Fagos en la industria lFagos en la industria láácteacteaUn problema siempre vigenteUn problema siempre vigente

MarMaríía Luja Lujáán n CapraCapra

INTI LINTI LáácteoscteosRafaela, 11 de junio de 2015Rafaela, 11 de junio de 2015

Daniela Daniela GuglielmottiGuglielmotti

La La bioconversibioconversióónn

de sustratos en compuestos de mayor valor de sustratos en compuestos de mayor valor agregado es el proceso bagregado es el proceso báásico de una amplia variedad de sico de una amplia variedad de

industrias biotecnolindustrias biotecnolóógicasgicas

BacteriofagosIndustria fermentativa

Las Las bacteriasbacterias

representan el pilar fundamental de los procesosrepresentan el pilar fundamental de los procesos

La mayorLa mayoríía de las a de las industrias fermentativasindustrias fermentativas

experimentan experimentan contaminaciones fcontaminaciones fáágicasgicas

Graves consecuenciasGraves consecuencias

de estas infecciones para todos los de estas infecciones para todos los sectores industrialessectores industriales

(retrasos o freno en las fermentaciones, impacto en la (retrasos o freno en las fermentaciones, impacto en la

calidad del producto, elevados costos y tiempo para identificar calidad del producto, elevados costos y tiempo para identificar origen e implementar origen e implementar medidas correctivas)medidas correctivas)

Cualquier poblaciCualquier poblacióón bacteriana en crecimiento activo es n bacteriana en crecimiento activo es susceptible a susceptible a infecciones finfecciones fáágicasgicas

Infecciones fágicas en la industria fermentativa

((EmondEmond

& & MoineauMoineau, 2007), 2007)

Los grandes volLos grandes volúúmenes de menes de leche crudaleche cruda

procesados diariamente procesados diariamente constituyen la constituyen la vvíía principal de ingreso de fagos a las plantasa principal de ingreso de fagos a las plantas

La elevada frecuencia de La elevada frecuencia de mutacimutacióónn

es origen de creciente es origen de creciente diversidaddiversidad

Entre el Entre el 0,1 y el 10% de los 0,1 y el 10% de los batchsbatchs

estestáán comprometidos por las n comprometidos por las infeccionesinfecciones

Fagos en la industria lácteaIngreso y persistencia

PRÁCTICAMENTE INEVITABLE

PRESENCIA DE FAGOS EN EL AMBIENTE INDUSTRIAL

MicrografMicrografíías electras electróónicas de la inicas de la infeccinfeccióónn

de un de un cultivocultivo

de S. thermophilus. El de S. thermophilus. El cultivocultivo

se se observaobserva

antes (A) y antes (A) y despudespuééss

(D) de la (D) de la infecciinfeccióónn. . AdsorciAdsorcióónn

de de loslos

virionesviriones

a la a la superficiesuperficie

celularcelular

bacterianabacteriana

antes (B) y antes (B) y despudespuééss

(C) de la (C) de la inyecciinyeccióónn

del AND del AND ffáágicogico

en el en el citoplasmacitoplasma

celularcelular..

BacteriofagosBacteriofagosInfecciInfeccióón y lisis celularn y lisis celular

CCéélulas de lulas de LactobacillusLactobacillus

spsp. . infectadas por un fago. infectadas por un fago.

90 min

después de la infección

Lisis celular

Sensibilidad a fagos en las tecnologSensibilidad a fagos en las tecnologíías de as de leches fermentadas y quesos leches fermentadas y quesos

QUESOSQUESOS LECHES FERMENTADASLECHES FERMENTADAS

Mat. prima/Trat. térmico Leche cruda/SuaveLeche cruda/Suave‐‐Moderado Moderado 

(63(63°°CC, 72, 72°°CC))Leche cruda/EnLeche cruda/Enéérgico rgico (90(90°°CC))

Proceso  MMúúltiples etapas que involucran ltiples etapas que involucran 

operarios y utensilios variosoperarios y utensilios variosAutomatizado y Automatizado y 

relativamente asrelativamente aséépticoptico

Suero SinSinééresis, drenaje, circulaciresis, drenaje, circulacióón, n, 

aerosolesaerosolesSin separaciSin separacióónn

Vías de ingreso fágico Leche crudaLeche crudaAmbiente Ambiente Cultivos iniciadoresCultivos iniciadores

Ambiente (ruptura de Ambiente (ruptura de 

barreras fbarreras fíísicas)sicas)Cultivos iniciadoresCultivos iniciadores

Frecuencia de infecciones  Elevada Elevada  Baja Baja 

Diversidad fágica ElevadaElevada BajaBaja

Cultivos iniciadores Acidificantes/Acidificantes/multicepamulticepa Acidificantes/Acidificantes/multicepamulticepa

ADITIVOADITIVO

propprop. . probiprobióóticatica

cepacepa--especespecííficafica

FERMENTOFERMENTO FAGOSFAGOS

Alta Alta vulnerabilidad a vulnerabilidad a

fagosfagos

LECHES FERMENTADAS PROBIÓTICAS

Mat. prima/Trat. térmico Medio a base de leche/Moderado

Proceso  AutomatizadoEstricto control microbiológico

Suero Sin separación

Vías de ingreso fágico Ambiente (ruptura de barreras físicas)Cultivos iniciadores

Frecuencia de infecciones  Elevada

Diversidad fágica Elevada

Cultivos iniciadores Probiótico/monocepa

Aumento y diversificaciAumento y diversificacióón en el uson en el usoCEPA CEPA 

PROBIPROBIÓÓTICATICA

Sensibilidad a fagos en las tecnologSensibilidad a fagos en las tecnologíías de as de leches fermentadas y quesos leches fermentadas y quesos

fermentaciones fermentaciones muy largasmuy largas

LisogeniaLisogenia

aireaire

ingredientes, materia prima, salmueras (queseringredientes, materia prima, salmueras (queseríías) as) producto en diferentes puntos de la lproducto en diferentes puntos de la líínea de produccinea de produccióónn

equipamiento y superficies (pisos, paredes, picaportes, equipamiento y superficies (pisos, paredes, picaportes, mesas, implementos de limpieza, camesas, implementos de limpieza, caññereríías, etc.)as, etc.)

efluentes efluentes

QuQuéé/d/dóónde muestrear? (nde muestrear? (ubicuidadubicuidad))

ConservaciConservacióón de la muestran de la muestra

CuCuáándo muestrear?ndo muestrear?Monitoreo o anMonitoreo o anáálisis de rutina lisis de rutina FermentaciFermentacióón anormal n anormal

DetecciDeteccióón de fagos n de fagos MUESTREOMUESTREO

INSTRUMENTALESINSTRUMENTALES

MOLECULARESMOLECULARES

MICROBIOLMICROBIOLÓÓGICASGICAS

DetecciDeteccióón de fagos n de fagos METODOLOGMETODOLOGÍÍASAS

Permiten reducir tiempos de anPermiten reducir tiempos de anáálisis y aumentar el nlisis y aumentar el núúmero de mero de muestras analizadas en menor tiempo. muestras analizadas en menor tiempo.

Seguimiento de Impedancia o Conductancia:Seguimiento de Impedancia o Conductancia:

detecta detecta diferencias en estos pardiferencias en estos paráámetros cuando el cultivo metros cuando el cultivo desarrolla en leche (comparacidesarrolla en leche (comparacióón con control libre de n con control libre de

muestra).muestra).

InmunoensayosInmunoensayos: : reacciones con anticuerpos especreacciones con anticuerpos especííficos ficos de los diferentes grupos morfolde los diferentes grupos morfolóógicos de fagos. gicos de fagos.

MicroscopMicroscopííaa

electrelectróónica:nica:

clasificaciclasificacióón en diferentes n en diferentes grupos morfolgrupos morfolóógicos.gicos.

DetecciDeteccióón de fagos n de fagos METODOLOGMETODOLOGÍÍAS INSTRUMENTALESAS INSTRUMENTALES

MicroscopMicroscopííaa

electrelectróónicanica

Permite diferenciar grupos morfológicos.

VENTAJASVENTAJAS

LD: 107

UFP/ml.

Equipamiento y personal

Numerosas etapas de purificación y concentración.

No discrimina partículas activas/inactivas

DESVENTAJASDESVENTAJAS

28,8 nm

92,8 nm

MicrografMicrografíías electras electróónicas nicas de fagosde fagos

de de S. thermophilusS. thermophilus. .

Permiten reducir tiempos de anPermiten reducir tiempos de anáálisis y aumentar el nlisis y aumentar el núúmero de mero de muestras analizadas en menor tiempo. muestras analizadas en menor tiempo.

Sondas especSondas especííficas:ficas:

dirigidas a determinar la naturaleza dirigidas a determinar la naturaleza de especies fde especies fáágicas (gicas (LactococcusLactococcus) ) ((MoineauMoineau

et al., 1992)et al., 1992)..

PCR (PCR (PolymerasePolymerase

ChainChain

ReactionReaction):):

amplificaciamplificacióón de n de secuencias conservadas en el genoma secuencias conservadas en el genoma ffáágicogico..

PCR tradicional: detecta, identificaPCR tradicional: detecta, identifica

PCR cuantitativa: detecta, identifica, cuantificaPCR cuantitativa: detecta, identifica, cuantifica

DetecciDeteccióón de fagos n de fagos METODOLOGMETODOLOGÍÍAS MOLECULARESAS MOLECULARES

TipificaciTipificacióón de fagos por PCR y secuenciacin de fagos por PCR y secuenciacióón del n del amplicamplicóónn

((VR2VR2): ): disediseñño racional de estrategias de rotacio racional de estrategias de rotacióón n

de cepas de de cepas de StSt. thermophilus . thermophilus y y LcLc. . lactislactis

multiplexmultiplex::

deteccideteccióón simultn simultáánea de varias especies de nea de varias especies de fago en la misma reaccifago en la misma reaccióón (fermento n (fermento multicepamulticepa))

PCRPCR

PCRPCR

tradicional: tradicional: DetecciDeteccióón e identificacin e identificacióón de fagos en n de fagos en muestras lmuestras láácteas (extraccicteas (extraccióón de ADN n de ADN ffáágicogico

o deteccio deteccióón n

directa) por directa) por amplificaciamplificacióón de secuencias conservadas en el n de secuencias conservadas en el genoma genoma ffáágicogico

muestras mix

de PCR ciclos de PCR gel

de agarosa

Técnica cualitativa

Límite de detección 103

‐

105

ufp/ml

PCRPCR

La presencia de fagos es ubicua en las plantas  industriales. La de ADN fágico, más aún.

tiempo de análisis reducido

análisis de un gran número de muestras

detección e identificación (cuantificación) de grupos/especies de fagos

VENTAJASVENTAJAS

requiere conocimiento de la secuencia nucleotídica

de los genes de los fagos a determinar

no informa infectividad

(sólo detecta ADN fágico)

detecta ADN fágico

de una especie determinada, pero no se sabe de la especificidad sobre las cepas que en particular se usan en una dada planta

posee menos sensibilidad que las técnicas microbiológicas estándar

DESVENTAJASDESVENTAJAS

Se basan en la inhibiciSe basan en la inhibicióón de las bacterias componentes del n de las bacterias componentes del starterstarter. .

TestTest

de Actividad:de Actividad:

detecta diferencias en la produccidetecta diferencias en la produccióón n de acidez (comparacide acidez (comparacióón con control libre de muestra) n con control libre de muestra) (FIL(FIL--

IDF, 1980)IDF, 1980)..

TestTest

de Turbidez:de Turbidez:

clarificaciclarificacióón (lisis) del cultivo en n (lisis) del cultivo en presencia de la muestra presencia de la muestra (FIL(FIL--IDF, 1991)IDF, 1991)..

Spot Spot TestTest::

detecta zonas de lisis en el cultivo detecta zonas de lisis en el cultivo bacteriano (medio agarizado) bacteriano (medio agarizado) (FIL(FIL--IDF, 1991)IDF, 1991). .

Doble capa agarizada:Doble capa agarizada:

permite enumerar las placas de permite enumerar las placas de lisis formadas lisis formadas (FIL(FIL--IDF, 1991)IDF, 1991)..

C MTC Mɸ

DetecciDeteccióón de fagos n de fagos METODOLOGMETODOLOGÍÍAS MICROBIOLAS MICROBIOLÓÓGICASGICAS

DetecciDeteccióón de fagos por metodologn de fagos por metodologíía a dependientes de cultivodependientes de cultivo

PROCESAMIENTO DE MUESTRASPROCESAMIENTO DE MUESTRAS(IDF, (IDF, BullBull. 263, 1991). 263, 1991)

Muestra

(suero, leche fermentada)

Centrifugación o filtración

Ajuste de pH

(4,5-4,7)

Filtración por membrana estéril (diám. poro 0,45 μm)

Tratamiento térmico (90°C/15 min)

Muestra para análisis de inhibidores químicos

Muestra para análisis de bacteriofagos

CinCinééticas de acidificaciticas de acidificacióón en leche n en leche por parte de por parte de S. thermophilusS. thermophilus,,

en presencia de fagos.en presencia de fagos.

5

5.5

6

6.5

0 50 100 150 200 250 300 350

Tiempo (min)

pH

control m.o.i.=1.25.10-3

m.o.i.=1.25.10-4 m.o.i.=1.25.10-5

S. thermophilusS. thermophilus

StSt

12.4 + fago 02112.4 + fago 021--44

DESVENTAJASDESVENTAJAS

En general, poco sensible, para cultivos multicepa.

VENTAJASVENTAJAS

Método sencillo.

TestTest

de Actividadde Actividad

ClarificaciClarificacióón (lisis) del cultivo en n (lisis) del cultivo en presencia de la muestra presencia de la muestra (FIL(FIL--IDF, 1991)IDF, 1991)

C MTC Mɸ

TestTest

de Turbidezde Turbidez

Método sencillo.

Sensible (enriquecimiento en fagos con sucesivos subcultivos: amplificación).

Específico (aislamiento previo

de clones).

VENTAJASVENTAJAS

Tiempo de procesamiento prolongado (dependiente de cultivo).

DESVENTAJASDESVENTAJAS

Muestra        

tal cualMuestra 

calentadaInterpretación de 

resultados

+ + Inhibición por ATB 

+ ‐ Inhibición por fagos

‐ ‐ Sin inhibición

+ presencia de lisis‐

ausencia de lisis requiere confirmacirequiere confirmacióón: placas de lisisn: placas de lisis

Método sencillo.

Sensible (LD bajo).

Específica (aislamiento previo de clones).

VENTAJASVENTAJAS

Tiempo de procesamiento prolongado (dependiente de cultivo).

No detecta fagos que no producen placas de lisis visibles.

DESVENTAJASDESVENTAJAS

DetecciDeteccióón y enumeracin y enumeracióón n de de bacteriofagosbacteriofagos

Spot Spot TestTest

MMéétodo de todo de lala

DobleDoble

Capa Capa AgarizadaAgarizada

Spot Spot TestTest

y Doble capa y Doble capa agarizadaagarizada

FormaciFormacióón de placas de lisis y de zonas de inhibicin de placas de lisis y de zonas de inhibicióónn

DetecciDeteccióón de fagos n de fagos COMPARACICOMPARACIÓÓN DE METODOLOGN DE METODOLOGÍÍAS AS

* 

Sí

permite conocer la especificidad de cepa (dependientes de cultivo). 

Tradicionales Instrumentales y Moleculares

Tiempo de ensayo Elevado  Reducido 

Sensibilidad analítica ~10 ufp/ml 102

‐

107

ufp/ml

Identificación fágica 

(especie, grupo 

morfológico)No permite* Permite 

InfectividadDetermina sólo fagos 

infectivosNo discrimina fagos 

infectivos/fagos no infectivos

Complejidad del 

laboratorioMicrobiología general Laboratorios equipados y 

especializados

Capacitación del personal 

técnicoPersonal con elevado 

entrenamiento y criterioPersonal con elevado 

entrenamiento y criterio

Costo económico Bajo/Moderado  Elevado 

(C(Capraapra

et al. 2009, et al. 2009, MercantiMercanti

et al. 2011)et al. 2011)LactobacillusLactobacillus

((BinettiBinetti

& & ReinheimerReinheimer

2000) 2000)

StreptococcusStreptococcus thermophilusthermophilus

EvoluciEvolucióón fn fáágica en la industria lgica en la industria láácteacteaResistencia tResistencia téérmicarmica

(Su(Suáárez rez andand

ReinheimerReinheimer

2002, 2002, MMüüllerller--MerbachMerbach

et al. 2005, et al. 2005, BuzrulBuzrul

et al. 2007, et al. 2007, AtamerAtamer

et et al. 2009)al. 2009)

LactococcusLactococcus

lactislactis

((AtamerAtamer

et al. 2011)et al. 2011)LeuconostocLeuconostoc

TECNOLÓGICAS

Resistencia tResistencia téérmica de rmica de bacteriofagosbacteriofagosImplicancias en la industria lImplicancias en la industria láácteactea

ANALÍTICAS

FagosFagos

vehiculizadosvehiculizados

en la en la leche leche crudacruda

(10(10--101044

ufpufp/ml),/ml),FagosFagos

que que resisten los resisten los tratamientos ttratamientos téérmicosrmicos,,

ContaminaciContaminacióón n del ambiente del ambiente (planta, laboratorios)(planta, laboratorios)

y de productos.y de productos.

INFECCIONES DURANTE LOS PROCESOS DE ELABORACIÓN

Muestras Muestras conteniendo elevados conteniendo elevados niveles de niveles de fagosfagos,,

Mayor Mayor frecuenciafrecuencia

de aislamiento de aislamiento de de fagos fagos termorresistentestermorresistentes,,

InconvenientesInconvenientes

durante los durante los ananáálisis lisis de laboratorio. de laboratorio.

ACTUALIZACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS

Resistencia tResistencia téérmica de rmica de bacteriofagosbacteriofagosImplicancias analImplicancias analííticasticas

Procesamiento de muestras Procesamiento de muestras sospechadas de contener sospechadas de contener

bacteriofagosbacteriofagos

(IDF, (IDF, BullBull. 263, 1991). 263, 1991)Muestra

(suero, leche fermentada)

Centrifugación o filtración

Ajuste de pH

(4,5-4,7)

Filtración por membrana estéril (diám. poro 0,45 μm)

Tratamiento térmico (90°C/15 min)

Muestra para análisis de inhibidores químicos

Muestra para análisis de bacteriofagos

Fagos termorresistentes

Muestra        

tal cual

Muestra 

calentada

Interpretación de 

resultados

+ + Inhibición por ATB

+ ‐ Inhibición por fagos

‐ ‐ Sin inhibición

FAGOS

+ presencia de lisis‐

ausencia de lisis

+

‐

‐

Aumento y diversificaciAumento y diversificacióón de n de poblaciones fpoblaciones fáágicas que resisten los gicas que resisten los

tratamientos ttratamientos téérmicosrmicos

BacteriofagosBacteriofagos

termorresistentestermorresistentesActualizaciActualizacióón de las metodologn de las metodologíías analas analííticas ticas

tradicionalestradicionales

JJ--1 (1965)1 (1965)

MLCMLC--A3R (2005)A3R (2005)

CCLL

2 (2006)2 (2006)

LactobacillusLactobacillus

caseicasei

031031--D (1995)D (1995)

CGLCGL--3 (2009)3 (2009)

CGLCGL--4 (2009)4 (2009)

WPCWPC--1 (2010)1 (2010)

StreptococcusStreptococcus thermophilusthermophilus

P008 (1971)P008 (1971)

P680 (2005)P680 (2005)

P1532 (2005)P1532 (2005)

LactococcusLactococcus

lactislactis

Prof. Prof. HorstHorst

NeveNeve

Prof. Prof. ZeynepZeynep

AtamerAtamer

((CapraCapra et al. 2013)et al. 2013)

InactivaciInactivacióónn

ttéérmica de fagos de rmica de fagos de StreptococcusStreptococcus

thermophilusthermophilus

y y LactobacillusLactobacillus

caseicasei

en tubos de vidrio.en tubos de vidrio.

Fagos con elevada Fagos con elevada resistencia tresistencia téérmicarmica

9090°°CC, leche, leche

9090°°CC, leche, leche

Propuesta de aplicaciPropuesta de aplicacióón de n de tratamiento ttratamiento téérmico mrmico máás s

severo 90severo 90ººCC

––

45 45 minmin

La lLa líínea de puntos vertical senea de puntos vertical seññala la ala la condicicondicióón de incubacin de incubacióón (90n (90ººCC--15 15 minmin) propuesta ) propuesta en la metodologen la metodologíía tradicional para la deteccia tradicional para la deteccióón de n de fagos (IDF, fagos (IDF, BullBull. 263, 1991).. 263, 1991).

InactivaciInactivacióónn

ttéérmica de fagos de rmica de fagos de LactococcusLactococcus

lactislactis

en en tubos de vidrio ( tubos de vidrio ( ))

y de acero inoxidable ( ). y de acero inoxidable ( ).

PPéérdidas moderadasrdidas moderadas

de actividad ade actividad aúún n frente a frente a tratamientos ttratamientos téérmicos severosrmicos severos

(de hasta 100(de hasta 100ººCC) por per) por perííodos de odos de tiempo tiempo

prolongadosprolongados

(hasta 3 h).(hasta 3 h).

(Roca et al. 2010)(Roca et al. 2010)

(Roca(Roca et al. 2011)et al. 2011)

aminoglicaminoglicóósidossidos

++++++R a QR a Q

EvaluaciEvaluacióón de la n de la termorresistenciatermorresistenciade inhibidores qude inhibidores quíímicos (ATB)micos (ATB)

macrmacróólidoslidos

ββ--lactlactáámicosmicos

quinolonasquinolonas

tetraciclinastetraciclinas

((ZorraquinoZorraquino et al. 2008, 2009, 2011et al. 2008, 2009, 2011))

Propuesta de aplicaciPropuesta de aplicacióón de n de tratamiento ttratamiento téérmico mrmico máás s

severo 90severo 90ººCC

––

45 45 minmin

factiblefactible

Resistencia tResistencia téérmica de rmica de bacteriofagosbacteriofagosImplicanciasImplicancias

BALANCE EVOLUTIVO

FagosFagos

BacteriasBacterias

Control Control ffáágicogico

y no y no erradicacierradicacióónn

Notable plasticidad y Notable plasticidad y flexibilidad flexibilidad gengenóómicamica

Elevada frecuencia de Elevada frecuencia de mutacimutacióónn

RRáápida adaptacipida adaptacióónn

ColonizaciColonizacióón de n de ambientes industrialesambientes industriales

EVOLUCIÓN

BACTERIOFAGOSBACTERIOFAGOS

ADAPTACIADAPTACIÓÓNN

MarMaríía Luja Lujáán n CapraCapra

Daniela Daniela GuglielmottiGuglielmotti

VivianaViviana

SuSuáárezrez

Diego Diego MercantiMercantiMariMariáángelesngeles

BriggilerBriggiler

MarcMarcóó

Silvina Silvina PujatoPujato

Jorge Jorge ReinheimerReinheimerAndrea Andrea QuiberoniQuiberoni

GRUPO DE TRABAJOGRUPO DE TRABAJO

Prof. Prof. HansHans--WolfgangWolfgang

AckermannAckermann

Prof. Prof. SylvainSylvain

MoineauMoineau

Prof. Prof. HorstHorst

NeveNeveProf. Prof. ZeynepZeynep

AtamerAtamer

……muchasmuchas

graciasgracias