Facultad de Ciencias Naturales y Ambientales

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LA MICROALGA Scenedesmus sp DE LA LAGUNA DE LIMONCOCHA PARA

APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Autora: Laura Fernández Almache

Director: Pablo Castillejo

Revisores: Emma Carrillo, Jefferson Rubio

Quito, abril 2018

INTRODUCCIÓN

• Chlorophyceae

• Hileras d 4 ó 16 células

• Obicuas,nomóviles

• Cultivo de microalgas

• Parámetros físico-químicos

• Producción Laboratorio

• Autótrofos

• Unicelulares

• Fotosíntesis oxigénica

• Macromoléculas

• Aminoácidos esenciales

• SCP

PROTEINAS VEGETALES

LAS MICROAGAS

Scenedesmussp

PROCESO PRODUCCION MICROALGAS

Objetivo General:

Aislar de una cepa pura de la especie Scenedesmus sp de un consorcio procedente de la Laguna de Limoncocha para su posterior cuantificación de contenido proteico y su aplicación en la industria alimentaria

Objetivos específicos:

• Identificar por observación al microscopio óptico y el uso de claves dicotómicas la especie de Scenedesmus sp.

• Cultivar en laboratorio Scenedesmus sp en medio de cultivo Bristol y BG11

• Determinar la cinética de crecimiento de Scenedesmus sp por conteo celular y densidad óptica.

• Obtener biomasa y determinar la productividad de los medios de cultivos Bristol y BG11

• Determinar contenido proteico de Scenedesmus sp

OBJETIVOS

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio

El consorcio de microalgas provienende la laguna de Limoncocha, que seencuentra ubicada en la ReservaBiológica Limoncocha del cantónShushufindi de la provincia deSucumbíos, en la región amazónicanortoriental del Ecuador, concoordenadas geográficas:

Latitud: -0.466667

Longitud: -76.4667

Altitud: 220 msnm

Temperatura anual: 24.9 °C

AISLAMIENTO

ENRIQUECIMIENTO

1mL en 100mL, 20°C, 12:12, 10 días

DILUCIONES SERIADAS

1mL cultivo en 9mL agua estéril, siembra en medio sólido, 10 días, 20°C, 12:12

CAPILARIDAD

Tomar una colonia y sembrar en medio sólido.

ADHESION A VIDRIO CIBREOBJETOS

PROPAGACION

MEDIOS DE CULTIVO

• Bristol

• BG11

ACONDICIONAMIENTO

• Temperatura

• Fotoperiodos

• Agitación

• Inóculo inicial 150ooo cel/mL

CONTROL

• Contaje celular, cámara Neubauer

• Densidad óptica, espectrofotómetro 675nm

Diseño

Experimental

AAx1 Ax2 Ax3

Ay1 Ay2 Ay3

BBx1 Bx2 Bx3

By1 By2 By3

OBTENCIO DE BIOMASA

CENTRIFUGADO

2000 rpm por 10 minutos

LISIS CELULAR

Ondas ultrasónicas, 60 seg 2 periodos

SECADO

Estufa 3 horas, 105°C

CUANTIFICACION DEL CONTENIDO PROTEICO

MÉTODO BIURET

ACONDICIONAMIENTO

25mg en 1mL buffer, centrifugar, reposar 60min

MEDICION

Amplitud de onda 540 nm

y = 0,1168x + 0,0062

R² = 0,9965

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Absorbancia BSA mg/mL

RESULTADOS

Según las micrografías obtenidas de lasplacas 105,106 y las claves dicotómicas(Wehr, Sheath, & Kociolek, 2015), sepuede identificar que la especiepredominante es perteneciente al géneroScenedesmus, de la división Chlorophyta.

En la Figura se observa coloniasformadas por grupos de 4 células, conuna organización en zigzag, cuerpo celularalargado con pared celular lisa,presentando las células externas unacurvatura hacia dentro, y células esféricasde 4µm de diámetro, agrupas en cenobiosde 2 a 4 cenobios organizados en línea oen forma alterna.

IDENTIFICACION

16 µm

PROPAGACION

0,00

1000000,00

2000000,00

3000000,00

4000000,00

5000000,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

célu

las/

mL

Días cultivo

Contaje Medio Cultivo Bristol

0,2800

0,3000

0,3200

0,3400

0,3600

0,3800

0,4000

0,4200

0,4400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ab

sorb

an

cia

Días de cultivo

Absorbancia Medio Cultivo Bristol

0,00

500000,00

1000000,00

1500000,00

2000000,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

célu

las/

mL

Días cultivo

Contaje Medio Cultivo BG-11

0,2600

0,2800

0,3000

0,3200

0,3400

0,3600

0,3800

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ab

sorb

an

cia

Días cultivo

Absorbancia Medio Cultivo BG-11

Curvas de crecimiento de Scenedesmus sp en medio de cultivo Bristol y BG11 determinadas por contaje celular y densidad óptica

Fase adap: 170000cel/mLFase exponencial: 700000cel/mL

Fase adap: 50000cel/mLFase exponencial: 300000cel/mL

0,00

500000,00

1000000,00

1500000,00

2000000,00

2500000,00

3000000,00

3500000,00

4000000,00

4500000,00

5000000,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

célu

las/

mL

días cultivo

Medio Cultivo Bristol vs BG-11

BRISTOL

BG11

N= 𝑁𝑜 ∗ (2)𝑛BRISTOL

NO 108833

N 4202333

n 5,22

BG11

NO 113000

N 1813166

n 2,04

Comparativo de crecimiento celular Bristol vs BG11

En ambos medios de cultivo las curvas de crecimiento presentan definidas las fases de crecimiento celular con una fase exponencial de 3 días. En el medio de cultivo Bristol el crecimiento en la fase exponencial fue 52.12% mayor que en medio de cultivo BG11.

Los porcentajes sales de cloruro de sodio y magnesio, y sulfatos son mayores en un 25,26% en el medio Bristol

R² = 0,9876

y = 3E+07x - 1E+07

0,00

600000,00

1200000,00

1800000,00

2400000,00

3000000,00

3600000,00

4200000,00

4800000,00

0,2800 0,3000 0,3200 0,3400 0,3600 0,3800 0,4000 0,4200 0,4400

Co

na

taje

Absorbancia

Contaje vs Absorbancia (Bristol)

y = 2E+07x - 7E+06

R² = 0,9761

0,00

500000,00

1000000,00

1500000,00

2000000,00

0,2800 0,2900 0,3000 0,3100 0,3200 0,3300 0,3400 0,3500 0,3600 0,3700

Co

nta

je

Absorbancia

Contaje vs Absorbancia (BG11)

Correlación de determinación de crecimiento celular por densidad óptica

PRODUCTIVIDAD DE BIOMASA SECA

Productividad de biomasa seca de

Scenedesmus sp en medio de cultivo BRISTOL

CULTIVO g L g/L

A1 0,0225 0,05 0,450

A2 0,0257 0,05 0,514

A3 0,0261 0,05 0,522

TOTAL 0,0743 0,15 0,495

Productividad de biomasa seca de

Scenedesmus sp en medio de cultivo BG11

CULTIVO g L g/L

B1 0,0134 0,05 0,2680

B2 0,0129 0,05 0,2580

B3 0,0138 0,05 0,2760

TOTAL 0,0401 0,15 0,2673

Productividad de biomasa seca en Bristol Productividad de biomasa seca en BG11

La productividad de biomasa seca de Scenedesmus sp en medio de cultivo Bristol, fue mayor en un 46,02% en relación con la biomasa seca obtenida en el medio de cultivo BG11

CONTENIDO PROTEICO

Contenido de proteína (BG11)

CULTIVO Abs 540nm Proteina g/L %Proteina

B1 0,0171 0,0933 34,82%

B2 0,0165 0,0882 34,18%

B3 0,0174 0,0959 34,74%

PROMEDIO 0,0925 34,58%

Contenido de proteína (BRISTOL)

CULTIVO Abs 540nm Proteina g/L %Proteina

A1 0,0275 0,1824 40,53%

A2 0,0282 0,1884 36,65%

A3 0,0289 0,1943 37,23%

PROMEDIO 0,1884 38,13%

Contenido proteico de Scenedesmus sp en medio Bristol

Contenido proteico de Scenedesmus sp en medio BG11

Los valores proteicos obtenidos difieren en un 3.58%, que se considera una variación no significativa; el contenido proteico para Scenedesmus sp. El ratio de contenido proteico en el medio de cultivo Bristol es de 2,89 y en el medio de cultivo BG11 es de 2,62.

CONCLUSIONES

- La combinación de técnicas de enriquecimiento condiluciones seriadas resulta un método idóneo paraobtener un cultivo axénico de un consorcio nosaturado.

- Las condiciones de cultivo dispuestas a unatemperatura de 20°C, con fotoperiodos de 12:12(luz-oscuridad) favorecen el crecimiento exponencialde la cepa Scenedesmus sp.

- Tener un cultivo axénico favorece la aplicaciónde un método indirecto para la determinacióndel crecimiento celular mediante densidadóptica al tener correlaciones altas.

- En relación a la productividad de biomasamicroalgal, para Scenedesmus sp, un medio decultivo rico en sales favorece su rendimiento aescala laboratorio.

- El método de ruptura celular por ondas ultrasónicascomo pretratamiento para determinación deproteínas por el método de Biuret resulta una opciónaceptable ya que los valores obtenidos soncomparables a los resultados obtenido por González& Cañizares (1998) en su estudio sobre la incidenciadel N2 en la producción de proteína algal .

- La aplicación a gran escala de la microalgaScenedesmus sp. como una fuente efectiva deproteína, no está limitada por acondicionamientosde producción y técnico, con lo que concluimos queestos resultados la hacen una especie recomendadapara la producción industrial orientada al usoalimentario.

¡MUCHAS GRACIAS!