biologÍa molecular erase una vez… dr. gerardo daniel deluca laboratorio de aplicaciones...
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BIOLOGÍA MOLECULARErase una vez…
Dr. GERARDO DANIEL DELUCALaboratorio de Aplicaciones Moleculares
Facultad de Medicina-UNNE
Los primeros pasos …
ADN
ARN
PCR
DOT BLOT
Electroforesis
RFLP
Hibridación Secuenciación
NASBA
Clonación
ARRAYS
HIBRIDACIÓN REVERSA
QUENCHER
El gran ninguneado de la microbiología se toma revancha…
Molar •mMolar - uMolar
L /mL/uL •uLitro
Grs/mgrs •nGrs / fGrs.
Moles •mMoles /nMoles
DNA RNA PROTEINASF. Crick
Dogma central de la biología molecular
El código genético
• 1960 Kromberg aisló y purificó la ADN polimerasa
Doty et al descubren las propiedades de hibridación del DNA.
• 1962 Arber aisla y purifica las enzimas de restricción.
• 1967 Se descubre la ADN ligasa
• 1972 Boyer Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación
• 1975 Southern desarrolla la hibridación del ADN con sondas específicas
• 1977 Métodos de secuenciación de ADN (Sanger y Gilbert)
• 1981 Primeros animales transgénicos
• 1985 Invención de la PCR (Kary Mullis)
• 1997 Secuenciación de genomas bacterianos completos
• 2001 Secuenciación del Genoma Humano
• 1960 Kromberg aisló y purificó la ADN polimerasa
Doty et al descubren las propiedades de hibridación del DNA.
• 1962 Arber aisla y purifica las enzimas de restricción.
• 1967 Se descubre la ADN ligasa
• 1972 Boyer Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación
• 1975 Southern desarrolla la hibridación del ADN con sondas específicas
• 1977 Métodos de secuenciación de ADN (Sanger y Gilbert)
• 1981 Primeros animales transgénicos
• 1985 Invención de la PCR (Kary Mullis)
• 1997 Secuenciación de genomas bacterianos completos
• 2001 Secuenciación del Genoma Humano
Principales descubrimientos y avances de la era molecular
Aplicaciones de la Biología Molecular
¿Cuál será la influencia probable de la biología molecular sobre el porvenir de la medicina?
1. Los virus y las enfermedades virales
2. Desórdenes metabólicos hereditarios
3. Malformaciones adquiridas, congénitas y estructurales
4. Cáncer
Edward L. Tatum, Atomes 1968
• Biotecnología (industria, animales, vegetales, microorganismos)
• Clonación de órganos y animales
• Medicina humana y veterinaria (diagnóstico y terapia génica)
• Medicina Personalizada
• Identificación de personas huella genética
• Paleontología
PRINCIPALES APLICACIONES DE LA PCR
INVESTIGACIONES PALEONTOLÓGICAS Y DE FÓSILES
INVESTIGACIONES FORENSES
MEDICINA HUMANA
PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
TIPOS DE PCR CONVENCIONAL
• PCR común• Nested PCR• Nested PCR (1º round primers genéricos y 2º round primers específicos)
• Heminested PCR• PCR de baja astringencia (RAPD PCR)
• RT-PCR
AMPLIFICACIÓN
PCR
• Más ampliamente utilizada
• Distintos formatos caseros y comerciales
NASBA
• Comercial
• Cargas virales y monitoreo
bDNA
• Comercial
• Cargas virales y monitoreo
MANUALES
Con solventes
Sin solventes
AUTOMATIZADOS
Robotizados
Magnéticos y de vacío
EXTRACCIÓN DE ADN O ARN
DETECCIÓN
Electroforesis
Hibridación con sondas marcadas
LIPA
Fluorescencia
RLB
ELISA
HC VMetodología utilizada:
• RT-PCR anidada de la región 5´no codificante (5´NC) del
genoma viral combinada con el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción (RFLP)
251pb
AGAROSA / BrEt
100pb
ACRILAMIDA / Nitrato plata
HPV PCR-RFLP
PCR
RFLP
E z d e r e s t r i c c i ó n
GENOTIPO
Micobacterias PCR-RFLP
RT-PCR MÚLTIPLE VIRUS RESPIRATORIOS
HIBRIDACIÓN REVERSA RLB
Inno-Lipa Micobacterias
Curva de amplificación PCR
Real time PCRVentajas
• No se hace corrida• Detección objetiva
del amplicón• Más sensible
• Multiplex• Más rápida
• Menor tamaño amplicones
• Cargas virales
Real time PCR
Curva de melting
Curva de melting
TaqMan probes
Molecular beacon probes
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
DETECCIÓN
MÉTODO DE
AMPLIFICACIÓN
EXTRACCIÓN
DE ADN O ARN
Amplificación isotérmicaEj: Bayer Quantiplex – NASBA (HIV – HCV)
Lectura por electroquimioluminiscencia
Branched DNA
Quantiplex bDNA Signal Amplification System, de Chiron Corporation (VIH – VHC –VHB)
Hibridación de captura
HPV – Chlamydia trachomatis – Neisseria
Secuenciación
Ej. aplicaciones en infectología: Determinación de resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis.
DNA CHIPMICROARREGLOS DE
DNA