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Facultad de Medicina

Facultad| Guía para Prácticas de Laboratorio 1

MED-402 BIOLOGIA MOLECULAR

MEDICINA

GUIA #: 1 SESION #: 1



Presentación

La presente Guía para Prácticas de Laboratorio ha sido desarrollada para que los estudiantes de la asignatura de BIOLOGÍA MOLECULAR dispongan de la información necesaria para la realización de las prácticas correspondientes de acuerdo a los temas, objetivos y resultados de aprendizaje definidos. En este documento se incluye el proceso en el laboratorio de experimentación e investigación, con los respectivos recursos y resultados esperados, para que el estudiante pueda desarrollar su práctica-taller y la elaboración de sus respectivos informes o cualquier otra evidencia de aprendizaje, que serán evaluadas con las rúbricas que constan en los anexos. La Guía presenta una secuencia donde se especifica cada sesión de prácticas en laboratorio con su respectivo proceso didáctico y formativo.



Adquirir destreza en el uso de los diferentes elementos del laboratorio de Biología Molecular.

2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS

Adquirirás las siguientes habilidades: 1. Conocer el equipamiento del laboratorio de biología Molecular 2. Manipular adecuadamente los instrumentos utilizados en el laboratorio para

medir microvolúmenes, pesar cantidades inferiores a un gramo, y separar macromoléculas o subpartículas celulares por centrifugación.

1.- Equipos: Vórtex, 3 juegos de Micropipetas (10, 200, 1000 Ul), Centrífuga, Microcentrífuga, Balanza analítica.

2.- Insumos: Tubos eppendorff 0,2-0,5-1 mL (20 Und c/u),

3 Gradillas, 20 pares de Guantes de latex, 3 guardianes, puntas de micropipetas 0,2-0,5-1 mL (1 rack c/u) , 100 gr. arena común .

3.- Reactivos: Agua destilada 20 ml,

ASIGNATURA: BIOLOGIA MOLECULAR

SIGLA: MED-402

PARALELO todos PERIODO: 2015

Fecha: 2015 PRÁCTICA No:1

SESIONES: 1 TEMA: Introducción al Manejo del laboratorio.

1.- OBJETIVO

2.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS



4.- Buffer de Carga 20 ml (Azul de bromofenol ó Xilen Xianol)

3.- ACTIVIDAD FORMATIVA

Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:) Aplicación estricta de las Normas Generales de Laboratorios biológicos, UDLA

DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD: El laboratorio de biología molecular requiere la manipulación de equipos muy precisos, por lo tanto conocer su correcta manipulación garantiza la exactitud del resultado final. En la Práctica, cada estudiante: Manipulará microvolúmenes de líquidos (agua y buffer), para adquirir la habilidad y experticia en el manejo de micropipetas y pequeños recipientes contenedores (tubos eppendorf). Recibirá instrucción precisa para la operación de diferentes equipos utilizados en la rutina del laboratorio: Centrífuga, Microcentrífuga, Balanza analítica y vortex. Protocolo: Seleccione 50uL con la micropipeta de 200uL, tome una punta desechable y absorba este volumen de agua y viértalo en un eppendorf de 0,2, 0,5 o 1 ml. Repita este proceso al menos 10 veces. Identifique los topes primario y secundario de la micropipeta. Repita el procedimiento anterior con xilene xianol o azul de bromofenol y mezcle ésta sustancia con el agua vertida en el paso anterior, aspire y expela la mezcla hasta que esta se presente homogénea. Coloque al menos dos tubos en la microcentrífuga teniendo en cuenta las recomendaciones para que esta esté perfectamente balanceada, seleccione 3000 rpm y accione el aparato por 1 minuto. Pese 1 gramo de arena en la balanza analítica de precisión, teniendo en cuenta las recomendaciones impartidas para la correcta manipulación de éste instrumento.

6.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Normas Generales de Laboratorios biológicos, Coordinación de Laboratorios UDLA Watson, J. (2008) Molecular biology of the gene. San Francisco, EEUU: Pearson.



7.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS

En cada uno de los laboratorios se debe entregar un informe escrito cuyo formato se puede observar en el Anexo 1. El mecanismo de evaluación es el informe con criterios de evaluación similares para cada una de las prácticas, por lo tanto en las prácticas subsecuentes se tendrá en cuenta la rúbrica consignada a continuación.

CATEGORIA 10 Excelente 7,5 Bueno 5 Regular 2,5 por mejorar NOTA

Introducción

El reporte de laboratorio incluye una introducción clara y precisa del tema, que incluye la problemática a solucionar, la justificación y la metodología general.

El reporte de laboratorio incluye una introducción del tema, que incluye la problemática a solucionar, la justificación y la metodología general.

El reporte de laboratorio incluye una introducción del tema, pero no capta la atención del lector

El reporte de laboratorio incluye una introducción del tema, pero carece de Problemática y/o justificación y/o metodología general.

Objetivos

Especifica claramente los objetivos de la práctica

Especifica solamente algunos de los objetivos

Los objetivos no son claros

No especifica los objetivos de la práctica

Metodología

Los procedimientos experimentales se detallan de manera clara y concisa, en un orden lógico y de acuerdo al marco teórico adecuado.

Los procedimientos experimentales se incluyen en un orden lógico y de acuerdo al marco teórico adecuado.

Los procedimientos experimentales se incluyen pero no cumplen un orden lógico o no están de acuerdo al marco teórico adecuado.

Los procedimientos experimentales no incluyen en forma precisa todos los pasos de la metodología.

Resultados

Se representan los datos de forma precisa en tablas y/o gráficas. Los resultados apoyan o rechazan la hipótesis y generan

Se representan los datos de forma precisa en tablas y/o gráficas. Los resultados no rechazan ni apoyan la hipótesis.

Se describen los datos experimentales en forma escrita.

Los datos presentados no son precisos ni detallados, los resultados no sirven para rechazar ni apoyar la hipótesis de trabajo



conclusiones válidas.

Conclusiones

Las conclusiones se basan en los resultados para apoyar o rechazar la hipótesis, se cumplen los objetivos planteados inicialmente

Las conclusiones se basan en los resultados pero no apoyan ni rechazan la hipótesis experimental de trabajo.

La conclusión se elaboran sin tener en cuenta los resultados experimentales, no son pertinentes

No existen conclusiones válidas que evidencien el cumplimiento de los objetivos planteados

Discusión

Se discuten posibles fuentes de error, se compara el estudio con aportes similares y se resalta la importancia del trabajo.

Se discute el trabajo de manera objetiva, se resalta la importancia del trabajo

Se realiza un resumen de resultados y conclusiones, no hay aporte propio hacia el tema en cuestión.

No se cuestiona ningún aspecto del trabajo ni se compara con ningún otro.

Cuestionario

El cuestionario está completo y correctamente contestado.

El cuestionario está incompleto, pero las preguntas contestadas están correctas.

El cuestionario está incompleto, y las respuestas contestadas son incorrectas.

No se responde el cuestionario.

Referencias Bibliográficas

Varias fuentes de antecedentes de renombre son usados y citados correctamente. Se evidencia la conceptualización de la información de la bibliografía

Algunas referencias bibliográficas son usadas y citadas correctamente. El material es traducido por los estudiantes en sus propias palabras.

Se utilizan pocas fuentes bibliográficas , citadas correctamente.

Se utilizan referencias bibliográficas no relevantes y/o no están citadas correctamente.




MEDICINA




Presentación




Conocer las diferentes herramientas bioinformáticas incluidas en bases de datos disponibles on-line


Adquirirás las siguientes habilidades: Explorar las principales bases de datos que contienen información de secuencias Protéicas o de Ácidos nucleicos. Efectuar búsquedas bibliográficas sobre genes, enfermedades o síndromes en particular utilizando los recursos de la página de NCBI y link adicionales de interés.

1.- Equipos: sala de informática o laboratorio de sistemas, un computador para cada persona con conexión a internet


Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:) Normas Generales de Laboratorios biológicos, UDLA DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD: EXPLORANDO NCBI El Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) mantenido por la Biblioteca Nacional de Medicina de EE.UU. y los Institutos Nacionales de la Salud es uno de los más importantes recursos de bases de datos biológicos del mundo. Este fantástico recurso en línea proporciona una extensa red de bases de datos de nivel cada vez mayor en áreas de la biología y genética molecular, medicina e información bioquímica de todos los seres vivos. Genomas enteros, desde virus a


SIGLA: MED-402

PARALELO todos PERIODO: 2015

Fecha: 2015 PRÁCTICA No:2

SESIONES: 1 TEMA: Fundamentos de Bioinformática




mamíferos superiores son recopilados , organizados y referenciados dentro de estas redes , de manera que acceder al genoma puede ser casi tan fácil como navegar por la web. Pero usted debe tener claro: a) lo que está buscando, y b ) Que es lo que espera encontrar. 1 . Abra su navegador Web y vaya a la página web de NCBI : www.ncbi.nlm.nih.gov. Esta página proporciona enlaces a todas las bases de datos y recursos NCBI . Vale la pena explorar aquí sólo para tener una mejor idea del alcance de NCBI.

Si hace clic en Acerca de NCBI se le llevará a una página que resume algunos de estos recursos. También puede revisar el manual ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21101/) para obtener más información.. Ahora vamos a pasar al portal GQuery - seleccione “All databases” de la barra de navegación en la parte superior de la página de inicio NCBI, haciendo clic en "Buscar" en el campo vacío, introduzca el término bacteria y explore cada uno de los diferentes links, Que puede decir de la cantidad de información relacionada….



Para esta práctica se va a utilizar un gen de Arabidopsis thaliana , una pequeña planta con flores que es como la mosca de la fruta del mundo de las plantas , ya que tiene un ciclo de vida rápida y requiere poco espacio para crecer . El producto de proteína de este gen se registra el número de acceso NP_565676 , y es un componente estructural del ribosoma . Vuelva a la página del portal NCBI GQuery e intentar una búsqueda más enfocada. Utilice los términos de búsqueda que se encuentran asociados a la secuencia del gen que va a utilizar con los Calificadores de campo de GenBank que se muestran a continuación Pruebe las cuatro búsquedas diferentes que se presentan a continuación:

• gene keywords e.g. structural constituent of ribosome

• gene keyword AND organism e.g. structural constituent of ribosome AND Arabidopsis thaliana

• gene keyword [PROT] AND organism [ORGN] e.g. structural constituent of ribosome [PROT] AND Arabidopsis thaliana [ORGN]

• accession or gi



number e.g. NP_565676

Describa los resultados encontrados con cada una de las búsquedas, ha sido alguna de ellas más específica hacia nuestro gen objetivo?? Consulte en la guía de NCBI que significan los siguientes términos: Accession Numbers, Version Numbers, y GI Numbers Búsque su número de acceso a través de la página del portal GQuery (NP_565676). Debería encontrar una secuencia proteíca. Haga clic en élal y en el siguiente enlace para que usted obtenga su descripción completa en GenBank, según el gráfico a continuación:

Observe todos los hipervínculos en el texto. Parece complicado, pero en realidad es sencillo. Por ejemplo, para obtener información taxonómica, haga clic en el hipervínculo SOURCE ORGANISM Algunos registros tienen enlaces a la publicación primaria donde esta secuencia fue citada originalmente en un hipervínculo con número PUBMED (no es el caso en el ejemplo anterior, pero hay una referencia en PubMed de la secuencia). Haga clic en torno a diferentes enlaces para ver qué encuentra. Responda las siguientes preguntas a. ¿Cuál es el linaje taxonómico de su organismo? b. ¿Se ha secuenciado el genoma de este organismo, es decir, ¿hay un proyecto Genoma? c. Si es así, ¿puede encontrar el acceso para la secuencia completa o a uno de los cromosomas? Vuelva al registro GenBank y haga clic en el enlace de CDS, que pasó cuando hizo esto? Vuelva al registro GenBank y examine la sección Información relacionada en la parte inferior derecha. Esto le da enlaces directos a otras bases de datos con información sobre esta consulta.



Pulse el link Gene; Este es un gran recurso inicial en el NCBI.

Recorra las diferentes secciones y utilice los links para responder a las siguientes preguntas. a. ¿Cuál es la posición de su gen en el genoma (consejo: si pasea el mouse sobre la barra verde, que representa el gen en el visor de la secuencia)? b. ¿Cuáles son los nombres de los genes que lo rodean (contexto genómico)? c. ¿Dispone de dominios conservados (desplácese hacia abajo a la sección de anotación del genoma)? ¿Cómo se llaman? d. ¿ en qué proceso biológico está involucrado este gen?




Normas Generales de Laboratorios biológicos, Coordinación de Laboratorios UDLA


En cada uno de los laboratorios se debe entregar un informe escrito cuyo contenido y rúbrica se puede observar a continuación. El mecanismo de evaluación es el informe con criterios de evaluación similares para cada una de las prácticas.




Introducción





Objetivos





Metodología





Resultados

Se representan los datos de forma precisa en tablas y/o gráficas. Los resultados apoyan o rechazan la hipótesis y generan conclusiones válidas.




Conclusiones

Las conclusiones se basan en los resultados para apoyar o rechazar la hipótesis, se cumplen los objetivos






planteados inicialmente

Discusión





Cuestionario













MEDICINA




Presentación




1.- OBJETIVO

Obtener una preparación de buena calidad y cantidad de material genético a partir de una muestra de sangre periférica humana.


Adquirirás las siguientes habilidades: 1.- Comprender los métodos de lisis de membranas para acceder al ADN nuclear 2.-Precipitar ADN con soluciones alcohólicas

La cantidad total de reactivos se ha calculado con un número de tres grupos experimentales (de +-8 alumnos c/u) por clase, ubicados en cada uno de los mesones de trabajo. 1.- Equipos: Vórtex,

3 juegos de Micropipetas (10, 200, 1000 Ul), Centrífuga, Microcentrífuga, Balanza analítica. baño maría

2.- Insumos: Tubos eppendorff 0,2-0,5-1 mL (20 Und c/u), 3 Gradillas, 30 pares de Guantes de latex, 3 guardianes, puntas de micropipetas 0,2-0,5-1 mL (1 rack c/u) , jeringuillas de 5ml (5)

tubos EDTA de 5ml (5) toallas de papel

alcohol antiséptico. Torundas de algodón 3.- Reactivos: Kit Wizard Genomic Promega 6 reacciones

ASIGNATURA: BIOLOGÍA

MOLECULAR SIGLA: MED402 PARALELO: todos PERIODO:2015

Fecha: 2015 PRÁCTICA

No: 3 SESIONES: 2 TEMA: EXTRACCION ADN DE SANGRE




kit Purelink Genomic DNA mini prep Invitrogen 6 Reacciones etanol frio 100% (100ml) isopropanol frío 100% (100ml) agua milliQ (100ml)

Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:) Conceptos básicos sobre estructura y función de los ácidos nucléicos. Replicación del ADN y transmisión de información genética. Ciclo celular y niveles de condensación del ADN. Descripción de la actividad: EXTRACCIÓN CON EL KIT WIZARD GENOMIC (PROMEGA) Lisis de Glóbulos Rojos 1. En un tubo eppendorff de 1,5 mL, combine 300 uL de sangre con 900 uL de Cell Lysis Solution y mezcle por inversión. 2. Incube por 10 minutos a T ambiente. 3. Centrifuge a 13,000–16,000 × g* ; 20 seg 4. Descarte el sobrenadante, Vortex breve al pellet. Lisis de Nucleos y Precipitación de Proteinas 5. Adicione 300 uL de Nuclei Lysis Solution, Mezcle por inversion. 6. Adicione 100 uL de Protein Precipitation Solution; vortex por 20 segs. 7. Centrifuge a 13,000–16,000 × g*; 3 minutos Precipitación de DNA y Rehidratación del pellet 8. Transfiera el sobrenadante a un Nuevo tubo, al que se le haya adicionado previamente 300 uL de isopropanol. Mezcle suavemente para observar la madeja de ADN en formación. 9. Centrifuge a 13,000–16,000 × g*; 1 minuto 10. Discarte el sobrenadante, adicione 300 uL de etanol (same volume as isopropanol). 11. Centrifuge como en el paso 9. 12. Retire el etanol, y deje secar el pellet (10–15 minutes), a Tamb 13. Rehidrate el DNA en 100 uL de Agua MilliQ o buffer Tris EDTA pH7,3 por 1 hour a 65°C o de un dia para otro a 4°C. EXTRACCIÓN CON EL KIT PURE LINK GENOMIC MINI PREP (INVITROGEN) El procedimiento de purificación de ADN está diseñado para purificar ADN genómico utilizando un procedimiento asado en centrifugación de columnas las cuales poseen carga específica para atraer el ADN.




Lisis 1. calentar el baño maría a 55ºC 2. En un tubo eppendorf de 1,5ml colocar 200ul de sangre periférica anticuagulada con EDTA 3. Añada 20ul de proteinasa K y 20ul de RNAsa A 4. Añada 200ul del buffer de lisis 5. Mezcle usando vortex 6. Incubar a 55ºC por 10minutos 7. Anadir 200ul de etanol 100% 8. Mezclar usando vortex hasta obtener una solución homogénea

Unión del ADN a la columna

9. Añadir el lisado anterior (≈640ul) a la columna 10. Centrifugar la columna a 10000xg durante 1 minuto a temperatura ambiente 11. Desechar el tubo de colección y colocar la columna en un tubo colector limpio

Lavado

12. Añadir 500ul de buffer de lavado 1 13. Centrifugar la colunma a 10000xg durante 1 minuto a temperatura ambiente 14. Desechar el tubo de colección y colocar la columna en un tubo colector limpio 15. Añadir 500ul del buffer de lavado 2 16. Centrifugar la colunma a máxima velocidad durante 3 minuto a temperatura ambiente

Elución del ADN

17. Colocar la columna en un tubo eppendorf de 1,5ml estperil y rotulado 18. Añadir de 25 a 200ul del buffer de elución a la columna 19. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto 20. Centrifugar a máxima velocidad por 1 minuto a temperatura ambiente

Conservación del ADN

21. Colocar el ADN purificado a -20ºC


Promega Co. (2010). TECHNICAL MANUAL Wizard® Genomic DNA Purification Kit Instruccions for Use of Products A1120, A1123, A1125 and A1620 Extraído el día 5 del mes agosto del año 2014 Desde: http://worldwide.promega.com/~/media/Files/Resources/Protocols/Technical%20Manuals/0/Wizard%20Genomic%20DNA%20Purification%20Kit%20Protocol.pdf Life Technologies. (2012). PureLink® Genomic DNA Kits For purification of genomic DNA Extraído el día 5 del mes agosto del año 2014 Desde: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_genomic_man.pdf

http://worldwide.promega.com/%7E/media/Files/Resources/Protocols/Technical%20Manuals/0/Wizard%20Genomic%20DNA%20Purification%20Kit%20Protocol.pdf

http://worldwide.promega.com/%7E/media/Files/Resources/Protocols/Technical%20Manuals/0/Wizard%20Genomic%20DNA%20Purification%20Kit%20Protocol.pdf

http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_genomic_man.pdf



Watson, J. (2008) Molecular biology of the gene. San Francisco, EEUU: Pearson.




Introducción





Objetivos





Metodología





Resultados

Se representan los datos de forma precisa en tablas y/o gráficas. Los resultados apoyan o rechazan la hipótesis y



Los datos presentados no son precisos ni detallados, los resultados no sirven para rechazar ni apoyar la hipótesis de



generan conclusiones válidas.

trabajo

Conclusiones





Discusión





Cuestionario













MEDICINA




Presentación




1. Realizar el montaje experimental de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 2. Conocer el fundamento teórico y las aplicaciones de la PCR.


Adquirirás las siguientes habilidades:

1. Calcular las cantidades correctas de los componentes de reacción de la PCR 2. Montar una reacción de PCR

La cantidad total de reactivos se ha calculado con un número de tres grupos experimentales (de +-8 alumnos c/u) por clase, ubicados en cada uno de los mesones de trabajo. 1.- Equipos: Termociclador

Vórtex, 3 juegos de Micropipetas (10, 200, 1000 Ul), Centrífuga, Microcentrífuga,

2.- Insumos: Tubos eppendorff 0,2-0,5-1 mL (20 Und c/u), 3 Gradillas para tubos eppendorff de 1,5 ml 3 Gradilla para tubos eppendorf de 0,2 ml 30 pares de Guantes de latex, 3 guardianes, puntas de micropipetas 0,2-0,5-1 mL (1 rack c/u) ,

toallas de papel alcohol antiséptico. Hielo picado 1 kg

3.- Reactivos: - Agua MilliQ estéril 150uL

ASIGNATURA: BIOLOGÍA MOLECULAR

SIGLA: MED402

PARALELO: todos PERIODO:2015

Fecha: 2015 PRÁCTICA No: 4

SESIONES: 1

TEMA: REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

1.- OBJETIVO




- dNTPs 10mM 10uL - Taq polimerasa 5U/µL 1 uL - Buffer o tampón de reacción 10X 15uL - Primers 10uM c/u 6 uL c/u

- ADN a ser amplificado 2uL - MgCl2 50 mM 3uL


Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:) Replicación del ADN y transmisión de información genética. Introducción al manejo del equipamiento básico del laboratorio de Biología Molecular Descripción de la actividad: PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA PCR 1. Sobre una cubeta con hielo picado colocar un tubo eppendorf estéril para preparar la master mix o mezcla maestra para PCR, usando la hoja especialmente diseñada para el objeto.

* Todos los reactivos deben ser sacados del congelador poco tiempo antes de hacer la mezcla y deberán ser mantenidos sobre hielo picado antes y después de ser usados. Al descongelarlos se debe cuidar de que todo el reactivo se disuelva completamente.

* Para la adición de cada reactivo se deben utilizar puntas de pipeta nuevas y estériles. La preparación de la mezcla se debe realizar con mascarilla y guantes.

* Evitar tocar el extremo de las puntas a usarse con cualquier material, el pelo, la piel, etc.

* La cantidad de master mix a preparar debe ser calculada según el número de tubos de reacción. MASTER MIX (Volumen final por tubo de reacción = 50 microlitros) Ingrediente/tubo Cantidad/tubo Taq 0,2 microlitros

MgCl2 50mM 1 microlitro



dNTPs 10mM 2 microlitros Primers 10µM 2 microlitros c/ primer Tampón de reacción 10X 5 microlitros

Agua bidestilada o ultrapura 35,8 microlitros

2. Colocar 48 microlitros de master mix en cada tubo de reacción (tubos eppendorf 0,2 microlitros). Añadir a cada uno 2 microlitros del ADN extraído.

3. Agregar de 2 a 3 gotas de aceite mineral a cada tubo de reacción dejándolo correr por las paredes. Cerrar bien los tubos y llevarlos al termociclador, que debe haber sido programado con anterioridad.

4. Una vez terminados los ciclos respectivos, congelar los tubos de reacción en caso de no usarlos inmediatamente.


León J., García J.M. 1992 Manual de Genética Molecular. SINTESIS Ed. Madrid. Newton C.R., Graham A. 1994 PCR BIOS. Scientific Publishers Limited Oxford, United Kingdom. Nussbaum R.L., Roderick R.McI., Huntington F.W. 2001 Thompson & Thompson Genetics in Medicine, W.B. Saunders Company, Philadelphia. Paz-y-Miño C., Creus A., Cabré O., Leone P.E. 2002 Genética Toxicológica y Carcinogénesis. Ediciones ABYA-YALA – FUNDACYT-PUCE. Paz-y-Miño C., Arévalo M., Muñoz M.J., Leone P.E. 2005 CYP1A1 genetic polymorphisms in Ecuador, South America. Disease Markers. 21(2):57-59. Strachan T., Read A. 1996 Human Molecular Genetics. Bios Scientific Publishers Limited, UK. Thompson N.W., McInnes R.R., Willard H.F. 1996 Genetics in Medicine.W.B.Saunders Company, Philadelphia, U.S.A. Verma R., Babu A. 1995 Human Chromosomes. Principles and Techniques. McGraw-Hill. Philadelphia.




En el cuerpo del informe del laboratorio, y siguiendo el formato entregado previamente, conteste a las siguientes preguntas: 1. Qué es el PCR anidado o nested PCR y que es el PCR multiplex? 2. De qué depende la temperatura de annealing o unión de los primers. Explique. 3. Por qué es recomendable usar material nuevo y estéril para PCR? 4. Qué son los RFLP y VNTR? En cada uno de los laboratorios se debe entregar un informe escrito cuyo contenido y rúbrica se puede observar a continuación. El mecanismo de evaluación es el informe con criterios de evaluación similares para cada una de las prácticas.


Introducción





Objetivos





Metodología







Resultados





Conclusiones





Discusión





Cuestionario













MEDICINA




Presentación




1.- Realizar el montaje experimental de una digestión por RFLPs.

2.- Conocer el fundamento teórico y las aplicaciones del análisis de RFLPs



1.- Calcular las cantidades correctas para montar una reacción de RFLPs

2.- Analizar resultados obtenidos de análisis previos de RFLPs

La cantidad total de reactivos se ha calculado con un número de tres grupos experimentales (de +-8 alumnos c/u) por clase, ubicados en cada uno de los mesones de trabajo.

1.- Equipos:

Termociclador

Cámara de electroforesis (agarosa)

Fuente de Poder

Vórtex,

3 juegos de Micropipetas (10, 200, 1000 Ul),

Centrífuga,

Fecha: 29/04/14 PRÁCTICA No: 6 SESIONES: 1 TEMA: RFLPs (Restriction Fragment Length

Polymorphisms)


1.- OBJETIVO



Microcentrífuga,

Microondas

Documentador de geles

2.- Insumos: Tubos eppendorff 0,2-0,5-1 mL (20 Und c/u),

3 Gradillas para tubos eppendorff de 1,5 ml

3 Gradilla para tubos eppendorf de 0,2 ml

30 pares de Guantes de latex,

3 guardianes,

puntas de micropipetas 0,2-0,5-1 mL (1 rack c/u) ,

toallas de papel

alcohol antiséptico.

Hielo picado 1Kg

3.- Reactivos:

- SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain 10 uL

- Agarosa 2 gramos

- TBE 1X: 1 Litro

- Buffer de Carga para Ácidos Nucleicos 50 uL

- Agua Milli Q estéril 1 mL

- Eco R1 5 Unidades

- Buffer de reacción Eco RI 10X 3uL

- MgCl2 50 mM 3uL

- ADN a ser digerido Plásmido Puc18 50 ng




Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:)

Fundamentos de Restricción Molecular. Introducción al manejo del equipamiento básico del laboratorio de Biología Molecular

DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD:

Importante: Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.

El buffer siempre debe añadirse como un 10% de la reacción total de digestión.

Protocolo

Digestión de DNA con Enzimas de Restricción:

En un tubo eppendorf de 0,5 mL realizar la master mix, teniendo en cuenta la cantidad de muestras a digerir, no olvidar incluir un control positivo y negativo de reacción.

1. Por cada muestra o control mezclar:

• 5µL de buffer 10 X

• 0.3µl de enzima (EcoRI)

• 0.5µL de BSA

• 30µL de DNA

• 12µL de H2O

____________________

• 50µL de Volumen Total

2. Incubar a 37ºC por una hora

3. Proceder a la electroforesis a voltaje constante (90 voltios).




León J., García J.M. 1992 Manual de Genética Molecular. SINTESIS Ed. Madrid.

Newton C.R., Graham A. 1994 PCR BIOS. Scientific Publishers Limited Oxford, United Kingdom.

Nussbaum R.L., Roderick R.McI., Huntington F.W. 2001 Thompson & Thompson Genetics in Medicine, W.B. Saunders Company, Philadelphia.

Paz-y-Miño C., Creus A., Cabré O., Leone P.E. 2002 Genética Toxicológica y Carcinogénesis. Ediciones ABYA-YALA – FUNDACYT-PUCE.

Paz-y-Miño C., Arévalo M., Muñoz M.J., Leone P.E. 2005 CYP1A1 genetic polymorphisms in Ecuador, South America. Disease Markers. 21(2):57-59.

Strachan T., Read A. 1996 Human Molecular Genetics. Bios Scientific Publishers Limited, UK.

Thompson N.W., McInnes R.R., Willard H.F. 1996 Genetics in Medicine.W.B.Saunders Company, Philadelphia, U.S.A.

Verma R., Babu A. 1995 Human Chromosomes. Principles and Techniques. McGraw-Hill. Philadelphia.


En el cuerpo del informe del laboratorio, y siguiendo el formato entregado previamente, conteste a las siguientes preguntas:

CUESTIONARIO

1. Que significa la signatura propia de las enzimas de Restricción.

2. Como se protege el ADN endógeno (propio) del ataque de las enzimas de Restricción en Bacterias?

3.- Que tipo de corte pueden generar éstas enzimas, existe alguna aplicación basada en ellos??



4. Describa brevemente un artículo científico en donde se utilizó RFLPs en la metodología, (no más de 10 renglones)



Introducción





Objetivos





Metodología





Resultados

Se representan los datos de forma precisa en tablas y/o gráficas. Los resultados apoyan o rechazan la hipótesis y generan






conclusiones válidas.

Conclusiones





Discusión





Cuestionario













MEDICINA




Presentación




1.- OBJETIVO

1.- Realizar el montaje experimental de un gel de agarosa

2.- Conocer el fundamento teórico y las aplicaciones de la electroforesis de ácidos Nucleicos.



1.- Calcular las cantidades correctas para elaborar un gel de agarosa en un porcentaje definido 2.-Montar una electroforesis para separar amplificados obtenidos por PCR

La cantidad total de reactivos se ha calculado con un número de tres grupos experimentales (de +-8 alumnos c/u) por clase, ubicados en cada uno de los mesones de trabajo. 1.- Equipos: Camara de electroforesis (agarosa) Fuente de Poder

Vórtex, 3 juegos de Micropipetas (10, 200, 1000 Ul), Centrífuga, Microcentrífuga, Microondas Documentador de geles

2.- Insumos: Tubos eppendorff 0,2-0,5-1 mL (20 Und c/u), 3 Gradillas para tubos eppendorff de 1,5 ml 3 Gradilla para tubos eppendorf de 0,2 ml 30 pares de Guantes de latex, 3 guardianes, puntas de micropipetas 0,2-0,5-1 mL (1 rack c/u) ,

toallas de papel alcohol antiséptico.

Fecha: 2015

PRÁCTICA No: 6

SESIONES: 1

TEMA: ELECTROFORESIS (AGAROSA)




3.- Reactivos: - SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain 10 uL

- Agarosa 2 gramos - TBE 1X: 1 Litro Buffer de Carga para Ácidos Nucleicos 50 uL


Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:) Fundamentos de Electroforesis, PCR. Introducción al manejo del equipamiento básico del laboratorio de Biología Molecular Descripción de la actividad: 1. Pesar 0,25 gr de agarosa. 2. Calentar la solución hasta que se disuelva la agarosa cuidando de que al hervir no se

riegue la misma. 3. Dejar enfriar la solución hasta aproximadamente 55 0C y agregar 2 microlitros de

bromuro de etidio al gel y mezclar bien. Preparar el molde del gel y verter la solución en el mismo moviendo las burbujas hacia la orilla.

4. Colocar la peinilla en el gel y dejar que éste se solidifique, entonces retirar la peinilla con cuidado.

5. En un pedazo de parafilm limpio colocar 5 microlitros de tinta azul por cada tubo de reacción y mezclar con 7 microlitros de muestra a correr.

6. Colocar el gel en la cámara de electroforesis y cubrirlo con TBE 1X. Colocar la mezcla obtenida en el paso 5, en cada uno de los pocillos del gel preparado anteriormente.

7. Proceder a la electroforesis a voltaje constante (90 voltios).


León J., García J.M. 1992 Manual de Genética Molecular. SINTESIS Ed. Madrid. Newton C.R., Graham A. 1994 PCR BIOS. Scientific Publishers Limited Oxford, United Kingdom. Nussbaum R.L., Roderick R.McI., Huntington F.W. 2001 Thompson & Thompson Genetics in Medicine, W.B. Saunders Company, Philadelphia. Paz-y-Miño C., Creus A., Cabré O., Leone P.E. 2002 Genética Toxicológica y Carcinogénesis. Ediciones ABYA-YALA – FUNDACYT-PUCE. Paz-y-Miño C., Arévalo M., Muñoz M.J., Leone P.E. 2005 CYP1A1 genetic polymorphisms in Ecuador, South America. Disease Markers. 21(2):57-59.



Strachan T., Read A. 1996 Human Molecular Genetics. Bios Scientific Publishers Limited, UK. Thompson N.W., McInnes R.R., Willard H.F. 1996 Genetics in Medicine.W.B.Saunders Company, Philadelphia, U.S.A. Verma R., Babu A. 1995 Human Chromosomes. Principles and Techniques. McGraw-Hill. Philadelphia.


En el cuerpo del informe del laboratorio, y siguiendo el formato entregado previamente, conteste a las siguientes preguntas: CUESTIONARIO 1. Por qué las bandas de menor peso molecular migran más rápidamente que las de mayor peso molecular? 2. Qué es el Bromuro de etidio? Como marca a los ácidos nucleicos? 3. Existen otros reactivos, además del Bromuro de etidio, para marcar a los ácidos nucleicos si se aplica electroforesis? 4. describa brevemente un artículo científico en donde se utilizó electroforesis en la metodología, (no más de 10 renglones), para el estudio de una mutación. En cada uno de los laboratorios se debe entregar un informe escrito cuyo contenido y rúbrica se puede observar a continuación. El mecanismo de evaluación es el informe con criterios de evaluación similares para cada una de las prácticas.


Introducción







Objetivos





Metodología





Resultados





Conclusiones





Discusión





Cuestionario


El cuestionario está incompleto, pero las preguntas contestadas están

El cuestionario está incompleto, y las respuestas contestadas son




correctas. incorrectas.









MEDICINA




Presentación




Comprender el fundamento de la extracción de RNA por el método de Trizol. Conocer el fundamento y aplicaciones clínicas de la PCR en tiempo Real. Adquirirás las siguientes habilidades:



1. Manejo de las condiciones adecuadas de trabajo con RNA. 2. Separación de RNA según su solubilidad 3. Establecer una curva estándar para el PCR cuantitativo 4. Interpretar correctamente los parámetros de calidad y resultados de la

técnica para la adecuada interpretación de los reportes procedentes del Laboratorio de Genética Molecular.

La cantidad total de reactivos se ha calculado con un número de tres grupos experimentales (de +-8 alumnos c/u) por clase, ubicados en cada uno de los mesones de trabajo. 1.- Equipos: In Focus, Computadora del aula.

Cámara de flujo Laminar Termociclador Vórtex, 3 juegos de Micropipetas (10, 200, 1000 Ul),


SIGLA: MED-402 PARALELO todos PERIODO:2015

Fecha: 2015 PRÁCTICA No: 7

SESIONES: 1 TEMA: EXTRACCION RNA Y RT PCR

1.- OBJETIVO




Centrífuga, Microcentrífuga bloque térmico baño maría temperado.

2.- Insumos: Tubos eppendorff 0,2-0,5-1 mL (20 Und c/u), 3 Gradillas para tubos eppendorff de 1,5 ml 3 Gradilla para tubos eppendorf de 0,2 ml 50 pares de Guantes de latex, 20 Tapabocas jeringuillas de 5ml (5)

tubos EDTA de 5ml (5) Torundas de algodón

3 guardianes, puntas de micropipetas 0,2-0,5-1 mL (1 rack c/u) estériles

toallas de papel alcohol antiséptico.

Hielo picado 1Kg Frasco especial para deshechos fenólicos

3.- Reactivos: - Agua Milli Q estéril 1 mL - Etanol 75% Frío 5mL - Trizol LS reagent 3ml

- Cloroformo 1mL - Isopropanol 2mL


Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:) Extracción y separación de ácidos nucleicos (Clases teóricas) Fundamentos de PCR en tiempo Real (Clases Teóricas) Descripción de la actividad: EXTRACCIÓN CON TRIZOL LS: PARA 0.25mL DE MUESTRA Nota: HOMOGENIZACIÓN: Siempre 3:1. P.E.: 0.75mL TRIZOL + 0.24mL de muestra. 1. Poner 0.25mL (250μL) de muestra en eppendorf estéril. 2. Añadir 0.75mL (750μL) de TRIZOL L.S. 3. Mezclar con pipeta hasta que el contenido este homogéneo.



SEPARACIÓN DE FASES 1. Incubar 5 minutos a 30°C en el baño María. 2. Sacar de la incubación y colocar 0.2mL (200μL) de cloroformo (* 0.2mL por cada 0.75mL de TRIZOL utilizado). 3. Mezclar por inversión y sacudir vigorosamente por 15 segundos. 4. Incubar a 30°C por 10 minutos. 5. Centrifugar por 10 minutos a 4°C a no más de 12500 rpm (12.000 g). 6. Tomar el sobrenadante y transferir a otro tubo eppendorf estéril. PRECIPITACIÓN 1. Mezclar con isopropanol: 0.5mL (500μL) por cada 0.75mL de TRIZOL utilizado. 2. Incubar a 30°C por 5 minutos en baño María. 3. Centrifugar a 12.500 rpm (12.000 g) a 4°C por 5 minutos. 4. Retirar el sobrenadante. LAVADO Y RESUSPENCIÓN ARN 1. Poner etanol al 75% (1mL por cada 0.75mL de TRIZOL utilizado). 2. Mezclar en el vortex. 3. Centrifugar a 9.500 rpm (7.500 g) a 4°C por 5 minutos. 4. Retirar todo el alcohol sin dejar que el pellet se seque completamente. 5. Resuspender en 50ul de H2O miliQ. Clase Magistral con exposición y análisis de Resultados Se expondrán los fundamentos y metodologías de la técnica de una forma demostrativa, se planteará un caso clínico con su correspondiente propuesta metodológica, resultados, y discusión que oriente la adecuada toma de decisiones respecto a los resultados obtenidos según la clínica del paciente.


Normas Generales de Laboratorios biológicos, Coordinación de Laboratorios UDLA Life Technologies. (2012). TRIzol ® LS Reagent. Extraído el día 5 del mes agosto del año 2014 Desde: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf Wong ML & Medrano JF, (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation; BioTechniques, Vol. 39, No. 1, July 2005, pp. 75–85


http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf



En el cuerpo del informe del laboratorio, y siguiendo el formato entregado previamente, conteste a las siguientes preguntas: CUESTIONARIO 1. Cuáles son las ventajas del Método Trizol respecto a otras metodologías (compare en una tabla con al menos dos de las más populares , Ej guanidin Isotiocianato – Fenol Cloroformo ) 2. Si se efectúa una extracción de ARN total de sangre humana, y esta se corre en un gel denaturante para RNA, cual sería el patrón de bandas a observar, ilustre uno y explíquelo. 3.- Porque en el lavado final se utiliza etanol al 75%, que sucedería si utilizáramos etanol al 100%? 3. Describa brevemente un artículo científico en donde se utilizó la extracción de Trizol LS en la metodología, (no más de 10 renglones) En cada uno de los laboratorios se debe entregar un informe escrito cuyo contenido y rúbrica se puede observar a continuación. El mecanismo de evaluación es el informe con criterios de evaluación similares para cada una de las prácticas.


Introducción





Objetivos





Metodología

Los procedimientos experimentales se detallan de manera clara y concisa, en un orden lógico y de acuerdo al marco


Los procedimientos experimentales se incluyen pero no cumplen un orden lógico o no están de acuerdo al marco teórico




teórico adecuado. adecuado.

Resultados





Conclusiones





Discusión





Cuestionario






Varias fuentes de antecedentes de renombre son usados y citados correctamente. Se evidencia la conceptualización de la información






de la bibliografía

facultad de medicina · facultad de medicina facultad| guía para prácticas de laboratorio 2 ....

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