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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Análisis microbiológico de alimentos vegetales
Alumno: Ana Parras Jurado
Julio, 2014
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1. RESUMEN ........................................................................................................................... 3
2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 5
3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 13
4. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................... 14
4.1. Alimentos ................................................................................................................... 14
4.2. Medios de cultivo ..................................................................................................... 14
4.2.1. TSA ........................................................................................................................ 14
4.2.2. TSB ........................................................................................................................ 14
4.2.3. MacConkey .......................................................................................................... 15
4.2.4. MRS agar ............................................................................................................. 15
4.2.5. Vogel Johnson ..................................................................................................... 16
4.2.6. KAA agar .............................................................................................................. 16
4.3. Procesado de los alimentos .................................................................................. 16
4.4. Recuentos bacterianos .......................................................................................... 17
4.5. Pruebas de identificación ...................................................................................... 17
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 18
5.1. Recuentos .................................................................................................................. 18
5.2. Identificación preliminar ........................................................................................ 24
6. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 26
7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 27
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1. RESUMEN
La contaminación de los alimentos vegetales puede verse influenciada por
numerosos factores, que incluyen el uso de estiércol como fertilizante, agua
contaminada por productos agrícolas, equipos de cultivo contaminados, prácticas
higiénicas de los trabajadores en el campo, en las envasadoras y en las plantas de
procesado y la presencia de animales salvajes en los campos y en las envasadoras.
Dado que estos productos se consumen crudos y no se utilizan prácticas de
intervención que puedan controlar o eliminar eficazmente los patógenos antes de su
consumo, es una fuente potencial de enfermedades alimentarias. En este trabajo se
persiguió estimar la incidencia de contaminación microbiana en los alimentos
vegetales empleados, analizar la presencia de distintos grupos bacterianos en ellos
y realizar un estudio comparativo de los microorganismos presentes sobre estos
alimentos. Para ello, se utilizaron alimentos adquiridos en el mismo establecimiento
en tres semanas distintas. Se realizaron recuentos de los microorganismos crecidos
a partir de los vegetales en medios selectivos y no selectivos y se realizó una
identificación preliminar de los microorganismos aislados mediante tinción de Gram y
prueba de la catalasa. Los resultados obtenidos mostraron un cambio significativo en
los recuentos microbianos de los alimentos comprados en las tres semanas
distintas. Los recuentos más bajos correspondieron a las muestras de tomate y
pimiento, justificados por sus valores inferiores de pH. Así mismo, se comprobó la
coherencia entre los microorganismos aislados sobre los medios selectivos y el
medio general y los distintos tipos microbianos identificados mediante tinción de
Gram y prueba de catalasa.
ABSTRACT
Pollution of vegetable food can be influenced by many factors, including use of
manure as fertilizer, water polluted by agricultural products, polluted farming
equipment, worker’s hygienic practices in the field, in the packing and processing
plants and the presence of wild animals in the fields or packing plants. As these
products are consumed raw and no intervention practices are used to control or
effectively eliminate pathogens before their consumption, this is a potential source of
foodborne illness. In this work the incidence of microbial pollution in vegetable foods
was estimated, as well as the presence of diverse bacterial groups on them. A
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comparative study of the microorganisms present on these foods was also
performed. Foods bought in the same establishment in three different weeks were
used and counts of grown microorganisms from these vegetables in selective and
non selective mediums were performed as well as a preliminary identification of
isolated microorganisms using Gram’s stain and catalase test. The results showed a
significative change in the microbial counts of the vegetable foods bought in three
different weeks, lower counts in tomato and pepper, justified by their low pH level,
and a relation between microorganisms grown in all mediums and the different
identified microbial types.
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2. INTRODUCCIÓN
La contaminación de los alimentos vegetales puede verse influenciada por
numerosos factores, que incluyen el uso de estiércol como fertilizante, agua
contaminada por productos agrícolas, equipos de cultivo contaminados, prácticas
higiénicas de los trabajadores en el campo, en las envasadoras y en las plantas de
procesado y la presencia de animales salvajes en los campos y en las envasadoras.
Dado que estos productos se consumen crudos y no se utilizan prácticas de
intervención que puedan controlar o eliminar eficazmente los patógenos antes de su
consumo, es una fuente potencial de enfermedades alimentarias (Matthews, 2006).
Según la WHO (World Health Organization) y la FAO (Food and Agriculture
Organization of the United Nations) es recomendable tomar al menos 400 g de frutas
y verduras cada día, ya que aportan muchas de las vitaminas, minerales y fibras
necesarias para el ser humano y juegan un papel importante sobre la salud al
prevenir enfermedades cardíacas, sobrepeso y obesidad
(http://www.who.int/dietphysicalactivity/fruit/en/).
Sólo en Estados Unidos el consumo de frutas y verduras frescas ha pasado de un
19% en 1980 a un 29% per cápita en el año 2000, tal y como manifiesta Clemens en
su estudio (2004) y, según Lin (2004), esta tasa puede seguir aumentando hasta
2020. Pero las frutas y las verduras que se consumen son vulnerables a los
patógenos humanos, al crecer en ambientes naturales, pudiendo verse asociado el
aumento en el consumo con el aumento en los casos de enfermedad alimentaria.
Precisamente, atendiendo al trabajo de la FDA (U.S. Food and Drug Administration)
junto a la CFSAN (Center for Food Safety and Applied Nutrition) (2004), en la
década de los 90, el 12% de las enfermedades alimentarias estaban relacionadas
con el consumo de estos alimentos. Son una fuente potencial de enfermedad debido
a que se consumen crudos y no se interviene en el control o la eliminación de
posibles patógenos, por lo que la FDA considera una prioridad la seguridad de frutas
y verduras frescas, sean o no importadas. Como consecuencia, inició una serie de
medidas para asegurar que los productos que llegan a los consumidores sean
microbiológicamente seguros (Beru y Salbury, 2002). Entre 1999 y 2000, la FDA
realizó unas encuestas sobre los productos vegetales frescos nacionales (Estados
Unidos) e importados, encontrando un 1% y un 4,4%, respectivamente, de muestras
positivas para Salmonella o Shigella spp.
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Sin embargo, los tipos de patógenos estudiados por la FDA han sido limitados y hay
muchos agentes etiológicos específicos relacionados con los productos vegetales
frescos y los brotes alimentarios. Entre estos agentes se han encontrado bacterias
pertenecientes a los géneros Salmonella o Shigella, E. coli O157:H7
(Sivapalasingam et al. 2004, Steele y Odumeru, 2004), Listeria monocytogenes,
Campylobacter jejuni y Yersinia enterocolitica; además de distintos tipos de virus y
especies de parásitos y helmintos (Beuchat 2002, Sewell y Farber 2001). El tipo de
producto, las condiciones climáticas y las prácticas agrícolas son algunos de los
factores que tienen influencia sobre la presencia, el número y la fuente de
microorganismos asociados a un producto vegetal antes de su recolección.
Antes de que se produzca la recolección de frutas y verduras frescas dos fuentes
potenciales de contaminación son el agua usada para la aplicación de insecticidas y
fungicidas y para la irrigación de los cultivos y el estiércol usado como fertilizante. La
gran capacidad de supervivencia de E.coli fue estudiada sobre estiércol ovino y
bovino, bajo distintas condiciones climáticas, por Kudva et al. (1998), revelando que
estos microorganismos podían llegar a sobrevivir durante 21 meses. La capacidad
de supervivencia de Salmonella también ha sido ampliamente estudiada por Findlar
(1971), Plym-Forshell et al. (1996) y Tannock y Smith (1972). Ambos tipos
bacterianos pueden sobrevivir también en residuos líquidos de estiércol de acuerdo
con Himathongkham et al. (1999). Chalmers et al. (2000) y Wang y Doyle (1998)
también pusieron de manifiesto la capacidad de supervivencia de E. coli en aguas
municipales, recreativas, en reservas y en pozos. El estiércol contaminado puede
entrar en contacto con las fuentes de agua para el cultivo, provocando la
contaminación del agua, donde E. coli es capaz de sobrevivir durante largos
períodos (Institute of Food Technologist 2002). Solomon et al. (2000) demostraron
una relación entre la aplicación de agua de riego y que el microorganismo se
encuentre asociado a la porción comestible del vegetal. Okafo et al (2003)
determinaron la presencia de Salmonella, Vibrio spp. o E. coli tras irrigar los cultivos
con aguas, procedentes de casas residenciales y establecimientos comerciales, en
las que también se encontraron estos patógenos. El consumo de frutas y verduras
frescas importadas y contaminadas debido a las prácticas de irrigación de los
cultivos y la calidad microbiológica del agua de otros países tienen un impacto sobre
las enfermedades alimentarias humanas. La FDA sugiere que “(…) el agua en
contacto directo con la porción comestible del producto puede necesitar ser de mejor
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calidad (microbiológica) comparada con la usada cuando hay un mínimo contacto”
(1998).
Las heces de animales salvajes también presentan bacterias patógenas humanas,
tal y como demuestran Kruse et al. (2004). Sin embargo, los microorganismos que
se recuperan durante la recolección no presentan un riesgo demasiado alto sobre la
salud humana, aunque sí contribuyen al deterioro de los productos vegetales. Entre
las bacterias que se hallan durante la recolección se encuentran miembros de los
géneros Bacillus, Erwinia, Xanthomonas y Clostridium spp., que participan en la
degradación del tejido del producto, permitiendo que los microorganismos patógenos
se instalen y crezcan en él. Por tanto, según Tournas (2005), el control de los
microorganismos alterantes también ayuda al control de los microorganismos
patógenos, ya que influyen en la supervivencia de éstos.
Se han realizado pocos estudios sobre la calidad microbiológica de los productos
vegetales según sean cultivados orgánica o convencionalmente. Los resultados
parecen indicar niveles mayores de bacterias patógenas en productos cultivados
orgánicamente, como evidencian Mukherjee et al. (2004).
Con el objetivo de minimizar la contaminación de frutas y verduras frescas se creó
una guía en 1998 a través de la FDA, el CFSAN y el Departamento de Salud y
Servicios Humanos de Estados Unidos. Entre las recomendaciones para conseguir
reducir esta contaminación se incluyen “análisis microbiológico de la granja y del
agua de riego, construcción de defensas para limitar el acceso de los animales
salvajes a los campos y a los huertos, aplicar el estiércol como fertilizante en los
campos mucho antes (>120 días) de su siembra, limpieza regular de los equipos de
la granja y uso del riego de superficie más que el de aspersión.” Estas
recomendaciones se relacionan con el uso de las GAP (Good Agricultural Practices),
desarrolladas para la seguridad microbiológica de los alimentos por Stier y Nagle
(2001).
Las semillas contaminadas también representan una fuente de patógenos, ya que
las condiciones utilizadas para que germinen son muy parecidas a las condiciones
óptimas para el crecimiento de bacterias, incluyendo las asociadas a enfermedades
humanas, como Salmonella y E. coli O157:H7. Los brotes de semillas han tenido
relación con brotes de enfermedades alimentarias. El caso de más importancia se
registró en Japón a finales de los 90 debido al consumo de brotes contaminados con
E. coli O157:H7, tal y como indica el trabajo de Taormina et al. (1999). El CDC
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(Center for Disease Control and Prevention) y la FDA impulsaron una serie de
recomendaciones que incluyeron la inclusión de compuestos antimicrobianos en el
medio de crecimiento y el agua de riego o el tratamiento con 20000 ppm de
hipoclorito cálcico para eliminar los patógenos. Sin embargo, Gandhi et al. (2001) y
Gandhi y Matthews (2003), demostraron, respectivamente, que estas medidas
resultaban ineficaces. En 1999, la FDA desarrolló guías reguladoras basadas en la
información científica disponible para controlar este problema, aunque los brotes de
semillas aún siguen representando un riesgo potencial sobre la alimentación.
Durante la recolección, tanto el material usado por los trabajadores como la
maquinaria empleada pueden favorecer la diseminación de patógenos desde pocos
productos contaminados a un conjunto más amplio si no se procede a la limpieza y
desinfección de estos recursos de trabajo. La desinfección alcanza una alta
importancia debido a que mediante el lavado sólo se alcanza a eliminar la suciedad
gruesa, reduciendo en poca medida la cantidad de microorganismos. La higiene de
los trabajadores también juega un papel crucial sobre la seguridad microbiológica de
las frutas y las verduras frescas. Un informe del Servicio Nacional de Estadísticas
Agrícolas del Departamento de Agricultura de Estados Unidos del 13 de junio de
2001 establece que, en Estados Unidos, el 90% de las granjas de cultivo de frutas y
verduras llevan a cabo la recolección de manera manual.
El agua utilizada en las instalaciones de procesado es, la mayoría de las veces,
tratada con desinfectantes, tal como indica el estudio anteriormente mecionado,
aunque esta acción tiene como objetivo principal controlar la carga microbiana del
agua en lugar de la propia de las frutas y las verduras. También se demostró que el
material de procesado se lava y desinfecta solo en el 50% de las ocasiones. Si entra
equipo contaminado con patógenos a un área de procesado constituye una fuente
potencial de contaminación. En instalaciones donde se procesan y cortan productos
frescos la desinfección en especialmente importante, tal y como establecen Allende
et al. (2004). Para controlar los patógenos en las plantas de procesado son
requeridas “unas buenas prácticas de elaboración, un sistema de desinfección y
desarrollar e implantar un sistema de análisis de peligros y de puntos de control
crítico (APPCC)”.
La preparación inadecuada de los alimentos o las prácticas higiénicas deficientes
pueden introducir patógenos en los productos. Muchas de las enfermedades
alimentarias derivadas de este problema no son registradas, tal y como ponen de
9
manifiesto Sivapalasingam et al. (2004). La preparación de otros alimentos, como
productos cárnicos o pescado contaminados puede dar lugar a la contaminación
cruzada de los productos vegetales debido a la falta de limpieza de los materiales
usados en su preparación o a la ausencia de prácticas higiénicas adecuadas. Para
minimizar el peligro microbiológico en estos casos es fundamental educar al
consumidor respecto a medidas efectivas de manipulación, almacenamiento y
preparación de frutas y verduras frescas. Las prácticas de manipulación deficientes
en las instalaciones de venta pueden anular las GAPs y los programas de APPCC.
Sagoo et al. (2003) realizaron el análisis microbiológico de alrededor de 3000
muestras de ensaladas procedentes de instalaciones de venta y determinaron que el
97% de ellas tenían una aceptable calidad microbiológica, sin encontrar en ellas
Salmonella, E. coli O157 o Campylobacter.
Respecto a la importación, el mayor país importador de frutas y verduras frescas es
Estados Unidos. Entre 1980 y 2001, Clemens (2004) establece que la importación
de frutas y verduras frescas aumentó un 155% y un 265%, respectivamente. Aunque
en el estudio realizado sobre los productos importados por la FDA entre 1999 y
2000, mencionado previamente, la tasa de contaminación fue baja, sigue
suponiendo un peligro sobre la salud humana. Hirotani et al. (2002) determinaron la
presencia de indicadores de contaminación fecal sobre muestras de verduras
frescas vendidas en Estados Unidos y en México, que resultaron positivas para la
presencia de colifagos, estreptococos fecales, coliformes totales y coliformes
fecales, aunque estuvieron presentes en menores niveles sobre las muestras
procedentes de Estados Unidos. Por tanto, es necesario vigilar mejor las prácticas
de trabajo de los países importadores.
Tal y como apuntaron Sivapalasingam et al. (2004) y el Servicio Nacional de
Estadísticas Agrícolas del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (2001),
entre 1973 y 1997 aumentaron los brotes alimentarios asociados a algún producto
en una proporción de 0,7% y 6%, respectivamente. Entre 1992 y 2000, los brotes
registrados en Inglaterra y Gales, asociados al consumo de frutas y verduras
frescas, alcanzaron niveles similares (5,5%) a los registrados en Estados Unidos
durante la década de los 90, según establecen Long et al. (2002). Como
consecuencia de 14 brotes alimentarios que surgieron entre 1996 y 2003, y que
provocaron alrededor de 859 casos de enfermedad (FDA, 2004), la FDA recomendó,
el mismo año, a las empresas que cultivan y procesan lechuga y tomates frescos,
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que tomaran medidas para asegurar la ausencia de patógenos. Los patógenos
asociados a lechuga fresca en esta fecha resultaron ser E.coli O157:H7, Cyclospora
y el virus de la hepatitis A. En tomates solo se encontró Salmonella.
Otro brote importante causó enfermedad en más de 10000 personas debido al
consumo de brotes de rábano contaminados con E.coli O157:H7. En Estados Unidos
se dio otro caso en el que 25000 personas se vieron afectadas por cantalupos
contaminados con Salmonella enterica serovar Chester. Dos ejemplos más de
brotes, uno causado en Estados Unidos en 1994 y otro que tuvo lugar en Dinamarca
en 1998, se atribuyeron a lechuga procedente de España y a maíz “baby”
importando desde Tailandia, ambos contaminados por Shigella sonnei. Long et al.
(2002) establecieron un brote de botulismo en Estados Unidos en 1987 tras el
consumo de ensaladas con col contaminada.
La mayoría de los brotes importantes han sido causados por bacterias patógenas
humanas, aunque existen casos en los que han sido otros microorganismos los
responsables de los brotes. En Estados Unidos y en Canadá muchos casos de
enfermedad se han relacionado con Cyclospora y, en Finlandia, entre 1996 y 1997,
los brotes de hepatitis A se relacionaron con ensaladas importadas y los brotes
debidos a calcivirus correspondieron al consumo de frambuesas contaminadas.
Entre las bacterias patógenas causantes de brotes alimentarios Salmonella ha
tenido gran importancia en relación al consumo de tomate. Fue responsable de 9
brotes entre 1990 y 2004. En 2004, tal y como ponen de manifiesto Cordy et al.
(2005) se detectaron otros 3 brotes en Estados Unidos y Canadá debidos al
consumo de tomates tipo Roma contaminados por 6 serotipos de Salmonella:
Javiana, Typhimurium, Anatum, Thompson, Muenchen y Braenderup. Salmonella ha
llegado a causar 561 brotes, afectando a 18 estados estadounidenses y a una
provincia canadiense. Hay poco conocimiento sobre los mecanismos de
contaminación del tomate o los métodos para eliminar posibles patógenos sobre
este producto, por lo que es difícil asegurar su calidad microbiológica (Solomon et
al., 2006).
E. coli O157:H7 estaba inicialmente relacionada con productos cárnicos pero, entre
1982 y 2002, se asoció con brotes relacionados con el consumo de frutas y verduras
frescas. Según Rangel et al. (2005) estos brotes están relacionados con las
prácticas domésticas y las llevadas a cabo en restaurantes y otros establecimientos.
También determinaron que, aproximadamente, el 47% de los brotes asociados a
11
restaurantes eran el resultado de una contaminación cruzada durante la preparación
de los productos vegetales frescos.
Shigella también ha provocado brotes alimentarios en relación a frutas y verduras
frescas. Tras la aparición de 45 casos de enfermedad alimentaria provocados por la
ingesta de zanahorias contaminadas en vuelos de una línea aérea, la FDA inició
una investigación en la que descubrió material sucio, exudados e insectos en el área
de preparación de los alimentos del proveedor que suministraba la comida a los
vuelos. Estos casos también pueden aparecer asociados a prácticas domésticas de
manipulación inadecuada de los productos vegetales.
En Estados Unidos y en otros países se lleva a cabo un análisis de los brotes de
enfermedades alimentarias relacionados con frutas y verduras a través de ensayos
rutinarios. La FDA, de esta forma, descubrió la contaminación con Salmonella de
tomates rojos tipo pera y pudo retirarlos. Otro ejemplo es la retirada de albahaca de
California después de que el ensayo rutinario del California Department of Health
Services revelase la presencia de Salmonella sobre el producto.
Existen muchísimos microorganismos potencialmente contaminantes de las frutas y
verduras frescas. Pascual (2000 a,b) describe la presencia de diversas bacterias
contaminantes incluyendo, además de E.coli y Salmonella, otras representantes de
la especie Enterobacteriaceae. También establece la posibilidad de encontrar formas
esporuladas de los géneros Bacillus y Clostridium. En frutos pueden hallarse
especies de los géneros Micrococcus, Streptococcus o Staphylococcus, así como
coliformes, bacterias esporuladas (Bacillus y Clostridium) o Pseudomonas.
A pesar de esto, no todas estas bacterias constituyen patógenos humanos
significativos asociados al consumo de estos productos.
Como conclusión, y debido a que las frutas y las verduras se consumen crudas,
debe mejorarse la vigilancia de las prácticas de manipulación y procesado y deben
implatarse GAPs y programas APPCC que contribuyan a minimizar los niveles de
posibles patógenos sobre estos productos. También es importante actuar a través
de la educación del consumidor para mejorar su actuación con respecto al
almacenamiento y manipulación de frutas y verduras. Un estudio de Pivarnik et al.
(2005) determinó que la mayoría de los consumidores de New England no pensaba
que las prácticas domésticas de manipulación estuvieran relacionadas con la
contaminación de frutas y verduras. Asumiendo que en otros países los
consumidores piensen de la misma manera, la acción educativa es crucial para
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disminuir los niveles de presencia de microorganismos patógenos sobre los
productos vegetales frescos.
Uno de los vegetales empleados en este estudio ha sido el rábano. Es de interés en
la alimentación gracias a su raíz gruesa y carnosa, que posee un alto contenido en
vitaminas y minerales (Ramírez y Pérez, 2006). Entre los patógenos asociados a
este alimento se encuentran Listeria monocytogenes y miembros de los géneros
Salmonella y Staphylococcus (Harris et al., 2007).
El pepino cuenta con unos altos valores de consumo por todo el mundo y es un fruto
carnoso, con pulpa abundante y alto contenido en agua. Se consume como producto
fresco e industrializado (InfoAgro: Pepino). Tal y como indican Harris et al. (2007) un
importante patógeno alimentario ligado al consumo de pepino fresco es Listeria
monocytogenes.
El tomate es la fruta fresca más consumida a nivel mundial, tanto como producto
crudo como procesado, siendo la pulpa su principal componente comercial. Existen
múltiples variedades de este alimento en relación a su forma, tamaño, color, sabor,
textura o dureza. El alto nivel de consumo de este vegetal se ha relacionado con
varios brotes de salmonelosis (Solomon et al., 2006). También se ha aislado Listeria
monocytogenes a partir de él (Harris et al., 2007).
De la cebolla puede consumirse tanto el bulbo fresco como la parte aérea. El
consumo del producto fresco se asocia con una disminución del riesgo de padecer
enfermedades cardiovasculares, ya que se relaciona con la reducción de lípidos,
colesterol y actividad antiplaquetaria en sangre. Un grupo muy importante de
patógenos humanos asociados al consumo de cebolla son las bacterias
pertenecientes al complejo Burkholderia cepacia, oportunistas en su mayoría, que
pueden infectar al bulbo a través de la tierra de cultivo contaminada o de la rizosfera
(Jacobs et al., 2008).
El consumo de pimiento se asocia a la reducción del riesgo de cáncer, gracias a un
potencial antioxidante debido a su alto contenido en vitamina C (CDC, 2002).
Atendiendo de nuevo a la publicación de Harris et al. (2007) algunos de los
patógenos alimentarios aislados a partir de este vegetal fresco son bacterias
pertenecientes a los géneros Aeromonas o Salmonella.
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3. OBJETIVOS
Los objetivos planteados en este trabajo fueron los siguientes:
1. Estimar la incidencia de contaminación microbiana en alimentos vegetales.
2. Analizar la presencia de distintos grupos bacterianos en verduras frescas.
3. Realizar un estudio comparativo de la presencia de microorganismos en
alimentos vegetales adquiridos en el mismo establecimiento en tres semanas
distintas.
4. Realizar una identificación preliminar de los microorganismos aislados de
alimentos vegetales.
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4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Alimentos
El estudio se ha centrado en 5 alimentos vegetales, que son: rábano, pepino,
tomate, cebolla y pimiento. Se obtuvieron en 3 compras distintas, correspondientes a
3 semanas distintas de trabajo en las que se realizaron los 3 ensayos comparativos.
4.2. Medios de cultivo Se han usado 2 medios generales (TSA y TSB) y 4 medios selectivos (MRSA,
MacConkey, KAA y Vogel-Johnson), todos ellos de Scharlab (Barcelona),
preparados según las instrucciones del fabricante. Tras pesado y disolución en agua
destilada, los medios se esterilizaron por autoclavado, se atemperaron a 50oC y se
vertieron en placas Petri a razón de 15 ml por placa.
4.2.1. TSA
Permite el crecimiento general de la mayoría de microorganismos cultivables,
aerobios, anaerobios, exigentes y no exigentes.
Typical formula g/l
Casein peptone 15,0
Soy peptone 5,0
Sodium chloride 5,0
Agar 15,0
Final pH 7,3 ± 0,2 at 25 ºC
4.2.2. TSB
Es un medio de cultivo general.
Typical formula g/l
Casein peptone 17,0
Soy peptone 3,0
Sodium chloride 5,0
15
Dipotassium phosphate 2,5
Dextrose 2,5
Final pH 7,3 ± 0,2 at 25 ºC
4.2.3. MacConkey
Usado para el crecimiento de bacilos Gram negativos.
Typical formula g/l
Peptones 20,000
Bile salts 1,500
Sodium chloride 5,000
Neutral red 0,030
Crystal violet 0,001
Agar 15,000
Final pH 7,2 ± 0,2 at 25 ºC
4.2.4. MRS agar
Usado para el crecimiento de bacilos Gram positivos y catalasa negativos.
Typical formula g/l
Peptone proteose 10,00
Meat extract 8,00
Yeast extract 4,00
D(+) - glucose 20,00
Sodium acetate 5,00
Triammonium citrate 2,00
Magnesium sulfate 0,20
Manganese sulfate 0,05
Dipotassium phosphate 2,00
Polysorbate 80 1,00
Agar 14,00
Final pH 6,2 ± 0,2 at 25 ºC
16
4.2.5. Vogel Johnson
Usado para la detección de estafilococos catalasa positivos.
Typical formula g/l
Casein peptone 10,000
Yeast extract 5,000
Mannitol 10,000
Dipotassium phosphate 5,000
Litium chloride 5,000
Glycine 10,000
Phenol red 0,025
Agar 15,000
Final pH 7,2 ± 0,2 at 25 ºC
4.2.6. KAA agar
Usado para aislamiento de enterococos.
Typical formula g/l
Tryptone 20,00
Yeast extract 5,00
Sodium chloride 5,00
Disodium citrate 1,00
Esculin 1,00
Ferric – ammonium citrate 0,50
Sodium azide 0,15
Kanamycin sulfate 0,02
Agar 10,00
Final pH 7,0 ± 0,2 at 25 ºC
4.3. Procesado de los alimentos
De cada alimento se obtuvieron 5 gramos iniciales que fueron añadidos a 5 ml de
solución salina estéril al 0,9%, para ser posteriormente procesados en un
homogeneizador (Stomacher® 80 Biomaster, Seward Ltd.).
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Se prepararon diluciones seriadas añadiendo 100 μl de muestra, suspensión madre
y primera dilución de la serie, sobre 0,9ml de solución salina estéril.
4.4. Recuentos bacterianos Se sembraron 100 μl de cada dilución, de la 0 hasta la -4, en placas de los medios
generales y 100 μl de las 2 primeras diluciones (0 y -1) en las placas de los medios
selectivos descritos.
Los recuentos se realizaron tras 24 y 48 horas de incubación a 37ºC, sumando las
colonias obtenidas en ambos tiempos para obtener los resultados finales.
4.5. Pruebas de identificación Se realizó una tinción de Gram a las colonias obtenidas en los diferentes medios
para determinar la morfología y el tipo de los microorganismos aislados.
Con ayuda de un asa de siembra se picaron colonias y se depositaron sobre una
gota de agua en un portaobjetos. A continuación, los microorganismos fueron fijados
con calor sosteniendo el portaobjetos sobre la llama de un mechero Bunsen. Sobre
la muestra se depositaron unas gotas de cristal violeta y se dejaron actuar durante 3
minutos, eliminándose después el exceso por decantación y añadiendo el mordiente
lugol durante 2 minutos. Después, se aplicó etanol al 70% durante 30 segundos, tras
los cuales, se añadieron unas gotas de safranina que se dejaron actuar 3 minutos.
Por último, se realizó el lavado suave de la muestra con agua destilada y, tras secar,
pudieron observarse los resultados.
La prueba de catalasa se realizó sobre colonias de las mismas características y
obtenidas de las mismas placas, fijando los microorganismos con calor y
depositando sobre ellos unas gotas de peróxido de hidrógeno (H2O2) a 10
volúmenes. La liberación de oxígeno indica la presencia de la enzima catalasa que
descompone el peróxido de hidrógeno y se considera prueba positiva.
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5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Recuentos
Vegetal Ensayo UFC/ml
Medio TSA Medio VJ Medio MRS Medio MC Medio KAA
Rábano
1 1,15 x 105 0 0 1,77 x 104 0
2 3,55 x 105 0 1,00 x 102 5,33 x 104 0
3 8,80 x 105 0 5,50 x 103 3,00 x 104 1,45 x 102
Pepino
1 1,29 x 103 0 1,00 x 102 4,55 x 102 0
2 1,50 x 102 0 0 2,29 x 103 0
3 3,00 x 105 2,65 x 102 0 3,00 x 105 0
Tomate
1 3,05 x 102 0 3,00 x 102 4,70 x 102 0
2 4,25 x 102 0 2,60 x 102 6,60 x 102 0
3 1,41 x 103 0 0 1,40 x 102 0
Cebolla
1 0 0 1,90 x 102 0 0
2 3,00 x 105 0 3,00 x 105 3,00 x 105 0
3 1,20 x 102 0 0 0 0
Pimiento
1 0 0 0 0 0
2 1,23 x 103 0 0 0 0
3 1,24 x 104 0 0 3,00 x 105 2,40 x 102
Tabla 1. Recuento microbianos expresados en unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro obtenidos en los vegetales en los tres ensayos realizados.
En la Tabla 1 se resumen los recuentos microbianos obtenidos en los tres lotes de
alimentos ensayados y para los medios empleados, tanto generales como
selectivos.
19
En rábano se obtuvieron recuentos similares en los tres lotes de alimentos en medio
TSA, medio no selectivo en que crecen diversos tipos de microorganismos. Los
recuentos fueron en todos los casos del orden de 105 UFC/ml.
Por el contrario, no se detectó crecimiento microbiano en medio Vogel Johnson (VJ),
selectivo para estafilococos, en ninguno de los lotes ensayados y tampoco se
detectó crecimiento en medio KAA para enterococos en los dos primeros ensayos
realizados, si bien en el tercero se detectaron 1,45 x 102 UFC/ml.
En medio MRS, en que crecen bacterias lácticas presentes de forma habitual en
diversos alimentos, los recuentos de muestras procedentes de rábano presentaron
valores crecientes, no detectándose crecimiento en el primer lote y pasando a un
orden de 102 y 103 UFC/ml en los sucesivos lotes ensayados, respectivamente.
En medio McConkey (MC), selectivo para enterobacterias, se detectaron recuentos
del orden de 104 UFC/ml en todos los ensayos realizados, no encontrándose
diferencias significativas entre los lotes analizados.
En las muestras de pepino analizadas no se detectó crecimiento en medio KAA en
ninguno de los lotes estudiados y sólo en el primer y tercer ensayo, respectivamente,
se observó crecimiento en los medios MRS y VJ, si bien en ambos casos fueron
recuentos bajos, del orden de 102 UFC/ml.
En medio TSA se obtuvieron recuentos del orden de 103, 102 y 105 UFC/ml en los
tres lotes analizados, respectivamente.
En medio McConkey se obtuvieron recuentos crecientes en los tres ensayos
realizados, oscilando entre los 102 y 105 UFC/ml.
En ninguna de las muestras de tomate analizadas se observó crecimiento en los
medios selectivos VJ ni KAA selectivos para estafilococos y enterococos
respectivamente.
En medio no selectivo TSA se obtuvieron los recuentos menores detectados en
todas las muestras de vegetales analizadas, no superándose el orden de 103
UFC/ml en ninguno de los lotes ensayados.
Tanto en medio MRS como McConkey, los recuentos fueron similares en los lotes
analizados y se mantuvieron del orden de 102 UFC/ml, a excepción del tercer lote de
tomate, en que no se detectó crecimiento en medio MRS.
En cuanto a las muestras de cebolla estudiadas, tampoco se obtuvo crecimiento en
los medios selectivos VJ y KAA, descartándose por tanto en principio la presencia de
estafilococos y enterococos en dichas muestras.
20
Cabe destacar el nulo crecimiento microbiano obtenido en el primer ensayo en
medio TSA, así como un bajo recuento, del orden de 102 UFC/ml en el tercer lote
analizado.
Destacan así mismo los altos recuentos detectados en el segundo ensayo, tanto en
medio TSA como en los medios MRS y McConkey, que en todos los casos fueron
del orden de 105 UFC/ml y muy superiores a los obtenidos en los otros dos lotes de
cebolla analizados.
En pimiento resulta característico el crecimiento nulo tanto en el medio TSA como en
los medios selectivos en el primer ensayo. Esta situación se mantiene en los tres
lotes analizados en los medios VJ y MC.
Se observó crecimiento en los ensayos segundo y tercero, obteniéndose recuentos
en medio TSA del orden de 103 y 104 UFC/ml, respectivamente, en el segundo y en
el tercer lote de pimiento.
Así mismo, se obtuvo un recuento bajo, de 2,40 x 102 UFC/ml, en el medio selectivo
KAA en el tercer lote. Es llamativo que, en este mismo lote, se obtenga un recuento
elevado en medio MC, del orden de 105 UFC/ml.
21
Figura 1. Resultados de crecimiento para los 3 ensayos en rábano.
Figura 2. Resultados de crecimiento para los 3 ensayos en pepino.
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
TSA VJ MRS MC KAA
UFC/ml V1: Rábano
ENSAYO 1
ENSAYO 2
ENSAYO 3
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
TSA VJ MRS MC KAA
UFC/ml V2: Pepino
ENSAYO 1
ENSAYO 2
ENSAYO 3
22
Figura 3. Resultados de crecimiento para los 3 ensayos en tomate.
Figura 4. Resultados de crecimiento para los 3 ensayos en cebolla.
1
10
100
1000
10000
TSA VJ MRS MC KAA
UFC/ml V3: Tomate
ENSAYO 1
ENSAYO 2
ENSAYO 3
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
TSA VJ MRS MC KAA
UFC/ml V4: Cebolla
ENSAYO 1
ENSAYO 2
ENSAYO 3
23
Figura 5. Resultados de crecimiento para los 3 ensayos en pimiento.
El menor crecimiento microbiano observado en los ensayos correspondientes a las
muestras de tomate (Figura 3) y pimiento (Figura 5) puede relacionarse con su pH
menor de 5, ya que es bien sabido que en alimentos con pH ácido se inhibe el
crecimiento bacteriano (Pascual, 2000b).
Los recuentos en pepino (Figura 2) y pimiento aumentan mucho en el tercer ensayo.
Lo mismo ocurre en cebolla (Figura 4) en el análisis del segundo lote.
Sólo se detectó un valor bajo de crecimiento en medio VJ, selectivo para
estafilococos, en el análisis del tercer lote de pepino, lo que permite descartar en
principio la presencia de estafilococos en los alimentos analizados.
Ningún alimento presenta crecimiento en medio MRS a lo largo de los tres ensayos.
Es nulo para pimiento y sólo se aíslan microorganismos en este medio en el análisis
del primer lote de pepino. En tomate y cebolla, sólo se obtiene crecimiento en los
ensayos primero y segundo. En las muestras de cebolla se registra una fuerte
subida del nivel de crecimiento en el segundo ensayo realizado. Para rábano, sólo
se obtiene crecimiento en este medio en el análisis de los lotes segundo y tercero.
En medio MC son significativos los altos niveles que se obtienen en pepino y
pimiento en el tercer ensayo y en cebolla en el segundo, mientras que en rábano y
tomate varían poco los recuentos obtenidos a lo largo de los tres ensayos.
Solamente se registra crecimiento en medio KAA en el análisis del tercer lote en
rábano y pimiento, siendo los recuentos obtenidos bajos.
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
TSA VJ MRS MC KAA
UFC/ml V5: Pimiento
ENSAYO 1
ENSAYO 2
ENSAYO 3
24
5.2. Identificación preliminar
Tinción de Gram
Vegetal Medio Morfología Tipo Prueba catalasa
RÁBANO TSA Bacilo Gram positivo
Positivo
MRS Bacilo Gram positivo
Negativo
MC Bacilo Gram negativo
Negativo
Bacilo Gram negativo
Positivo
KAA Coco Gram positivo
Negativo
PEPINO MRS Gram positivo
Negativo Bacilo
MC Gram negativo
Positivo Bacilo
Gram negativo
Negativo Bacilo
TOMATE TSA Bacilo Gram negativo
Positivo
MC Bacilo Gram negativo
Negativo
MRS Bacilo Gram positivo
Negativo
CEBOLLA MRS Bacilo Gram positivo
Negativo
MC Bacilo Gram negativo
Negativo
PIMIENTO TSA Bacilo Gram negativo
Positivo
KAA Coco Gram positivo
Negativo
Tabla 2. Resultados de las pruebas de identificación realizadas sobre colonias de los medios de cultivo.
En la Tabla 2 se recogen, para cada alimento y cada medio, el tipo de bacterias
presentes en función de su morfología y su tipo revelado tras una tinción de Gram y
su capacidad para producir la enzima catalasa. Las bacterias sobre las que se
25
aplicaron las pruebas de identificación fueron aisladas de colonias que crecieron
sobre los respectivos medios.
Así, sobre rábano, se detectaron bacilos Gram positivos y catalasa negativos en
medio MRS, donde crecen bacterias lácticas Gram positivas.
Las pruebas también revelaron la presencia de bacilos Gram negativos, tanto
catalasa negativos como positivos en medio MC, de donde se aíslan enterobacterias
con forma de bacilos o cocos y Gram negativas. Estas tinciones se realizaron a partir
de los dos tipos de colonias detectadas en este medio selectivo, con coloración
púrpura y rojiza.
En medio KAA se identificaron cocos Gram positivos catalasa negativos,
reconocidos como enterococos.
De igual manera, en pepino se obtienen bacilos Gram positivos catalasa negativos
sobre MRS y bacilos Gram negativos catalasa positivos y negativos en medio MC.
En tomate se detectaron bacilos Gram negativos catalasa negativos sobre medio
MC y bacilos Gram positivos catalasa negativos sobre medio MRS.
Las bacterias aisladas de cebolla se identificaron como bacilos Gram positivos
catalasa negativos en medio MRS y bacilos Gram negativos catalasa negativos en
medio MC.
En pimiento se reveló la presencia de enterococos Gram positivos catalasa
negativos procedentes de medio KAA.
En general los tipos morfológicos detectados son coherentes con las bacterias que
crecen en cada uno de los medios selectivos empleados en los ensayos.
26
6. CONCLUSIONES
A partir de los resultados obtenidos se pueden establecer las siguientes
conclusiones:
1. Se ha comprobado la presencia de distintos grupos bacterianos sobre los
vegetales analizados: rábano, pepino, tomate, cebolla y pimiento.
2. Se ha observado un cambio significativo en los recuentos microbianos de los
alimentos comprados en tres semanas distintas en el mismo establecimiento.
3. Los menores recuentos bacterianos se han detectado en tomate y pimiento,
pudiéndose justificar por los valores de pH inferiores inherentes a estos
alimentos.
4. Los microorganismos aislados sobre los medios selectivos y el medio general
han mostrado relación con los tipos bacterianos identificados mediante tinción
de Gram y prueba de la catalasa.
27
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