguntas que forman parte de cada práctica (no se refiere al cuestionario)



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Nota: se debe tener en cuenta que entregar el informe no significa que haya sido aprobado. Ejemplos:

Parte B: 1º parcial 2º parcial 55 55 Aprueba la parte B 54 55 Recupera 1º parcial 55 54 recupera 2º parcial Las recuperaciones se aprueban con 60 puntos. Promoción: podrán acceder a la promoción aquellos alumnos que, sin haber recuperado ningún parcial, hayan obtenido las siguientes notas como mínimo: 1º parcial 2º parcial Parte A 75 75 Parte B 60 60

IMPORTANTE

Es requisito indispensable para realizar las prácticas, el saber y entender todos los temas

involucrados (a tal fin se tomarán interrogatorios orales y/o escritos). Como ayuda y ejemplo no

excluyente se ha agregado a cada Guía de T.P. un cuestionario con preguntas y problemas típicos.

BIBLIOGRAFIA 1. A. Vogel “Practical Organic Chemistry, Longmans”. 2. S. Glasstone “Elementos de Físico-Química”. 3. S. J. Baum, W. Bowen, S. Poulter “Laboratory Exercises in Organic and Biologic Chemistry”,

Second Edition. 4. M. P. Cava, M. J. Mitchel “Selected Experiments in Organic Chemistry”, Benjamin, 1966 5. G. Brieger “A Laboratory Manual of Physical Methods in Organic Chemistry”, Harper & Row,

1969. 6. K. B. Wyberg “Técnica de Laboratorio en Química Orgánica”, Kapelusz, 1962. 7. L. F: Fieser “Experimentos en Química Orgánica”, Reverté S.A., 1967. 8. L. G. Galagovsky “Química Orgánica: Fundamentos Teórico-Prácticos del Laboratorio,

Eudeba, 1992.



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NORMAS DE SEGURIDAD

LABORATORIOS SUPERIORES (LABORATORIO 4, 5, 6 y 7)

INSTRUCTIVO PARA ALUMNOS Riesgos de Incendios por causas eléctricas Los incendios provocados por causas eléctricas son muy frecuentes. Ellos ocurren por:

• sobrecalentamiento de cables o equipos bajo tensión debido a sobrecarga de los conductores. • sobrecalentamiento debido a fallas en termostatos o fallas en equipos de corte de temperatura. • fugas debidas a fallas de aislación. • autoignición debido a sobrecalentamiento de materiales inflamables ubicados demasiado

cerca o dentro de equipos bajo tensión, cuando en operación normal pueden llegar a estar calientes.

• ignición de materiales inflamables por chispas o arco. Shock Eléctrico Un shock eléctrico puede causar desde una sensación de cosquilleo hasta una desagradable estímulo doloroso resultado de una perdida total del control muscular y llegar a la muerte. Los mecanismos de muerte por electricidad son:

1. Fibrilación ventricular; es el más riesgoso ya que a menos que se disponga de un desfibrilador o se esté en un centro médico se trata de un acontecimiento espontáneo irreversible provocando la muerte. 2. Tetanización: produciendo la contracción de los músculos estriados de las extremidades haciendo que la victima quede prendida al conductor. 3. Doble acción: de tetanización y fibrilación. 4. Parálisis bulbar, cardiocirculatorio y respiratorio.

Los factores que se deben tener en cuenta para evitar accidentes son: La Intensidad de la corriente:

El umbral mínimo de percepción es 1.1 mA con Corriente Alternada. El umbral mínimo dc contracción muscular se produce con 9 mA pudiendo ocurrir contracción de los músculos que ocasiona la proyección del accidentado lejos del conductor y cuando no sea asi se puede Ilegar a la asfixia por contracción de los músculos respiratorios. El umbral de corriente peligroso es de 80 mA en Corriente Alternada de 50 ciclos, donde ya se puede llegar a la fibrilación ventricular . El umbral de corriente que pueden causar depresión del Sistema Nervioso Central ocurre con corriente de 3 ó 4 A. Asi según la intensidad y su acción sobre el organismo se clasifica:



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CATEGORIA INTENSIDAD EFECTO 1 menor de 25 mA Tetanización sin influencia sobre corazón

2 de 25 a 80 mA Tetanización con posibilidad de parálisis temporal cardíaca y respiratoria

3 de 80 mA a 4 A Zona peligrosa de fibrilación ventricular 4 mayor a 4 A Parálisis cardíaca y respiratoria: quemaduras graves

Tiempo de contacto. El corazón no puede producir la fibrilación a menos que el tiempo de contacto sea como mínimo del orden de un periodo cardíaco en valor medio 0,75 seg. O sea que a tiempos de contactos menores no se produce la fibrilación. Esto es muy importante desde el punto de vista de la protección de los disyuntores diferenciales, ya que el corte de la corriente se produce en tiempos de aproximadamente 200 mil segundos o sea que no se puede llegar a que atraviesen el organismo corrientes peligrosas. NORMAS PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO Objeto: Seguridad en el laboratorio. Este es un recordatorio para estudiantes y cualquier persona que trabaje en el laboratorio acerca de los criterios de seguridad que se deben contemplar POR FAVOR LEA DETENIDAMENTE Y SIGA ESCRUPULOSAMENTE LAS SIGUIENTES NORMAS DE SEGURIDAD RECUERDE: LA PRECARIEDAD ES LA PRINCIPAL CAUSA DE LOS ACCIDENTES EN EL LABORATORIO 1- NORMAS DE SEGURIDAD PARA TRABAJAR CON MAQUINAS HERRAMIENTAS

• Use en todo momento antiparras. • No trabaje solo. • No opere máquinas para las cuales no está calificado. • No deje la llave en la mordaza del torno. • Si tiene cabello largo, use una banda para mantenerlo recogido. • No use cadenas, anillos, corbata o cualquier prenda suelta mientras está trabajando en una

máquina. • Verifique si las pinzas están fijadas correctamente en las máquinas antes de ponerlas en

funcionamiento. • Mantenga el piso alrededor de las máquinas libre de grasa, aceite, virutas, piezas y

herramientas de trabajo. • Sea precavido en las zonas donde se usa aire comprimido. Nunca apunte el pico a una

persona. ya que tal acción puede hacer volar partículas extrañas a los ojos, oídos, etc, o causar daños serios.

• Nunca abandone una máquina hasta que esté totalmente detenida.

2- NORMAS DE SEGURIDAD PARA TRABAJAR CON ALTA TENSlÓN

• Si se encuentra solo NO realice experimentos que requieran utilizar alta tensión



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• Asegúrese que su fuente y su circuito de alta tensión estén adecuadamente puestos a tierra (verifique la tierra usada y que las conexiones sean firmes).

• NUNCA toque un cable de alta tensión o cualquier parte que haya sido conectada a una fuente de alta tensión sin haber antes cortocicuitado a tierra AL MENOS DOS VECES dicho elemento, con una -barra a tierra-. Para este propósito el laboratorio debe tener una barra con aislación para ser usada con alta tensión. El procedimiento a seguir en este caso es: Fijar mecánicamente el cable de la barra a una buena tierra y luego tocar el elemento que pudiera estar a alta tensión con el extremo aislado de la barra.

• Ud debe suponer SIEMPRE que todos los condensadores ESTAN CARGADOS. Siempre cortocircuite con la barra de tierra todos los condensadores antes de tocarlos.

• LA DESCARGA DE UN CONDENSADOR DE ALTA TENSION PUEDE SER LETAL AUN SI NO HA ESTADO CONECTADO A UNA FUENTE DE ALTA TENSION POR VARIOS DIAS.

• Las fuentes de alta tensión de su experimento pueden tener condensadores que pernanecen cargados aún si la fuente ha sido apagada. Una descarga de tal condensador puede ser LETAL. Utilice la barra de tierra antes de tocar la salida de la fuente.

• Cubra todas las conexiones de alta tensión para evitar contactos accidentales con las mismas. • Coloque carteles "PELIGRO, ALTA TENSlÓN" en todo experimento o conexión que lo

requiera. • Asegúrese que el piso o la mesa de trabajo no estén mojados cuando trabaja con alta tensión. • Use cables de especificaciones adecuadas para alta tensión. • Asegúrese de apagar las fuentes de alta tensión cuando no está controlando personalmente su

experimento. • Las descargas rápidas de alta tensión emiten ruido electromagnético que pueden alterar el

funcionamiento de marcapasos. • La tensión de Línea también es potencialmente peligrosa, ya que con más de 80 V el cuerpo

humano admite una corriente capaz de producir paro cardíaco. • Controle la calidad de la tierra de su circuito antes de conectarlo. • Por norma de seguridad todos los equipos tienen su correspondiente conexión a tierra.

Controle la calidad de este contacto cuando va a usar un equipo no comercial. • Tenga especial cuidado al conectar un autotransformador o variac. El borne común de este

dispositivo debe estar conectado al neutro de la línea. Sea consiente que en este caso los contactos del enchufe no son equivalentes.

• En el laboratorio muy frecuentemente se usan adaptadores de enchufes. Tenga siempre en cuenta que cuando se usan estos aditamentos puede desconectarse la tierra del equipo que está usando

3- NORMAS DE SEGUIDAD CON GASES y PRODUCTOS QUIMICOS

• Verifique el la literatura la toxicidad y normas de manipulación de cada sustancia química que utilice.

• Use antiparras de protección y guantes de seguridad cuando manipule ácidos y sustancias reactivas.

• Mezcle y manipule productos químicos peligrosos en la campana. • Los tubos de gas deben estar fijados a la pared, y ser trasladados con el carrito

correspondiente. Recuerde que tienen muy alta presión y en caso de caer, pueden explotar o salir despedidos a gran velocidad si la válvula principal se rompe.

• No toque solventes con las manos desnudas (eso incluye acetona y metanol).



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• Disponga de las medidas de seguridad adecuadas para los gases tóxicos, (Esto incluye las salidas de los bombas de vacío).

• No presurice en exceso recipientes que pueden explotar. Recuerde la presión en un recipiente puede aumentar en un experimento por ejemplo con el aumento de la temperatura.

• No arroje residuos químicos al desagüe. Verifique con quien corresponda el procedimiento adecuado para su desecho.

• Si utiliza lentes de contacto, el riesgo a los ojos es mayor pues los gases son ocluidos detrás de las lentes. Utilice siempre antiparras protectoras.

• Cuando manipule líquidos criogénicos utilice siempre termos adecuados para este fin. Los termos comunes con cobertura plástica no son adecuados y pueden explotar produciendo graves accidentes.

• Nunca abrir la válvula de un tubo de alta presión que no tiene conectada una válvula reguladora y los correspondientes manómetros.

• En el manejo de líquidos criogénicos, recordar que el aire liquido tiene un alto porcentaje de oxigeno liquido, y que el nitrógeno liquido se enriquece de oxigeno a menos que este aislado del ambiente por medio de una válvula que deja salir vapor de nitrógeno cuando la presión del termo supero un cierto umbral por encima de presión atmosférica. El oxigeno liquido es un excelente comburente de modo que no debe ponerse en contacto con elementos combustibles y posibles chispas.

4- NORMAS DE Seguridad CON RADIACIONES Ionizantes En esta categoría se incluyen fuentes radioactivas y rayos X. De manejar habitualmente estas fuentes es imprescindible leer las medidas de seguridad indicadas en los respectivos manuales así como los manuales de seguridad correspondientes. La exposición a este tipo de radiaciones no es dolorosa. Pero es letal. Es importante que extreme las precauciones tanto para su seguridad como la de sus compañeros, vecinos o transeúntes circunstanciales. Le recordamos algunas medidas elementales.

• Si trabaja habitualmente con fuentes de radiación ionizantes, solicite su dosímetro personal y haga controles periódicos.

• Asegúrese que el recinto en que se encuentra la fuente está correctamente blindado. • Deben haber carteles indicando el tipo de radiación y advirtiendo si hay peligro. • No permanezca en el recinto mas tiempo que el necesario para controlar el experimento. • No deje el recinto con la fuente encendida, asegúrese que ninguna persona ingrese

inadvertidamente al mismo y que las señales indicando "Fuente encendida" son claramente visibles.

• Los cuidados deben extremarse en caso de mujeres en su período de embarazo. El feto es más sensible durante los primeros tres meses de embarazo, por lo tanto evite la exposición a radiaciones ionizantes si planea quedar embarazada.

• Las descargas de alta tensión emiten rayos X. Tome las precauciones correspondientes. • Como con cualquier radiación no visible, extreme las precauciones. El sentido común es

fundamental. 5- NORMAS DE SEGURIDAD CUANDO SE UTILIZAN LASERES. Los láseres están clasificados en 6 categorías de seguridad según su peligrosidad entre la clase I y clase IV. La clase I es considerada no peligrosa. La clase IV produce daños en los ojos y piel aún en exposiciones de luz dispersada.

• .Verifique la etiqueta de clasificación que tiene el láser que utiliza. • Use siempre antiparras de seguridad. • Evite usar objetos metálicos (relojes, anillos) que puedan producir una reflexión directa del

haz.



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• Evite exponer la piel al haz láser. • No mire directamente al haz AUN CUANDO UTILICE ANTIPARRAS DE PROTECCIÓN. • Extreme las precauciones con radiación no visible. • Los laceres en la zona del infrarrojo cercano son particularmente peligrosos pues no son

visibles y producen daño permanente en la retina se introducen accidentalmente en el ojo. • Como con cualquier fuente de luz muy brillante y potencialmente peligrosa, el sentido común

es fundamental.



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Instrucciones de primeros Auxilios Atención de heridas Las heridas deberán lavarse con agua y jabón (Espadol). Si hay cuerpos extraños, grasa u otras suciedades, éstos deberán quitarse previamente con gasa estéril, no con algodón. Si la herida es superficial se podrá aplicar un antiséptico (Pervinox) y se cubrirá con un apósito y un vendaje si fuera necesario. Atención de salpicaduras o proyecciones en ojos. Lavar con abundante agua destilada o solución fisiológica, levantando el párpado superior e inferior y permitiendo que fluya la solución de lavado en la superficie del ojo. No usar pomadas ni antisépticos comunes. Cubrir el ojo con gasa estéril. Trasladar de inmediato al lesionado a un centro asistencial especializado. Atención de quemaduras. En quemaduras leves deberá colocar la zona afectada en un baño de agua con cubos de hielo, con lo que disminuirá el dolor y bajará la temperatura. Luego secar y aplicar una gasa de Pancután sobre la zona a tratar cubriendo con vendaje liviano no compresivo (de sostén). Cambiar el vendaje exterior una o dos veces por día, retirando la gasa de Pancután una vez que ésta se desprenda espontáneamente. En caso de quemaduras más severas consultar inmediatamente al médico. Cuando la quemadura se produjera por salpicadura o derrame de un producto químico, lavar con abundante cantidad de agua y luego tratar como quemadura común. Atención de hemorragias. En caso de hemorragia en un miembro elévelo más alto que el resto del cuerpo. Puede actuar: � Por compresión directa sobre la herida (con apósito o pañuelo) � Por presión indirecta sobre los puntos de presión con un lazo hemostático simple. Servicio de Higiene y Seguridad en el Trabajo



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PRECAUCIONES EN EL LABORATORIO

1. Mantenga limpio el sitio de trabajo.

2. NO FUME, COMA NI BEBA EN EL LABORATORIO. NO USE EL TELÉFONO CELULAR EN EL LABORATORIO.

3. Conozca la ubicación del extinguidor de incendios y manta no inflamable más cercanos a su sitio de trabajo. AVERIGÜE COMO SE UTILIZAN.

4. NO TRASVASE LÍQUIDOS INFLAMABLES SI HAY MECHEROS ENCENDIDOS CERCA. Los solventes no deben colocarse en vasos de precipitados.

5. Al calentar solventes inflamables en pequeña cantidad, utilice un baño maría con el mechero apagado.

6. Al mezclar o calentar sustancias evite que la boca del recipiente esté dirigida hacia el rostro

7. Extreme las precauciones cuando use ETER ETÍLICO.

8. No caliente sistemas cerrados.

9. Las recristalizaciones se harán en un tubo, erlenmeyer o balón, nunca en un vaso de precipitados.

10. Cuide que las uniones esmeriladas estén limpias. Es conveniente cargar los balones con un embudo (líquidos) o proteger el esmerilado con papel satinado (sólidos).

11. Cuando deba desmenuzar o despegar sustancias del fondo de un recipiente de vidrio, use una espátula flexible (no una varilla de vidrio), apoyando el recipiente sobre la mesada.

12. Cuando deba introducir un tubo de vidrio en un tapón, tome el tubo con un repasador cerca del tapón. No presione los tubos acodados cerca del sitio doblado.

13. Use soportes que se apoyen bien en la mesa y controle especialmente los aparatos con centro de gravedad alto.

14. Retire los capilares usados de los baños de punto de fusión. Nunca enfríe con agua los baños de punto de fusión.

15. Evite que caigan papeles, vidrios y todo tipo de material en las piletas.

16. LOS SOLVENTES ORGANICOS PERFORAN LAS PILETAS, DESÉCHELOS EN LOS BIDONES DESTINADOS A TAL FIN.

17. NUNCA TIRE SOLUCIONES BÁSICAS EN LOS BIDONES DE SOLVENTES.



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CORTADURAS Lavar la herida con abundante agua. Si han quedado trozos de vidrio (cortaduras más

frecuentes) retirarlos con cuidado y dejar salir un poco de sangre. Lavar y desinfectar con agua oxigenada de 10 volúmenes (o alcohol) y cubrir la herida con un apósito protector (o vendas, colocando previamente sulfatiazol en la zona afectada).

No volver a trabajar sin haber protegido la herida. Si mana abundante sangre puede deberse a un corte en vena o arteria, en tal caso aplicar un torniquete por encima de la herida y llamar a un médico.

QUEMADURAS Lavar con mucha agua y hielo. En caso de quemadura severa concurrir inmediatamente al

Instituto del Quemado. FUEGO En el laboratorio: No arrojar agua. Lo más indicado es el uso de extinguidores de anhídrido carbónico (deben

dirigirse primero al borde de la zona en llamas y luego al centro) y arena. Cerrar las llaves de gas más próximas y retirar las botellas con solventes inflamables.

En las ropas: NO CORRA. Arrójese al suelo y gire sobre sí mismo, con esto se consigue sofocar las llamas

y proteger la cabeza. Ayude al accidentado cubriéndolo con una manta no inflamable o con sacos (no usar telas de material sintético).

AGENTES CORROSIVOS SOBRE LA PIEL En caso de quemaduras con agentes químicos lo primero que debe hacerse es lavar con

abundante agua, a menos que específicamente se indique otra cosa. El paso siguiente será: ACIDOS: lavar con solución saturada o pasta de bicarbonato de sodio y luego con abundante

agua. BASES: lavar con ácido acético 4% o con ácido bórico. QUEMADURAS CON BROMO Eliminar el bromo lavando con agua, luego tratar la quemadura con solución saturada de

tiosulfato de sodio, lavar con agua y poner un aceite suavizante. QUEMADURAS CON FENOL Lavar con agua, quitar lo que quede de fenol con glicerina o etanol. No aplicar ungüentos

grasos.



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AGENTES CORROSIVOS EN LOS OJOS Lavar la parte externa del ojo con abundante agua, luego abrir el ojo y lavar primero con agua y

luego con solución de bicarbonato de sodio 1% si se trata de un ácido o con solución 1% de ácido bórico si se trata de una base. Ayudarse con un vasito ocular en los lavados.

INGESTION DE SUSTANCIAS TOXICAS ACIDOS: enjuagar la boca con abundante cantidad de agua.

BASES: enjuagar con mucha agua, luego tomar agua con jugo de limón o solución diluida de ácido cítrico y finalmente tomar leche.

SALES DE METALES PESADOS: tomar leche o clara de huevo. COMPUESTOS DE MERCURIO: tomar inmediatamente un emético. EMETICOS:

� Una cucharada de mostaza en agua tibia (consistencia de pasta). � Solución de sulfato de zinc tibia. � Soluciones de cloruro de sodio o bicarbonato de sodio (dos cucharadas en un vaso de agua

tibia). EN CASO DE ACCIDENTES Hospital Militar Cosme Argerich Luis María Campos 725

4576-5716 / 5717 /7879

Hospital Santa Lucía San Juan 2021

4941-7077

Instituto Municipal de Quemados Pedro Goyena 369

4923-3022 al 25

Bomberos Bomberos ( Belgrano ) Obligado 2254

100 4783- 2222

Intoxicaciones

4962-6666, 4962-2247, 4307-7491, 4300-2115

Hospital Pirovano Monroe 3551 (Guardia)

4542-5552/9279

SAME 107, 4923-1051/57



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CUESTIONARIO: - ¿Qué debe hacer si le salpica una solución concentrada de H2SO4 en el ojo? ¿Cómo debería haber

evitado ese accidente? - ¿Qué debe hacer si se prende fuego un recipiente con solvente? - ¿Cómo se extinguen los fuegos causados por líquidos inflamables como grasas, pinturas, ceras,

solventes (como éter etílico)? - ¿Cómo procedería en el caso de trabajar con una mezcla de acetona-metanol como solvente que

eventualmente debe calentarse?

Entrega de cajones: la semana previa al inicio de clases se realizará la entrega de cajones, cada cajón contiene el material necesario para la realización de las prácticas de laboratorio. La fecha y hora será indicada en la página de la materia y en la cartelera correspondiente. Cada cajón será compartido hasta por tres turnos, por lo que es necesario que el día de la entrega cada alumno traiga un candado con 3 (tres) llaves a fin de que todos los alumnos que lo comparten puedan utilizarlo al inicio de clases y tengan acceso al material. Al final del cuatrimestre se fijará una fecha para la devolución de los cajones, que deberán estar en iguales condiciones que en las que fueron recibidos.



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QUÍMICA ORGÁNICA (CIENCIAS BIOLÓGICAS) Cajón Nº : _____ Llave Nº : ______ 1. Trípode de hierro........................................................................................................................ 1 2. Agarradera de hierro s/nuez 1 mín 23 cm de ancho mord. 25-30............................................. 3 3. Nueces de hierro o bronce plancha de espesor mín. 4 mm.................................................... 4 4. Anillo de hierro s/nuez................................................................................................................ 1 5. Mecheros de Bunsen.................................................................................................................. 2 6. Telas metálicas de 15 x 15 cm.................................................................................................... 2 7. Gradilla de madera para 12 tubos de ensayo de 16 x 150 mm.................................................. 1 8. Escobilla para tubos de ensayo D.E. 25 mm.............................................................................. 1 9. Pinza de madera largo 20 cm..................................................................................................... 2 10. Tubos de goma D.I. 9 mm. D.E. 12 mm. largo mín. 80 cm. ..................................................... 3 11. Tubos de ensayo Pyrex C.R. de 25 x 150 mm. con borde y zona para marcar......................... 2 12. Tubos de ensayo Pyrex C.R. de 16 x 150 mm. con borde y zona para marcar....................... 10 13. Tubos de ensayo Pyrex C.R. de 13 x 100 mm. con borde ....................................................... 10 14. Balón Pyrex de 250-300 ml. c/esmeril 24/40 seg. Cat. Rigolleau nº 4320................................ 1 15. Balón Pyrex de 100-125 ml. c/esmeril 24/40 seg. Cat. Rigolleau nº 4320................................. 1 16. Vaso de precipitados Pyrex de 500 ml....................................................................................... 1 17. Vaso de precipitados Pyrex de 250 ml........................................................................................ 2 18. Vaso de precipitados Pyrex de 100 ml........................................................................................ 2 19. Erlenmeyer Pyrex de 250 ml....................................................................................................... 2 20. Ampolla de decant. Pyrex 250 ml., robinete teflon tapa plástica 19/21 o 16/18 vást.9 cm......... 1 21. Embudo común D.E. 6-8 cm. vástago mín. 6 cm........................................................................ 1 22. Probeta graduada de 100 ml....................................................................................................... 1 23. Probeta graduada de 100 ml....................................................................................................... 1 24. Pipeta graduada de 10 ml........................................................................................................... 1 25. Pipeta graduada de 5 ml............................................................................................................. 1 26. Pipeta graduada de 1 ml............................................................................................................. 1 27. Tubo kitasato Pyrex según modelo............................................................................................. 1 28. Alargadera de destilación Pyrex esm. 24/40 según modelo....................................................... 1 29. Refrigerante Liebig Pyrex camisa 30/40 cm. esm 24/40 (R.2400).............................................. 1 30. Cabezal de destilación Pyrex esm 24/40 según modelo............................................................. 1 31. Embudo Büchner de porcelana GUNTHER 140/56.................................................................... 1 32. Embudo Hirsch de porcelana GUNTHER 144/12....................................................................... 1 33. Kitasato Pyrex 250 ml................................................................................................................. 1 34. Varillas de vidrio.......................................................................................................................... 2 35. Termómetro (indicar graduación)................................................................................................ 1 36. Portaobjetos................................................................................................................................ 6 37. Vidrio de reloj.............................................................................................................................. 1 D.E.: diámetro externo; D.I.: diámetro interno. Nota importante: se aceptará únicamente el material con las especificaciones detalladas anteriormente. Cualquier diferencia en cuanto a: medidas, marca o calidad se deberá indicar al dorso de esta planilla en el momento de recibir el material.



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Material necesario para el laboratorio.

(provisto por el alumno)

- Cuaderno de anotaciones. - Espátula. - Plato poroso - Tijera - Fósforos - Tetina de goma o látex. - Repasador. - Trozos de neumático (cámara de auto) - Detergente. - Candado con 3 llaves - Tapones de goma de varias medidas - Tapones de corcho de varias medidas - Tela adhesiva o lápiz marcador (de tinta no soluble en agua) - Algodón - Frascos de distintos tamaños, con tapa - Etanol 500 ml - Papel de aluminio, tornasol, pH. - Anteojos de seguridad. - Recipientes de vidrio con tapa, chicos (mínimo 3) (son útiles por su tamaño, los de

extracto de tomate) para efectuar cromatografías en microplacas. - Pipetas Pasteur 5 - Guantes descartables de látex. - Rollo de papel de cocina.



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TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 DESTILACIÓN DE LÍQUIDOS TOTALMENTE MISCIBLES.

1.-Objetivos

El objetivo de esta práctica es determinar la composición aproximada de una mezcla de líquidos totalmente miscibles, a partir de los datos de punto de ebullición, composición azeotrópica y los resultados obtenidos de la destilación fraccionada de la muestra. Se compararán los datos obtenidos por destilación fraccionada con los obtenidos por destilación simple de una muestra de la misma composición. 2.- Parte Experimental

2.1.-Destilación simple.

a) Arme el aparato adecuado (figura 1). En el balón de destilación de 250 ml coloque 100 ml de la mezcla de n-propanol:agua suministrada, agregue dos o tres trozos pequeños de material poroso y destile calentando sobre tela metálica.

b) Antes de empezar a destilar, pida a un docente que revise el correcto armado del aparato.

c) Al comenzar la ebullición regule la llama de modo de establecer una velocidad de destilación de una gota por segundo. Recoja el destilado en una probeta graduada, midiendo la temperatura de destilación al recoger las primeras gotas y luego cada 5 ml de destilado. Con estos datos construya la curva de destilación (temperatura versus ml de destilado), y complete la tabla. Es muy importante que mantenga constante la velocidad de destilación durante toda la experiencia para lo cual será necesario ir aumentando progresivamente el tamaño de la llama. No deje llegar a sequedad el balón y determine el volumen de residuo que queda en el mismo.

2.2.-Destilación Fraccionada.

d) Arme el aparato adecuado (figura 2). Destile 100 ml de mezcla agregando nuevamente material poroso.

e) Antes de empezar, pida a un docente que revise el correcto armado del aparato.

f) Comience la destilación regulando siempre la llama. Recoja el destilado en una probeta graduada cuidando de mantener la misma velocidad de destilación durante toda la experiencia. Mida la temperatura de destilación al recoger las primeras gotas y luego cada 5 ml de destilado. Construya la curva correspondiente a esta destilación en el mismo gráfico donde hizo la curva de destilación simple. Termine de completar la siguiente tabla.

VOLUMEN Temp. Dest. Simple Temp. Dest. Fraccionada

1ª GOTA 5 ml

10 ml 15 ml ...... ......... ........

g) Presente los gráficos de temperatura versus mililitros junto con la tabla, y conteste los siguientes puntos en el informe.

1- Explique las diferencias observables en el gráfico y en la Tabla entre ambas destilaciones.



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2- ¿Resulta la destilación fraccionada más efectiva para separación de los componentes? 3- En la destilación fraccionada, ¿Cuál es la composición de la primera gota y del líquido

remanente en el balón? 4- ¿Por qué el bulbo del termómetro debe estar enteramente por debajo de la salida al refrigerante? 5- ¿Por qué el agua en el refrigerante debe circular desde el final (alargadera) hacia el cabezal? 6- Suponga que destiló con columna lo más rápidamente que pudo, ¿Cómo se hubiera afectado la

eficiencia de la destilación? 7- ¿En cuál de las curvas del gráfico se observa el verdadero P.Eb? del componente menos

volátil? 8- ¿Cómo hubieran variado los P.Eb si trabajara a menor presión que la atmosférica? 9- Si el volumen total final fue menor que 100 ml ¿A qué se debió dicha reducción?

Figura 1: Aparato de destilación simple



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Figura 2: Modificación para aparato de destilación fraccionada con columna Vigreaux y esquema de columna rellena para destilación fraccionada.



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3.-CUESTIONARIO.

1) a) Enuncie la ley de Raoult. Defina sistema ideal y no ideal de líquidos miscibles. ¿Cuál es el caso general de desviación de la ley de Raoult observado en mezclas líquidas orgánicas?

b) Dibuje diagramas de presión de vapor versus composición para sistemas binarios: i- ideales; ii- con desviación positiva de la ley de Raoult; iii- con desviación negativa de la ley de Raoult.

2) a) Indique en un diagrama de temperatura vs. composición cómo se obtiene la composición del vapor en equilibrio con una mezcla líquida binaria (ideal) de composición conocida. Indique, en el mismo diagrama, cómo se determina en un momento dado la composición del líquido que queda en el balón. b) n-Pentano (P.E. 36 ºC) y n-heptano (P.E. 98 ºC) forman una solución casi ideal. Dibuje cualitativamente en un diagrama las curvas de punto de ebullición versus composición para dichas sustancias. Con la ayuda de este gráfico indique qué sucede cuando se calienta hasta ebullición una mezcla equimolecular de los componentes, los vapores se condensan y el condensado se redestila.

3) ¿Puede separar dos líquidos de igual punto de ebullición por destilación fraccionada?¿Por qué?

4) Se tiene una columna de fraccionamiento ideal, aislada adiabáticamente del medio con la cual se está fraccionando una mezcla de solventes que no forman azeótropo. Indique cuál será la temperatura en ambos extremos de la columna.

5) ¿Qué es una mezcla azeotrópica y qué aplicaciones puede tener la formación de la misma? ¿Cómo distinguiría una mezcla azeotrópica de una sustancia pura?

6) Una mezcla de 50 g de acetona (P.E. 56,2ºC) y 50 g de ciclohexano (P.E. 81,4ºC) se destila con una buena columna de fraccionamiento. Se observa que primero destila una fracción de temperatura de ebullición 53ºC. Después de haber destilado 75 g, la temperatura aumenta rápidamente a 81ºC, donde se mantiene hasta el final. Esquematice las curvas y explique los resultados obtenidos.

7) Describa el micrométodo de Siwoloboff para determinar el punto de ebullición.

8) Dibuje el esquema de un aparato de destilación a presión reducida. ¿Qué ventajas presenta este tipo de destilación?

9) ¿Qué precauciones son necesarias cuando se destilan líquidos inflamables? Enumere algunos solventes inflamables.

10) ¿Cuál es la importancia de secar líquidos orgánicos o soluciones previo a su destilación? ¿Qué desecantes emplearía? ¿Por qué? 11) Dos líquidos miscibles A y B, dan soluciones que se apartan del comportamiento ideal según la

ley de Raoult. A puro hierve a 110ºC y B puro a 90ºC, a presión atmosférica. Se determinó el punto de ebullición y la composición de varias mezclas. Grafique los resultados:

TEMP. EBULLICION

( ºC ) COMP. LIQUIDO

(%A ) COMP. VAPOR

( %A ) 110 100 100 100 90 78 88 70 52 82 50 38 78 20 30 82 10 24 90 0 0



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¿Qué conclusiones puede sacar de los datos presentados? Discuta la posibilidad de separar las

siguientes mezclas por destilación fraccionada: a) 70% A; 30 % B b) 20% A; 80 % B. 12) Dibuje los gráficos de destilación (temperatura versus ml) para los siguientes sistemas: a- mezcla ideal de dos líquidos de distinto punto de ebullición con columna de fraccionamiento

ideal. b- Ídem al anterior en destilación simple. c- mezcla de líquidos que dan azeótropos de P.E. máximo con columna. d- una sustancia pura con y sin columna de fraccionamiento. 13) Conteste, justificando en cada caso su respuesta, si las siguientes afirmaciones son verdaderas o

falsas: a) 2,2-dimetilbutano y n-hexano tienen el mismo punto de ebullición. b) iodobutano y bromobutano tienen el mismo punto de ebullición. c) Cuando se seca un solvente con sulfato de sodio anhidro, no es necesario retirar el desecante del

balón antes de destilar. d) Cuando se seca tolueno con sodio metálico: i) se puede realizar la operación en un balón cerrado

herméticamente; ii) se puede retirar el sodio y filtrar antes de destilar. e) La destilación a presión reducida se utiliza para destilar solventes que tienen punto de ebullición

muy alto a presión atmosférica. f) La destilación a presión reducida de una mezcla azeotrópica a presión atmosférica permite separar

los dos componentes puros. g) En una destilación a presión atmosférica, el termómetro se debe colocar en el interior del líquido. h) Una mezcla etanol-agua se puede separar en sus componentes puros por destilación con una

columna de fraccionamiento ideal. i) El material poroso se puede agregar sobre el solvente caliente. j) El NaOH sólido es un buen agente desecante para compuestos como anilina y piridina. Puede

utilizarse también para secar ácido acético. 14) Conteste y justifique brevemente i) ¿Para qué sirve la piedra porosa en la destilación? ¿puede reemplazarla por otro elemento /

técnica / aparato? ii) ¿Para qué sirve la destilación a P. reducida? 15) Al destilar con columna de fraccionamiento ideal una mezcla de 100 ml c/u de etanol (P. Eb

78,5° C) y n-hexano (P.Eb. 69,0°C) se obtienen 125 ml de destilado a 59,0°C y el resto a 78,5°C. En base a estos datos:

i) Construya un diagrama de equilibrio liq. / vapor (T vs. comp.) ii) Dibuje la curva de destilación correspondiente a una destilación simple de la mezcla

mencionada. iii) Si se somete a destilación simple otra mezcla de ambos, la 1° gota aparece a los 65°C. ¿Cuál es

la composición de dicha mezcla? iv) Para una mezcla con 70% etanol, dibuje las curvas de destilación fraccionada con columna real

y con columna ideal.



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INTRODUCCIÓN A LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

EXTRACCIÓN Y CROMATOGRAFÍA Extracción y cromatografía son dos formas sencillas y ampliamente utilizadas como métodos

para separar un compuesto deseado de sus impurezas, o para aislar cada componente presente en una mezcla, y están basadas en el principio de distribución de las diferentes sustancias entre dos fases inmiscibles.

Es importante, para lograr la integración entre el laboratorio y la teoría, aplicar las técnicas separativas mencionadas al aislamiento de algunos productos naturales.

De esta forma, tendremos las siguientes asociaciones temáticas: • Cromatografía de adsorción de "Pigmentos Vegetales" • Cromatografía de partición de "Hidratos de Carbono" y "Pigmentos" • Arrastre con vapor y extracción diferencial de " Alcaloides, terpenos o flavonoides" • Extracción de "Lípidos" Las prácticas que se inician a partir de ahora, se fundamentan en principios teóricos sencillos, y

apuntan básicamente a presentar herramientas para la resolución de problemas separativos concretos. La dificultad está entonces, en utilizar correctamente esas herramientas, entendiendo la complejidad de los problemas separativos que se planteen.

De aquí que no basta estudiar lógica y memoriosamente para entender el tema.

Las prácticas se diseñaron para preparar integralmente al estudiante, de tal forma que se propicia la experimentación con distintos materiales (sustratos, adsorbentes, solventes de desarrollo, reveladores, etc.) con el objetivo fundamental de que se planteen problemas experimentales no previstos en la guía.

Para un aprovechamiento cabal de las posibilidades que brinda cada práctica, resulta indispensable que cada alumno:

a) Comprenda el significado y la tarea que realizará en el laboratorio. b) Tenga los conocimientos teóricos sobre el comportamiento de los productos naturales que se

utilizarán. c) Utilice el margen de creatividad disponible. d) Rescate la totalidad de la práctica, y no sólo la parte que le tocó realizar.

Referencias bibliográficas * S. Bawn, W. Bowen: "Laboratory Exercises in Organic and Biological Chemistry" 2º Edición.

Mac Millan Publishers, New York 1981. * G. Walther, S. Morán Palma: "La química en experimentos " Guatemala, 1977. * W. Smith, J. Mc Carty: "A Laboratory Manual for a Modern Introduction to Organic

Chemistry". 1963. Merril Books, Inc. New York * Journal of Chemical Education:

1982 = "Química de los limpiadores" Pág. 305. 1978= "Qué es un detergente" Pág. 596. 1977= "El pH de los shampoos" Pág. 553. 1972= "El rol de los fosfatos en los detergentes- Determinaciones cuantitativas" Pág. 15. 1971 = "Aislamiento de trimiristina de nuez moscada" Pág. 255.

* M. Cava , M. Mitchell "Selected Experiments in Organic Chemistry", 1966. * F. Sixma , H. Wynberg. "A manual of Physical Methods in Organic Chemistry". J. Wiley and

Sons, Inc. London, 1964.



33

* R. Robertson T. Jacobs. "Laboratory Practice of Organic Chemistry". Mac Millan Co. London, 1962.

* E. Heftmann. "Chromatography". Reinhold Publishing Corporation New York, 1961 * L Savidan. "Cromatografía". EUDEBA, Buenos Aires, 1979. * E. y M. Lederer. "Cromatografía". El Ateneo, Buenos Aires, 1960. * D. Abbot y R. Andrews. "Introducción a la Cromatografía". 2ª ed. Alhambra,Buenos Aires,

1970. * I. Smith y J. Feinberg."Cromatografía sobre papel y capa fina. Electroforesis" Exedra, Buenos

Aires,1979. * L.G. Galagovsky "Química Orgánica: Fundamentos Teorico-prácticos del Laboratorio."

Eudeba, Buenos Aires, 1992.



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TRABAJO PRÁCTICO Nº2

EXTRACCIÓN Y CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

ESPECTROSCOPÍA Y PUNTO DE FUSIÓN

Parte A_ Extracción y CCD. 1.- Objetivos: Introducir la técnica de extracción y su manipulación experimental. Introducir la técnica de cromatografía en capa delgada.

2.- Introducción: El proceso de extracción con solventes es empleado generalmente en el aislamiento de productos naturales y purificación de mezclas. En algunos casos se la utiliza para remover impurezas solubles en mezclas de compuestos de interés, denominándosela en este último caso, lavado. La cromatografía es una técnica separativa basada en la distribución diferencial de los componentes de una mezcla entre una fase estacionaria y una fase móvil. En la cromatografía en capa delgada (c.c.d. o t.l.c., thin layer chromatography), se usa una placa de vidrio, aluminio o plástico como soporte de la fase estacionaria.

3.- Parte experimental El alumno será provisto de una muestra orgánica binaria la cual deberá separar mediante extracción haciendo uso de sus características ácido-base. Los componentes separados serán identificados mediante CCD, punto de fusión y espectroscopía (los espectros I.R y RMN serán provistos por el docente). 3.1.-Separación de mezclas insolubles en agua. En primer lugar se realizará un análisis por CCD de la mezcla incógnita. Para ello se disolverá una punta de espátula de la muestra (5 mg) en 0.5 ml de diclorometano y se analizará por CCD analítica (silicagel F254) usando solventes de desarrollo de distinta polaridad con el fin de encontrar las condiciones óptimas de separación. Luego, mediante ensayos de mini-extracción en medio ácido y básico se determinaran las características acido-base de los componentes de la muestra. Para llevar a cabo la separación sistemática de una mezcla insoluble en agua, se trabaja con 1-2 g de mezcla sólida, que se trata con 50 ml de CH2Cl2 (1) y se procede según el esquema 1. Tener en cuenta que el esquema es solo orientativo. La solución orgánica (1) se extrae con NaHCO3 (s.s.), agregándolo lentamente, con cuidado y agitación (por qué?) (2×20 ml), queda una solución alcalina de pH cercano a 8 (2) y una solución en cloruro de metileno (2’). A continuación se procede a acidificar la solución alcalina (2) con HCl diluido hasta pH = 2, luego de lo cual se extrae con CH2Cl2 (2×20 ml). El extracto orgánico obtenido (3’) se lava con agua (2×20 ml), se seca con MgSO4 (anh), se filtra a un balón con boca esmerilada y se evapora el solvente a presión reducida en un evaporador rotatorio, obteniéndose el residuo B (ácidos). La solución orgánica (2’) que fue extraída anteriormente, se extrae ahora con NaOH 10 %. La solución básica resultante (4) se lleva hasta pH ácido con HCl 10 % y se extrae con CH2Cl2 (2×20 ml), se obtiene así la solución orgánica (5’). Dicha solución (5’) se lava con agua, se seca con MgSO4 (anh), que se elimina por filtración y se evapora el solvente en rotavapor. Se obtienen de esta forma los fenoles (residuo C). Tenga en cuenta que la fracción obtenida anteriormente es soluble en NaOH 5% e insoluble en NaHCO3.



35

La solución orgánica (4’), de la cual se han extraído ya todos los componentes ácidos, se extrae con HCl 10% (2×15 ml); queda una fase acuosa ácida (6) y una fase orgánica (6’). La fase acuosa ácida (6) se alcaliniza con NaOH 20% y se extrae con CH2Cl2 (2×15 ml), obteniéndose la fase orgánica (7’). Ésta se lava con agua, se seca con MgSO4 (anh), se elimina el desecante por filtración y luego el solvente a presión reducida, obteniéndose el residuo D (aminas

insolubles en agua). La fase orgánica (6’) se lava con agua (2×15 ml), se seca y se filtra. Se elimina el solvente y se obtiene el extracto E (componentes neutros). Esquema 1

Mezcla + CH2Cl2 (1)NaHCO3 (s.s.)

fase acuosa (2) fase orgánica (2')

1) HCl 10 % (pH = 2)2) CH2Cl2

fase acuosa (3)

fase orgánica (3')

1) Lavar con agua2) MgSO4 (anh.)3) Evaporar svte

Residuo B (ácidos)

NaOH 10%

fase acuosa (4) fase orgánica (4')

Residuo C (fenoles)


fase orgánica (5')

fase acuosa (5)

1) HCl 20 % (pH = 5)2) CH2Cl2


fase orgánica (7')

fase acuosa (7)

1) NaOH 20 % (pH = 12)2) CH2Cl2

fase orgánica (6')fase acuosa (6)

HCl 10%

fase orgánica (4')

Residuo D (Básicos)

continúa abajo

Residuo E (neutros)



36

3.2.- Análisis de los componentes de la mezcla por cromatografía en capa delgada

Una vez aisladas y purificadas las sustancias que componen la mezcla, se sembrarán las mismas en microplacas de sílica gel. En cada placa se sembrarán separadamente las dos sustancias a los costados y la mezcla original en el centro. Las manchas deben ser de 3 mm de diámetro cada uno y deben estar a 0,5 cm del borde inferior de la placa y del borde lateral de la placa. Para desarrollar las placas, se colocarán éstas en microcubas, que contengan 1 o 2 mm de solvente en el fondo, de manera tal que al colocar la placa, el solvente no cubra la zona sembrada de la placa. En primer lugar, se desarrollarán o (correrán) las placas en cubas con solventes y mezclas de ellos de polaridad creciente (como mínimo utilizar 4 solventes). Se debe dejar la microplaca en la cuba hasta que el solvente suba, por capilaridad, hasta 0,5 cm del borde superior de la placa, marcando este límite superior. Luego del desarrollo cromatográfico, se deja evaporar el solvente de cada placa al aire y se revela sucesivamente con luz visible, UV (254 y 366 nm) y en cámara de I2. Se dibujarán las microplacas obtenidas en el cuaderno, se calcularán los valores de Rf de cada uno de las sustancias y se relacionará con la polaridad del solvente.

Se deberá encontrar un solvente o sistema de solventes en el cual los valores de Rf de las dos sustancias que componen la mezcla oscilen entre 0,3 y 0,7 y además las manchas de cada uno de los componentes aislados tengan un ∆Rf > 0,2.

A continuación se procederá a identificar los grupos funcionales presentes en cada uno de los componentes aislado. Por otra parte se determinará el punto de fusión de los compuestos indicados por el JTP. Adicionalmente se compararán los compuestos con patrones disponibles en ccd.

4. CUESTIONARIO � Extracción 1) Una mezcla constituida por los siguientes productos se sometió a los tratamientos que se

indican a continuación:

a) ¿Cuál de los cuatro compuestos es A y en qué se basa su separación de los otros compuestos. b) Indique un esquema de separación que permita aislar los compuestos B, C y D.

CO2H

CH3

NH2

CO2CH3

N

O

OH

Cl



37

mezcla

fase acuosa 2

compuesto

1) éter

fase acuosa 1

1)HCl 5% frío

2)éter

fase etérea 2

- éter

fase etérea 1

-éter

compuestos

2) Solución de NaHCO3

A

B, C, D.

2) Separe por métodos convenientes la siguiente mezcla de compuestos, de forma tal que obtenga cada uno por separado.

3) Utilizando métodos extractivos, proponga un esquema de separación de los componentes de la

siguiente mezcla (debe llegar a obtenerlos puros):

4) Defina constante de partición. ¿De qué factores depende? ¿Por qué es conveniente hacer n

extracciones de volumen V y no una sola extracción de volumen n. V?

NHCH3

O

CH3CO2H

H3C

O

OH

O

CH3

1 2 3 4

OCH3

OCH3H3CO

NH2

OHO2C

OO

O

OH

HO

OCH3

CO2H

CHNH2

CH3

AB C

D E



38

5) ¿Qué precauciones debe tener cuando trabaja con éter?

� Cromatografía en capa delgada 6) ¿Qué se entiende por cromatografía? ¿Cuántos tipos de técnicas cromatográficas se pueden

distinguir en base a la naturaleza de la fase móvil y de la fase estacionaria? 7) ¿Cuáles son las principales aplicaciones de la c.c.d? 8) ¿En qué se basa la cromatografía de adsorción? Nombre los adsorbentes más comunes y

ordénelos según su poder de adsorción creciente. 9) Nombre los solventes más comunes y ordénelos de acuerdo con su polaridad creciente (serie

elutrópica). 10) Ordene los siguientes solventes de acuerdo con su poder de elución creciente en sílica: a) Diclorometano, tolueno, hexano, isopropanol b) Acetona, ciclohexano, ácido acético, acetato de etilo, benceno, metanol. 11) ¿Cómo influyen la polaridad de los compuestos a separar y la naturaleza del adsorbente y del

disolvente en la retención? 12) Conteste las siguientes preguntas, justificando detalladamente: a) ¿Qué diferencias hay entre cromatografía analítica y preparativa? b) Si las sustancias que va a analizar son incoloras, ¿Cómo las visualiza sobre la placa? c) ¿Qué es un revelador? Indique por lo menos cuatro. d) ¿Qué es un revelador universal? ¿y uno específico? Dé ejemplos. 13) Sobre una placa de sílica se sembraron los compuestos siguientes:

A

n-pentano

OH

OH

ED

NH2

O

C

COOH

COOH

B

F

O

O

La c.c.d se desarrolló en cloroformo y se reveló por carbonización, dando el resultado que se detalla más abajo. Considerando estos datos indique qué se sembró en cada punto I...V. Justifique todas sus respuestas.



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I II III IV V VI 14) Dadas las siguientes afirmaciones, conteste a c/u si es Verdadera o Falsa y justifique: a) Por cromatografía en capa delgada se pueden obtener puros los componentes de una mezcla

de colesterol, ácido benzoico y cloruro de metileno. b) Una sustancia A, que en c.c.d. sobre sílica con benceno da Rf = 0,7, al usar benceno-metanol

1 : 1 dio Rf = 1,2. 15) Los compuestos A, B, C, D y E se sometieron a una cromatografía de adsorción en capa

delgada de sílica gel:

EDCBA CHO

OH

CO2HCHO

OH

OH

OHHO OH

Utilizando tolueno:etanol (3:1) como solvente de desarrollo se obtuvo el cromatograma que se

indica a continuación:

1 2 3 4 5. . . . .



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Conteste cuál Rf corresponde a cada sustancia. Justifique brevemente.

Parte B_ Espectroscopía. 1.- Objetivos:

Introducción de los principios básicos para adquirir espectros de IR y UV, utilizando los equipos disponibles.

Aplicación del entrenamiento en análisis de espectros adquirido en la Parte A de Química Orgánica Ciencias Biológicas. Utilización de los espectros de IR y UV obtenidos en los turnos de trabajos prácticos y los espectros de RMN suministrados por los docentes para la determinación de la identidad de una sustancia incógnita. 2.- Introducción: En la actualidad, los métodos espectroscópicos ocupan un lugar predominante en el análisis de sustancias orgánicas, ya sea que provengan de fuentes naturales o sintéticas. Si bien en algunos casos la utilización de espectros como única herramienta no permite determinar la identidad de un compuesto, su versatilidad, y rapidez hacen de los mismos aliados valiosos, y en algunos casos, indispensables, para el científico moderno. Los conocimientos teóricos necesarios para llevar a cabo esta práctica ya han sido incorporados en la Parte A. 3.- Parte experimental Deberán analizar espectroscópicamente la muestra incógnita cuyo punto de fusión se determinó en el TP 3 (Consultar con el docente cuál de las dos muestras que posee va a ser utilizada en este T.P.) 3.1.-Realización del espectro de IR. Se analizará la solubilidad de la muestra en diferentes solventes a fin de determinar la posibilidad de realizar el IR en film sobre pastilla de KBr. También se deberá explorar la solubilidad de la muestra en ácidos y bases con el objeto de determinar si será necesario o no medir los espectros UV en condiciones ácidas o alcalinas.

Los alumnos discutirán con el docente la mejor opción para la elección del solvente apropiado para la formación del film para la adquisición del espectro IR. Dicho solvente no debe contener restos de agua, ni debe disolver el KBr a efectos de no dañar la pastilla. La sustancia una vez disuelta se deposita sobre la pastilla de KBr con ayuda de una pipeta Pasteur, evaporando el solvente entre agregado y agregado hasta lograr una capa de sustancia en forma de film sobre la superficie de la pastilla, terminando de eliminar el solvente con aire caliente (se puede utilizar un secador de pelo). La muestra así preparada se introduce en el espectrómetro de FT-IR y se adquiere el espectro correspondiente, que será analizado por los alumnos. 3.2.-Determinación de la identidad de la muestra incógnita. Solicite al docente el espectro de RMN-1H de la muestra analizada y determine la mayor cantidad posible de datos acerca de su estructura. 4.-CUESTIONARIO

1.- Se dispone de los datos espectroscópicos de tres isómeros. En función de dichos datos indique

cuales de ellos corresponden a los distintos isómeros que se presentan a continuación e indique qué relación de isomería guardan entre sí:



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COOH

NH2

NO2

CH3

NO2

CH3

A B C



42



43

2.- Se cuenta con tres botellas conteniendo un líquido incoloro cuyo rótulo ha sido extraviado. Se sabe que se trata de acetona, 3-pentanona y metilisopropil cetona. Indique que espectroscopia sería la más indicada para determinar la identidad del líquido contenido en cada recipiente, fundamentando claramente su elección y el descarte de otras espectroscopias posibles. 3.- Indique en base al análisis espectroscópico qué espectro corresponde a cada estructura, justificando las asignaciones mediante tablas.

NH2

O

OH

OH

A B C D



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45



46

4.- A continuación se muestran los espectros de los siguientes productos naturales: alcanfor, tripalmitina, testosterona y aspartamo (un terpeno, un triglicérido, un esteroide y un péptido. Realice una búsqueda bibliográfica que le proporcione las estructuras correspondientes en caso de no conocerlas y determine a cuál de ellos corresponden los siguientes espectros.



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48



49

5.- El mirtenol y la fenchona son dos terpenos naturales, cuya fórmula y espectros de IR se muestran a continuación:

CH2OH

O

Mirtenol Fenchona



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Asigne el IR que corresponde a cada estructura indicando que datos de los mismos utilizó para realizar dicha asignación. 6.- La mentona y la pulegona son dos terpenos monocíclicos cuya estructura es la siguiente:

O O

Mentona Pulegona ¿Pueden ser distinguidos utilizando espectroscopia ultravioleta? En caso de respuesta afirmativa, justifique identificando las transiciones observadas en cada caso. Si la respuesta es negativa proponga el tipo de espectroscopia que crea más adecuada, fundamentando claramente su elección.



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TRABAJO PRÁCTICO Nº3 REACCIONES. ANÁLISIS FUNCIONAL ORGÁNICO CUALITATIVO

PUNTO DE FUSIÓN

Parte A_ Reacciones de Reconocimiento.

En este trabajo práctico se llevarán a cabo muchas de las reacciones estudiadas en la Parte A. Se compararán las diferentes reactividades de varios grupos funcionales, a fin de reforzar la comprensión de las reacciones involucradas. Se desea identificar un compuesto desconocido mediante un proceso deductivo, a través de sus propiedades físicas (punto de fusión, ebullición, solubilidad en agua o éter etílico, datos espectroscópicos) y químicas (propiedades ácido-base, ensayos de reconocimiento de grupos funcionales y ensayos de diferenciación o clasificación). Como se tratará en posteriormente, algunos de los ensayos aplicados en este TP también constituyen el fundamento de reveladores selectivos para placas cromatográficas, como: 2,4-dinitrofenilhidrazina; cloruro férrico, etc. Cada alumno (o par de alumnos) recibirá dos compuestos incógnita, cuya identidad será deducida por medio del Experimento I (diagrama I) o el Experimento II (diagramas II y III), según indique el docente (de acuerdo con los grupos funcionales presentes en la molécula). Cada ensayo debe realizarse: i) sobre un compuesto conocido que se sabe que da una señal positiva clara (testigo). ii) en ausencia de cualquier compuesto (sólo con solvente, si fuera necesario), siguiendo el

procedimiento completo para observar qué ocurre al mezclar y reaccionar solamente los reactivos involucrados en el ensayo (blanco),

iii) sobre la muestra incógnita y comparar con testigo y blanco. Deducir si el resultado del ensayo es positivo o negativo.

El orden de los ensayos en cada diagrama tiene una secuencia lógica tal que evita falsos positivos y resultados ambiguos, previniendo también procedimientos innecesarios que no son aplicables cuando las reacciones precedentes dieron resultados negativos. Bibliografía: Griswold, J. R., Rauner, R. A. J. Chem. Ed. 1991, 68 418-420. Cooley, J. H., Williams, J. H. J. Chem. Ed. 1999, 76 1117-1120.



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Experimento I En este experimento los compuestos desconocidos se limitan a: alcanos, alquenos, halogenuros de alquilo, alcoholes (primarios y secundarios, terciarios) y éteres. Se sigue el procedimiento indicado en el Diagrama I. Como no se conocen buenos ensayos de reconocimiento para alcanos o éteres, la presencia de estos grupos funcionales se deduce a través de la solubilidad en ácido sulfúrico, resultados negativos en otros ensayos, y eventualmente por espectros IR y RMN. La identidad del compuesto incógnita se deduce de los resultados de los ensayos, en combinación con el punto de fusión y datos espectroscópicos, contando con una lista de compuestos posibles. DIAGRAMA I – ALCANOS, ALQUENOS, HALOGENUROS DE ALQUILO, ALCOHOLES Y ÉTERES

Experimento II En este experimento se introducen aldehídos, aminas, amidas, ácidos carboxílicos, ésteres, cetonas y fenoles. El procedimiento a seguir se indica en los Diagramas II y III.

compuesto A

Soluble en agua NO SI

NO SI

alcohol (<C-5), éter (<C-5)

Soluble en éter

Muy polar, más de un grupo

OH

Sólo un grupo OH

Positivo ensayo de nitrato cérico

Alcohol

Clasificación por: CrO3 (1º, 2º)

Lucas (1º, 2º, 3º)

Alcano, alqueno, halogenuro de alquilo,

alcohol (>C-5), éter (>C-5)

Soluble/Reacciona en H2SO4 (c)

NO SI

Alcano, halogenuro de alquilo

Alqueno, alcohol, éter

Positivo ensayo de nitrato cérico

Positivo ensayo de Baeyer o Br2

Alqueno Alcohol

Clasificación por: CrO3 (1º, 2º)

Lucas (1º, 2º, 3º)

Positivo Beilstein,

AgNO3, o NaI en acetona

Halogenuro de alquilo



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El compuesto incógnita se identifica por los ensayos de solubilidad, de grupos funcionales y su punto de fusión o ebullición, así como datos espectroscópicos. DIAGRAMA II – ÁCIDOS, ALDEHÍDOS, AMIDAS, AMINAS, CETONAS, ÉSTERES Y FENOLES

compuesto B

Soluble en agua NO SI

Controlar pH

Ácido, fenol Aldehído, amida, éster, cetona

Amina

Ácido Neutro

Básico Ir a Diagrama III

NO SI

Fenol

Reacciona en NaHCO3 5%

Ácido

Ensayo con FeCl3

Ensayo 2,4-DNFH

NO SI

Éster, amida

Aldehído, cetona

Diferenciar por ensayo de ácidos hidroxámicos en

EtOH y en propilenglicol

NO SI

Cetona Aldehído

Ensayo de Tollens

Clasificar por: - Hinsberg

Clasificar por

Fehling

Clasificar por

iodoformo



54

DIAGRAMA III – ÁCIDOS, ALDEHÍDOS, AMIDAS, AMINAS, CETONAS, ÉSTERES Y

FENOLES INSOLUBLES EN AGUA

Ensayo 2,4-DNFH

NO SI

compuesto B

Soluble / reacciona en HCl 5% NO SI

Ácido, aldehído, amida, éster. cetona, fenol

Ácido, fenol

SI

Amina

Clasificar por: - Hinsberg

Soluble / reacciona en NaOH 5%

Aldehído, amida, cetona, éster

NO

Diferenciar por ensayo de ác.

hidroxámicos en EtOH y en

propilenglicol

Amida, éster

Cetona Aldehído

Ensayo de Tollens

Clasificar por

Fehling

Clasificar por

iodoformo

Aldehído, cetona

NO SI

Fenol

Reacciona en NaHCO3 5%

Ácido

Ensayo con FeCl3

NO SI



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Ensayos Cualitativos

1) Solubilidad en agua: Colocar 3 ml de agua en un tubo de hemólisis, agregar 5 gotas (o una punta de espátula) de la muestra y agitar durante 1 minuto. Si algo del compuesto permanece como una fase separada, se considera insoluble a temperatura ambiente. Generalmente, los compuestos monofuncionles de hasta 4 átomos de carbono (hasta 5 si son alcoholes) son solubles en agua.

2) Solubilidad en HCl 5%: Se repite el ensayo de solubilidad en agua descripto anteriormente usando HCl 5% en lugar de agua.

3) Solubilidad en NaHCO3 5%: Se repite el ensayo de solubilidad usando una solución de NaHCO3 en vez de agua y se observa si hay desprendimiento de de anhídrido carbónico.

4) Solubilidad en H2SO4 (c): Se colocan 0,5 ml de la muestra en un tubo de ensayo y se agregan 2 ml de H2SO4 (c), se agita y se deja reposar. Se observa.

5) Ensayo de Beilstein: Consiste en introducir un alambre de cobre (asegurarse que la superficie esté limpia quemándolo a la llama previamente dejándolo enfriar) en la muestra líquida (o en una solución de la muestra sólida) y luego acercarlo a la llama. Al quemarse la película de muestra sobre el alambre se formaran halogenuros cuprosos que le dan color verde brillante a la llama. Los derivados de fluor no dan color y existen numerosas interferencias.

Para los posteriores ensayos de reconocimiento, se debe tener en cuenta que si la sustancia incógnita no es soluble en el medio de reacción, la misma se solubilizará en un solvente que no interfiera con el ensayo a realizar

6) Nitrato de plata en etanol: A 2 ml del reactivo se agregan 2 gotas de sustancia (ó 50 mg). Si no aparece precipitado luego de 5 minutos a temperatura ambiente se calienta en baño de agua a ebullición durante 10 minutos y se observa si hay aparición de precipitado. Si hay precipitado, observe el color.

7) Ioduro de sodio en acetona: A 1 ml de reactivo se agregan 2 gotas de una solución de la muestra en acetona. Se agita y se deja estar durante 3 minutos. Si no hay aparición de precipitado, y la solución se mantiene sin ningún cambio, se calienta en baño de agua a 50°C durante 5 minutos. Se enfría a temperatura ambiente y se observa si hubo reacción. Los bromuros primarios producen precipitado dentro de los primeros 3 minutos a temperatura ambiente. Si aparece precipitado solo después de calentar, puede tratarse de un cloruro primario o secundario, o de un bromuro secundario o terciario. Los cloruros terciarios no reaccionan en estas condiciones. (Reactivo: 15 g de ioduro de sodio disueltos en 100 ml de acetona.) 8) Test de Baeyer (Oxidación con permanganato): Se disuelven 0,1 ml o 50 mg de la sustancia en 2 ml de agua y se agrega gota a gota una solución acuosa al 2% de KMnO4. El ensayo se considera positivo cuando se decoloran mas de 3 gotas del reactivo. Los grupos con propiedades reductoras interfieren en este ensayo. 9) Bromo en tetracloruro de carbono: Se disuelven 0,1 ml (o 100 mg) de la sustancia en 2 ml de CCl4 y se añade gota a gota una solución de bromo 2% en el mismo solvente hasta que el color persista durante 1 minuto. Se observa la cantidad gastada. Se investiga además la presencia de vapores de ácido bromhídrico acercando a la boca del tubo otro tubo de ensayos



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con NH3 (c), observando si hay formación de humos blancos. El ensayo se considerará positivo si se consumen más de 2 gotas del reactivo y si no hay desprendimiento de HBr. Nota: El desprendimiento de HBr indica que ha ocurrido una reacción de sustitución y no de adición debida, posiblemente, a la presencia de sustancias aromáticas reactivas (fenoles, aminas, etc.) o de compuestos que poseen grupos metilénicos activados (aldehídos, cetonas, etc.). 10) Nitrato cérico: En un tubo de ensayos se diluyen 0.5 ml del reactivo con 3 ml de agua. Se agregan 4 a 5 gotas de la muestra, se agita y se observa el cambio de color. Si la muestra no es soluble en agua se usa dioxano en vez de ésta. Una prueba positiva para un alcohol queda indicada por un por un cambio en el color del reactivo de amarillo a rojo. Los fenoles dan en solución acuosa un precipitado que va de color café a café verdoso; en dioxano se forma una coloración que va de rojo intenso a café. (Reactivo: Se disuelven 200 g de nitrato cérico amónico [(NH4)2Ce(NO3)6] en 500 ml de ácido nítrico 2 N.). Este ensayo no se llevará a cabo. 11) Oxidación suave de alcoholes (CrO3/H2SO4): Colocar 5 gotas de la muestra en un tubo de ensayo y agregar 1 ml de acetona, luego, agitando, se agrega una gota del reactivo. La aparición de un color verde indica la presencia de un alcohol primario o secundario. Los alcoholes terciarios no reaccionan.

Los residuos de este ensayo SON TOXICOS, pregunte al docente DONDE ELIMINARLOS. 12) Ensayo de Lucas (diferenciación de alcoholes 1°, 2° y 3°): A 1 ml de la sustancia colocada en un tubo de ensayo se agrega 1 ml de reactivo, se tapa, se agita vigorosamente durante 1 minuto y luego se deja en reposo. Con los alcoholes terciarios se observa casi inmediatamente la separación de 2 fases, lo cual se manifiesta como opalescencia. Los alcoholes secundarios reaccionan dentro de los 5 minutos. Los primarios dan negativo este ensayo. Los alcoholes primarios superiores no se disuelven en el reactivo. (Reactivo: Se disuelven 136 g de ZnCl2 (anh) en 105 g de HCl (c).) 13) Ensayo de cloruro férrico: Se disuelven 30 mg se sustancia en 1 ml de agua o en una mezcla de agua-etanol y se agregan hasta 3 gotas del reactivo. Una coloración rojo, púrpura, azul o verde indica un resultado positivo. Algunos fenoles como la hidroquinona, el guayacol, los ácidos m- y p-hidroxibenzoicos, sus ésteres, el 2,6-diterbutil-p-cresol, el α y β-naftol y algunos nitrofenoles dan negativo este ensayo. (Reactivo: Solución acuosa 2,5% de cloruro férrico.) 14) 2,4-dinitrofenilhidracina: A 3 ml del reactivo se agrega una punta de espátula o 2 gotas de la muestra y se agita vigorosamente. La aparición de un precipitado indica un resultado positivo. Si no se forma inmediatamente se deja en reposo 15 minutos. A veces el precipitado es en principio aceitoso pero cristaliza con el tiempo. Si el grupo carbonilo esta impedido estericamente este ensayo puede dar negativo. (Reactivo: Se disuelve 1 g de 2,4-dinitrofenilhidracina en 7,5 ml de ácido sulfúrico concentrado y se diluye a 250 ml con agua.) 15) A) Ácidos hidroxámicos para ésteres: Para realizar este ensayo, la muestra debe dar negativo el ensayo del cloruro férrico. Se disuelve (o suspende) 1 gota (o 50 mg) de sustancia en 1 ml de reactivo y se agregan 0,2 ml de NaOH 6N. Se calienta a ebullición, se deja enfriar durante 30 segundos y se agregan 2



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ml de HCl 6N. Si la solución es turbia deben agregarse 2 ml de etanol. Se añade entonces una gota de solución de cloruro férrico 5% y se observa el color. Un color rojizo o violáceo indica un resultado positivo; si el color no persiste se continúa agregando solución de cloruro férrico hasta que el color sea estable. (Reactivo: Solución de clorhidrato de hidroxilamina 0,5N en etanol.) B) Ácidos hidroxámicos para amidas: Para realizar este ensayo, la muestra debe dar

negativo el ensayo del cloruro férrico. Se colocan 30 mg (o 1 gota) de sustancia en un tubo de ensayos y se agregan 2 ml de reactivo y 1 ml de hidróxido de potasio 1 M en propilenglicol. Se calienta la mezcla a ebullición durante 2 minutos, se enfría y se agregan 5 gotas de solución de cloruro férrico 5 %. El desarrollo de un color rojo o violeta indica un resultado positivo. Los ésteres y anhídridos dan positivo este ensayo. (Reactivo: Solución de clorhidrato de hidroxilamina 1M en propilenglicol) 16) Ensayo de Tollens (aldehídos): Se agregan 30 mg (o 1 gota) de sustancia a 2 ml del reactivo recién preparado colocado en un tubo de ensayos bien limpio. Se agita y se deja estar durante 10 minutos, si no hay aparición de precipitado se coloca el tubo en un baño de agua a 35° durante 5 minutos. Un precipitado o la formación de un espejo de plata indican un resultado positivo. Los aldehídos dan positivo este ensayo, las cetonas no reducen el reactivo. Otros grupos reductores interfieren en este ensayo. ( Reactivo: A 2 ml de nitrato de plata 5% se añaden 2 gotas de NaOH 5%, se agita el tubo y se agrega solución de hidróxido de amonio 2N gota a gota hasta resolubilización del precipitado.) 17) Ensayo de yodoformo (metilcetonas): A una gota de líquido (o a un cristalito) se agregan 3 ml de reactivo y 1 ml de NaOH 30%. La aparición instantánea de un precipitado amarillo indica resultado positivo y por ende la presencia de una metilcetona. Si el precipitado tarda en aparecer significa que la sustancia debe oxidarse antes de formar el yodoformo (por ejemplo metilalcoholes). (Reactivo: A 12,7 g de yodo suspendidos en 1000 ml de agua se agrega ioduro de potasio (o de sodio) hasta total disolución del yodo.) 18) Ensayo de Fehling: A 1 ml de una solución de la muestra se le agregan 5 ml del reactivo. El reactivo se prepara en el momento mezclando volúmenes iguales de la solución A y la solución B. Un cambio de color de la solución y la aparición de un precipitado rojo indica señal positiva. (Reactivos: Solución A: 34,6 g de sulfato de cobre hidratado en 500 ml de agua Solución B: 173 g de tartrato de sodio y potasio mas 70 g de NaOH en 500 ml agua.)

19) Test de Hinsberg (diferenciación de aminas 1°, 2° y 3°): En un tubo de ensayos se colocan 50 mg (o 2 gotas) de sustancia, se agregan 5 gotas de cloruro de bencenosulfonilo y 4 ml de NaOH 10%. Se agita la suspensión durante 3-5 minutos, se añade HCl 6N gota a gota hasta acidez. Si hay precipitado, lo cual indica la presencia de una amina primaria o secundaria, se filtra y se lava con agua caliente. Los clorhidratos de algunas aminas pueden precipitar en estas condiciones, pero el precipitado desaparece al lavar con agua caliente. Si no hay formación de precipitado, la amina es terciaria. El precipitado se suspende en 2 ml de agua, se agregan 2 lentejas de KOH y se calienta suavemente. En caso de una amina primaria el precipitado se disuelve, si la amina fuese secundaria no se observa disolución.



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CUESTIONARIO

1) ¿Qué entiende por ensayo sencillo? 2) Distinguir mediante ensayos sencillos:

BrBrCH3Br

3) Un compuesto A, que produce un precipitado amarillo con AgNO3, reacciona con hidróxido de

sodio en etanol, para dar un compuesto B. B da positivo el ensayo de Lucas sólo por calentamiento. Por tratamiento de B con CrO3/H2SO4, se obtiene C (C7H6O2), que resulta soluble en hidróxido de

sodio diluído. Por tratamiento de A con Br2/Fe, se obtiene D como producto mayoritario, que presenta en su

espectro RMN-1H, las siguientes señales: singulete (2H) δ : 4,4 ppm doblete (2H) δ : 7,0 ppm doblete (2H) δ : 7,5 ppm Deduzca las estructuras de A, B, C y D. Formule las reacciones involucradas.

4) Un compuesto A (C6H10), que decolora una solución de permanganato de potasio diluido y frío,

produce un compuesto B al ser tratado con Br2/H2O. B da positivo el ensayo de Beilstein, y también

reacciona con sodio metálico, liberando un gas. Por ozonólisis reductiva de A, se obtiene como único producto un dialdehído C.

a) Proponga estructuras para A, B, y C, justificando los datos. b) ¿Cómo reaccionará B con AgNO3/Etanol?

c) ¿Qué señal de importancia presentará el espectro I.R. de B? d) Discuta si el compuesto B así obtenido presenta actividad óptica; escriba un diasterómero.

5) Dados los siguientes compuestos:

OH

Br

Cl

C

CH3

HO CH3

CH3

C

CH3

Cl

CH3

CH3

HO

Indique cuáles forman parte de una mezcla ternaria que tiene las siguientes propiedades: a) Es totalmente insoluble en agua. b) Decolora Br2/CCl4 en la oscuridad.

c) Da positivo CrO3/H2SO4.

d) Es parcialmente soluble en NaOH diluido. e) Con AgNO3/EtOH en frío da (-) y en caliente da (+).

6) Analice si las siguientes afirmaciones son V o F - explique porqué -. a) La reacción con H2SO4 fumante permite distinguir benceno de ciclohexeno.



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b) La reacción en NaOH diluido permite distinguir entre:

C

CH3

HO CH3

CH3

CH2OH

(CH2)7

CH3

OH

c) El ensayo con el reactivo de Lucas permite diferenciar entre el 1-pentanol y el 4-amino-2-

metil-2-butanol.

7) Los compuestos A, B y C tienen la misma fórmula molecular (C9H9OBr). Sólo B y C son solubles

en NaOH 5 % y precipitan inmediatamente en AgNO3/EtOH, mientras que A reacciona con

CrO3/H2SO4 dando un precipitado verde. Los tres reaccionan con KMnO4 diluido en frío. Por otra

parte B y C con KMnO4 en caliente dan el mismo compuesto D que da negativo el test de Beilstein.

B presenta isomería cis/trans mientras que C no. D puede obtenerse a partir de un compuesto E por reacción con CrO3/H2SO4. E es soluble en agua, tiene fórmula (C7H8O2) y da el ensayo de Lucas

positivo.

En los espectros I.R. en la zona entre 600 y 1000 cm-1, se observa para A dos bandas a 700 y

780 cm-1, mientras que para B y C solo se observa una a 820 cm-1. Proponga estructuras posibles para A, B, C, D, y E, y justifique los resultados de los ensayos.

8) A (C9H12O) responde a la siguiente serie de reacciones.

a) Na : lenta evolución de burbujas.

b) Tratamiento con Ac2O, H+ : olor agradable.

c) CrO3, SO4H2 : color azul verdoso inmediatamente. El compuesto orgánico obtenido presenta

un singulete que integra para 3 H en δ = 2.2. d) H2O : insoluble; NaOH : ins.; NaHCO3 : ins.; HCl (d) : insoluble .

e) MnO4-, H+, calor : produce B, ppdo. blanco, insoluble en agua, soluble en NaOH 10 % y en

NaHCO3 10 %. B presenta señales en el RMN 1H a δ = 7,25 y 12,1.

f) Br2/ Cl4C, oscuridad : no decolora.

g) Produce rotación de la luz polarizada. h) C, isómero de A también es ópticamente activo. Tiene el mismo comportamiento que A salvo

que la reacción con Na es más rápida y el compuesto aislado en c) no da el singulete en δ =2,2. Por

oxidación suave con KMnO4 dio D (C9H10O2), soluble en NaOH, que libera CO2 con CO3H-. D

presenta señales en δ = 12, δ = 7,2 y δ ≤ 3. En I.R. se detectaron dos bandas fuertes en 700 y 750 cm-

1. Además produce la rotación de un haz de luz polarizada. i) Deduzca cuál es la estructura de los compuestos A, B, C y D. Escriba las reacciones utilizadas

en cada test.

ii) Describa el espectro de RMN - 1H de D en la zona alifática. iii) ¿Por qué no se utilizó el ensayo de Lucas?

a) Determine que etiqueta le debe colocar a cada uno de los frascos, explicando los test

utilizados. b) ¿Para cuál de los compuestos le sería útil el espectro I.R., en cuanto a la determinación

estructural y por qué?

9) Un compuesto de fórmula C9H9O2Br presenta las siguientes características:



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es soluble en NaOH 5 %. Da un precipitado amarillo al ser tratado con 2,4-dinitro-fenilhidrazina. Da negativo el ensayo de Fehling. Da positivo el ensayo de NaI/Acetona.

Su espectro IR. Presenta una banda entre 3500-3300 cm.-1.

Su espectro RMN-1H presenta las siguientes señales: δ : 2,85 (2H, t) δ : 3,35 (2H, t) δ : 7,57 (2H, d) δ : 7,80 (2H, d) δ : 5-6 (1H, banda ancha) a) proponga una estructura compatible con estos datos. b) Escriba todas las reacciones involucradas. c) Justifique todos los datos espectroscópicos.

10) Diferenciar los siguientes compuestos entre si, mediante ensayos sencillos Presente los resultados en forma de tabla:

b)

O

O

progesterona O

OH

HO O

aldosteronaHO colesterol

HO

OH

estradiol O

OH

testosterona

a) OH OH3C

H3CO O

11) Un compuesto A (C8H9Cl) da positivo el test de NaI/Acetona rápidamente, y presenta en su

espectro I.R., entre otras, dos bandas fuertes a 700 cm-1 y 750 cm-1. A reacciona con NH3 para dar

un compuesto B. Por reacción de B con C (C8H7ClO), se obtiene un compuesto D. C reacciona

rápidamente con agua para dar E, el cual resulta soluble en NaOH 5 %. El espectro de RMN-1H de E presenta, entre otras señales, 2 dobletes deformados entre δ : 7,2 y 7,8.

Sabiendo que D da positivo el test de ácidos hidroxámicos, plantee las estructuras de A, B, C, D y E, consistentes con los datos, y formule las reacciones involucradas. ¿Qué esperaría observar al aplicar el ensayo de Hinsberg sobre B? ¿Podría diferenciar A de C por el ensayo de AgNO3/Etanol?



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12) Un frasco contiene una mezcla de tres de los siguientes compuestos : acetato de sodio; urea; ß-naftol; ácido cinámico; benzofenona; p-metoxianilina. En base a los siguientes resultados experimentales, conteste: ¿Cuál es la composición de la mezcla? Justifique

a) La mezcla resultó totalmente insoluble en agua. b) La mezcla resultó totalmente soluble en éter. c) La mezcla fue parcialmente soluble en NaOH 5 %. d) La mezcla fue parcialmente soluble en HCl 5 %. e) La mezcla fue totalmente insoluble en NaHCO3.

13) Un compuesto A (C17H14O5), que resultó insoluble en agua, pero soluble en NaOH diluido, dio

positivo el ensayo de ácidos hidroxámicos. Por calentamiento de A con NaOH acuoso y posterior acidificación, se obtuvieron dos compuestos B y C.

El compuesto B dio positivo los ensayos con I2/NaOH y 2,4-dinitro-fenilhidrazina; y mostró en

su espectro I.R., entre otras, una banda ancha a 3500-3300 cm-1 y una señal fuerte a 820 cm-1. B dio negativo el ensayo de Tollens, y no resultó soluble en solución diluida de NaOH.

El compuesto C (C8H6O4) resultó soluble tanto en NaOH diluido como en NaHCO3 diluido.

Por calentamiento de C, se obtuvo D (C8H4O3), que dio positivo el test de ácidos hidroxámicos.

Proponga estructuras para A, B, C y D, que sean compatibles con los datos experimentales. Escriba las reacciones enunciadas, justificando los resultados obtenidos.

14) Un compuesto A (C9H8O2), reacciona con CrO3 en medio ácido para dar B. A presenta en su

espectro I.R., entre otras, una banda a 820 cm-1. Por tratamiento de B con SOCl2 se obtiene C, el

cual reacciona vigorosamente con agua para regenerar B. El tratamiento de C con D (C3H8O) en

medio ácido a reflujo, produce E. Teniendo en cuenta los datos de la tabla, formule A, B, C, D, y E. Plantee su razonamiento deductivo. Complete la tabla indicando si los ensayos resultan positivos o negativos.

2,4-dinitro-fenilhidrazina

I2 /

NaOH

ácidos hidroxámicos

solub. en NaHCO3

Fehling

A +(ppdo naranja)

+ -

B +

C +

D +

E + + +

15) Diferenciar los siguientes compuestos mediante ensayos sencillos. Hacer una tabla, indicando si los resultados son positivos o negativos. Para cada ensayo, ejemplifique con un compuesto y plantee la señal que se observa cuando el ensayo resulta positivo.



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CH3CHOa) Ob)OH O

c) Cl

O

d)

Cl

OCH3

O

e)CHO

f) g)

O

16) Discuta si es posible diferenciar mediante el ensayo de Hinsberg CH3-CH2-NH2 de CH3-NH-

CH2-COOH

17) Se tienen 5 muestras ( A...E) de las cuales se dispone de los siguientes resultados experimentales:

Tollens Ac. Hidrox. Ag+/EtOH CrO3/ácido I2/base Sol. HCl dil fenil-hidrazina

A - + - - - - - B - + + - + - + C + - - + - - + D - - - - - - + E - - - + - + -

Sabiendo que A...E están entre las siguientes sustancias, asigne una estructura a cada muestra y justifique brevemente.

O

NH

Ph

HO

N

N

H

O

Cl

O

OH

O

H

O

O Cl

O

O2C

O2C

1 2 3 4 5

6 7 8 9



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Parte B_ Punto de Fusión.

1.-Objetivos: Ejercitación de la técnica de determinación del punto de fusión de una sustancia pura por

utilización del método del capilar y con aparatos (Fisher-Jones). Para ello se utilizarán sustancias incógnitas proporcionadas por los docentes. 2.-Introducción Es una de las propiedades físicas más importantes para identificar sólidos cristalinos. Desde el punto de vista práctico se puede considerar que el punto de fusión es la temperatura a la cual un sólido - en contacto con el aire - se transforma bajo condiciones de equilibrio en un líquido. Cuando una sustancia es pura, el rango de temperaturas entre las cuales se produce su fusión es muy pequeño (usualmente 0,5 a 1°C). Si es impura ese rango es muy amplio y está por debajo del verdadero punto de fusión ( para ampliar este tema, lea propiedades coligativas en libros de química inorgánica). Por ello las sucesivas purificaciones de una sustancia orgánica pueden controlarse por su punto de fusión ya que cuanto más nítido y estrecho sea el rango de fusión, más pura puede considerarse la sustancia. Esta propiedad que tienen las impurezas de disminuir el punto de fusión real de un producto, se puede emplear como criterio de identificación (no de pureza) mediante el llamado punto de fusión mezcla: Si después de varias cristalizaciones el punto de fusión de una sustancia se mantiene nítido y no varía, puede razonablemente suponerse que dicha sustancia es pura. Si por ejemplo su punto de fusión fuera 148°C, se recurrirá a continuación a las tablas de Compuestos Orgánicos (por ejemplo C. Hodgman "Handbook of Chemistry and Physics"; N.A. Lange, etc.), en los que se suelen encontrar varios compuestos con puntos de fusión análogos. Si se mezcla la sustancia obtenida con muestras puras de los distintos compuestos que poseen puntos de fusión similares sólo mantendrá la constancia del punto de fusión en el caso de que se trate de la misma sustancia, pues las que son diferentes actuarán como impurezas y al determinar los respectivos puntos de fusión estos serán más bajos. Puede haber excepciones al comportamiento descripto, por lo que el punto de fusión mezcla es una buena demostración y no una prueba concluyente de la identidad de sus dos componentes. Estos ensayos se realizan empleando unos pocos mg de sustancia. El punto de fusión de una mezcla puede presentar características que merezcan ser mencionadas. Generalmente se suele describir dentro de una zona de temperaturas que, como se ha dicho para sustancias puras suele ser muy estrecho, p. ej. p.f.: 130-131°C. Pero algunas sustancias puras suelen presentar ablandamientos previos a temperaturas más bajas que la de fusión propiamente dicha y en esos casos se indica de la siguiente manera: p.f: 115° (abl.), ocurre a 142°. Algunas sustancias al fundir se descomponen y ello se indica así: p.f. 234° (d). Una causa de error en la determinación del punto de fusión reside en la dilatación desigual de la columna de mercurio a medida que se aleja de la zona caliente del baño. La temperatura de fusión leída se suele corregir debido a la columna de mercurio emergente. Esta corrección es aplicable a los puntos de fusión altos. Se aplica la siguiente fórmula:

C = 0,000158 ( T-t ) n donde: T: temperatura leída

t: temperatura media de la columna emergente (que se determina con otro termómetro colocado en la parte media de la columna emergente).

n: número de grados de la columna emergente. 0,000158: coeficiente de dilatación aparente del mercurio para temperaturas inferiores a 150°C

Esta corrección a la temperatura leída se suma y el punto de fusión se indica así: p.f. 221° (corr.) El método más usado para determinar el punto de fusión es el de tubo capilar cuya preparación se detalla más adelante y para la cual se emplean tubos de vidrio neutro (los vidrios



64

alcalinos alteran el punto de fusión de las sustancias orgánicas) que previamente se ha lavado con agua destilada y secado. Si es necesario determinar temperaturas más elevadas que las que permite el baño de glicerina (180ºC), se puede emplear ácido sulfúrico (250°C) o una mezcla de ácido sulfúrico y sulfato de potasio (7:3) con lo que se llega a 325°C. El cloruro de zinc fundido puede usarse entre 360°-600°C. 3.-Desarrollo de la Práctica

3.1.-Preparación de tubos capilares Los tubos capilares se preparan de la siguiente manera : se calienta un tubo de vidrio blando, limpio y de paredes finas de 6-8 mm de diámetro, o bien un tubo de ensayos, rotando el mismo en la llama de un mechero (un Mecker o un Bunsen provisto de mariposa) hasta que el vidrio se ablande. Entonces se lo retira del fuego y se lo estira de modo que resulte un capilar de 1-2 mm de diámetro externo. Una vez frío el tubo, se corta en trozos de 8-10 cm de largo y se cierra por un extremo, colocándolo horizontal mente en la misma llama, cuidando de no formar un bulbo de vidrio demasiado grueso. Los capilares preparados se guardan en un tubo de ensayos limpio y cerrado. 3.2.-Llenado de capilares.

Para el llenado de los tubos capilares se coloca una pequeña porción de la sustancia seca en un vidrio de reloj o plato poroso y se pulveriza con la ayuda de una espátula, formando finalmente un montículo. Se introduce en el mismo el extremo abierto del capilar, se invierte y el sólido se hace bajar golpeando suavemente el extremo cerrado del tubo en la mesa, permitiendo al mismo tiempo que se deslice el tubo entre los dedos y sobre la mesa para impedir su rotura. Este proceso se repite hasta que se forme en el fondo del tubo capilar una masa compacta de 2-3 mm de altura. La sustancia que queda adherida en la parte externa del capilar debe limpiarse para impedir que arruine el baño en el cual se determinará el punto de fusión. 3.3.-Determinación del punto de fusión y punto de fusión mezcla de una muestra incógnita.

El alumno entregará al docente un tubo de hemólisis limpio, seco y rotulado, en el que se le suministrará una muestra incógnita para determinar el punto de fusión, el punto de fusión mezcla y luego realizar el TP 4. Una vez cargado el tubo capilar con la muestra incógnita se adosa por capilaridad al extremo inferior del termómetro de tal manera que la sustancia dentro del capilar quede a la altura de la parte media del bulbo del mercurio, (el cual previamente ha sido humedecido con el líquido del baño). No deben usarse bandas de goma, etc. El termómetro y el capilar adherido se introducen en el baño cuidando que el bulbo quede en el centro de éste y completamente sumergido. Se calienta rápidamente en una primera determinación con el objeto de establecer aproximadamente el punto de fusión y luego en una segunda determinación, con un nuevo capilar, se efectúa un calentamiento rápido hasta unos 20° por debajo del punto de fusión encontrado en la primera determinación, siguiendo con una velocidad de calentamiento de aproximadamente 2°/minuto, hasta que la sustancia funda. El aparato consiste en un balón de 100 ml de capacidad, de cuello largo, lleno hasta las 3/4 partes de glicerina u otro líquido. En una modificación (figura 1) los capilares se introducen por los tubos laterales y se ponen en contacto con el bulbo del termómetro. El termómetro se fija por medio de un tapón de corcho al cual se le ha practicado una ranura para permitir ver la escala íntegra, así como la libre expansión del aire en el aparato. Es conveniente observar la fusión con ayuda de una lupa y una lámpara ubicada lateralmente. Anote la temperatura en que la sustancia comienza a fundir y aquella en la que la fase sólida ha desaparecido totalmente. Repetir la medición del punto de fusión, pero usando un aparato de Fisher-Jones.



65

Se compara el punto de fusión obtenido para la muestra incógnita con los puntos de fusión de las sustancias puras de la Tabla proporcionada por el docente. Se solicitan muestras (unos pocos mg) de todos aquellos patrones de punto de fusión similar al de la muestra incógnita. Cada uno de los patrones se mezcla con la muestra incógnita en la proporción (1:1) y se determina el punto de fusión de la mezcla en cada caso. Aquella sustancia que no manifieste depresión en el punto de fusión mezcla se considera idéntica a la muestra incógnita.

Reservar el sobrante de muestra incógnita para realizar el TP 4 y confirmar su identidad. .

Figura 1



66

4.-CUESTIONARIO

1) Además del punto de fusión: ¿Qué otras constantes físicas se pueden utilizar como criterio de

pureza de una sustancia sólida? 2) ¿Cómo determinaría el P.F. de una sustancia que funde con descomposición? ¿Y el de una que sublima? 3) ¿Qué métodos se utilizan para secar sustancias sólidas? 4) Un compuesto A funde a 104°C, un compuesto B funde a 156°C. Una mezcla de dos moles de

A con un mol de B funde neto a 81°C. Dibuje un diagrama de P.F. vs. composición para este sistema y conteste las siguientes preguntas con referencia a dicho diagrama

a) ¿Qué se observa cuando se determina el punto de fusión de una mezcla de un mol de A con dos moles de B?

b) ¿Cuál es la temperatura eutéctica para la combinación A + B? c) Si una mezcla de A y B termina de fundir a 100º C, ¿Qué se puede decir acerca de su

composición? 5) La figura muestra un diagrama de P.F. para mezclas de dos sustancias A y B. Considere una

mezcla sólida de A y B que contiene 80% A; cuando la mezcla se calienta lentamente: a)¿A qué temperatura aparecerá líquido y a qué temperatura la mezcla habrá fundido

totalmente? b) Si la mezcla se enriquece en el

componente A, ¿Cómo variará teóricamente el punto de fusión? Explique este hecho.

c) ¿Cuanto más puro es el sistema en el

componente A, más amplio es el rango de fusión?

6) ¿Qué efecto tendrán trazas de humedad y solvente sobre la mayoría de los puntos de fusión de

los compuestos orgánicos?

100% A 100% B

60º C

90º C

40º C



67

OCH3

HO

TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 DESTILACIÓN POR ARRASTRE CON VAPOR Y EXTRACCIÓN

Aislamiento de limoneno y eugenol 1.-Objetivos: Ejemplificar el aislamiento de componentes orgánicos volátiles e insolubles en agua a partir de material de origen biológico (o de una mezcla compleja), utilizando vapor de agua. 2.-Introducción: LIMONENO

Los monoterpenos constituyen una de las familias de compuestos más simples de origen vegetal. Muchos son componentes claves de sabores y olores familiares: algunos fácilmente accesibles experimentalmente, ya que son volátiles y por esto pueden ser arrastrados por una corriente de vapor desde los frutos o semillas. Entre ellos encontramos al limoneno, que se aísla casi puro de las cáscaras frescas del limón, naranja, etc. EUGENOL

La esencia de clavos de olor de especia (Eugenia Cariophyllata) que se obtiene por arrastre con vapor, está formada casi exclusivamente por el eugenol y compuestos similares (p-propenilfenoles), que son muy abundantes en la naturaleza; por ejemplo, la esencia de pimienta de Jamaica tiene hasta 80 % de eugenol. Aparte de su uso en odontología por sus propiedades antisépticas, se lo utiliza como punto de partida en la obtención de vainillina. El rendimiento del eugenol a partir del producto seco varía entre 10 y 17 % según el estado de conservación de los clavos, pues el fenol se pierde lentamente por oxidación y/o volatilización. 3.-Procedimiento: 3.1.-Aislamiento de limoneno a partir de cáscaras de cítricos Se pesan 50 g de cáscaras frescas y se las corta en pequeños trozos. Colocarlas en un balón de 250 ml con 100 ml de agua. (No olvidar el material poroso) Calentar a ebullición y destilar 70-80 ml. Extraer el destilado con CH2Cl2 (3 × 20 ml, se puede mejorar la extracción realizando un salting out). Juntar las fracciones de la fase orgánica y secar con MgSO4 anhidro. Filtrar y concentrar el extracto a presión reducida. Obtener el espectro IR del producto y comparar con bibliografía.



68

3.2.-Aislamiento de eugenol a partir de clavos de olor. Se parte de 2 g de clavo de olor sin moler y se los coloca en un balón de 300 ml, junto con unos trozos de material poroso y 150 ml de agua. Al balón se le adapta un cabezal, un refrigerante y una alargadera que desemboca en una probeta. Se lleva a ebullición sobre tela metálica y se destilan unos 80 ml (aprox. 1 h). El destilado se alcaliniza con 10 ml de una solución de NaOH 20 % y se extrae con 20 ml de CH2Cl2. La fase orgánica se desecha y la fase acuosa se acidifica con HCl 20% (papel pH) y luego se extrae con 20 ml de CH2Cl2, desechándose la fase acuosa.

La fase orgánica se seca sobre sulfato de sodio anhidro y se evapora a presión reducida. El residuo (aprox. 230 mg), está constituido casi exclusivamente por el eugenol (4-alil-2-

metoxifenol). Se preparan microplacas de sílica gel, con y sin indicador fluorescente, en portaobjetos, y se siembra en ella 1 o 2 gotas de eugenol disueltas en un solvente apropiado. Se prueban varios solventes de desarrollo y se anotan los resultados obtenidos en cada solvente. Las placas de sílicagel sin indicador se observan con luz UV, luego se revelan con I2. Las placas con indicador fluorescente se observan con luz UV. Otro revelador que puede usarse es solución de FeCl3 ¿Por qué? Nota: También pueden utilizarse otros vegetales para hacer el arrastre, consulte con el docente que procedimiento debe seguir en cada caso. Busque en bibliografía cuáles son los principales componentes volátiles que contiene su muestra.

Figura 1



69

4.-CUESTIONARIO 1) Explique brevemente el fenómeno de arrastre con vapor. 2) ¿Cuál es el objeto de alcalinizar el destilado? ¿Cuál es el objeto de la primera extracción con sv. orgánico? ¿Qué pasaría si se alcalinizara con NaHCO3? ¿Qué ocurriría si se empleara Na2CO3? 3) De los siguientes desecantes, ¿Cuáles usaría para secar el extracto orgánico de eugenol? Justifique. a) NaOH en forma de lentejas. b) Sulfato de magnesio. c) Sulfato de sodio. d) Ácido sulfúrico concentrado. e) Pentóxido de fósforo. 4) ¿Qué masa de agua es necesario agregar al balón para arrastrar todo el eugenol presente en 10 g de clavos de olor (aprox. 15 % de eugenol), y qué masa de agua se necesita para arrastrar el 85 % del eugenol presente? Datos: Temp . (ºC) 60 80 100 110 P vapor agua (mm Hg) 150 250 760 --- P vapor eugenol (mm Hg) 2 7 18 48 ¿Qué aproximaciones hizo; por qué? 5) Esquematice un procedimiento para separar una mezcla de eugenol y nicotina. 6) ¿Por qué la evaporación de los solventes de los extractos se realiza a presión reducida?

¿Cómo procedería a separarlos?

7) Un extracto contiene los siguientes alcaloides:

NCO2CH3

O

H

Ph

O

OH

HO

NH3

+

Cl-



70

8) De las siguientes mezclas diga cuáles podrán separarse por arrastre por vapor de H2O justificando claramente su respuesta. Entre paréntesis se indica la solubilidad promedio (g/100 ml) de la sustancia en H2O entre 80 y 100 ºC, suponiendo que todos tienen presión de vapor apreciable. a) glucosa (90) o-nitroanilina (1) b) naftaleno (0,2) fenantreno (0,03) c) acetanilida (180) urea (150) d) Bromohexano (0,2) cloruro de bario (59) e) Ac. succínico (121) 2,4-pentanodiona (51,8) 9) ¿Cómo separaría por arrastre con vapor?

10) Se quieren separar por arrastre los componentes de una mezcla de 2 g c/u de X, Y, y Z, en base a los datos de la tabla. Justifique todas sus respuestas. i- ¿Cuál/es se arrastrarán con vapor de agua y cuales no? ii- ¿Cuánta agua necesitaría para destilar el/los arrastrable/s; por qué? (¿Hizo alguna suposición para este cálculo; cuál ?). iii- ¿Puede separar los 3 compuestos entre si? Si no puede, sugiera un método alternativo basado en los datos disponibles.

p. Mol. solubilidad en H2O a ebull.

P vapor (mm Hg) 100ºC 99ºC 98ºC 97ºC

H2O 18 ------- 760 733 707 682 X 328 insoluble 0.04 0.03 0.02 0.01

Y 122 25 g / 100 ml 58 25 17 10 Z 140 0.25 g / 100 ml 75 27 18 10

11) Se someten 10 g de la sustancia 1 al tratamiento indicado:

Luego de 1/2 hora, a la mezcla de reacción A se le agrega agua, se destila y se sigue el siguiente esquema separativo:

VAINILLINAMEZCALINACHO

OCH3

OH

H3CO

H3CO

OCH3

NH2

321

1) O3

2) H2O2 / HO-

CO2Na

+

O



71

A + aguadestilación

destilado

Residuo B

+ éter

1) acidifico

2) + éter

Sc acuosa C

Sc etérea D

Sc acuosa E

Sc etérea F Se toman muestras de A....F, se concentran y se analizan por c.c.d. En base a todo esto, Conteste y justifique: i- ¿Qué hay en cada fracción? ii- Asigne cada mancha en la c.c.d. a una sustancia. iii- ¿Fue suficiente 1/2 hora para la reacción?

* * * * * *A B C D E F



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TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS - REACCIONES DE LÍPIDOS - JABONES

1. Objetivos: Ejemplificación de técnicas extractivas sólido-líquido en la obtención de lípidos naturales. Purificación por recristalización de un producto sólido y comportamiento de un triglicérido frente a la reacción de hidrólisis básica (saponificación). Análisis del comportamiento cromatográfico del triglicérido y del producto hidrolizado (jabón). Comparación de las propiedades del jabón obtenido con las de los detergentes comerciales. 2. Introducción Lípidos:

Se definen así a los compuestos orgánicos de origen natural, insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos poco polares, p. ej: éter etílico o hidrocarburos.

Esta definición abarca muchos tipos de compuestos, los cuales tienen en común la solubilidad; al mismo tiempo pueden diferir ampliamente en cuanto a sus estructuras y funciones biológicas.

Algunos de los lípidos más comunes son: las grasas y aceites, los lípidos complejos, los esteroides, los terpenos, etc.

Grasas y aceites Son los lípidos más abundantes en la naturaleza y se los llama triglicéridos o triacilgliceroles, porque

son ésteres compuestos por tres moléculas de ácidos grasos (iguales o diferentes) y una de glicerol (1,2,3-propanotriol).

Los ácidos grasos son ácidos orgánicos de cadena hidrocarbonada larga, por ej el ácido esteárico CH3-(CH2)16-COOH (se considera larga cuando tiene más de 8 carbonos).

Estas cadenas hidrocarbonadas pueden tener uniones simples (ácidos grasos saturados) o uno o más dobles enlaces (ácidos grasos insaturados).

Lípidos complejos Son ésteres que contienen glicerina, 1 o 2 ácidos grasos y otro

grupo; éste puede ser fosfato, en los fosfolípidos como la lecitina; o un azúcar como galactosa en los glicolípidos.

Esteroides Estos compuestos son muy comunes en la naturaleza e

incluyen - entre otros - hormonas animales, vitamina D y colesterol. Todos los miembros de este grupo tienen el mismo esqueleto de cuatro anillos hidrocarbonados (ciclopentano-perhidrofenantreno), con diferentes sustituyentes: alquílicos, oxigenados, ésteres, etc.

R1COOH

R2COOH

R3COOH+

OH

OH

OH O2CR3

O2CR2

O2CR1

+ H2O

3 ácidos grasos glicerol triglicérido

NO P O

O

O

OCOR

OCOR'

lecitina

HOColesterol



73

Terpenos

Los componentes olorosos de las plantas, que pueden separarse de otros materiales de las plantas por arrastre con vapor (TP Nº5), se llaman aceites esenciales. Muchos de ellos se usan en perfumería. La mayor parte de los aceites esenciales son mezclas de terpenos, una clase de productos naturales que se encuentra tanto en plantas como en animales.

Los terpenos poseen un esqueleto carbonado que proviene de unir “cabeza - cola” dos o más unidades de isopreno. La cabeza es el extremo más próximo a la ramificación del metilo. Sus moléculas pueden ser abiertas o cíclicas y si contienen otros elementos aparte de H y C se los llama terpenoides

Jabones y detergentes sintéticos

El jabón ha sido utilizado como agente limpiador mucho antes de que fuera entendido el mecanismo de su acción limpiadora. La primera receta involucraba primero una extracción de lejía de cenizas de madera (solución acuosa de NaOH) y luego su ebullición con grasa animal.

Las hidrólisis de los triglicéridos se pueden llevar a cabo en soluciones ácidas o básicas, o por acción de enzimas llamadas “lipasas”. La hidrólisis alcalina se denomina saponificación y uno de sus productos es jabón, es decir la sal de sodio o potasio del ácido graso, y se separa de la solución acuosa por agregado de NaCl.

La acción limpiadora del jabón se debe a su poder emulsificante, esto es, su habilidad para suspender en agua sustancias que normalmente no se disuelven en agua pura. La cadena hidrocarbonada (parte hidrofóbica) de la sal, tiene afinidad por sustancias no polares, tales como grasas de comidas. El grupo carboxilato (parte hidrofílica) de la molécula tiene afinidad por el agua.

Laureato de sodio En la solución de jabón los iones carboxilato rodean a las partículas aceitosas: sus partes no polares se ubican (disuelven) dentro de dichas partículas, mientras que los grupos carboxilato se ordenan sobre la superficie externa. Así pueden asociarse con moléculas de agua y mantenerse en solución. Estas pequeñas gotas que contienen las partículas no polares rodeadas de aniones carboxilato, se denominan MICELAS.

La presencia de estos aniones hace que las superficies de las micelas estén cargadas negativamente y se repelen entre sí, impidiendo la coalescencia y manteniendo la emulsión, como se observa en el gráfico.

NaO

O

parte hidrofóbica parte hidrofílica

CHO

isopreno terpeno terpenoide terpeno cíclico



74

Resulta entonces que la micela íntegra es soluble en agua y puede ser arrastrada (lavada) por una corriente de agua.

Los jabones no pueden usarse fácilmente en “aguas duras”, por la formación de sarro y la poca espuma que se logra. Ocurre que los iones metálicos (Mg2+, Ca2+) precipitan los ácidos grasos pues forman sales insolubles y por lo tanto se requiere mucho más jabón para lograr un mismo efecto limpiador. Además el sarro es un problema en lavanderías industriales. Una forma de evitar estos inconvenientes es utilizar detergentes que no precipiten con estos iones, o usar agentes quelantes de los iones metálicos.

Otra característica de los jabones es su incompatibilidad con ácidos. El jabón en medio ácido se neutraliza, liberando el ácido graso que es insoluble en agua.

Los detergentes sintéticos contienen, a veces, compuestos que mantienen un nivel apropiado de alcalinidad en el agua de lavado. Otros detergentes contienen grupos tipo sulfonato o amonio cuaternario unidos a una cadena carbonada; éstos grupos no se ven tan afectados por las variaciones de pH.

En la actualidad la variedad de productos limpiadores se ha incrementado notablemente. Tanto los detergentes como los productos para lavar la ropa contienen enzimas que facilitan la limpieza. Se agregan “proteasas” (hidrolizan las proteínas), “lipasas” (hidrolizan los lípidos) y “mananasas” (remueven polisacáridos de la familia de los mananos. También son usadas como agentes anti-redeposición.

Entre los aditivos usados en los productos para lavar la ropa se encuentran los blanqueadores, el tradicionalmente usado es la lavandina, pero actualmente la utilización de perborato de sodio y percarbonato de sodio está aumentando. Estos productos mantienen el color y son agentes antimicrobianos. El percarbonato es activo aún usando bajas temperaturas de lavado y es “más limpio” para el cuidado del medio ambiente.

También se agregan agentes para proteger las prendas (y la gente) de la acción de la luz solar. Se utiliza “Tinosorb”, que con un solo tratamiento incrementa la protección 30 veces y se mantiene luego de varios lavados.

Las, tabletas se fabrican agregando al agente limpiador (generalmente un surfactante tipo alquilpoliglucósido, que es sólido a temperatura ambiente) un polímero de acrilato entrecruzado o carboximetilcelulosa y un desintegrante, que le confieren solidez a la tableta sin estar fuertemente comprimida y que permiten su solubilización fácilmente en el agua. La efervescencia se consigue con la presencia de bicarbonato de sodio y ácido cítrico.

Las formulaciones de los productos para remover los olores están basadas en las ciclodextrinas, moléculas en forma de anillo formadas por 6, 7 u 8 monómeros de glucosa que pueden atrapar los olores.



75

3.-Desarrollo de la práctica ( Referencia: J. Chem. Ed, 48, 255 (1971))

3.1.- Extracción de trimiristina a partir de nuez moscada Dos nueces moscadas enteras se muelen en un mortero. Se agita el polvo obtenido con 50 ml de cloruro de metileno durante 10’ y luego se filtra por gravedad. El filtrado se recoge en un balón del cual se eliminará el solvente por destilación en Rotavapor. El aceite obtenido se recristaliza (preguntar al docente) de acetona o acetato de etilo, para obtener trimiristina cristalina. Seque parte del precipitado y determine el punto de fusión. Los cristales de trimiristina funden a 55-56ºC. Guarde un poco de trimiristina para la realización de ccd.

3.2.- Saponificación del triglicérido y posterior obtención del ácido mirístico: En un balón de 100 ml se colocan 0,30 g de trimiristina y se agrega 25 ml de KOH 7% en etanol,

y se refluja suavemente. Retire una alícuota a los 5’ (0,5 ml de solución) para sembrar una ccd; otra a los 30’ y luego continúe calentando hasta que haya transcurrido 45 minutos. Divida la solución en dos partes iguales (porción A y B).

Vuelque la porción A sobre 50 ml de agua y agregue 2,5 ml de HCl (c), (verifique que el pH sea menor que 4). Observará la formación de un precipitado blanco. Filtre rápidamente y lave con 5 ml de agua. Seque. Determine el punto de fusión (p.f del ácido mirístico: 53-54ºC). En microplacas de sílica gel, siembre ácido mirístico, trimiristina y las alícuotas separadas durante la saponificación. [Ste. de desarrollo: Tolueno : MeOH (95:5)]

Diluya la porción B con 10 ml de agua y agregue NaCl, en pequeñas porciones, mientras se agita. Enfriar hasta que aparezca el precipitado de jabón. Sacar el jabón con espátula y secar sobre papel de filtro. Hacer los ensayos de 3.3.

a) Interprete los resultados obtenidos en el desarrollo de las placas en distintos solventes, para cada uno de los compuestos. b) Compare los resultados obtenidos a los 5 y a los 30 minutos de reacción.

c) El informe debe incluir los siguientes puntos: 1. Formule las reacciones ocurridas. 2. Haga un esquema de extracción de ácidos grasos 3. ¿En qué paso podría haber utilizado un Soxhlet? 4. ¿Por qué obtiene la trimiristina como un aceite? 5. ¿Por qué agrega etanol en la saponificación? 6. ¿Qué pasaría si la cantidad de alcohol no fuera suficiente? 7. ¿Podría reconocer por el punto de fusión si se trata de ácido mirístico ó trimiristina? 8. ¿Cómo justifica que un ácido tenga el punto de fusión semejante al de su éster? 9. ¿Podría diferenciar por I.R. el ácido del éster? Técnica opcional:

En un balón de 125 ml se colocan 5 g de grasa vacuna, 50 ml de KOH 7% en etanol y se calienta la mezcla a reflujo suavemente. Después de 30 min., se investiga si se completó la reacción del siguiente modo: Se deja enfriar un poco la solución, se toman unas gotas y se agregan a un tubo con agua. Si se forma una fase aceitosa, la reacción no se completó y hay que seguir reflujando. Si no se forma, la reacción se ha completado.



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La mezcla de reacción se diluye con 25 ml de agua destilada y, mientras se agita, se agrega sal (NaCl) en pequeñas porciones hasta que la solución se sature y el precipitado de jabón se separe. Se saca el jabón con una espátula y se presiona sobre papel de filtro. La fase acuosa contiene glicerina. El jabón obtenido se guarda para hacer los ensayos sobre jabones. Conteste en el informe las siguientes preguntas:

1. ¿Por qué se debe trabajar con agua destilada? 2. Formule las reacciones ocurridas. 3. Busque el nombre y la estructura de los principales ácidos grasos presentes en el sebo de

vaca. 4. ¿Cómo se determina que el proceso de saponificación concluyó? Justifique. 5. ¿Para qué se agrega sal? Justifique.



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3.3.-Ensayos químicos sobre el jabón obtenido y un detergente comercial: � Complete la siguiente tabla

TABLA VIII

Ensayo Jabón Detergente

pH

CaCl2

MgCl2

Aceite vegetal

HCl dil.

HCl + CH2Cl2

� Indicaciones para completar la tabla VIII 1.- Prepare una solución de 1 g de detergente en 50 ml de agua destilada y otra de 1 g del jabón obtenido en 50 ml de agua destilada. 2.- Tome el pH de ambas soluciones y registre el valor en la tabla VIII. Coloque 10 ml de la solución de su jabón en un tubo de ensayos y 10 ml de la solución de detergente en otro. Agregue 2 ml de una solución 0,5% de CaCl2 en cada uno y agite vigorosamente. Repita luego con MgCl2. Registre sus observaciones. 3.- Coloque en sendos tubos 10 ml de su jabón y 10 ml de la solución de detergente. Agregue 4 gotas de aceite vegetal común y agite vigorosamente. Anote lo observado. 4.- Coloque 4 ml de las soluciones de su jabón y del detergente en tubos de ensayos. Agregue gota a gota HCl 5% hasta pH = 1. Anote lo que observa (utilice papel pH). 5.- Agregue 1 ml de CH2Cl2 a cada uno de los tubos del ítem anterior. Agite y observe. Registre en la tabla el resultado. � Conteste las siguientes preguntas: 1 ¿Con sus observaciones sobre jabón y detergente, puede usted determinar cuál es el mejor agente

emulsificante? 2 ¿Puede actuar el jabón como emulsificante si la solución está ácida? Explique. 3 ¿Cuáles son las ventajas del detergente sobre el jabón? 4 Mire bajo la acción de una luz fuerte la solución jabonosa ¿Qué coloración observa (efecto

Tyndall)? ¿Qué concluye de esta observación? 3.4. Verificación de la acción lavadora del jabón:

Disminución de la tensión superficial: En un tubo de ensayos coloque 3 ml de agua pura. Introduzca bajo la superficie una parte de un capilar abierto en ambos extremos. Observe ahora la altura a la que asciende el agua por capilaridad. Agregue ahora (sin modificar la profundidad relativa del capilar con respecto a la superficie) unas gotas de solución jabonosa. Registre en el informe qué es lo que sucede con la altura de la columna del líquido dentro del capilar. Justifique. Haga una analogía entre el capilar y una fibra de tejido.



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4.-CUESTIONARIO 1) Una semilla con alto contenido de CH3-(CH2)10-COO-CH2-CH3 y de CH3-COO-(CH2)10CH3, se

somete a los tratamientos indicados en la pág. siguiente. Indique qué compuesto/s se obtienen en cada una de las etapas indicadas. Adjudique las

estructuras a las distintas manchas obtenidas por c.c.d. y a los distintos picos observados por CGL. Justifique.

2) En un extracto biológico están presentes los siguientes compuestos:

Dicho extracto se reflujó con una solución de KOH 7% en EtOH durante 1 hora. La reacción

se siguió por c.c.d y se tomaron 3 alícuotas a t=0, 20 y 60 minutos. Cada alícuota se subdividió en 3 partes (A, B y C) y a cada una de ellas se les realizaron los siguientes tratamientos. A: se sembró tal cual, B: se extrajo con éter etílico y agua, y se sembró la fase etérea. C: se acidificó con HCl 10% hasta pH ácido, se extrajo con éter y se sembró la fase etérea.Se obtuvieron las siguientes cromatografías:

0,010,05

0,50

0,70

0,80

A B CA B C A B CA B C

0 min. 20 min. 60 min.

a) Asigne el Rf de cada compuesto al comenzar la reacción. b) Explique por qué no obtiene la mancha de Rf=0 en la siembra de B.

Br

O OCH3

Br

O

O

(CH2)14CH3

Extracto en cloroformo

Semilla

Producto de reacción

1) Evaporación2) Saponificación

Rf = 0.8CCD, silica-gel, Hexano

CCD

Rf = 0

Rf = 0.5

Rf = 0.3Rf = 0.5

Neutralización, CCD

tr = 0.9 tr = 5.0 tr = 5.8

cgl

Extracto en cloroformo

Semilla

Producto de reacción

1) Evaporación2) Saponificación

Rf = 0.8CCD, silica-gel, Hexano

CCD

Rf = 0

Rf = 0.5

Rf = 0.3Rf = 0.5

Neutralización, CCD

tr = 0.9 tr = 5.0 tr = 5.8

cgl



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c) ¿Qué le sugiere el aspecto del cromatograma a los 20 min. de la reacción? d) La mezcla de reacción (t=60 min.) se acidifica con HCl 10% y se extrae con éter.

i.- Indique todos los productos que espera obtener en las fases etérea y acuosa. ii.- Asigne a cada producto su correspondiente Rf si se siembran por separado las dos

fases.

3) ¿Qué métodos conoce para estudiar la composición en ácidos grasos de los lípidos?

4) ¿En qué se basa la extracción con Soxhlet?

5) Se tiene una mezcla de los siguientes compuestos:

Se realizó la saponificación total de estos compuestos con NaOH/Etanol durante 1 hora a reflujo. a) Escriba las reacciones de saponificación observadas indicando los productos obtenidos. b) Esquematice la separación de los productos de la saponificación utilizando métodos extractivos.

OCH3

O

O

NH

O

OCH

O O

CCH3(CH2)14 OCH3

O



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TRABAJO PRÁCTICO Nº 6 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

OBTENCIÓN DE PIGMENTOS NATURALES 1.-Introducción: Los pigmentos presentes en las plantas

Cada primavera la Naturaleza nos asombra con su derroche de brillantes matices de verdes, amarillos, rojos, rosas y magentas que se ven en el follaje de algunas plantas. A medida que los días pasan, el despliegue cromático continúa. Las flores aparecen y exhiben prácticamente todos los colores y formas que se puedan imaginar. Cuando llega el otoño, la mayoría del follaje verde cambia su color a amarillo, naranja, rojo y finalmente marrón, al aproximarse el invierno. La mayoría de estos colores y cambios de color resultan de la producción, interacción y desaparición de tres tipos fundamentales de estructuras: PORFIRINAS, CAROTENOIDES Y FLAVONOIDES.

CLASE TIPO DE COMPUESTO COLOR (*)

Porfirinas clorofilas verde

Carotenoides carotenos (α,β y γ)

licopeno

amarillo, naranja

rojo

Flavonoides Xantofilas

flavonas

flavonoles

antocianinas

amarillo

amarillo

amarillo

rojo, azul, magenta, púrpura

(*) Los colores que presentan los pigmentos dependen también del pH y de otras interacciones químicas.

PORFIRINAS : Las porfirinas son derivados de la estructura porfirínica, que consiste en 4 anillos pirrólicos heterocíclicos (que contienen nitrógeno), unidos por cuatro grupos metileno, formando un sistema total con dobles ligaduras conjugadas. Muchas porfirinas tienen intensos colores: una de ellas es la clorofila, que es el pigmento verde de las plantas; otro es el grupo hemo, responsable del color rojo de la hemoglobina sanguínea. En las plantas existen la clorofila a y la b, siendo la primera la predominante. En la Figura V-a se muestra la estructura del anillo porfirínico y de la clorofila a. Como se observa, en la clorofila un átomo de magnesio reemplaza a dos de los hidrógenos en el centro de la molécula, además de tener un anillo más y varios grupos unidos al anillo porfirínico principal. La clorofila juega un papel primordial en la actividad fotosintética de las plantas, durante la cual el agua, el CO2 y la luz solar se transforman en hidratos de carbono.

La biosíntesis de clorofila responde al estímulo de la luz sobre la planta. La degradación hasta



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Fig V a compuestos más simples también ocurre en las hojas y de tal forma que la velocidad de este proceso es menor que el de biosíntesis, de modo de garantizar el proceso sintético durante las horas de luz (cuando el estímulo luminoso decrece, también lo hace la producción de clorofila). CAROTENOS Bajo este nombre se clasifican numerosos terpenos o derivados terpénicos coloreados, formados por combinación de unidades de isopreno con dobles ligaduras conjugadas. Los carotenos contribuyen en gran medida al conjunto de colores de vegetales, y los más importantes son: carotenos α, ß y γ, licopeno, y xantofilas (que presentan oxígeno en su estructura). Las moléculas mencionadas se muestran en la figura siguiente: Los colores amarillos presentes en tejidos fotosintéticos se deben, principalmente, a carotenos y xantófilas. El licopeno es el responsable del color rojo de pimientos, tomates y otras frutas. Las zanahorias contienen pequeñas cantidades de α-caroteno y abundante cantidad del ß. En general, las plantas no requieren luz para producir carotenos, y una vez producidos no se degradan rápidamente. Es así como algunas moléculas de carotenos permanecen en la hoja durante todo el lapso vital de la misma, ejerciendo una acción protectora (antioxidante).

H2C

C

HC

CH2

CH3

Isopreno: fórmula completa Isopreno: fórmula de esqueleto

Figura V-c

N

N

COOH

O

O

O(C

20H

39)

N NMg

clorofila a

N

N

HNNH

porfirina



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FLAVONOIDES : Todos los flavonoides tienen la unidad estructural siguiente

Figura V c

En los tres casos de flavonoides que detallaremos, la cadena de tres carbonos que conecta los anillos se encuentra ciclada con un átomo de oxígeno como nexo, formando un anillo heterocíclico de 6 miembros. En las flavonas (Fig. V-d), este anillo heterocíclico está sustituido con un oxígeno carbonílico. Los flavonoles, tienen un hidroxilo unido a la estructura de flavona. En las antocianinas, no se ha encontrado el oxigeno carbonílico sobre el anillo heterocíclico, y la posición del hidroxilo de los flavonoles está ocupada por una unión glicosídica (formada por deshidratación entre el hidroxilo mencionado y un azúcar, por ej. la glucosa). Además, las antocianinas se encuentran en las plantas como sales (indicadas con la carga positiva sobre el oxígeno heterocíclico). Los distintos tipos de flavonas, flavonoles y antocianinas también presentan grupos hidroxilo (sustituidos o no con metilos, acetilos, etc.) en distintas posiciones de los otros anillos.

Figura V-d

flavona flavonol antocianina Los flavonoles y las flavonas son responsables de algunos colores amarillos de hojas, pero la gran contribución la hacen a los colores de los pétalos de las flores. Las antocianinas son responsables de la mayoría de los colores rojo, azul y púrpura de las plantas superiores. Como glicósido (sustancia que tienen azúcares unidos a la estructura central de la molécula), no es casual que la producción de antocianinas en plantas esté relacionada con la disponibilidad de azúcares en la misma. En algunos casos la biosíntesis está influida por la luz. Por ejemplo, la superficie de la fresa que da al sol, consigue su color rojo mucho antes que el lado más oculto. Por el contrario, la luz no parece tener acción sobre la formación de antocianinas en rabanitos, que están enterrados. El color de las antocianinas depende del pH del medio en el que se disuelven, como se observa en la siguiente figura, así como de su interacción con átomos o iones metálicos.

Figura V-c

O

O

O

OGlu

O

O

OH

+



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Figura V-e El color en las hojas Los colores que presentan las hojas se producen por combinación de los tres tipos de pigmentos que hemos descripto. En la mayoría de las plantas la clorofila se produce abundantemente durante la primavera, y el color verde enmascara al amarillo y otros colores tenues debidos a los demás pigmentos. El color distinto de verde que se desarrolla en algunas hojas jóvenes se debe a la presencia de antocianinas. Se ha sugerido que los brotes tienen más cantidad de azúcares que la que necesitan y esto activa la formación de antocianinas. A medida que las hojas van creciendo, la cantidad de clorofila es tal que enmascara el color original, pero se ignora si los pigmentos juveniles se pierden por degradación, o simplemente se diluyen. Las plantas que ostentan colores distintos del verde durante esta época de desarrollo, tienen gran valor ornamental. Algunas tienen colores rojos o púrpuras en su follaje, como algunos tipos de abedules, arces, cerezos japoneses, ciruelos y manzanos silvestres. Estas plantas tienen la capacidad genética de producir tal cantidad de antocianinas que modifican el color verde normalmente observable de la clorofila. ¿Cómo es el proceso de color para una hoja otoñal?. Según Creighton y Winkelman lo que ocurre es que la cantidad de clorofila formada va en disminución a medida que los días se acortan y la luz solar no es tan brillante. Luego, debido a que los procesos de degradación continúan, la clorofila va desapareciendo lentamente de las hojas, y se hace más evidente el amarillo de los carotenos, xantofilas y antocianinas. Con el advenimiento del frío todos los movimientos de fluidos se aletargan; ocurriría entonces que durante el día la fotosíntesis provee a las hojas de azúcares los cuales, debido al frío nocturno, no son retirados eficientemente por la savia para su distribución. Este aumento en la concentración de azúcares provocaría la biosíntesis de niveles superiores de antocianinas, apareciendo colores más amarronados en las hojas. Cuando las hojas están próximas al caer, aparece un tejido esponjoso entre la rama y la hoja, que dificulta la circulación de la savia y, finalmente sellará la herida y evitará la pérdida de humedad en el resto de la planta. Nuevamente, esta dificultad en transportar los azúcares biosintetizados en los últimos días de la hoja, tornan activa la biosíntesis de antocianinas, y las hojas toman un tinte amarillo anaranjado. Además el pH de la savia determina - por ejemplo - que en los arces (savia acídica) las antocianinas le dan un color más rojo a las hojas que en los fresnos (savia alcalina) cuyas hojas presentan un tono más púrpura.

O

OGlu

OH

HO

OH

OH+

O

OGlu

OH

HO

OH

O

O

OGlu

OH

HO

O

O

pH < 3 rojo pH 7 - 8 violeta pH > 11 azul

-H+

+H+-H+

+H+

-



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2.-Objetivos: El objetivo del presente trabajo práctico experimental es el logro del manejo de la técnica de cromatografía de adsorción. Para lograrlo, se aplicará dicha técnica a la separación de pigmentos vegetales. Primero se analizarán por cromatografía analítica en capa delgada los pigmentos presentes en un extracto vegetal, y luego se aplicará la información obtenida a la separación de los mismos por cromatografía en columna. 3.-Desarrollo de la práctica

3.1.-Extracción de los pigmentos Los alumnos deberán traer el material vegetal y la arena limpia. Técnica A: Se toman 20 g de hojas de espinaca fresca, trébol u otro vegetal de color verde intenso, se cortan en trozos pequeños y se trituran bien en un mortero con agregado de un poco de arena. Se procede entonces a extraer los pigmentos, para lo cual se agregan 30 ml de acetona y se muele unos 5', imprimiendo un movimiento de rotación al pilón. Se forma una solución verdosa que se filtra a través de un algodón. Esta solución se guarda, y el procedimiento se repite otras dos veces sobre el residuo vegetal. Se evapora esta solución de acetona hasta que quede un residuo acuoso, que se extrae 2 veces con AcOEt. La fase orgánica se seca sobre MgSO4 o Na2SO4 (anh). El secado se completa en unos 5 minutos (se reconoce cuando la solución se torna límpida) consulte con los docentes. Se filtra la solución a un balón, usando un embudo con algodón (ver fig.1, Pag. 89). El residuo vegetal de la molienda se extrae ahora con CH2Cl2 (2×20 ml, ver fig. 2, Pág. 89). Las soluciones orgánicas obtenidas se juntan en el balón con la anterior (extracto de AcOEt) y se evaporan los solventes a presión reducida hasta casi sequedad. Se analiza el número de componentes del extracto por cromatografía en capa delgada. Técnica B: Colocar 20 g de hojas de espinaca fresca, trébol u otro vegetal de color verde intenso, previamente cortadas en trozos pequeños, en el recipiente de la licuadora. Agregar aprox. 150 ml de etanol y licuar. Filtrar a través de un algodón. El filtrado se concentra en el rotavapor hasta obtener un aceite que posteriormente se extrae con acetato de etilo. La fase orgánica de lleva a sequedad en el rotavap. Explicar los resultados obtenidos. En base a los mismos, discuta con el docente la secuencia de solventes a utilizar para realizar la cromatografía en columna, y en qué momentos debe cambiar la polaridad del solvente, durante el desarrollo de la misma. Antes de proseguir con la siguiente etapa, debe tener claro los siguientes puntos: i) ¿En qué solvente va a preparar la columna? ⇒ Sv. de armado ii) ¿Cómo coloca la/s sustancia/s a separar en la columna? ⇒ Siembra iii) ¿Con qué solvente o mezclas y en qué orden realiza la separación? ⇒ Sv. de elución

Debe consultar con el docente sobre el tamaño de la columna a usar 3.2.-Separación cromatográfica: a) Preparación de la columna de cromatografía Se toma una columna de cromatografía y se coloca en posición vertical. Se introduce hasta el fondo de la misma un pequeño trozo de algodón, se aprieta suavemente y se alisa la superficie con una varilla de vidrio a la que se le ha ensanchado la punta (lo que se consigue calentando al rojo la punta de la varilla y apretándola suavemente sobre una superficie de hierro). Se moja el algodón con el sv. de armado, se apisona con la varilla de vidrio, se cierra el robinete de la columna, y se agrega solvente hasta una altura de 100 mm; luego se agregan una suspensión del adsorbente en el solvente de armado, por medio de un embudo colocado en la parte superior de la columna. Esta operación requiere mucho cuidado: debe agregarse despacio. Se agita entonces el adsorbente agregado con la varilla para eliminar burbujas de aire que puedan haber quedado retenidas. Se añade otra porción similar y se repite la operación (conviene remover la parte superior del agregado anterior para que no



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queden zonas separadas). El proceso se vuelve a repetir hasta añadir todo el adsorbente. Cuando sea necesario se podrá abrir el robinete para drenar el exceso de solvente pero es de suma importancia que el nivel de éste sea siempre superior al del adsorbente. b) Desarrollo de la cromatografía: Se disuelve el extracto vegetal en el mínimo volumen de sv. de armado (¿qué hace si no es soluble en él?) Se abre el robinete de la columna, cuando el nivel del líquido está sobre la arena, se agrega el extracto con una pipeta Pasteur (un tubo de vidrio estirado), tratando de que el extremo de ésta esté muy cerca de la arena. Se enjuaga el balón con otro ml de solvente y se agrega a la columna, una vez adsorbida la porción anterior. Si es necesario se enjuaga otra vez el balón y se vierte otra fracción de solvente por las paredes de la columna para arrastrar las sustancias que hubiese adheridas. Se inicia el desarrollo cromatográfico utilizando los solventes adecuados, en base a las conclusiones obtenidas previamente por el análisis del extracto por ccd. Una ampolla de decantación adaptada al extremo superior de la columna puede facilitar el agregado del eluyente. Se verá extender la zona verde de la clorofila y luego comenzará a adelantarse una zona de color rojo-anaranjado de algunos mm. de espesor que contiene los carotenos. Si la columna fue bien armada, estas zonas tendrán bordes netos. Cuando se note la presencia de líquido coloreado a nivel del algodón, se cambiará el recipiente colector y se recogerá el eluído de la columna en tubos de ensayo. Se analiza el contenido de los tubos por ccd con el solvente apropiado, para comparar el contenido de los mismos y el de la mezcla inicial; se observan las placas con luz U.V. (¿Qué observaría si revela con iodo?) Luego se trasvasa el contenido de cada tubo de caroteno a un balón de 125 ml, y se evapora el solvente a presión reducida. Se deja enfriar el residuo aceitoso a temperatura ambiente: se separarán los cristales de caroteno en forma de placas; con este residuo se realizan reacciones de carotenos y se observa al iluminar con luz U.V. en un lugar oscuro. Tenga en cuenta que los carotenos se oxidan rápidamente en presencia de luz y oxígeno. Si se deben guardar algún tiempo, se toma el residuo con 1 ml de cloruro de metileno y se pasa a un tubo de ensayos, se evapora a sequedad el solvente en un baño de agua a 70-80ºC, se envuelve el tubo en papel y se lo guarda en desecador de vacío oscuro o en freezer. Reacciones para clorofila: Las soluciones de clorofila son de color verde azulado; sin embargo, presentan a la luz ultravioleta una fluorescencia rojo intensa. Espectroscopía: Se realizará el espectro ultravioleta de las muestras coloreadas en solución metanólica. Se compararán con los siguientes espectros.



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Clorofilas y Caroteno

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

320 370 420 470 520 570 620 670

Longitud de Onda (nm)

Ab

s.

Clorof ila a (Dietil Eter)

Clorof ila a (Metanol)

Clorof ila b

Beta Caroteno



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4.-CUESTIONARIO 1- ¿Qué técnicas cromatográficas preparativas conoce? Describa 3 de ellas. ¿Con qué masa puede trabajar con cada una de ellas? 2- ¿Cuál es la relación usual entre la cantidad de adsorbente y la cantidad de producto a separar en una columna cromatográfica? ¿Qué pasa si la relación es demasiado baja? ¿Qué pasa si la relación es demasiado alta? 3- ¿Cómo se arma una columna de cromatografía? ¿Qué función cumple la lana de vidrio o el algodón en la parte inferior de la columna? ¿Cuál es la función de la arena o el papel de filtro en la parte superior a sembrar? 4- ¿Qué es el sembrado de la columna cromatográfica? ¿Cómo se realiza? ¿Qué requisito debe cumplir el solvente en el cual se disuelve el producto a sembrar? 5- ¿Cómo se procede cuando el producto a sembrar en la columna, sólo es soluble en un solvente más polar que el solvente de elución? 6- ¿Cómo se procede para elegir el solvente (o mezcla de solventes), que serán empleados en la elución de una columna cromatográfica? 7- ¿A qué se debe el ensanchamiento de las bandas observado a lo largo de la columna? 8- ¿Qué ocurre si deja secar una columna? ¿Y si suspende la corrida y la continúa al día siguiente? 9- Explique el orden de elución de observado para los compuestos de la práctica. 10- Indique Verdadero o Falso y justifique: i) Si al extracto de colorantes de espinaca - sembrado en columna de sílica se lo eluye primero con metanol y luego con hexano, se obtienen primero las clorofilas y luego los carotenos que son menos polares. ii) Si una columna aumenta su longitud al doble, la resolución aumenta al doble. 13- Las hojas de una planta X se extraen con Cl3CH:MeOH (9:1). El extracto se cromatografía en ccd

de sílica y se obtienen los siguientes resultados :

Solvente de desarrollo Valor Rf n-hexano 0,01 0,1 0,2

n-hexano / Cl3CH 0,01 0,2 0,6

Cl3CH 0,01 0,4 0,7

Cl3CH / MeOH 2% 0,01 0,8 1

Cl3CH / MeOH 2% + AcOH 1% 0,2 1

a) ¿Cómo procedería para separar 5 g del extracto original seco en c/u de los componentes?. Describa claramente el proceso desde el armado hasta la elución total. b) Una porción del extracto original se esterificó con MeOH. Al completarse la reacción se obtuvo por ccd usando Cl3CH como solvente de desarrollo, 3 manchas de Rf = 0,4 ; 0,6 ; 0,7. Analice e

interprete los resultados obtenidos por ccd después de la reacción. 14- A partir de un extracto de alcaloides de un hongo, se obtuvieron las siguientes c.c.d. (reveladas con iodo).



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En base a ellas conteste y justifique brevemente a) ¿Cuántos compuestos contiene el extracto? b) ¿Para separarlos por columna, con qué solvente o mezcla la armaría, y con cual/es la eluiría? c) Si el extracto solo se disuelve en metanol, ¿Cómo lo sembraría? d) ¿Espera obtener una separación total? e) ¿Cómo controla finalmente la pureza de cada fracción obtenida? f) Si fueran solo 100 mg ¿Puede usar c.c.d preparativa? Describa el procedimiento. 15- Se tiene una mezcla de tres compuestos A, B y C cuyos Rf en tres solventes distintos son los de la tabla siguiente:

Solvente Rf A Rf B Rf C I 0,2 0,8 1,0 II 0,2 0,3 0,9 III 0,9 0,9 1,0

Indique como procedería en la elución para obtener los tres compuestos separados por cromatografía en columna.

Hexano Hexano: AcOEt 9:1

T

CH2Cl2 ACOEt Acetona MeOH



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TRABAJO PRÁCTICO Nº 7 CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN

1.-Objetivos El objetivo del presente trabajo práctico experimental es el logro del manejo de la técnica de cromatografía de partición en placas de celulosa de 10 x 20 cm. Para lograrlo, se aplicará dicha técnica al caso separativo de Hidratos de Carbono. Dado que este grupo de compuestos fue estudiado tanto en Clases Teóricas, como en clases de problemas de la Parte A, las evaluaciones estarán orientadas tanto hacia las técnicas experimentales empleadas, como hacia las reacciones características de dichos productos naturales. 2.-Introducción Cromatografía de Partición de Hidratos de Carbono. Los azúcares - o hidratos de carbono - son compuestos sumamente polares (polihidroxicetonas, o polihidroxialdehidos) de fórmula general Cn(H2O)n

Son solubles en agua en estado de monosacárido, y también en asociaciones de oligo- y polisacáridos; esta solubilidad los hace susceptibles de ser separados por cromatografía de partición sobre papel o celulosa. Las polaridades de los hidratos de carbono son altas, y para lograr diferencias apreciables en sus movilidades cromatográficas se requiere una gran distancia recorrida por el frente del solvente. Por este motivo cuando se emplea la técnica en papel descendente para análisis cualitativos, el parámetro que mide movilidades es Rg en vez de Rf.

Una regla práctica establece que, cuanto mayor sea la relación nº de grupos OH nº de carbonos

más retenida quedará la sustancia; es decir, tendrá menor Rg. Además cuanto mayor es el peso molecular, menor es el Rg obtenido. En general un azúcar en forma furanósica tiene un valor de movilidad mayor que el mismo en forma piranósica. Las metilaciones también aumentan la movilidad. Los azúcares presentan una amplia gama de reveladores específicos, que además brindan datos no sólo acerca de la ubicación de las manchas en el cromatograma, sino también, sobre propiedades diferenciales de los azúcares. Por ejemplo, se pueden diferenciar azúcares reductores de los no reductores, hexosas de pentosas, etc. SUGERENCIA: Formule las reacciones que ocurrirían con los azúcares y reveladores utilizados en el Trabajo Práctico.

3.- Desarrollo de la práctica 3.1.- Cromatografía de partición de una muestra incógnita y de azúcares testigo y seguimiento de la reacción de hidrólisis de un disacárido (lactosa o sacarosa). Se utilizarán placas de celulosa de 10 x 10 cm. Los alumnos se reunirán en grupos de cuatro para la realización de los siguientes ítems:

a) Siembra de 3 placas de celulosa de 10 x 10 cm con la muestra incógnita y distintos azucares testigo (Consulte con sus docentes cuáles usa)

b) Siembra de una placa con lactosa, lactosa a 4 tiempos de hidrólisis, glucosa y galactosa o de una placa con sacarosa, sacarosa a 4 tiempos de hidrólisis, glucosa y fructosa.

c) Desarrollo de las 4 placas (Doble desarrollo). d) Revelado de las placas sembradas en a) con: nitrato de plata-hidróxido de sodio, biftalato de

anilina y periodato-permanganato. e) Revelado de la placa sembrada en b) con nitrato de plata-hidróxido de sodio. f) Cálculos de Rg y análisis de conclusiones



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g) Cromatografía de partición de pigmentos de marcadores. SUGERENCIA: Debido a que las soluciones a sembrar son acuosas, se recomienda traer secadores de pelo para secar cada siembra y así terminar más rápido. Para realizar los anteriores puntos de la práctica se da la siguiente información: 1.- Cantidad a sembrar: Se sugiere sembrar tres gotas de una solución de 10 mg/ml del hidrato de carbono en agua. 2.- Solvente de desarrollo para los testigos de azúcares: acetato de etilo-piridina-agua (6:3:1) 3.- Hidrólisis del disacárido: Se prepara una solución de 1 g del disacárido (lactosa o sacarosa) en 5 ml de agua. Esta solución se siembra en la placa (una sola gota). Luego se le añade 1 ml de HCl 1N. Se calienta el tubo a baño maría durante media hora, efectuando siembras en la placa a tiempos 0, 5, 10 y 20 minutos. 4.- Solvente de desarrollo para el disacárido y sus productos de hidrólisis: acetato de etilo-piridina-agua (6:3:1) 5- Reveladores a) Para azúcares: Se mezcla una solución acuosa saturada de AgNO3 (0,1 ml) con acetona destilada (10 ml), el ppdo. formado se disuelve agregando agua destilada gota a gota y agitando. La placa se pulveriza con esta solución, y se deja secar en campana. Luego se pulveriza con una solución de NaOH 2 % en EtOH 50 %. Posteriormente se pueden fijar las manchas por inmersión en una solución de Na2S2O3 5 % en agua. c) Para polialcoholes: A 8 ml de una solución de metaperiodato de sodio al 2% se agregan 2 ml de solución de permanganato de potasio al 1% en solución de bicarbonato de sodio al 2%. Se debe preparar en el momento. Se pulverizan los cromatogramas y se observan a los 5-10 minutos. Nota: Este revelado se desvanece rápidamente.

TRABAJO PRÁCTICO COMPLEMENTARIO: AISLAMIENTO Y ANÁLISIS DE POLISACÁRIDOS DE ORIGEN VEGETAL

Objetivos: Obtener un extracto acuoso de distintos materiales vegetales, investigar la presencia de hidratos

de carbono y determinar los azúcares componentes.

1) Extracción de los hidratos de carbono. Suspender 10 g de distintos materiales vegetales (semillas de lino, talo del alga parda Fucus

vesiculosus [se compra en farmacias], granos de arroz) en 100 ml de H2O destilada y realizar una extracción a ebullición por 20 min. Luego separar el residuo sólido por decantación, filtración al vacío en embudo con vidrio fritado o centrifugación, según el material utilizado. Tratar el sobrenadante con 3 volúmenes de etanol para precipitar los polisacáridos, dejar una noche en heladera, centrifugar, aislar el material sólido y liofilizar o bien secar en estufa a 40 ºC.

2) Análisis de la composición de monosacáridos. Se efectuará una hidrólisis del extracto seco. Pesar 3 mg del extracto seco y colocarlos en viales

con tapa a rosca y cierre de teflón. Adicionar 1 ml de ácido trifluoroacético (TFA) 2 M, y llevar a estufa a 120 ºC durante 90 min. Luego llevar a sequedad bajo corriente de aire o bien a presión reducida y a 35 ºC. Posteriormente redisolver los hidrolizados en agua y evaporar nuevamente; repetir este tratamiento hasta eliminar totalmente el ácido. Dejar las muestras en un desecador al vacío durante una noche.

Preparar los alditoles acetilados de acuerdo a la técnica descripta en el Trabajo Práctico de cromatografía gaseosa.



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4.-CUESTIONARIO

1- ¿En qué se basa la cromatografía de partición? 2- Si la cromatografía en celulosa es de partición, ¿Cuáles son las dos fases líquidas? 3- ¿Qué es el Rg? ¿Por qué en la cromatografía de partición no se usa el Rf? 4- ¿Qué tipos de sustancias se cromatografían comúnmente en celulosa? 5- Ordene los siguientes azúcares en función de su Rg creciente y justifique dicho orden: arabinosa, glucosa y lactosa. 6- ¿Qué reveladores cromatográficos conoce para hidratos de carbono? ¿Cuáles son las reacciones involucradas? 7- Formule la reacción de un hidrato de carbono con los reactivos de Fehling y Tollens. 8- ¿A qué atribuye el poder reductor de un hidrato de carbono? ¿Qué azúcares se consideran reductores? ¿Por qué la sacarosa no es reductora y la lactosa sí lo es? 11- ¿Cómo revelarán los siguientes azúcares con nitrato de plata / hidróxido de sodio? comente la intensidad de la mancha en cada caso: sorbitol, glucosa, arabinosa, lactosa y sacarosa. 12- Dadas las siguientes mezclas, indique qué método separativo usaría:

a) proteínas más 2 % de grasas (5 g). b) arabinosa, glucosa, lactosa, (1:2:2) (30 mg). c)

en relación 2:3 (5 g).

d) metanol, benceno (5:3) (3 l ). e) m-dihidroxibenceno, m-nitrofenol, m-dinitrobenceno (1:1:1) (400 mg).

14- Por hidrólisis ácida de un compuesto A, (C21H38O16) que no reduce el reactivo de Tollens, se

obtuvo glucosa, galactosa y un compuesto B (C3H8O). El espectro RMN - 1H de B mostró un doblete a δ= 1,20, un multiplete a δ = 3,94 y un singulete ancho a δ= 4,50. Por tratamiento de A con periodato de sodio y posterior hidrólisis, se obtuvieron dos moles de ácido fórmico y galactosa, entre otros productos. El tratamiento de A con α-glucosidasa produjo glucosa y un disacárido C que no reduce el reactivo de Tollens. El tratamiento de A con β-glucosidasa produce B y un trisacárido reductor D. Por tratamiento con ioduro de metilo en medio alcalino y posterior hidrólisis ácida se obtuvo: 2,3,4,6-tetra-O-metil-glucosa; 2,4,6-tri-O-metil-galactosa y 2,3,4-tri-O-metil-glucosa.

a) Escriba una estructura - en fórmulas de Haworth - para el compuesto A compatible con los datos, justificando brevemente. ¿Existen otras estructuras posibles?

b) Asigne las señales correspondientes al espectro de RMN-1H de B.

15- Se desea conocer la estructura de un trisacárido X para lo cual se ensayaron distintas reacciones cuyos productos se analizaron por cromatografía de partición en celulosa, comprando con patrones. Los resultados son:

IO4-MnO4 (Rg) Glucosa 1 Fructosa 1,2 Galactosa 0,9

Hidrólisis 30 minutos 0,1; 0,4; 0,5; 0,9; 1 Hidrólisis 3 horas 0,9; 1

Tratamiento con α-glucosidasaa 0,4; 1 Tratamiento con β-glucosidasa 0,5; 1

NH2 CONH2



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La oxidación de x con IO4_ dio 2 moles de ácido fórmico (se consumieron 4 moles de periodato).

Además, se sabe que X y el compuesto con Rf 0,4 no reaccionan con fenilhidrazina. Proponga una estructura para el trisacárido que sea consistente con los datos observados.

16- La rafinosa es un azúcar que se encuentra en jarabes de remolacha, tiene la fórmula C18H32O16 y no reacciona con los reactivos de Tollens ni Fehling. La rafinosa fue sometida a estudios estructurales, cuyos resultados se muestran a continuación. a) La hidrólisis ácida total seguida por derivatización y estudio por cromatografía gaseosa mostró tres señales a tr 11, 13 y 15 min. Se comparó con la siguiente mezcla de testigos (convenientemente derivatizados): glucosa (13 min), manosa (14 min), galactosa (15 min), xilosa (10 min), fructosa (11 min). b) La hidrólisis con α-galactosidasa da D-galactosa y sacarosa (la α-galactosidasa rompe uniones α-galactosídicas). c) La hidrólisis con invertasa da D-fructosa y el disacárido melibiosa (la invertasa rompe uniones de β-fructosa). d) La hidrólisis con maltasa da fructosa y un disacárido (la maltasa rompe uniones α-glucosídicas). e) El estudio por cromatografía gaseosa de los productos de metilación y posterior hidrólisis de la rafinosa mostró 1,3,4,6-tetra-O-metil-D-fructosa, 2,3,4,6-tetra-O-metil-D-galactosa y 2,3,4-tri-O-metil-D-glucosa. Proponga una estructura para la rafinosa. Explique sus conclusiones. 17- Responda verdadero o falso, justificando su respuesta:

a) La fructosa da negativo el test de Tollens por ser una cetosa. b) Un polisacárido de glucosas unidas α(1-3), por tratamiento con periodato de sodio y posterior

hidrólisis, rinde como producto mayoritario glucosa. c) Es posible diferenciar el ribitol de la ribosa, revelando el cromatograma con

AgNO3/NaOH/Na2S2O3.

18- Conteste, justificando brevemente: i- ¿Cuándo se dice que un azúcar es reductor? ii- ¿Se puede aplicar cromatografía de partición a compuestos poco polares? iii- ¿Qué tipo de sustancias se cromatografían sobre celulosa?



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TRABAJO PRÁCTICO NO 8 CROMATOGRAFÍA GAS-LÍQUIDO (CGL) Y

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (CLAR)

1.-Objetivos:

El objetivo de esta práctica demostrativa es conocer teórica y prácticamente dos de las técnicas cromatográficas de uso más extendido en la actualidad.

2.-Desarrollo de la práctica 2.1.-Preparación de los acetatos de alditoles El docente entregará las muestras incógnitas de azúcares o bien se utilizarán los hidrolizados obtenidos de vegetales en el TP 7.

Disolver los hidratos de carbono en agua (0,5 ml) y luego adicionarle NaBH4 (una punta de

espátula, 20 mg), verificar que el pH se mantenga mayor a 7. Dejar reaccionar durante 90 minutos. Adicionar luego AcOH (g), gota a gota, hasta pH 5. Se evapora a sequedad en rotavapor con bomba de aceite, y se agrega metanol (3 x 1 ml) y se lleva a seco para eliminar el borato residual como borato de metilo. Dejar en desecador hasta la clase siguiente. Como alternativa, se puede evaporar en corriente de aire en un baño de agua a 40 °C.

Los alditoles se acetilan por agregado de piridina (0,5 ml) y anhídrido acético (0,5 ml) calentando durante 30 min a 80°C. La solución se enfría y se extrae con cloruro de metileno:agua 1.1, en un tubo de ensayos. La fase acuosa se separa con pipeta Pasteur y se reextrae con cloruro de metileno. El extracto orgánico combinado se evapora a sequedad y el residuo obtenido se disuelve en cloruro de metileno inmediatamente antes de inyectar en el cromatógrafo gaseoso. 2.2.-CGL:

Se analizará la composición de la mezcla incógnita de azúcares convenientemente derivatizada, inyectando 1 µl de la fase orgánica. Se realizarán corridas en distintas condiciones y se identificarán los componentes de la muestra comparando con los tiempos de retención de los patrones adecuados.

Se analizará la composición de la fase orgánica de los compuestos arrastrables (volátiles) del TP de destilación por arrastre con vapor. Se realizarán corridas en distintas condiciones y se identificarán los componentes de la muestra comparando con los tiempos de retención de los patrones adecuados.

2.3.-CLAR: (más conocida por su sigla en idioma inglés como HPLC : high performance liquid chromatography): Se separarán los analgésicos presentes en un comprimido, que podrá contener: ácido acetilsalicílico, cafeína, paracetamol.

Moler el comprimido en mortero, pasar a un tubo de ensayos y agregar unos 5-10 ml de MeOH. Analizar el contenido de la muestra por ccd.

Filtrar la muestra en embudo con vacío. La solución final debe tener una concentración de principio activo de 0,5-1 mg/ml.

Se empleará una columna analítica RP-18 y un sistema de solventes MeOH-H2O. Se determinarán los tiempos de retención de los componentes y la composición del analgésico utilizado.



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3.-CUESTIONARIO 1. Explique cuál es la base teórica de estas dos técnicas. 2. Explique de qué partes constan ambos equipos. 3. ¿Cuáles son los detectores más usuales en CG? 4. ¿Cuál es la diferencia entre fase reversa y fase normal? ¿Cuáles son las fases móviles más usadas

para cada una? 5. ¿Qué requisitos debe cumplir un solvente o mezcla de solventes usado como fase móvil en HPLC? 6. ¿Cómo se filtran y desgasifican los solventes para HPLC? 7. Se desean encontrar las condiciones óptimas para separar por CGL a un producto natural X de una

impureza. Cómo procedería si en una determinada corrida no se observan picos además del pico de solvente en el que estaba disuelta la muestra.

8. Idem al problema anterior por CLAR. 9. Al analizar por HPLC la materia prima ibuprofeno, usando una columna de 150mm x 4,6mm

rellena con RP-18, un flujo de 1ml/min. y como fase móvil CH3CN-H2O (70:30), se observan dos señales por detección a 260 nm. La primera es una señal importante a tr = 2 min. y la segunda, de menor intensidad, a tr =4,5 min.

Indique cualitativamente cómo variará cada tr. si sólo se cambia: a)La columna por otra de 250mm x 4,6 mm. b)El flujo a 0,2 ml/min. c)La fase móvil a CH3CN-H2O, 50:50. d)El detector por uno de índice de refracción. e)La longitud de onda a 265 nm. f)El relleno por RP-8. Justifique su respuesta. 11) Por extracción y posterior metilación de los ácidos grasos de un aceite vegetal se obtuvieron cuatro señales por C.G.L. usando una columna capilar SP2250 de 30 m de longitud y FID como detector. Los tiempos de retención observados fueron: 2; 2,5; 4; 6 minutos respectivamente. Sabiendo que los ácidos grasos precedentes son C16:1, C22:1, C16:0, C20:0 y que se usó la siguiente programación de temperaturas T1= 150ºC, t1= 3 min.; T2=200ºC con una rampa de 10ºC/min. a) Asigne los tr a los ácidos grasos presentes en la muestra. b) Indique cualitativamente cómo variará cada tiempo de retención si solo se cambia: i-La rampa de temperatura por una corrida isotérmica a 150ºC. ii-El flujo, aumentándolo y disminuyéndolo. iii-La longitud de la columna, por una de 60 m de longitud con el mismo relleno. iv-El detector por uno de captura electrónica. v-¿Podría haber analizado por CGL los ácidos grasos sin derivatizar? Justifique. vi-¿Qué otra técnica podría haber usado para analizar cuantitativamente los ácidos grasos libres? Describa brevemente las condiciones.



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TRABAJO PRÁCTICO No 9 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO - AMINOÁCIDOS

1.-Introducción Las proteínas están entre los compuestos más importantes del organismo animal. Son poliamidas que por hidrólisis dan aminoácidos. Por lo común sólo se encuentran veinte aminoácidos en las proteínas de plantas y animales, sin embargo, estos veinte aminoácidos se pueden combinar en una gran variedad de formas, para originar músculos, tendones, piel, uñas, plumas, seda, hemoglobina, enzimas, anticuerpos y muchas hormonas. 2.-Objetivo Separar por cromatografía de intercambio iónico una mezcla de aminoácidos, verificando las propiedades ácido/base de los mismos. 3.-Parte experimental • Cromatografía de intercambio iónico Armar una columna con resina Amberlite CG-45 (aniónica débil, forma OH-) de aproximadamente 2 cm de altura . Lavar con agua destilada. Controlar que el pH sea neutro. Sembrar 0,5 ml de una solución acuosa de la mezcla proporcionada por el docente y eluir (muy lentamente) con 2 ml de agua destilada, y repetir la operación 4 veces (10 ml en total) recogiendo las fracciones en tubos separados. Luego eluir con 10 ml de NH3 1M, en fracciones de dos mililitros. • Cromatografía de partición en celulosa Sembrar en una placa de celulosa de 10 x 10 cm la solución original (5 ó 6 gotas), los eluídos con agua y con NH3 (9-10 gotas) y los testigos suministrados por el personal docente. Dejar secar los puntos de siembra. Desarrollar la cromatografía en n-butanol-ácido acético-H2O 9:1:2,5. Revelado: pulverizar con solución de ninhidrina 2% en acetona, dejar secar y poner en estufa a 100ºC. Nota: Una placa de 10 x 10 cm tarda aproximadamente 2 horas y media en correr. Si la muestra de aminoácidos incluyera hidratos de carbono, se realizará, además, una cromatografía en placa delgada de sílica sembrando la muestra y los eluidos acuosos. Se desarrollará la cromatografía en n-PrOH: NH3: H2O en relación (7:1:2) como solvente, y se revelará por inmersión en una solución etanólica de H2SO4 10 % y posterior calentamiento. IMPORTANTE: En todos los pasos de este trabajo práctico debe utilizarse agua destilada.



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4.-CUESTIONARIO 1) Explique los fundamentos de la cromatografía de intercambio iónico. 2) En el TP realizado explique:

a) ¿Para qué se usa una columna de intercambio? b) ¿Qué habría ocurrido si se hubiera utilizado una resina ácida? c) ¿Qué es y para qué se usa la ninhidrina?

3) Responda verdadero o falso, justificando claramente su respuesta:

a) Es posible separar glucosa de lisina por medio de una resina de intercambio catiónico fuerte. b) Es posible separar glicina de ácido aspártico por medio de una resina de intercambio catiónico fuerte, si se usa como solvente un buffer de PI igual al PI del ácido aspártico.

4) Se tienen los siguientes aminoácidos:

NH2CH2COOH (Glicina) (PI: 6,1) SHCH2CH(NH2)COOH (Cisteína) (PI: 5,0) NH2(CH2)4CH(NH2)COOH (Lisina) (PI: 9,7) HOOCCH(NH2)COOH (Ac. Aspártico) (PI: 2,7). ¿Cuáles serían retenidos por una resina catiónica a pH 6,1? Explique.



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Ejercicios adicionales 1° Parcial Problema 1: Una empresa fabricante de tolueno, durante el control de calidad del producto, detecta un lote anómalo que presenta un diagrama de destilación como el que sigue:

Se reconoció mediante diversos ensayos la presencia de un contaminante que pudo ser identificado como una amina X (P. Eb. 96 °C). Ingresan entonces a un manual y encuentran que el tolueno presenta con la amina X un azeótropo de mínima (P.Eb. 75°C), cuya composición expresada en % m/m es (25:75) respectivamente.

a) Determine la proporción de amina X en el tolueno contaminado. b) Proponga un método de purificación del tolueno. c) Dibuje el gráfico de destilación fraccionada (temperatura versus gramos de destilado) para

una mezcla tolueno: amina X (1:1). Problema 2: Un alumno recibe una muestra sólida M que contiene dos de los siguientes analgésicos y se propone separarlos mediante una extracción ácido-base:

HN

OH

O

Paracetamol

O

O

N

COOH

Propoxifeno Clorhidrato Ibuprofeno

HCl

COOH

O

O

Aspirina

Al recibir la muestra el alumno realiza un análisis preliminar por C.C.D., para ello siembra la muestra M disuelta en metanol y los patrones de los analgésicos que le proporcionó el docente

(cada uno de ellos disuelto en metanol). Obtiene el siguiente resultado: C.C.D Silicagel F254, Solvente de desarrollo éter petróleo/acetato de etilo 1:1 Revelador: Luz U.V. long. Onda. 254 nm Siembra: 1- Paracetamol

T( ºC)

75

110

48 100 gramos de destilado

Diagrama 1

1 2 3 4 5



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2- Aspirina 3- Muestra M 4- Ibuprofeno 5- Propoxifeno clorhidrato

Teniendo en cuenta los resultados de la CCD el estudiante realiza una extracción siguiendo el esquema que se muestra abajo. Sobre el sólido 1 realiza el ensayo de ácidos hidroxámicos (etanol) y da resultado negativo.

Muestra M

CH2Cl2agua

F. Org. 1

F. ac. 1

1- Na2SO4 anhidro2- filtrado, evaporación sólido 1

1-NaOH 10 % (pH: 9)2- CH2Cl2

sólido 2F. Org. 2

F. ac. 2

1- Na2SO4 anhidro2- filtrado, evaporación

Responda:

a) ¿Qué analgésicos están presentes en la muestra M? Explique brevemente. b) ¿Por qué el propoxifeno clorhidrato tiene un Rf = 0? c) Indique la identidad de los sólidos 1 y 2 (formule sus estructuras), y justifique. d) ¿Podría separarse una mezcla de los cuatro analgésicos mencionados mediante extracción ácido-base? Justifique dibujando un esquema de extracción. Indique claramente que soluciones utiliza en cada etapa (ácido, base, agua y/o solvente orgánico), indique los lavados, secados y filtrados que realiza donde corresponda. Formule las especies presentes en cada fracción orgánica y acuosa. e) Sabiendo que el Rf del paracetamol es 0.4 usando como solvente de desarrollo éter de petróleo/acetato de etilo 1:1, como espera que varíe si usa como solvente:

- éter de petróleo/acetato de etilo 8:2 - éter de petróleo/acetato de etilo 2:8 - Acetato de etilo/metanol 9:1 Justifique su respuesta



100

Problema 3: Dada la siguiente tabla, complete con el ensayo correspondiente, seleccionando entre los siguientes: Lucas, NaI en acetona, Fehling, Br2/CCl4, ácido hidroxámicos, Tollens, CrO3, AgNO3/etanol.

Ensayo Br

O

H

OH

O

OEt

A - - + - B + - - + C - + - - D - - - + E + - - -

Formule un ejemplo de cada ensayo e indique la señal positiva. Problema 4: Indique si las siguientes suposiciones son verdaderas o falsas. Justifique brevemente (no más de 5 renglones) a) El P.F de una mezcla de dos sólidos A y B puede ser mayor que cualquiera de los P.f. de A y de B puros. b) Si se mezcla α-naftol con vidrio molido, el P.f. desciende proporcionalmente al grado de molienda del vidrio. c) Si la adición de pequeñas cantidades de una sustancia A disminuye el punto de fusión de una sustancia X, entonces X y A son sustancias distintas.



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Ejercicios adicionales 2ª parcial Problema 1: Se desea conocer la estructura de un disacárido A para lo cual se ensayaron sobre éste distintas reacciones. Algunas de estas reacciones se cromatografiaron posteriormente en placa de celulosa, comparando con patrones y se revelaron con distintos reactivos. Los datos obtenidos fueron los siguientes: Siembra Rg (IO4-/MnO4-) Hexosa 1 1,0 Hexosa 2 0,9 Hexosa 3 1,1 Hexosa 4 1,2 Hidrólisis ác de A 15 min 0,4; 1,2; 0,9 Tratamiento de A con β-glicosidasa

-

Además, la hidrólisis ácida total de A seguida de derivatización con borohidruro de sodio y posterior tratamiento con anhídrido acético y piridina, mostró por cromatografía gaseosa tres señale a tR= 16,5; 18,5 y 21,0 con relación de áreas 10:20:10 respectivamente. El CGL de una mezcla de testigos de arabinosa, xilosa, manosa, galactosa y glucosa con la misma derivatización y en las mismas condiciones dio señales a tR= 8,4; 10,3; 16,5; 18,5 y 21,0 respectivamente. La oxidación de un mol del metilglicósido de A con periodato de sodio consumió dos moles de reactivo y liberó un mol de ácido fórmico. El disacárido A dio positivo el ensayo de Tollens.

a) Siendo A un disacárido, por qué se observan tres señales por CGL luego de la hidrólisis total y posterior derivatización ?

b) Indiqué qué hexosas forman el disacárido. c) Escriba la estructura de A en fórmula de Haworth, compatible con los resultados obtenidos,

indicando claramente su razonamiento. Problema2: Dada la siguiente mezcla (lisina, ácido benzoico y glucitol)

H2N CH C OH

O

(CH2)3

CH2

NH2

O OH

CH2OH

OHH

HHO

OHH

OHH

CH2OHpI = 9.7 pKa = 4.2

i) Sepárelos mediante cromatografía de intercambio iónico en columna, elija la fase estacionaria adecuada y especifique los solventes y el orden de elución (pH). Formule las especies que salen de la columna.

ii) ¿Podría usar CGL para analizar directamente las fracciones que eluyen de la columna? Explique.



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Problema 3: Con el objeto de separar los componentes de una mezcla de reacción, se analizaron las CCD desarrolladas con distintos sistemas de solventes, con el fin de buscar condiciones para una separación por columna: Hexano-Acetato de etilo (7:3), Hexano-Acetato de etilo (1:1), Acetato de etilo-Metanol (7:3) y Acetato de etilo-Metanol (1:1). De acuerdo a las placas obtenidas indique:

a) con qué solvente fue corrida cada CCD. b) Indique brevemente con qué solvente armaría la columna y con cuales eluiria. Aclare en que

orden los utilizaría y qué componente eluye en cada caso. c) Cómo sembraría la columna en caso de que la mezcla fuera totalmente soluble solo en

metanol.

Rf = 0,39

Rf = 0,63

Rf = 0,83

Rf = 0,00

Rf = 0,31

Rf = 0,09

Rf = 0,43

Rf = 0,71Rf = 0,78

Rf = 0,94

A B C D Problema 4: En la figura 1 se muestra la separación por HPLC de una mezcla de las siguientes sustancias:

NH

NH

O

O

OH C

O

CH3 NO2 C

O

OCH3 CH3

1 2 3 4 5 6 Las condiciones de trabajo son: Columna: Rp-18 (25 cm) Fase móvil: metanol-agua (65:35) Flujo: 0.5 ml/min Detector: UV (254 nm) Responda brevemente (justificando su respuesta): a) ¿Porqué el tolueno es eluido en último término? b) Indique cualitativamente cómo se modificarían los tiempos de retención en los siguientes casos: i) empleando una fase móvil metanol –agua (35:65). ii) empleando un flujo de 1 ml/min. iii) empleando una columna de similar fase estacionaria y diámetro pero de 15 cm de largo c) Podría utilizar un detector de índice de refracción en el análisis anterior?



103

Problema 5: Con el objetivo de aislar los componentes principales (A-E) de una hierba aromática se sometió la planta al siguiente tratamiento: una destilación de arrastre por vapor a pH=7. El destilado se extrae con CH2Cl2 y la fase orgánica se analiza por cromatografía gaseosa.

HierbaAromática

Destilado

Residuo (R1)

1. H2O, pH=7

2.Arrastre por

vapor

Fase Orgánica (FO1)

Fase acuosa (FA1)

CH2Cl2

NH3

CO

O

NH3

OH

A B C D E

O

HO

HOOH

O

OH

CH2

CHOH

CH2 O C

O

(CH2)12CH3

Datos: B, C y D tiene presión de vapor ~ 10 mm Hg a T=100 ºC Teb(B)=178 ºC; Teb(C)=236 ºC; Teb(D)=195 ºC; pIE= 9,7.

a) Indique en qué fracción (R1, FO1, FA1) se encuentra cada componente. Justificando la respuesta. b) El análisis por cromatografía gaseosa de FO1 arrojó los siguientes resultados: (los cromatogramas se realizaron a igual flujo de gas portador)

1. t=220 ºC 2. t=100 ºC i) Explique las diferencias observadas. ii) Identifique cada compuesto en el cromatograma. iii) Dibuje el cromatograma que se obtendría si se mantienen las condiciones del cromatograma 2 pero se aumenta la velocidad del gas portador al doble. ¿Cómo sería el cromatograma si se la disminuye a la mitad? iv) Plantee condiciones de corrida en cromatografía gaseosa que permitan una buena separación de los compuestos en el menor tiempo posible

guía de laboratorio - química orgánica para biología - parte b

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