Genética Viraly

Evolución

¿Por qué estudiar la genética de los virus?

• Para comprender cómo funcionan los virus en el contexto del huésped.

• Para conocer cómo producen enfermedad.• Para manipularlos a favor nuestro.

Ej. generando estrategias para combatir o prevenir infecciones virales

¿Qué estudiamos?

• Tipos de genomas• Expresión de genes virales• Tipos de mutaciones.• Fenotipos virales• Intercambio de material genético• Variabilidad genética

Tipos de Genomas Virales

• ADNCircular doble cadena (ds). papiloma/polyomavirusLineal doble cadena (ds). adenovirus/herpesvirus/poxvirusLineal simple cadena (ss). parvovirusCircular parcialmente simple cadena. hepadnavirus

• ARNLineal simple cadena (+). picornavirusLineal simple cadena (-). rhabdovirus/paramyxovurusLineal segmentado simple cadena. ortomyxovirusLineal segmentado doble cadena. reovirus

Síntesis de proteínas

Estrategias virales para la síntesis de proteínas

A nivel de transcripción:• Presencia de distintos promotores.• Transcripción en dos direcciones.• Reiniciación de la transcripción. (Rhabdovirus, RNA - )

A nivel de procesamiento:• Presencia de distintos sitios de poliadenilación.• Splicing alternativo.

A nivel de traducción:• Diferentes mecanismos de traducción.

Mecanismos que generan variabilidad

• Mutaciones

• Recombinación AND y ARN

• Reasociación o Reassortment

(solo en virus ARN segmentados)

Diferentes mecanismos de traducción

• Clivaje de poliproteína• Leaky scanning• Reiniciación de la traducción• Supresión de terminación• Ribosomal frameshifting• Inicio de traducción independiente de CAP• Ribosome shunting

Clivaje de poliproteína: Ej. picornavirus

Leaky scanning (uso de AUGs alternativos) Ej. polyomavirus

Replicación polyomavirus

(SV40)

Proteínas VP1, VP2 y VP3 se generan por leaky

scanning

Reiniciación de la traducción en otro AUG Ej. Cytomegalovirus humano e Influenza B

Cytomegalovirus

Influenza B

(Togavirus)

Supresión de la terminación(El ribosoma a veces se detiene y a veces no)

Supresión de la terminación

Togavirus Retrovirus

Requiere una secuencia resbaladiza X-XXY-YYZ (virus del sarcoma de Rous es A-AAU-UUA) y una estructura secundaria de ARN llamada pseudoknot, ubicada 5 a 8 nucleótidos río abajo.

Ribosomal frameshifting

Ribosomal frameshifting

Secuencia resbaladiza

pseudoknot

Ribosomal frameshifting (Ej. Retrovirus)

Retoma en -1

Traducción independiente de CAP

Requiere de la presencia de una estructura secundaria del ARNm viral denominada

IRES (internal ribosome entry site)

Ej. picornavirus

Iniciación con IRESIniciación de la traducción celular

Picornavirus (requiere prot inic),Poliovirus (cliva eIF4G celular),Pestivirus: diarrea viral bovina, fiebre porcina (no requieren PI),Hepatitis C (requiere eIF3).

Estructura IRES de picorna (II a VI)

Traducción con IRES

Ribosome shuntingEj adenovirus

En la etapa tardía de infección, los Adenovirus traducen selectivamente los ARNm tardíos y en forma simultánea suprimen la traducción de los ARNm celulares. Los ARNm tardíos tienen CAP y se traducen, a pesar de estar bloqueada la traducción celular, ya que poseen la secuencia leader tripartita en el extremo 5´que les confiere la habilidad de iniciar la traducción por el mecanismo de “ribosome shunting”. En el mismo, el ARNm recluta la subunidad 40S, se realiza un escaneo muy limitado y rápidamente se transloca hasta el codón de iniciación. Este mecanismo está favorecido por la proteína tardía 100k de los adenovirus.

Ribosome shunting en Adenovirus

La proteína tardía 100k de Adenovirus se une al eIF4G ocupando el lugar de la enzima que fosforila al eIF4E. De esta forma se altera la traducción de los ARNm celulares ya que se interfiere en la formación del complejo de iniciación. También se une a la secuencia tripartita del ARNm viral favoreciendo la traducción por el mecanismo de “ribosome shunting”.

Bloqueo de la traducción celular CAP dependiente al impedir la interacción entre eIF4E y eIF4G

El factor eIF4G es clivado por la proteasa viral 2A (polio / rhinovirus) o la proteasa L (aftovirus).

Diferentes mecanismos de traducción

• Diferentes mecanismos de traducción

• Mecanismos que generan variabilidadEstán relacionados con evolución/adaptación:

• Mutaciones• Recombinación• Reasociación (en virus ARN segmentados)

Mutaciones

• ¿Qué es una mutación?• ¿Qué tipos de mutación hay?• ¿Cómo se producen?• ¿Cuáles son las consecuencias?• ¿Qué utilidad tienen para el investigador?

Mutaciones según efecto en la síntesis de proteínas

Cambio del marco de lectura

a. Inserción

5’ AUG UUU CUC AUC ACC 3’met- phe- leu- Ile- thr

5’ AUG AUU UCU CAU CAC 3’met- Ile- Ser- His- His

b-Deleción

5’ AUG UUU CUC AUC ACC 3’met- phe- leu- Ile- thr

5’ AUG UUC UCA UCA CC 3’met- phe- ser- ser-

¿Cómo se producen las mutaciones?

1- Espontáneas:• Genoma celular. FM = 10-9 - 10-10

• Virus ADNLo esperable sería:Virus que utilizan ADN polimerasa celular sean

poco variables (Virus ADNss).Virus que codifican su ADN polimerasa sean más

variables (Virus ADNds). FM = 10-7 - 10 -8

Sin embargo los virus ADNss tienen una frecuencia de mutación de 10-6. Ej: parvo y circovirus

• Virus ARN. FM = 10 -3 - 10 -5

ARN polimerasa ARN dependiente comete muchos errores dando origen a ARNs con diferentes secuencias CUASIESPECIES

Dinámica de la producción de cuasiespecies del virus de la hepatitis CFigure 1. (click image to zoom) Nucleotide sequences of HCV isolates representing the quasispecies population before initiation of IFN therapy. The pretreatment HVR1 PCR product was cloned in six randomly selected patients (V2, V4, V5, V6, V7, and V14), who were further investigated by direct solid-phase sequencing. A total of 14-30 clones from each patient were generated and analysed by sequencing. In each patient, five (patients V2) to 11 (patient V5) different variants were identified. The HVR1 sequence of the major type is given for comparison on the top and variants with nucleotides identical to the major type are indicated by dashes (-). Relative frequencies of variants are shown in parenthesis on the right.

Secuencias parecidas pero no idénticas

Las mutaciones en regiones regulatorias (promotores, UTRs, etc. ) también pueden

tener consecuencias en la expresión de proteínas.

Reversión de mutación

Reversión Verdadera

Supresión Intragénica

Supresión Extragénicaseudorevertantes

revertantes

Interacciones entre virus

• Complementación• Mezcla de fenotipos• Pseudotipo• Recombinación en virus ADN• Recombinación en virus ARN• Reasociación o Reassortment

Complementación• co-infección con distintos mutantes.Dos virus defectivos pueden ayudarse mutuamente obteniéndose progenie de ambos (pero cada uno sigue con su mutación). No hay intercambio de material genético, sólo interacción a nivel funcional.

1

2

Progenie viral se ensambla con proteínas wt B y wt A

mutante A mutante B

Ejemplo complementación

Virus helpers

• Requieren de otros virus, a veces no emparentados, para su replicación.Ej. parvovirus (dependovirus) se asocian a Adenovirus o Herpes.

Mezcla de fenotipos

No hay cambios en el genoma

Altera rango de huesped y reconocimiento antigénico

Pseudotipo

Una cubierta totalmente distinta:Altera rango de huesped y reconocimiento antigénicoAlternativa utilizada en el desarrollo de vectores virales.

Dos cepas o mutantes intercambian secuencias y corrigen la mutación o adquieren nuevas caracteristicas: un nuevo virus emerge.

Recombinación (Homóloga o no) en virus ADN

From your text: Flint et al., 2004

Recombinación en virus ARN

La ARN polimerasa salta de templado cuando está copiando el ARN.

Becher, P., M. Orlich, and H. J. Thiel. 2001. RNA recombination between persisting pestivirus and a vaccine strain: generation of cytopathogenic virus and induction of lethal disease. J. Virol. 75:6256-6264.

Generación de cepas citopáticas del virus de la diarrea viral bovina debido a la recombinación de RNA entre una cepa persistente y una cepa vacunal, que conlleva a la aparición de un sitio de clivaje

Influenza

SHIFT ANTIGSHIFT ANTIGÉÉNICONICO

Reasociación o Reassotment(virus RNA segmentados reovirus y orthomixovirus)

Humano H2N2

Aviar H3N8

Humano H3N2Reasociación

Reasociación o Reassortment

L M

Shift antigénico en influenza

Presión de selección

Anticuerpos neutralizantes

Plasticidad estructural = Toleran cambios de proteínas de superficie (variación antigénica) (Ej. influenza, rhimovirus, HIV)

Drift antigénico: es la consecuencia de la selección y establecimiento de mutantes que escapan al reconocimiento antigénico en las poblaciones virales

Se seleccionan viriones con cambios leves en proteínas de superficie (antigénicas)

Evolución de los virus• Diferentes presiones de selección conducen a

constantes cambios en las poblaciones virales.

• Los virus tienen una alta capacidad adaptativa: ciclo reproductivo rápido, altísimo número de partículas, capacidad de eludir respuestas del huesped, capacidad de sobrevivir fuera del huesped.

• Fuentes de variablidad genómica: mutación, recombinación, edición de RNA, reasociación (virus RNA).

Ejemplos de adaptación• Cuasiespecies en virus ARN constituyen un

reservorio genético para la adaptación y evolución.

• Virus ADN con infección latente (Herpesvirus) tienen una tasa de variabilidad semenjante a su huesped. Co-evolución con sus huespedes. Poca capacidad de adaptación si hay alguna presión de selección muy fuerte.

• Virus emergentes: necesitan un periodo de adaptación. Matar al huesped no es conveniente. Ej. influenza aviar en humanos.

Nature. 2006 January 19; 439(7074): 344–348.

Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions within a viral population

Marco Vignuzzi1, Jeffrey K Stone1, Jamie J. Arnold2, Craig E. Cameron2, and Raul Andino1

Un mutante con una RNA polimerasa RNA dependiente con menor error en la síntesis, produce una población menos adaptada y con menor capacidad de producir neuropatogénesis.

Menor adaptación por menor capacidad de complementación entre cuasiespecies.

poliovirus

FPV

CPV tipo 2

Lys 93 AsnAsp 323 AsnLys 80 ArgSer 564 AsnGly 568 Ala Caninos

CPV tipo 2a y 2b

FelinosCaninos

Leu 87 MetGly 300 AlaTyr 305 Asp

Parvovirus felino que adquirió poder patogénico en caninos

Felinos < 1900-Presente

1978-1980

1979- presente

Afinidad por receptor transferrina canino

Mayor afinidad por rec. transferrina canino

CPV tipo 2c Caninos 2001- presente

Asp 426 Gly

mutaciones en prot.cápside VP2 (drift antigénico)

s

a

1 5

A

d e e p

c a n y o n

c

r c

Estructura terciaria de la VP2

Unión al receptor

Huesped Resistente

En Evolución Letal

Estable

Dinámica de interacciones virus-huespedes

mutaciónselección

ambiente

Edad huesped alimentación

Comportamiento social

ProMED-mail promed@promed.isid.harvard.edu

• Ebola Reston (2009) Filipinas. Porcino humano (granjeros)

• Adenovirus asociado a neumonía (2010) EEUUMono humano (científico)Muy contagioso entre monos (25% mortandad)

• Ljungan virus (Picornavirus) asociado con muerte fetal intrauterina en humanos. (2009) Suecia.Roedor humano

The endogenous retroviral locus ERVWE1 is a bonafide gene involved in hominoid placental physiologyFranc¸ois Mallet*†, Olivier Bouton*, Sarah Prudhomme*, Vale´ rie Cheynet*, Guy Oriol*, Bertrand Bonnaud*,

Lyon Cedex 07, France; ‡Centre de Neuroge´ne´ tique Mole´ culaire, 44 Rue Monge, 75005 Paris, France, and §Laboratoire

La presencia de secuencias retrovirales (env en particular) faciliaría la formación de la placenta en algunas especies de mamíferos.

Herpesvirus latency confers symbiotic protection from bacterial infectionErik S. Barton1{, Douglas W. White1,5, Jason S. Cathelyn2, Kelly A.

Nature Vol 447| 17 May 2007| doi:10.1038/

La presencia de secuencias virales de un herpesvirus confiere mayor resistencia frente a las infecciones bacterianas.

PNAS February 10, 2004 vol. 101 no. 6 1731–1736

Posibles razones por las cuales convivimos con virus

Bibliografía• Flint, S.J. et al 3ra edición (2009). Principles of Virology.

Molecular Biology, Pathogenesis and Control of Animal Viruses. American Society for Microbiology Press, Washington DC.

Volumen 1Cap 2: Mutaciones, interacción entre virus.Cap 9: Origen diversidad virus RNA.Cap 11: Estrategias de traducción viral.

Volumen 2Cap 10: Evolución.

Traducción IRES: http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=4902 5103