extraccion de melaza de caña como sustrato para la producción(acho sarzuri marisol)

7/23/2019 Extraccion de Melaza de Caña Como Sustrato Para La Producción(Acho Sarzuri Marisol)

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UNIVERSIDAD MAYOR

DE SAN ANDRES

FACULTAD DE

INGENIERIA

PROCESOS INDUSTRIALES II Página 0

EXTRACCION DE LA MELAZA DE CAÑA COMO

SUSTRATO PARA LA PRODUCCIÓN

NOMBRE: ACHO SARZURI MARISOL

C.I.: 8422341 LP

CARRERA: IGENIERIA INDUSTRIAL

DOCENTE ING. MARIO ZENTENO

LA PAZ – BOLIVIA

2015

PROCESOS



INTRODUCCIÓN

Desde hace algún tiempo, Colombia se ha caracterizado por las cosechas de

caña de azúcar a lo largo del año, lo que hace importante aprovechar al

máximo materias primas como la melaza para la producción de biomasa y

para la obtención de diferentes productos biotecnológicos por vas

fermentativas! "e prefiere el uso de melaza ya que esta presenta venta#as

económicas y nutricionales frente a otros medios de cultivo comerciales

como el caldo $%& '(xtracto de levadura, %eptona y &lucosa), el cual es

utilizado normalmente para la obtención de biomasa levaduriforme!

(n la actualidad se ha venido me#orando la salud nivelando la carga

microbiana intestinal mediante la inclusión de microorganismos vivos como

los probióticos, los cuales regulan la microflora intestinal, aumentan la

asimilación de los alimentos, reducen niveles de colesterol y estimulan el

desarrollo del sistema inmune entre otras caractersticas! (s por esta razón,

que especies de Saccharomyces han sido frecuentemente utilizadas en la

industria, por lo que la producción de biomasa a gran escala se convierte en

un factor primordial para el desarrollo biotecnológico del pas!(n Colombia, el uso de la melaza como sustrato para la producción de

Saccharomyces cerevisiae es una alternativa válida ya que reduce costos

para industrias nacionales y además evita el frecuente uso de productos

importados que incrementan costos en procesos biotecnológicos! (ste

proyecto se plantea en dos etapas! (n la primera, se evaluaron diferentes

concentraciones de melaza a nivel de erlenmeyer para obtener la mayor

cantidad de biomasa levaduriforme, realizando paralelamente un seguimiento

de la viabilidad y el consumo de sustrato!




2. MARCO TEÓRICO

2.1 CAÑA DE AZÚCAR

2.1.1 Características generales

*a Caña de +zúcar es una gramnea tropical, un pasto gigante emparentado

con el sorgo y el maz, en cuyo tallo se forma y acumula un #ugo rico en

sacarosa, compuesto que al ser extrado y cristalizado forma el azúcar!

orma espiguillas pequeñas agrupadas en rosetas y rodeadas por largas

fibras sedosas! "e conocen diversas variedades cultivadas que se

diferencian por el color y la altura de los tallos! (l tallo de la caña es el que

contiene el te#ido espon#oso y dulce del cual se extrae el azúcar '-C+, ./0.)!

2.2.2 S!"r#$ct#s2.2.2.1 Mieles

*a miel o tambi1n llamada melaza, es un lquido denso y viscoso de color

oscuro, es producto final de la fabricación o refinación de la sacarosa

procedente de la Caña de +zúcar! (ste subproducto se usa para alimentos

concentrados para animales y como suplemento alimenticio para el hombre!

'*eeson y "ummers, 2333)!

2.2.2.2 Cac%a&a

4esiduo que se elimina en el proceso de clarificación del #ugo de caña

durante la fabricación del azúcar! (s un material rico en fósforo, calcio,

nitrógeno y materia orgánica, pero pobre en potasio! "e usa principalmente

como abono, ya que me#ora algunas propiedades fsicas y ácidas del suelo,

aunque tambi1n se emplea en alimentación de ganado vacuno y en la

obtención de ceras y aceites '*eeson y "ummers, 2333)!

2.2.2.' (aga&# $e Ca)a

Desecho que queda despu1s de la molienda de la Caña de +zúcar! (stá

formado por un con#unto de partculas de diferentes tamaños cuyo promedio

oscila alrededor de 2 a 2!5mm el resto consta de sólidos solubles e

insolubles! (s utilizado normalmente como combustible en las calderas que




le dan energa a los ingenios '*eeson y "ummers, 2333)!

2.' ME*AZA DE CAÑA DE AZÚCAR

2.'.1 De+inici,n

*as melazas, mieles finales o melazas 6blac7strap8, suelen ser definidas, por muchos autores como los residuos de la cristalización final del azúcar de los

cuales no se puede obtener más azúcar por m1todos fsicos!

*a 9orma -C:9;(C 50< de .//=, define como miel final o melaza 'no

cristalizable) al #arabe o lquido denso y viscoso, separado de la misma masa

cocida final y de la cual no es posible cristalizar más azúcar por m1todos

usuales '-C:9;(C, .//=)!

*a denominación melaza se aplica al efluente final obtenido en la preparación

del azúcar mediante una cristalización repetida! (l proceso de evaporación y

cristalización es usualmente repetido tres veces hasta el punto en el cual el

zúcar invertido y la alta viscosidad de las melazas ya no permitan una

cristalización adicional de la sacarosa '">an y ?aralazos, .//3)!

*a melaza es una mezcla comple#a que contiene sacarosa, azúcar invertido,

sales y otros compuestos solubles en álcali que normalmente están

presentes en el #ugo de caña localizado, as como los formados durante el

proceso de manufactura del azúcar! +demás de la sacarosa, glucosa,

fructosa y rafinosa los cuales son fermentables, las melazas tambi1n

contienen sustancias reductoras no fermentables ';abla .)! (stos

compuestos no fermentables reductores del cobre, son principalmente

caramelos libres de nitrógeno producidos por el calentamiento requerido por el proceso y las melanoidinas que si contienen nitrógeno derivadas a partir

de productos de condensación de azúcar y aminocompuestos '@onig, ./<=)!




Ta!la 1. Composición de la melaza de caña de azúcar!

COM-ONENTES CONSTITUENTCONTENID

O /"0"

Componentesmayores

Aateria seca <0B%rotenas B

"acarosa 3 E B F +zúcares E 5 B F"ustanciasdisueltas = E 0 B F

+ ua .B&rasas 3 =3BCenizas /B

Contenido deminerales

Calcio 3 <=BAa nesio 3 5Bósforo 3 30B%otasio <B

Contenidodeaminoácido

&licina 3 .3B*eucina 3 3.B

*isina 3 3.B;reonina 3 3BGalina 3 32BColina 33 m9iacina =0 0 m

Contenido deGitaminas

+cido %antot1nico =2,/3 m%iridoxina == m4iboflavina = =3 m

;iamina 3 00 muenteH ;ellez, 233= I $epez, .//5!

2.'.2 -r#ces# $e O!tenci,n

*as melazas se obtienen como un subproducto final en la elaboración del

azúcar de caña! Jna breve reseña de los principales pasos del proceso, se

encuentran resumidos en la igura .!

"in entrar en mayores detalles, brevemente se explica en que consiste cada

uno de los pasos que llevan a la obtención de la melaza de caña de azúcar!

2.'.2.1 Alacenaient#

*a caña despu1s de ser cortada es llevada a patios de almacenamiento en el

ingenio! (ste almacenamiento no debe ser muy prolongado, puesto que los

efectos del sol disminuyen el rendimiento del #ugo, lo mismo que su calidadI




por este motivo, debe pasarse a la molienda en el menor tiempo posible

despu1s de haber sido cortadaI dentro de lo posible debe procurarse que

este tiempo no sobrepase las =0 horas para evitar p1rdidas '">an y

?aralazos,.//3)!

2.'.2.2 -re"araci,n 3 E4tracci,n $el 5g#

(stas dos operaciones se llevan a cabo en una forma continua, por lo cual

generalmente se conoce ba#o el nombre de 6(xtracción del #ugo8! (ste

proceso, se lleva a cabo en una serie de 6cuchillas desmenuzadoras y

molinos extractores8! *a caña es desmenuzada en preparación para la

molienda con cuchillas giratorias y desmenuzadoras para facilitar una me#or

extracción del #ugo ':spina y %alacios,.//=)!

*a caña desmenuzada pasa a los molinos donde se efectúa el proceso de

extracción del #ugoI luego, esta caña es rociada con agua y #ugos claros a

medida que sale de cada molino, en esta forma se diluye el azúcar que

queda en el bagazo a la salida de cada molino y se obtiene un mayor

rendimiento en la extracción! (n esta forma, se extrae mas del /3B delazúcar que hay en la caña, quedando una parte remanente en el bagazo, el

cual va a las calderas como combustible ':spina y %alacios,.//=)!

2.'.2.' Clari+icaci,n

(l #ugo es bombeado de los molinos a los clarificadores por medio de

bombas centrfugas hechas de materiales resistentes a la abrasión y a los

ácidos! *a clarificación se lleva a cabo por medio de cal y calor! *a acidez

del #ugo es neutralizada con cal y luego se eleva la temperatura hasta su

punto de ebullición! (l precipitado que se forma por acción de la cal y el

calor, se de#a sedimentar en los tanques clarificadores continuos y el #ugo

clarificado es decantado de la espuma, barro y desperdicios y es llevado a la

estación evaporadora ':spina y %alacios,.//=)!




2.'.2.6 E7a"#raci,n

(l #ugo clarificado pasa a un evaporador de efecto múltiple sin ningún

tratamiento previo! *os evaporadores consisten en una serie de techos de

vaco, de tal manera que se logre la ebullición a temperatura más ba#a

':spina y %alacios,.//=)!

.'.2.8 Cristali&aci,n

"e hace en tanques de vaco de efecto simple a presión reducida! (l #arabe o

las aguas madres de cristalizaciones anteriores 'melazas), se evaporan

hasta su saturación de azúcarI en este punto, los granos son separados de la

masa en ebullición y sirven como núcleo para la formación de cristales! (l

tanque es cargado a medida que el agua se evapora y su contenido de

azúcar es depositado sobre los cristales presentes sin la formación de

cristales adicionales! (n este punto, la mezcla de cristales y #arabe,

constituye una masa densa denominada 6;empla8 ':spina y %alacios,.//=)!

2.'.2.9 Centri+gaci,n

*a ;empla es derramada sobre un mezclador y de all pasa a centrfugas

verticales de alta velocidad! *os cristales de azúcar son retenidos en la

centrfuga y pueden ser lavados con agua si se desea! *as aguas madres

que se separan, se denominan melazas de primera! Completada la

centrifugación, se remueve el azúcar quedando la máquina lista para una

nueva carga ':spina y %alacios,.//=)!

(l azúcar obtenido pasa a los depósitos para su despacho, mientras que las

melazas se envan a un nuevo evaporador y de ah a la centrfuga 6K8, donde

se obtiene el azúcar y las melazas de segunda! (stas melazas se someten a

un proceso similar a los anteriores, obteni1ndose en esta oportunidad azúcar

de semilla y melazas finales! (stas melazas finales, han sido consideradasen los ingenios como producto sobrante y al cual son muy pocos los usos

que se le dan ':spina y %alacios,.//=)!




Caña de azúcar +lmacenamiento (xtracción del #ugo

(xtracción del azúcar Kagazo

Clarificación Combustible decaldera

Lugoclarificado

4esiduos deespuma, barroy desperdicios

Cristalización

%roducción de templa o 6mazacote8

Centrifugación

+zúcar Aelaza

:igra 1! %roceso de obtención de las melazas '+riza y&onzalez .//<)!

2.'.' Clasi+icaci,n

*a +sociación +mericana de Control :ficial de +limentos '++C:),

recomienda diferentes clasificaciones para las melazas, según el azúcar total

y el contenido de humedad, asH

M Aelaza "uperior Klac7strapH Aelaza de caña que contiene 2!=B de aguao menos, y 5!5B o más de azúcares totales!

M Aelaza Klac7strapH Aelaza compuesta por 2!5B a 2!=B de agua y

=0!5B a 5!5B de azúcares totales 'Castro, .//)!




:tra clasificación de las melazas, se da por el porcenta#e de materia sólida

en peso, o grados Krix, de la siguiente maneraH

M Aelaza Klac7strapH (s el subproducto de la elaboración del azúcar, cuyoporcenta#e de materia sólida en peso 'grados Krix), diluido con igual peso

de agua es de =2!5 grados Krix!

M Aelaza de Caña +limenticiaH (s la melaza blac7strap diluida con agua,

hasta una concentración en grados Krix, no menor de /!<5I a este

producto no se le ha especificado un valor de concentración de azúcares!

M Aelaza @igh ;est o Larabe -nvertidoH (s el producto obtenido por la

concentración del #ugo clarificado, hasta un porcenta#e de materia sólida

en peso de 05B e invertido con ácido o con invertasa 'Castro, .//)!

2.'.6 C#"#sici,n

*a composición de las melazas es muy heterog1nea y puede variar

considerablemente dependiendo de la variedad de caña de azúcar, suelo,

clima, perodo de cultivo, eficiencia de la operación de la fábrica, sistema de

ebullición del azúcar, tipo y capacidad de los evaporadores, entre otros! %or otro lado, la melaza de caña se caracteriza por tener grados Krix ó sólidos

disueltos de 0E <5B y un p@ de 5!3E !.B 'Castro, .//)!

2.'.6.1 A&;cares

*os principales azúcares en la melaza son la sacarosa '3B E B en peso),

la glucosa o dextrosa 'B E /B en peso), y la fructosa o levulosa '5B E .3B

en peso)I estas dos últimas constituyen la mayor porción de los azúcares

reductores encontrados en los análisis! *a fructosa puede sufrir

transformaciones al igual que la glucosa, debido a reacciones dependientes

de la temperatura! (l contenido de glucosa y fructosa en las melazas puede



variar a causa de la hidrólisis de la sacarosa, a valores de p@ ácido y a

temperaturas altas 'Castro, .//)!

2.'.6.2 N# a&;cares

*os no azúcares están compuestos por B de sustancias inorgánicasE E'eNNN, ?N, 9aN, Ca2N, Ag2N, On2N, +sN, Cd2N, @gN, %bN y ClE, 9: ,

":2 )I el

=2B corresponde a sustancias nitrogenadas 'aminoácidos, p1ptidos,

colorantes)I y el 25B a sustancias orgánicas libres de nitrógeno 'ácidos

carboxlicos, alcoholes, fenoles, 1steres, vitaminas, gomas y dextranos)

'Castro, .//)!

2.'.6.' Ceni&as

(n general la composición de las cenizas de las melazas, es cualitativamente

similar a la del #ugo, del cual se obtiene 1stas! Casi todos los análisis

publicados, muestran que el contenido de potasa vara alrededor de =3B del

peso del carbono total de la cenizaI el contenido de cal es de .3B al 23B, el

de sulfatos vara entre el .3B y el 23B, y las sales de magnesio, sodio,

aluminio, la slice, los cloruros, fosfatos y los óxidos de hierro, completan el

resto del contenido de cenizas 'Castro, .//)!

2.'.6.6 C#"est#s nitr#gena$#s

(stán constituidos principalmente por aminoácidos mono y dibásicos, amidas

ácidas, betanas y pequeñas cantidades de peptonas y nitratos! Cuando los

azúcares reductores, glucosa y fructosa, son sometidos a los procesos de

clarificación, en el tratamiento subsiguiente, se producen varias reacciones,

siendo la más importante la de los aminoácidos con estos azúcares, en la

cual se forman productos coloreados como las melanoidinas y los residuos



fermentables a los cuales se les ha encontrado un contenido aproximado de

0B de nitrógeno combinado, en melazas!

(l 9itrógeno total de las melazas, vara entre 3!=B y .!5B del peso total dela melaza! *a protena cruda frecuentemente se determina como porcenta#e

en peso del contenido de nitrógeno 'Castro, .//)!

2.'.6.8 <ci$#s

(l ácido acontico, es el más abundante de los ácidos orgánicos presentes en

la caña que se acumula en las melazas, representando aproximadamente elB del peso de sólidos en la melaza! *os ácidos málico y ctrico están

presentes en cantidades apreciables en las melazas! (l ácido órmico está

presente como producto de descomposiciónI la mayora de estos ácidos son

metabolizados por los microorganismos, como fuente de carbono y no

presentan problemas de inhibición de crecimiento 'Castro, .//)!

2.'.6.9 =itainas

+quellas vitaminas resistentes a la acción del calor y de los álcalis, aparecen

encontradas en las melazas! *a niacina, ácido pantot1nico y riboflavina,

importantes para el crecimiento microbiano, pueden estar presentes en

cantidades significativas y otras vitaminas lo están en cantidades muy

pequeñas 'Castro, .//)!

2.'.6.> :en#les 3 C#"est#s 7#l?tiles*os fenoles presentes en las mieles finales, provienen de la parte fibrosa de

la caña, 1stos se derivan de los ácidos hidroxicinámico y

parahidroxibenzóicos necesario tener en cuenta, que desde el punto

de vista de la fermentación, algunos fenoles son indeseables, por

presentar actividad inhibitoria sobre el crecimiento de los microorganismos,



a concentraciones de

3!5gF*! *os ácidos fenólicos que mayor actividad bacteriostática han

demostrado son el clorag1nico, el pEcumárico y el telúricoI estos dos últimos

son capaces de inhibir totalmente el crecimiento de algunas bacterias

'Castro, .//)!

2.'.8 =al#r ntrici#nal

+unque hay muchos reportes sobre el valor nutritivo de las melazas, como

ingredientes de las raciones para rumiante, parece haber poca concordancia

entre los resultados obtenidos por los diversos investigadores! +unque

algunos de ellos llegan a la conclusión de que el valor nutritivo de las

melazas es equivalente aproximadamente al 05B del maz en grano

';ocagni, ./0.)!

Cuando las melazas son suministradas como alimento a novillos de engorde

en proporción del .3B, 1stas suministran una energa neta relativamente alta

'(9)! "in embargo, cuando el nivel es incrementado a 25 y =3B, la (9 se

reduce en casi .33B ':lsen y +llermann, .//.)!

*a melaza es portadora de energa de fácil aprovechamiento por el animal, la

cual representa del <3 al <5B del valor energ1tico del maz ':lsen y

+llermann, .//.)!



2.'.9 -r#"ie$a$es +isic#@íicas

2.'.9.1 =isc#si$a$

*as relaciones entre concentración y viscosidad para soluciones de azúcar

pura son igualmente válidas para las melazas! *a viscosidad de las

soluciones saturadas de azúcar impuro, aumenta rápidamente con el

contenido de impurezas debido al incremento de la concentración de sólidos!

(l efecto de las sales minerales sobre la viscosidad de las soluciones de

azúcar es variable! Jn enriquecimiento de iones Ca2N aumenta la

viscosidad, mientras que un incremento de iones ?N, la disminuye '">an y

?aralazos,

.//3)!

*os compuestos orgánicos no azúcares, tienen un profundo efecto sobre la

viscosidad, pues los componentes de alto peso molecular pueden

incrementarla considerablemente '">an y ?aralazos, .//3)!

*a aireación influye marcadamente sobre la viscosidad aparente de las

soluciones de azúcar, y si se disminuye el contenido de aire en las melazas,

disminuye la viscosidad '">an y ?aralazos, .//3)!

(l efecto de las variaciones del p@ sobre la viscosidad de las soluciones de

azúcar es insignificante, excepto cuando el p@ es superior a ..I en este

caso, la viscosidad aumenta! (l efecto de la concentración y la temperatura

sobre la viscosidad de las melazas, tiene importancia práctica en la cantidadde melaza que fluye por las tuberas y bombas, as como la descarga por

gravedad natural, o el desplazamiento por fuerza centrfuga! "i se considera

que la viscosidad de las melazas decrece a una temperatura dada, con una

disminución de la concentración, y tambi1n cuando la concentración es

constante y la temperatura aumenta '">an y ?aralazos, .//3)!



*a región de viscosidad crtica en la melaza de caña, está en un intervalo de

concentraciones en grados Krix entre 0. y 05! (sto significa que un aumento

de solo algunas d1cimas en el valor de la concentración, determina un

incremento notable en la viscosidad '">an y ?aralazos, .//3)!

2.'.9.2 "

*as melazas de caña son ligeramente ácidas, tienen un p@ entre 5!5 y !5I

un p@ ba#o es atribuible a la presencia de ácidos alifáticos y al ba#o p@ de la

clarificación, si es ácida '">an y ?aralazos, .//3)!

(l p@ de las melazas cambia con la temperatura y depende tambi1n de la

naturaleza y de la cantidad de material estabilizador del p@ que posea '">an

y ?aralazos, .//3)!

*a acción estabilizadora del p@ tiene efecto sobre la melaza para resistir la

adición de ácidos o álcalis, sin cambiar su naturaleza ácida o básica! (n la

melaza la acción estabilizadora depende del contenido de no azúcares y de

las caractersticas de la melaza '">an y ?aralazos, .//3)!

*a estabilización del p@ en las melazas de caña tiene un patrón uniforme, es

decir, no existen variaciones irregulares debidas a relaciones de cambio de

peso entre las sustancias que intervienen, por lo tanto la actividad

estabilizadora se modifica '">an y ?aralazos, .//3)!

2.'.9.' Cal#r es"ecí+ic# 3 C#n$cti7i$a$ TBrica

(n las soluciones de azúcar, el calor especfico depende de la temperatura,

de la concentración y de la composición! "e ha comprobado, que el calor

especfico disminuye al aumentar la concentración de las soluciones impuras

de azúcarI es necesario, conocer el calor especfico de las melazas para



calcular la transferencia de calor durante el calentamiento o enfriamiento

'">an y ?aralazos, .//3)!

2.'.9.6 Densi$a$

(n la práctica, la densidad se determina mediante equivalencia con la

concentración en grados Krix! +demás, para su determinación se usan tres

instrumentos densim1tricosH el hidrómetro, la balanza de Pestphal y el

picnómetro, de los cuales el primero es el más utilizado '">an y ?aralazos,

.//3)!

2.'.> Micr##rganis#s $e la ela&a

Aediante ensayos adecuados con soluciones diluidas de melazas, se ha

demostrado que 1stas, a pesar de su ba#o contenido de fósforo, constituyen

un buen medio nutritivo para muchos microorganismos, tales como

levaduras, hongos y bacterias '+riza y &onzález, .//<)!

"e considera importante la presencia de microorganismos mesófilos ytermófilos dentro de la melaza! *os organismos mesófilos se desarrollan bien

durante la dilución de las melazas '+riza y &onzález, .//<)!

2.'. A"r#7ec%aient# $e la ela&a

*a melaza ha sido suministrada al ganado de carne y de leche por muchos

años, principalmente como aditivo para incrementar la gustosidad o facilitar la

reducción a comprimidos de las raciones convencionales mezclados en seco!

;ambi1n ha sido utilizada como vehculo en varios tipos de alimentos

lquidosI como suplemento para el ganado en pastoreo solo o adicionado con

otros componentes como urea y ácido fosfórico! -gualmente ha sido común

como ingrediente alimenticio para pollos y cerdos, en donde constituye un



subproducto de primer orden para su alimentación, ya que puede ser

utilizada a niveles hasta de =3B, logrando alimentación adecuada en los

animales '+riza y &onzález, .//<)!

%or otro lado, se usa como fertilizante para suelos, mezclada con bagazo y

otros componentes, en casos especiales de abundancia! ;ambi1n es

frecuentemente utilizada como combustible, para la preparación de

pavimentos! *os diferentes usos de la melaza se resumen en la ;abla 2!

Ta!la 2. +provechamiento de la melaza de caña

UTI*IZACIÓN ENERA*IDADES +limentos +limentación rica

+nimales

+limentación menos ricaHdesecados sobre pulpas,mezcla con diversos

4ecuperación delquidosdesazucarados

Ginazas para la obtención de ácidoglutámico!

*e#as finales como alimento

ermentación

*evaduras para panificación!

*evaduras para alimentaciónhumana y animalH aditivo para

piensos, extractos e hidrolizadosde levadura, fuente de enzimas,vitaminas y ácidos nucl1icos!

+demás es el sustrato utilizadoen la producción de protenaunicelular!

&rasas de

uenteH '+riza y &onzález, .//<)



2.'. Alacenaient# $e la ela&a

*os principales cambios notados durante el almacenamiento sonH p1rdida de

sacarosa, ganancia de azúcares reductores, incremento del porcenta#e de

compuestos orgánicos no azúcares, p1rdida de sólidos totales, y gran

incremento de color '@onig, ./<=)!

*a descomposición se atribuye principalmente a la reacción de las sustancias

orgánicas inestables, con los azúcares reductores, formándose impurezas

coloidales coloreadas, con alto contenido de carbono! (stos productos llegan

a contener entre un .5 y 53B del nitrógeno total de la melaza, en forma no

asimilables por los microorganismos '@onig, ./<=)!

%ara reducir la probabilidad de cambios qumicos originados por las altas

temperaturas 'climas tropicales), la

melaza reci1n centrifugada debe

enfriarse, a la menor temperatura posible, antes de ser almacenada! *a

cantidad de melaza almacenada y la duración del perodode

almacenamiento, son factores que deben considerarse en las medidas de

seguridad '@onig, ./<=)!

*a p1rdida de sacarosa, azúcares reductores y azúcares totales está

acompañada de un aumento de las sustancias reductoras no fermentables!

9ormalmente, el aumento de 1stas últimas, es más rápido durante los tres

primeros meses de almacenamiento! *a formación de estos productos va

acompañada de desprendimiento de anhdrido carbónico y además está en

relación inversa con la magnitud de la temperatura de almacenamiento

'@onig, ./<=)!



(s necesaria la limpieza periódica de los tanques de almacenamiento, ya que

los sólidos sedimentables se adhieren y se compactan con facilidad,

principalmente en el fondo, siendo necesario removerlos con elementos

cortantes '@onig, ./<=)!

2.' Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae es la especie de levaduras utilizada por

excelencia para la obtención de etanol a nivel industrial debido a que es un

microorganismo de fácil manipulación y recuperación, no es exigente en

cuanto a su cultivo, no presenta alto costo, tolera altas concentraciones de

etanol, en la fermentación produce ba#os niveles de subproductos, es

osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones de azúcares, presenta

alta viabilidad celular para el reciclado y caractersticas de floculación y

sedimentación para el procesamiento posterior 'Carballo, 2333)!

*a

clasificación taxonómica de la levadura se observa en la ;abla !

Ta!la '. Clasificación ;axonómica de Saccharomyces cerevisiae.

4eino @on oDivisión Amasto om cotaClase Ascom cetes"ubclase Hemiascom cetid :rden Endom cetalesamilia Sacchaom cetac "ubfamilia Saccharom cetai &1nero Saccharom ces

(s ecie CerevisiaeuenteH 'Carballo,

2333)!

*as levaduras, son organismos eucarióticos unicelulares, por lo tanto sus

estructuras se encuentran formadas por pared celular, núcleo diferenciado y

organelos como ribosomas y mitocondriasI la formación de una cápsula de

polisacaridos, la ausencia o presencia de vacuolas y el desarrollo de las

mitocondrias dependen de las condiciones fisicoqumicas y de la edad del



cultivo ';uite y :liver .//.)! *as caractersiticas generales de las levaduras

se resumen en la ;abla 9o! =!

Ta!la 6. Caractersticas generales de las levaduras

CARACTERISTIC *E=ADURA

Dimensiones= E 0

;iempo deduplicación . E

%h ran o ó timo=,5 E 5,5

9itró eno B<,5 E 0,5

%rotena B5 E =5

+cidos nucleicos E .2

Carbohidratos B3 E =5

uenteH :spina y %alacios, .//=!

Saccharomyces cerevisiae es una levadura cuya colonia es de color crema o

blanco, apariencia húmeda y brillante, de bordes irregulares 'igura 2)! *a

temperatura óptima de crecimiento es de 25 a 3QC! %uede producir

ascosporas cuando hay requerimientos nutricionales adecuados!

:igra 2. Gista macroscópica de Saccharomyces cerevisiaeen medio $%& uenteH Aanual de Aedios deCultivo! Aer7! 2333!



"us dimensiones sonH 2!5 R .3 micras de ancho y =!5 R 2. micras de largo!

Aicroscópicamente se observan redondas y ovoides, elipsoides, a veces

cilndricas y filamentosas! ermenta glucosa, galactosa, sacarosa y maltosa y

no fermenta lactosa! +simila galactosa, sacarosa, maltosa y rafinosa! *aaireación óptima es de 3! R 3!/ vvm '+riza y &onzález, .//<)!

(l nombre de Saccharomyces significa azúcar de hongos! %roducen una

fermentación vigorosa y es conocida como la levadura de la cerveza, sirve

como fuente de enzimas 'invertasa), como extracto de levadura autolisado

para sustituir los sabores naturales del extracto de carne, hace fermentar la

masa del pan, interviene en la fabricación del vino y como fuente de protena,

vacunas, ácidos grasos y aceites '+riza y &onzález, .//<)!

Saccharomyces pertenece al g1nero de las levaduras de la familia

SaccharomycetaceaeI las c1lulas son esferoidales, elipsoidales o cilndricas

'igura )H *a reproducción vegetativa ocurre por mecanismos multilateralesH

los pseudomicelios pueden ser formados por algunas especies, pero

presenta ausencia de hifas verdaderas! (n presencia del 32 las

cepas pueden metabolizar oxidativamente sustratos como glicerol, etanol y

lactato '$epez, .//5)!

:igra '! Gista Aicroscópica de Saccharomycescerevisiae

'httpHFF>>>!nEt!ruFtpFnrFm7Sp32!#pg)!



Saccharomyces cerevisiae y otras especies de levaduras en general, realizan

fermentación alcohólica, en la cual el etanol es formado a partir de la DE

glucosaI 1ste azúcar es convertido en piruvato por la va de (mbdenE

Aeyerhof %arnas en la cual el piruvato es descarboxilado a acetaldehdo por la piruvato descarboxilasa y la tiamina pirofosfato y el acetaldehdo reducido

finalmente a etanol '@alasz y *aszlity, .//.)!

2.'.1 Re@eriient#s ntrici#nales

Saccharomyces cerevisiae requiere ciertos nutrientes y condiciones

ambientales para su apropiado crecimiento y

reproducción! +lgunos

elementos son básicamente necesarios como por e#emplo carbono,

hidrógeno, oxgeno, nitrógeno y fósforo ':spina y %alacios, .//=)!

(l carbono sirve como fuente de energa y como material constitutivo de la

masa celular! (l nitrógeno se encuentra en la c1lula formando parte esencial

de las protenas, aminoácidos y ácidos nucleicosI el fósforo se encuentra en

los ácidos nucleicos, en la lecitina y en diversos compuestos fosforilados que

participan activamente en los procesos de degradación oxidativa y de

intercambio energ1tico '+;%, +D%, +A%, 9+D%)! %ara que las fuentes de

9itrógeno, ósforo y Carbono presentes en el sustrato sean aprovechados

por la levadura se requiere que se encuentren en forma asimilable ':spina y

%alacios, .//=)!

2.'.2 Re@eriient#s +ísic#F@íic#s

(l crecimiento de S. cerevisiae se ve favorecido por un p@ próximo a =!3 R

5!3 y no se desarrollan bien en medio alcalino a menos que se hayan

adaptado al mismo! + pesar de la tolerancia bastante amplia de esta

levadura para las variaciones de p@ a partir de los sustratos habitualmente



usados en los medios de cultivo forman productos en especial ácidos que

influyen en el crecimiento celular, producción enzimática y utilización de

glucosa! +s por e#emplo, algunas investigaciones han observado que con un

p@ inicial del medio a valores entre =!3 y =!5 se obtiene me#or crecimiento yutilización de glucosa, mientras que la máxima producción de enzima se

observa a un p@ de !3 ';uite y :liver, .//.)!

2.'.' C#"#sici,n @íica

*as levaduras contienen un <5B de agua y un 25B de materia seca

aproximadamente! *a composición de la materia seca de la levadura se

presenta en la ;abla 5!

Ta!la 8! Composición qumica de las levaduras!

COM-ONENT -ORCENTA5E

Ceniza <

Carbohidrato =

%rotena =0

&ras 2

uenteH @aehn,.//.!

*as sustancias minerales de las levaduras representan por lo general un 5 R

/B del peso seco! *os componentes principales son ácido fosfórico,

alrededor del 53B y potasio del 3B '@aehn, .//.)!

*as sustancias nitrogenadas de la levadura representan unas dos terceras

partes de su peso seco '3 R <5B), contienen entre 5 y .2B de 9itrógeno

'Castellanos, .//.)! (stas sustancias se reparten en un =B de protena,

.3B de peptonas y aminoácidos, 0B de amonio, .3B de purina y el resto

consiste en pirimidinas y vitaminas! (l contenido normal de aminoácidos



depende de la alimentación, de la cantidad de oxgeno, de la temperatura del

cultivo, etc! ';uite y :liver, .//.)!

2.6 -ROCESO DE :ERMENTACIÓN

2.6.1 :erentaci,n a escala in$strial

+ trav1s del tiempo se han introducido diferentes modelos de fermentación

tales como los sistemas discontinuos y sistemas continuos!

*a mayora de las fermentaciones son procesos discontinuos, cuya cin1ticapropia permite que los equipos sean operados en intervalos! +l final de dicho

tiempo, se procede a la recuperación de la levadura por centrifugación! (s un

sistema que presenta facilidad en sus operaciones, ya que disminuye los

requerimientos para obtener su completa esterilización, evitando as, el

riesgo de p1rdidas financieras y facilitando el mane#o de materias primas!

Como desventa#a de este sistema, se muestra la decreciente productividad

en la fermentación debido al largo tiempo de rotación y retraso en el

crecimiento inicial 'Tuintero, ./0.)!

2.6.2 :erentaci,n $isc#ntina

*lamados tambi1n procesos en 6Katch8 o lote, son de gran importancia

comercial para su amplio uso! *as t1cnicas de instalación de los cultivos

discontinuos, van a depender de si el proceso es aerobio o anaerobio 'Doran,

.//0)!

Jna fermentación discontinua 6Katch8 puede considerarse como un 6sistema

cerrado8! + tiempo cero 't3), la solución esterilizada de nutrientes se

inocula con microorganismos y se permite que se lleve a cabo la

incubación en



condiciones óptimas de fermentación! + lo largo de toda la fermentación no

se adiciona nada, excepto oxgeno 'en forma de aire), un agente

antiespumante y ácidos o bases para controlar el p@! *a composición del

medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración demetabolitos, cambia generalmente en forma continua como resultado del

metabolismo de las c1lulas 'Doran, .//0)!

2.6.2.1 C#n$ici#nes @e $e!en e$irse 3 c#ntr#larse $rante na

+erentaci,n $isc#ntina

Jna vez que un microorganismo y un sustrato han sido seleccionados es

necesario encontrar las condiciones de operación más adecuadas y que

optimicen el sistema! Desde el punto de vista de la operación es muy

importante decidir las siguientes variablesH temperatura, p@ y productividad

entre otras! Jnas de estas variables se miden de manera continua, mientras

que otras se miden a intervalos de tiempo! *as variables que se deben medir

continuamente sonH temperatura, p@, aireación, adición de nutrientes, y las

variables mediadas de manera intermitente sonH biomasa, producto y

consumo de sustrato 'Tuintero, ./0.)!

2.6.2.1.1 Te"eratra

*a temperatura óptima de crecimiento de las levaduras especialmente de

Saccharomyces cerevisiae es de 3 a 5QC! *a temperatura afecta el

crecimiento de manera notable, principalmente porque los microorganismos

de una especie dada solo pueden crecer en un rango restringido detemperaturas, esto afecta de manera importante el crecimiento microbiano

'Tuintero, ./0.)!



2.6.2.1.2 "

(l p@ es la medida de la concentración de iones hidrógeno y tiene un

marcado efecto en la velocidad de crecimiento y el rendimiento! ;ambi1n elp@ es óptimo para algunas especies como la de las levaduras que

comprende un rango de =!3 a !3! Jn cambio en el valor de p@ del medio

puede afectar su composición y la naturaleza de la superficie microbiana al

disociarse ácidos y bases! (ste último, puede afectar la floculación de la

biomasa o su adhesión al vidrio! (l p@ tiene una gran influencia en los

productos finales del metabolismo anaeróbico 'Tuintero, ./0.)!

2.6.2.1.' Ntrientes

Jn medio de cultivo debe tener todos los elementos necesarios para el

crecimiento microbiano, pero es conveniente señalar que las relaciones entre

ciertos elementos son de particular importancia! "egún investigaciones

realizadas, se ha encontrado que en un cultivo para levaduras en melazas la

relación carbonoFnitrógeno debe ser .H. para que la productividad celular sea

máxima! ;ambi1n la relación fósforoFoxgeno es relevante en lo que refiere a

la eficiencia de conversión energ1tica y a la respiración 'Tuintero, ./0.)!

2.6.2.1.6 Aireaci,n

*a ausencia o abundancia de oxgeno permite una selección tanto de

microorganismos como de productos del metabolismo! Cuando el cultivo se

produce en presencia de oxgeno molecular, la fermentación se denomina

aeróbica y cuando 1ste carece de oxgeno anaeróbica! "i la fermentación es

anaeróbica, la mayor parte del carbono se emplea como energa y sólo el 2B

se asimila como material celular! Saccharomyces cerevisiae es una levadura

que posee alta actividad metabólica, por lo que en un proceso fermentativo



en fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y en fase

anaerobia generalmente por la producción de etanol ':>en, .//.)!

2.6.2.1.8 -r#$cti7i$a$

*a productividad se define como la producción de biomasa por unidad de

volumen, por unidad de tiempo del cultivo, dado en concentración de

biomasa 'gF*) en función del tiempo 'h)! (sta depende del diseño del

fermentador, ya que afecta la transferencia de oxgeno que se ve refle#ada en

el rendimiento obtenido al final de la fermentación 'Tuintero, ./0.)! Jn

microorganismo adecuado para su utilización industrial debe producir la

sustancia de inter1s, pero hay muchos otros aspectos a considerar! (s

preciso disponer del organismo en cultivo ax1nico 'puro), debe ser

gen1ticamente estable, y debe crecer en cultivo a gran escala '"tanbury et

al., .//5)!

2.6.2.2 Mecanis# $e trans+#raci,n $e a&;car en !i#asa

*a levadura obtiene la energa a trav1s de dos tipos de metabolismoH.! +similació n H (n el cual la levadura toma las sustancias nutritivas que

necesita del medio en que se desarrolla!

2! DesasimilaciónH (n el cual, se degradan los hidratos de carbono

incorporados a la c1lula 'Lorgensen, .//3)!

"e distinguen dos formas de desasimilación, la respiración y la fermentación!

*a primera se define como un proceso metabólico que conduce a una

oxidación total de los hidratos de carbono incorporados ba#o formación de

dióxido de carbono, agua y energa, generando biomasa '(cuación .)! (sta

va se presenta como ruta catabólica de glucosaI la mayora de las c1lulas

que convierten glucosa en piruvato pasan al ciclo del ácido tricarboxlico,



donde se convierte en dióxido de carbono y agua! *o anterior se presenta en

la siguiente ecuación 'Lorgensen, .//3)H

(cuación .H

[email protected]: N :2 C:2 N @2: N ?Cal

2.8 THCNICAS MHTODOS UTI*IZADOS

2.8.1 TBcnica $e i$r,lisis $e la sacar#sa

*a sacarosa es un disacárido que no posee carbonos anom1ricos libres por

lo que carece de poder reductor! Dado que es común utilizar este azúcar en

procesos fermentativos su determinación por el m1todo de D9" requiere de

hidrólisis ácida '@Cl) ó enzimática para la obtención de glucosa y fructosa

que son azúcares reductores! (ste proceso se denomina inversión de la

sacarosa y se puede observar en la siguiente ecuación '&odoy, 2332)H

(cuación 2H

"acarosa N @2: &lucosa N ructosa

2.8.2 TBcnica $el <ci$# '8F$initr#salicílic# /DNS

(s una t1cnica de oxidoEreducción que se basa en la capacidad de la

glucosa para reducir el ácido ,5Edinitrosaliclico ba#o determinadas

condicionesI esta reducción produce una coloración que se hace más

intensa a medida que aumenta la concentración de azúcares reductores! "e



evidencia por medio de la lectura de la absorbancia en espectofotómetro, lo

que conlleva a la aplicación de la *ey de KeerE *ambert 'Ailler, ./5/)!

(l fundamento de esta t1cnica consiste en la oxidación de la glucosa, sin

embargo, la glucosa en solución acuosa se encuentra en su forma cclica

que es muy estable y por lo tanto, no reacciona! %or esta razón, es

necesario calentar la muestra para que el anillo se abra de#ando expuesto el

aldehdo dando lugar a una reacción de oxidación como se observa en la

igura = '4outh et al., .//3)!

Calor

&lucosa &rupo aldehdo libre

:igra 6. (structura del anillo antes y despu1s de ser sometido aun proceso de calentamiento'httpHFF>>>!infoag r o!c o mFviticul turaFvi n oFanal is isSvinos5! a s p )!

%ara que se de la reacción tambi1n es necesario proporcionar un medio

alcalinoI esto es posible gracias a la adición de 9a:@ el cual es una base

fuerte! (n solución acuosa se ioniza liberando 9aN y :@E al medio, el cual

se alcaliniza, permitiendo la oxidación de la glucosaI en esta oxidación,

el carbono del grupo aldehdo se convierte en un ácido carboxlico por

la p1rdida de hidrógenos y la ganancia de oxgeno, obteni1ndose de

esta forma el ácido glucónicoI por otro lado, el ácido ,5

dinitrosaliclico es reducido gracias a la acción del tartrato de sodio y

potasio y de la oxidaciónde la &lucosa! (l ácido pierde una de sus configuraciones ó 5,

principalmente la por ser más reactiva, quedando ácido EaminoE5E

nitrosaliclico el cual produce una coloración amarilla 'igura 5)! *a

http://www.infoagro.com/viticultura/vino/analisis_vinos5.asp








coloración es proporcional a la concentración de glucosa '4outh et al.,

.//3)!

+cido ,5E dinitrosaliclico &lucosa +cido EaminoE5Enitrosaliclico +cido

glucónico

:igra 8. 4eacción del Ucido ,5Edinitrosaliclico

'httpHFF>>>!i n foagro !comFv iticulturaFvino Fanal is isSvin o s 5! a s p )!

*uego se frena la reacción con hielo haciendo que la mol1cula de glucosa se

cierre y adquiera de nuevo su configuración piranosa '4outh et al., .//3)!

2.8.' MBt#$# Ec#Btric#

(l A1todo (com1trico es una t1cnica sencilla en la cual se siembran por

estra de modo secuencial inóculos de prueba, que producen unidades

formadoras de colonia 'JC) siempre decrecientes! (sta t1cnica valora tanto

la sensibilidad de los medios a la colonización por los microorganismos

buscados como tambi1n la resistencia a la colonización por las cepas que

interfieren 'Aosell, 233)!

(n este m1todo, el comportamiento de un medio determinado se valorainoculando seis placas! ;res de ellas se siembran por estra con la cepa de

prueba, la cual es de esperar que crezca en el medio y forme colonias! *as

otras tres placas se siembran con el microorganismo interferente, por lo

tanto, se espera que no se presente crecimiento en el medio a evaluar! *as










placas testigo o control se siembran de modo similar y deben permitir el

crecimiento de ambos grupos de microorganismos! -dealmente las placas

control deben tener la misma composición que el medio prueba, pero sin

incorporar agentes selectivos 'Aosell, 233)!

Jn parámetro útil para interpretar los resultados ecom1tricos es el ndice de

crecimiento absoluto '-C+)! (ste ndice denota el último sector de la placa en

el que ha habido un crecimiento significativo! %ara evaluar el ndice de

crecimiento absoluto '-C+) para el microorganismo de prueba, se efectúan

las lecturas de las ca#as despu1s de la incubación teniendo en cuenta que

cada estra tiene un valor de 3!2 y la central de .!3! %osteriormente, se

verifica en cuales estras se observa el crecimiento y se multiplica por el valor

correspondiente para cada estra! "i se observa crecimiento en las cinco

estras de cada cuadrante y en la central, el -C+ es igual a 5! (l -C+ debe ser

evaluado para el medio de prueba con el microorganismo de prueba y para el

medio de prueba con el microorganismo interferente! "e realiza la misma

operación con el medio de referencia 'Aosell, 233)!

Despu1s de la incubación apropiada, las lecturas se expresan como ndicede crecimiento relativo '-C4)! (sto es la relación o cociente del -C+ en la

placa selectiva con respecto al medio testigo o control 'Aossel, 233)!

+ nivel industrial se busca desarrollar medios de cultivo que sean altamente

productivos y en lo posible selectivos, cuando la segunda condición no se

logra obtener mediante la formulación, se entran a implementar otras

medidas a nivel de control de proceso para evitar la presencia de

microorganismos indeseables 'Aosell, 233)!

*a productividad o rendimiento se define como el número de colonias de los

microorganismos buscados en superficie del medio selectivo sobre el número

de colonias de los microorganismos buscados en superficie del medio control



no selectivo! (sta se evalúa en el medio de prueba con el microorganismo de

prueba y pueden encontrarse los siguientes resultadosH -C+ V 5H Aedios

altamente productivosI -C+ V 2!5 R 5!3H Aedios medianamente productivosI

-C+V Aenor De 2!5H Aedios poco productivosI -C+ V 3H Aedios no

productivos 'Aosell, 233)!

*a selectividad se define como el número de colonias de los

microorganismos interferentes no buscados en superficie del medio selectivo

sobre el número de colonias de los microorganismos interferentes no

buscados en superficie del medio control! (sta se evalúa en el medio de

prueba con el microorganismo interferente! (l -C+ del medio evaluado con el

microorganismo interferente no debe ser mayor de 2 y se pueden obtener los

siguientes resultadosH -C+ V 3H Aedios +ltamente selectivosI -C+ V 3E2H

Aedios medianamente selectivosI -C+ V Aayor De 2H Aedios no selectivos

'Aosell, 233)!

'. 5USTI:ICACIÓN

(l medio $%& '(xtracto de levadura, %eptona y &lucosa) es utilizado como



sustrato para la obtención de biomasa de Saccharomyces cerevisiae; es un

medio sint1tico, comercial, procesado y enriquecido con fuentes de carbono

como glucosa, fuentes de nitrógeno como extracto de levadura y peptona!

"in embargo, debido a los componentes del medio $%& principalmente el

extracto de levadura, resulta ser un medio costoso cuando se pretende

obtener biomasa a gran escala, por lo que es de gran utilidad obtener un

sustrato económico y de fácil consecución para fines biotecnológicos!

;eniendo en cuenta lo anterior, mediante este proyecto se pretende sustituir

la producción de Saccharomyces cerevisiae en medio $%& por la utilización

de medio melaza de caña, la cual tiene venta#as económicas y nutricionales

como sales y minerales fundamentales para el crecimiento de la levadura!

+demás la melaza de caña, posee compuestos que favorecen el desarrollo

de la biomasa como altos contenidos de carbohidratos 'sacarosa), protenas,

grasas, calcio, fósforo, aminoácidos y vitaminas entre otros!

Con la utilización de este sustrato, se pretende minimizar los costos de

producción a mayor escala y hacer buen uso de subproductos de los

procesos de la industria azucarera, los cuales son actualmente utilizadospara la producción de etanol y ácido ctrico entre otros!

*a producción de biomasa levaduriforme a partir de la fermentación de la

melaza de caña se realiza con el fin de incrementar el rendimiento de

biomasa a partir sustrato $xFs 'gFg) y disminuir costos para cumplir con

la segunda etapa del proyecto “Evaluación de la capacidad probiótica in vitro

de una cepa nativa de Saccharomyces cerevisiae”, que se desarrolló en

el laboratorio de biotecnologa aplicada de la %ontificia Jniversidad

Laveriana!



6. O(5ETI=OS

6.1 O!Jeti7# general

(valuar la melaza de caña como sustrato para la producción de

Saccharomyces cerevisiae.

6.2 O!Jeti7#s es"ecí+ic#s

W (valuar diferentes concentraciones de melaza de caña con el fin de

seleccionar la más adecuada para la producción de biomasa

levaduriforme!

W Calcular parámetros cin1ticos de rendimiento de biomasa a partir de

sustrato $xFs 'gFg), velocidad especfica de crecimiento Xx 'hE.),

tiempo de duplicación td 'h) y productividad 'g*E.Fh) de la cepa enestudio y de una cepa control!

W Comparar los parámetros cin1ticos de la cepa en estudio 'Cepa +) con

la cepa control 'Cepa K), usando la concentración de melaza

seleccionada!

W (valuar la productividad y selectividad del medio melaza de caña a la

concentración seleccionada por medio del A1todo (com1trico!



8. MATERIA*ES MHTODOS

*os procedimientos experimentales se llevaron a cabo en el *aboratorio de

Kiotecnologa +plicada, &rupo de Kiotecnologa +mbiental e -ndustrial'&K+-)! Departamento de Aicrobiologa, acultad de Ciencias, %ontificia

Jniversidad Laveriana!

8.1 MEDIO DE CU*TI=O UTI*IZADO

*a melaza de caña como sustrato para la producción de Saccharomyces

cerevisiae se obtuvo de manera comercial, ya que es un subproducto de laindustria azucarera que actualmente se comercializa para el engorde de

animales!

%ara realizar las curvas de crecimiento se llevó a cabo un tratamiento a la

melaza de caña, con el fin de remover contaminantes e impurezas presentes

que pudieran interferir con el crecimiento óptimo de Saccharomyces

cerevisiae! (l tratamiento se realizó de la siguiente maneraH

*a concentración de melaza de caña seleccionada se pesó y disolvió en

agua est1ril, calentando y agitando hasta diluirla totalmente! %osteriormente,

se centrifugó tres veces con el fin de retirar gran parte de impurezas y

contaminantesI se esterilizó por 23 minutos a 23 libras de presión! %or último,

se adicionó ampicilina a una concentración de '33 mgF*) '%edroza, 233) y

se procedió a realizar las curvas de crecimiento de Saccharomyces

cerevisiae.



8.2 MICROORANISMOS

*a cepa utilizada en este estudio fue previamente aislada de cultivos de caña

de azúcar, pertenece al g1nero Saccharomyces, especie cerevisiae y fuedenominada Cepa + '+nexo +), y como un control se utilizó la cepa que

pertenece al g1nero Saccharomyces, especie boulardii , denominada en este

estudio Cepa K, la cual es un producto comercial liofilizado utilizado como

probiótico y restaurador de flora intestinal!

8.' CONSER=ACIÓN DE CE-AS

*as cepas fueron conservadas en un Kanco de C1lulas %rimario mantenidas

en glicerol 3B'vFv) a E<3QC '+guirre, 233)!

+ los bancos se les realizó control de calidad durante ocho meses con

muestreos cada dos mesesI el tamaño total del banco fue de .33 viales de

los cuales el 53B correspondió al Kanco de C1lulas de ;raba#o 'KC;) y el

resto correspondió al Kanco de C1lulas de 4eserva 'KC4)I (l control de

calidad se realizó de la siguiente maneraH "e tomaron cuatro viales del banco

de traba#o, cada vial se vertió en un erlenmeyer con relación .F5 de caldo

$%&I posteriormente, se incubaron a una temperatura de 3QC .53 rpm,

durante .2 horas! ;ranscurrido el tiempo de incubación se llevaron a cabo

pruebas de pureza y finalmente se realizaron diluciones seriadas con

posteriores siembras en superficie en medio $%&!

8.6 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTA*ES

;eniendo en cuenta que el medio de cultivo está compuesto por sacarosa, se

hizo necesario realizar hidrólisis ácida previa a la cuantificación de azúcares



reductores mediante la t1cnica del acido ,5Edinitrosaliclico 'D9") 'Ailler,

./5/)!

8.6.1 i$r,lisis $e la sacar#sa

-nicialmente, se realizó la curva patrón de sacarosa preparando una

concentración "toc7 de gF*! + partir de esta solución se prepararon

diferentes concentraciones para obtener la curva patrón! %osteriormente, se

tomaron 2ml de cada una de las concentraciones y se adicionaron 2ml de

@Cl al <B 'vFv) con dilución .F2 '+nexo K)! *os tubos fueron agitados en

vórtex y calentados a /2QC durante .3 minutos! *a reacción se frenó en hielo!

%osteriormente, se adicionaron tres gotas de fenoftalena a cada una de las

muestras, luego 9a:@ al 25B 'pFv) 'aproximadamente 2!32ml) hasta obtener

un tono ligeramente rosado! %or último, se adicionó @Cl al 5B 'vFv)

'aproximadamente 3!ml) y se agitó nuevamente en vórtex '&odoy, 2332I

-C:9;(C, .//=)!

8.6.2 TBcnica $el Aci$# '8F $initr#salicílic# /DNS

Despu1s de la etapa de hidrólisis, se procedió con el protocolo para llevar a

cabo la t1cnica de determinación de azúcares reductores por el m1todo de

D9" para lo cual a 3!25 ml de la solución hidrolizada se agregaron 3!25 ml

del reactivo D9", los tubos fueron calentados en ebullición durante 5

minutos! %osteriormente, se frenó la reacción con hielo! "e adicionaron 2!5ml

de agua destilada, se agitó en vórtex y se realizó la lectura de densidad

óptica 'D!:) a 5=3nm para cada tubo 'Ailler, ./5/)! (sta t1cnica se describeen detalle en el +nexo C!



8.8 DETERMINACIÓN DE (IOMASA

*a biomasa se determinó mediante la t1cnica de peso seco, la cual fue

realizada previamente! %ara llevar a cabo la lectura de la biomasa obtenidaen las curvas de crecimiento se realizaron tres lavados con solución salina

est1ril al 3!05B 'pFv), con el fin de retirar cualquier interferente proveniente

de la melaza de caña que pudiera afectar en la lectura en espectrofotómetro

a 23nm! +demás, se verificó la viabilidad de la cepa por medio de recuentos

en placa en agar $%& 'Ger composición en el +nexo D.) al inicio y al final de

cada fermentación tanto en erlenmeyer como en biorreactor!

8.9 -RUE(AS DE CRECIMIENTO EN AAR CA*DO ME*AZA EN

1KG 2KG 'KG /"07 A NI=E* DE ER*ENMEER

%ara evidenciar el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en caldo y agar

melaza, se prepararon tres concentraciones '.3B, 23B y 3B 'pFv))! "e

realizó una siembra masiva para cada una de las concentraciones, las ca#as

fueron incubadas a <QC durante 2= horas! %ara el caldo melaza se

prepararon las tres concentraciones con .5 m*, inoculadas con .,5 m* de

una suspensión celular obtenida del banco de c1lulas de traba#o 'KC;)!

%osteriormente se incubaron a <QC durante 2= horas!

8.> -RUE(AS DE TEM-ERATURA

Debido a que la ficha t1cnica de esta levadura reporta temperatura de

crecimiento en <QC, y por literatura se tiene que la temperatura óptima está

entre 25QC y 3QC, se plantearon pruebas preliminares para comparar el

crecimiento de la levadura a 3QC y <QC, esto con el fin de asegurar la

obtención de mayor cantidad de biomasa! (sta prueba se realizó por

triplicado durante . horas con muestreos en la hora 3, 0 y . y se tomó en



cuenta la concentración de melaza al .3B 'pFv) ya que esta es una

concentración frecuentemente utilizada!

8.>.1 -re"araci,n $el in,cl#

"e realizó un preinóculo en erlenmenyer con relación .F5 de caldo melaza en

el cual se inoculó una suspensión celular obtenida del banco de c1lulas de

traba#o de Saccharomyces cerevisiae 'cepa +), adicionando ampicilina con

una concentración de '33 mgF*) '%edroza, 233) y se incubó a una

temperatura de 3QC, .53 rpm, durante .2 horas! "e realizó recuento inicial y

final en placa y absorbancia '23nm)! *os muestreos fueron analizados

por triplicado!

(ste cultivo se utilizó para inocular dos erlenmeyer con concentración de

melaza al .3B 'pFv) con relación .F5, los cuales fueron llevados a diferente

temperatura '3QC y <QC)! %osteriormente, se midió la biomasa hasta

obtener una absorbancia '23nm) de .,3 diluy1ndolo con solución salina

est1ril al 3!05B 'pFv)!

8.>.2 :erentaci,n $isc#ntina

%ara la fermentación en erlenmeyer se guardó la relación .F5 tomando .3B

de inóculo! "e adicionaron en erlenmeyer con caldo melaza al .3B 'pFv)

adicionando ampicilina '33 mgF*) a un p@ inicial de 5!3! *os erlenmeyer se

incubaron a 3QC y <QC, .53 rpm, durante . horas! %osteriormente, se

realizaron muestreos cada 0 horas midiendo absorbancia'23nm) de

biomasa y sustratoresidual con previa hidrólisis de la

sacarosa por triplicado! +dicionalmente se verificó la viabilidad

sembrando en superficie en placas de agar $%& adicionado de Cloramfenicol

3,.B 'pFv) a la hora 3 y la hora .!



8. CUR=A DE CRECIMIENTO CONTRO* DE Saccharomyces CE-A A

CE-A ( EN CA*DO -.

"e realizó la curva control para las cepas + y K en erlenmeyer con el fin decomparar la producción de biomasa en caldo $%& con la producción de

biomasa obtenida en la fermentación con caldo melaza!

8..1 -re"araci,n $el in,cl#

"e realizó en un erlenmenyer con relación .F5 de caldo $%& en el cual se

adicionó una suspensión celular de Saccharomyces cerevisiae Cepa + y

Saccharomyces boulardii Cepa K obtenidas del banco de cepas de traba#o,

adicionando ampicilina '33 mgF*)! "e incubó a 3QC, .53 rpm, durante .2

horas! "e realizó recuento inicial en placa por duplicado para verificar

viabilidad de la cepa, determinación de azúcares reductores por la t1cnica de

D9"! "e midió la biomasa hasta obtener una absorbancia'23 nm) de

.!3 diluy1ndola con solución salina est1ril al 3!05B 'pFv)!

8..2 :erentaci,n $isc#ntina

%ara las fermentaciones se guardo la relación .F5! "e tomó .3B del inóculo y

se vertió en el erlenmeyer de 533m* con caldo $%& adicionando ampicilina

'33 mgF*)! %osteriormente, se agitó a .53 rpm a 3QC durante 23 horas! "e

realizaron muestreos con intervalos de una hora desde la hora 3 hasta la

hora y de dos horas desde la hora 0 hasta la hora 23! (n cada muestreo se

midió biomasa a una absorbancia'23 nm) y se determinaron losazúcares reductores mediante la t1cnica de D9" por triplicado a 5=3 nm!

"e verificó viabilidad sembrando en la hora 3 y en la hora 23 en agar $%&

adicionado de cloramfenicol 3,.B 'pFv)!



8. E=A*UACIÓN DE *A CONCENTRACIÓN DE ME*AZA DE CAÑA A

NI=E* DE ER*ENMEER /ETA-A INICIA*

"e realizaron fermentaciones discontinuas en erlenmeyer manteniendo la

relación de .F5 del volumen del cultivo y tamaño del recipiente con el fin defavorecer la aireación! (l medio de cultivo utilizado fue melaza a diferentes

concentraciones '.3B, 23B y 3B 'pFv))! *as condiciones de fermentación

mane#adas fueron temperatura de 3QC, agitación de .53 rpm, durante 23

horas adicionando ampicilina '33mgF*) con p@ inicial de 5!3! "e realizaron

muestreos con intervalos de una hora desde la hora 3 hasta la hora y cada

dos horas de la hora 0 a la hora 23! "e realizó la lectura de la

absorbancia'23nm) con previos lavados de c1lulas con solución salinaest1ril

3!05B 'pFv), los datos obtenidos se transformaron a concentración celular gF*

por medio de curvas de peso seco previamente determinadas para cada

cepa 'Kuitrago y ;en#o, 233<I +guirre, 233)! (l sustrato residual fue

evaluado mediante la t1cnica de D9" con previa hidrólisis de la sacarosa!

*os experimentos se realizaron por triplicado tanto para la cepa en estudio

'cepa +) como para la cepa control 'cepa K)!

8.1K CUR=AS DE CRECIMIENTO EN :ERMENTADOR DE 1.8 *ITROS

/SEUNDA ETA-A

Jna vez seleccionada la concentración de melaza de caña adecuada para

ambas cepas en t1rminos de concentración de biomasa 'gF*), se procedió a

realizar fermentaciones discontinuas en fermentador de .!5*!

8.1K.1 -re"araci,n $el in,cl#

"e realizó en un erlenmenyer con relación .F5 de caldo melaza al .3B 'pFv)

en el cual se adicionó una suspensión celular de Saccharomyces cerevisiae



cepa + y Saccharomyces boulardii Cepa K, adicionado de ampicilina

'33mgF*) con p@ inicial de 5!3 y se incubó a 3QC, .53 rpm, durante .2

horas! "e realizó recuento inicial en placa por duplicado para verificar

viabilidad de la cepa, determinación de azúcares reductores por la t1cnica deD9" con previa hidrólisis de la sacarosa y se midió la biomasa hasta obtener

una absorbancia'23nm) de .!3 diluy1ndola con solución salina est1ril al

3!05B 'pFv)!

8.1K.2 :erentaci,n $isc#ntina

%ara las fermentaciones en biorreactor de .!5* se guardó la relación .F2! "etomó el .3B del inóculo y se adicionó en cada biorreactor a la concentración

de melaza escogida en erlenmeyer adicionando ampicilina '33 mgF*) con un

p@ inicial de 5!3! "e incubó a una temperatura de 3QC, .53 rpm, .vvm

durante 23 horas '+guirre, 233)! %osteriormente, se realizaron muestreos

con intervalos de una hora desde la hora 3 hasta la hora y de dos horas

desde la hora 0 hasta la hora 23! (n cada muestreo se midió biomasa a una

absorbancia'23nm) y se determinaron los azúcares reductores mediante

la t1cnica de D9" con previa hidrólisis de la sacarosa a una

absorbancia'5=3nm)! "e verificó viabilidad sembrando en superficie la

hora 3 y la hora 23 en placas de agar $%& adicionado de cloramfenicol

al 3,.B 'pFv)! "e realizó coloración de &ram para verificar pureza! Cada

t1cnica fue realizada por triplicado!

8.11 DETERMINACIÓN DE -AR<METROS CINHTICOS

Con los datos obtenidos de las curvas de crecimiento en erlenmeyer y enfermentador de .!5*, se determinaron parámetros cin1ticos como

rendimiento de biomasa a partir de sustrato $xFs 'gFg), velocidad especfica

de



crecimiento Yx 'hE.), tiempo de duplicación td 'h) y productividad'Doran,.//0)!

8.12 -RUE(AS DE -RODUCTI=IDAD SE*ECTI=IDAD MEDIANTE E*

MHTODO ECOMHTRICO

(stas pruebas se realizaron con el ob#etivo de evaluar la productividad y

selectividad del medio melaza de caña a la concentración seleccionada en la

primera etapa!

-nicialmente, se tomaron dos ca#as con el medio a investigar 'medio melaza a

la concentración seleccionada) y una ca#a de agar $%& adicionado decloramfenicol al 3!.B 'pFv) como medio de referencia! (l microorganismo a

evaluar fue Saccharomyces cerevisiae 'cepa +) y el microorganismo

interferente fue Staphylococcus aureus!

%ara realizar el m1todo ecom1trico, inicialmente se tomo una suspensión

celular de .!5m* de Saccharomyces cerevisiae y de Staphylococcus aureus

mantenidas a E<3QC en el banco de traba#o y se sembraron en ca#as de agar

$%& adicionado de cloramfenicol al 3!.B 'pFv) y Kaird %ar7er 'Ger

composición en el anexo D2) respectivamenteI + partir de esta siembra se

realizó un inóculo en solución salina est1ril al 3!05B 'pFv) de cada

microorganismo con una concentración del tubo 5 patrón de Aac arland!

%osteriormente, se tomó con el asa curva calibrada una muestra del inóculo

de Saccharomyces cerevisiae y se sembró en el medio a investigar melaza

de caña! (sta siembra se realizó trazando en la superficie del agar cincoestras paralelas por cuadrante y una estra central, sin tomar nueva muestra!

*as ca#as fueron incubadas a 3ZC durante =0 horas! +s mismo, se tomó



otra ca#a del medio a investigar y se sembró el microorganismo interferente

Staphylococcus aureus 'Aosell, 233)!

8.1' ANA*ISIS ESTADISTICO

%ara la presentación e interpretación de resultados, se utilizaron las medias

estadsticas como la Aedia +ritm1tica, Desviación (stándar, Coeficiente de

Gariación, %orcenta#e de Gariación y %resentaciones gráficas!

%or consiguiente, para la discusión de resultados obtenidos a lo largo del

proyecto, se utilizó la prueba ;Estudent para establecer cual de las tresconcentraciones estudiadas es la más adecuada para la mayor producción

de biomasa de Saccharomyces cerevisiae! +dicionalmente, estos datos se

tabularon mediante el programa estadstico "%"" versión .= para observar

la dispersión de los datos y as verificar la confiabilidad del estudio!

8.1'.1 CE-A A. Saccharomyces cerevisiae

W @ipótesis &eneralH

*a producción de biomasa obtenida a la concentración de melaza al .3B no

difiere a la producción de biomasa obtenida a la concentración de melaza al

23B!

@oH Y. E Y2V 3

@iH Y. E Y2 [3


*a producción de biomasa obtenida a la concentración de melaza al 23B no


3B!



@oH Y. E Y2 V 3

@iH Y. E Y2 [ 3

8.1'.2 CE-A (. Saccharomyces boulardii


*a producción de biomasa obtenida a la concentración de melaza al .3B no


23B!

@oH Y. E Y2 V 3

@iH Y. E Y2 [ 3


*a producción de biomasa obtenida a la concentración de melaza al 23B no


3B!

@oH Y. E Y2 V 3

@iH Y

.E Y

2[ 3



U : C 0 2 *

9. RESU*TADOS DISCUSIÓN

9.1 CONSER=ACIÓN DE CE-AS

*a conservación de cepas es una herramienta esencial en la biotecnologa,

ya que es necesario contar con una fuente pura y viable del microorganismo

de inter1s en cualquier bioproceso, teniendo en cuenta que los problemas de

viabilidad y de pureza en los cultivos son frecuentes y comunes! Con el fin de

evitar la p1rdida de cualquier microorganismo tanto de inter1s industrial como

investigativo, es necesaria la implementación de un banco de c1lulas, el cual

es definido como 6un con#unto de alcuotas homog1neas de un cultivo

microbiológicamente puro que se almacena ba#o condiciones que garanticen

la estabilidad y la viabilidad gen1tica8 '&onzález, 2332)!

Cepa +Cepa K

.,23(N3/

.,33(N3/0,33(N30

D,33(N30

=,33(N30

2,33(N30

3,33(N33 3 2 = 0.3

Tie "#/M e ses 1



:igra 9. Galores de JCFm* en función de los controles realizados cadados meses!

+ lo largo del control de calidad del banco de cepas, se observó que el

recuento inicial fue de .30 para ambas cepas 'igura )! "in embargo, en

el mes = la cepa nativa comenzó a perder viabilidad disminuyendo un

ciclo logartmicoI en el sexto mes se obtuvo un recuento de .35, lo que

indicó que la cepa se estaba muriendo debido a un mane#o

inadecuado de la temperatura ya que al comienzo el banco se conservó a

una temperatura de

E<3QC y posteriormente se cambio a una temperatura de E23QCI lo que indica

que esta temperatura no es la ideal para la conservación de bancos! +l

observar esta p1rdida se recuperó la concentración de c1lulas para que

quedara en un exponente de .30 por medio de inóculos en medio $%&!

*a viabilidad de la cepa K estuvo estable a lo largo del estudio! *os datos

se observan en el +nexo (!

(xisten muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectantes,

pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración

del .5B al 3B 'vFv)! (stas sustancias protegen del daño que se pueda

producir en las c1lulas microbianas en el momento de la congelación a

temperaturas inferiores a cero grados centgrados, a la que el agua se

congela! De esta forma, al no disponer las c1lulas de agua en forma lquida

no hay crecimiento '&onzález, 2332)! *o anterior afirma, que el cambio

brusco de temperatura que tuvieron las cepas afectó la viabilidad debido a

que al utilizar como crioprotectante el glicerol inicialmente a una temperatura

de E<3QC y luego pasar a E23QC se formaron cristales, los cuales afectaron lapared celular de las c1lulasI por lo tanto, es me#or que las variaciones de la

temperatura sean rápidas tanto para la congelación como para la

descongelación!

9.2 DETERMINACIÓN DE *A CUR=A -ATRÓN DE SACAROSA



+l realizar la t1cnica de D9" con previa hidrólisis de la sacarosa se realizó la

curva patrón en la cual se obtuvo la siguiente ecuación '*os datos obtenidos

se encuentran en el +nexo )H(cuación H

L 4!$V 3!.=x N 'E3!3)

42 V 3!//</

Curva patrónsacarosa

uenteH +utores

9.' -RUE(AS DE CRECIMIENTO EN AAR CA*DO ME*AZA EN 1KG2KG 'KG /"07 A NI=E* DE ER*ENMEER

*uego de sembrar el microorganismo en agar y caldo melaza a las tres

concentraciones estudiadas .3B, 23B y 3B 'pFv), se observó el desarrollo

metabólico del microorganismo al utilizar como fuente de carbono la

sacarosa y otros azúcares reductores presentes en menor cantidad 'igura

<)!

3B 23B

:igra >. %ruebas de crecimientode Saccharomyces cerevisiae en

agar melaza! Gista macroscópica!uenteH +utores!



pureza mediante coloración de &ram se observó en los caldos contaminación

por Kacilos esporulados &ram positivos y Kacilos &ram negativos en

contraste al agar melaza en el cual se evidenciaron solamente levaduras

'igura 0)I Dado que la melaza de caña es un medio muy enriquecido graciasa la alta concentración de carbohidratos los cuales pueden ser utilizados

como fuente de carbono por gran variedad de microorganismos, además la

melaza contiene compuestos tales como calcio, magnesio, fósforo y potasio

indispensables para el funcionamiento celular!

;eniendo en cuenta que la melaza es un residuo de la industria azucarera y

que tiene impurezas y contaminantes en su composición, se tomó la decisión

de centrifugar la melaza tres veces, además de esterilizarla a 23lb de presión

durante 23 minutos y adicionar ampicilina a una concentración de '33 mgF*)

como inhibidor de la flora acompañante '%edroza, 233), mediante ensayos

con melazas, se ha demostrado que 1stas, a pesar de su ba#o contenido en

nitrógeno y fósforo, constituyen un buen medio nutritivo para muchos

microorganismos, como hongos y bacterias! (n base a esto, se utilizó un

antibiótico betaElactámico como la ampicilina ya que es una penicilina

semisint1tica que posee un amplio espectro en el que se incluyen bacterias&ram negativasI este antibiótico actúa inhibiendo la última 1tapa de la

sntesis de la pared celular bacteriana uni1ndose a unas protenas

especficas llamadas %K%s 'enicillin!"inding roteins) localizadas en la

pared celular! +l impedir que la pared celular se construya correctamente, la

ampicilina ocasiona la lisis de la bacteria y su muerte 'Carballo, 2333)!

(l uso de antibióticos como inhibidores de microorganismos o flora

acompañante en las fermentaciones industriales y la influencia de la

penicilina y ampicilina han sido favorables como agentes controladores de la

contaminación de la melaza de caña en procesos biotecnológicos 'Calderón,

233<)!



:igra . Coloración de &ram de laCepa +! a partir de colonias en agar

melaza! uenteH +utores!

9.6 -RUE(AS DE TEM-ERATURA

(n la tabla , se muestra que el consumo de sacarosa en melaza .3B 'pFv),

a una temperatura de <QC es mayor que a 3QCI sin embargo, se obtuvo la

mayor cantidad de biomasa a 3QC '2., gF*) en comparación a la obtenida a

<QC './,02 gF*), además al determinar el rendimiento de biomasa en

sustrato, se obtuvo a la temperatura de 3QC un $xFs '3,05< gFg) y a <QC

un $xFs '3,5/< gFg) indicando que la temperatura adecuada para laproducción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae es a 3QC!

Ta!la 9. Galores de producción de biomasa yconsumo de sustrato a temperaturas de 3QC y<QC! Cepa +!

(IOMASA /g0* SUSTRATORESIDUA*

Tie"# 'KC '>C 'KC '>C

K .,5 3,0/ /,0 =,<0 .5,.< .5,< .,3/ 2,.519 2., ./,02 .,= .5,.



;eniendo en cuenta que se partió de un mismo inóculo, en esta parte se

observa que a la hora 3 la biomasa en 3QC y en <QC presenta diferencias

en los valores! (sto puede deberse a que se realizó un preinóculo para

asegurar la concentración inicial de biomasa a una temperatura de 3QC,posteriormente se realizó un segundo preinóculo para cada una de las

temperaturas con esta concentración de biomasa obtenida para iniciar las

curvas de crecimiento!

%or otro lado, al analizar el sustrato residual se observa que los valores a

3QC y <QC de la hora 3 presentan diferencias en cuanto al sustrato inicial

teórico 'sacarosa 3gF*)! (sto puede atribuirse a dos razonesH la primera,

que al centrifugar la melaza para retirar los sólidos presentes en ella pudo

haber disminuido la cantidad de sustratoI y la segunda, el tiempo de

esterilización pudo excederse de 23 minutos a 23lb de presión, lo cual puede

conllevar a una disminución en la concentración de los carbohidratos

presentes! + pesar de esto, se observó un consumo de sustrato lógico ya

que la concentración 'gF*) disminuye notablemente a las dos temperaturas

de manera similarI sin embargo, se observó que el sustrato no se agota en

su totalidad en . horas de fermentación, esto indica que para que el

sustrato se agote totalmente debe transcurrir un tiempo mayor en el cual

seguramente el microorganismo entrara en fase estacionaria!

9.8 CUR=A DE CRECIMIENTO CONTRO* DE Saccharomyces CE-A A

CE-A ( EN CA*DO -.

(stas curvas se realizaron con el fin de comparar el crecimiento de las cepas + y K en el medio $%& adicionado de ampicilina '33mgF*), con la melaza de

caña y de esta forma conservar las mismas condiciones de crecimiento del

microorganismo! (n estudios realizados por Kuitrago y ;en#o, 233<,



efecto secundario sobre el crecimiento de Saccharomyces, ya que se produ#o

crecimiento adecuado por parte de la levadura en medio $%& con ampicilina

y sin ampicilina!

;ras 23 horas de fermentación en caldo $%&, se observó que la cepa +

consume la fuente de carbono que es en este caso la glucosa desde la hora

3 hasta la hora 0 y a partir de esta hora el sustrato se agota en su totalidad,

resultados que corroboran lo mencionado anteriormente en las pruebas

realizadas a 3QC y <QC, teniendo en cuenta que la glucosa es un sustrato

de fácil asimilación! (n la igura /, se observa que la producción de biomasa

de la cepa + se obtiene desde la hora 3 hasta la hora .= siendo esta la fase

logartmica o exponencial, sin tener una fase de adaptación! Desde la hora

. hasta la hora 23 la levadura entra en fase estacionaria '+nexo &)! *os

datos obtenidos en este estudio coinciden con lo reportado por %1rez et al.,

2335 y +guirre, 233 quienes utilizaron el medio $%& para la obtención de

biomasa levaduriforme, ya que la levadura al ser cultivada a 3QC no

presentó fase de adaptación y la fase estacionaria inició desde la hora .2 E

.= hasta la hora 23 luego de 23 horas de fermentación!

(n cuanto a la cepa K, el consumo de sustrato se obtuvo desde la hora 3

hasta la hora 0, y desde la hora .3 a la hora 23 se observa el agotamiento de

la glucosa 'igura /)! %or otra parte, la producción de biomasa en la cepa K

arro#a como resultado una fase de adaptación que va desde la hora 3 a la

hora 2 y con una fase logartmica o exponencial desde la hora hasta la hora

.= para luego entrar a fase estacionaria! *os datos obtenidos se observan en

el +nexo &! +l analizar el comportamiento del sustrato residual tanto de la cepa + como

de la cepa K, se observa que en la hora 3 hay un incremento en el valor del

sustrato experimental en comparación con el sustrato teórico '23gF*) como



K i o

m a s a ' g F * )

" u

s t r a t o ' g F * )

se observa en el +nexo &! (sto puede deberse a que generalmente cuando

el tiempo de esterilización se excede, los azúcares tienden a caramelizarse y

concentrarse, razón por la cual se pueden encontrar valores experimentales

superiores al sustrato inicial teórico!

=3

=3

3 3

23

23

.3 K i om as a gF * C ( % + + .3 K i om as a gF * C ( % + K

"u s t r a t og F * C (% + + "u s t r a t

o g F * C(% + K

3 33 2 = 0 . 3 . 2 . = . . 0 2

3

; i e m po 'hor as )

:igra . Kiomasa y "ustrato residual en función del tiempo! Curva controlen caldo $%&con adición de ampicilina '33mgF*)! Cepa + y cepa K!

*os resultados de producción de biomasa fueron convertidos a concentración'gF*) con la siguiente ecuación de peso seco para la Cepa +H

(cuación =H

L 4 !



$V 3,225x N 3,3<.<42H 3,/03

%eso seco Cepa +! 'Kuitrago y ;en#o, 233<)

*os resultados de sustrato residual fueron convertidos a concentración 'gF*)

con la siguiente ecuación utilizada para la t1cnica de D9"!

(cuación 5H

L 4 !$V 3!=/0x N 'E3,22)

42H 3,//</

Consumo de sustrato! ;1cnica deD9"!

uenteH +utores!

*os resultados de producción de biomasa fueron convertidos a concentración

'gF*) con la siguiente ecuación de peso seco para la Cepa KH

(cuación H

L 4 !$V .!<3/x N 'E3,2.3)

42H 3,/0

%eso seco Cepa K! '+guirre, 233)!

*os valores de sustrato residual para la cepa K fueron convertidos a

concentración gF* con la ecuación descrita anteriormente para la t1cnica de

D9"!



9.9 E=A*UACIÓN DE *A CONCENTRACIÓN DE ME*AZA DE CAÑA A

NI=E* DE ER*ENMEER /ETA-A INICIA*.

9.9.1 Ce"a A. Saccharomyces cerevisiae.

+l realizar las fermentaciones con melaza de caña .3B 'pFv) 'igura .3,

%anel +), se presentó fase de adaptación desde la hora 3 hasta la hora 5 y

una fase exponencial desde la hora hasta la hora ., lo que afirma que el

microorganismo creció en el medio melaza! "in embargo, al analizar el

comportamiento del sustrato residual se presentan algunos incrementos

'horas .,2,,= y 5) a lo largo de las horas de fermentación ';abla <), esto se

debe a la presencia de la enzima invertasa! (sta enzima hace que el

microorganismo consuma sustrato a medida que actúa sobre la sacarosa

produciendo glucosa y fructosa que son azúcares reductores, los cuales son

más simples y la levadura puede asimilarlos con mayor facilidad '?azuhi7o y

4ozo, .//5)! (n esta parte, podra afirmarse que se lleva a cabo el proceso

conocido como inversión de la sacarosaI la presencia de esta enzima

depende de las concentraciones de glucosa en el medio de cultivo, es decir,

que a mayor concentración de glucosa a una temperatura de 3QC, se

evidencia con mayor facilidad la actividad de la enzima invertasa y a valores

óptimos de p@ y temperaturas afecta la actividad probablemente debido a

que esta enzima esta situada cerca de la superficie de la c1lula 'Oech y

&\risch, .//5)! (l p@ óptimo para la formación de biomasa en levaduras está

en un rango de =!3 R 5!3, razón por la cual en el presente estudio se preparó

el medio melaza a p@ 5!3!



(n la igura .3, %anel +I se observa que al utilizar la melaza al 23B 'pFv), se

presentó una fase de adaptación por parte del microorganismo, esto permite

deducir que el incremento en la concentración de melaza hace que el

microorganismo necesite producir enzimas tipo invertasa que le permitanmetabolizar el sustrato y para lograrlo tarda mayor tiempoI en la hora 0

comienza la fase exponencial y en la hora . empieza la fase estacionaria!

(n cuanto al sustrato residual, se presenta un comportamiento esperado

debido a la presencia de la enzima invertasa, como se puede ver claramente

en la igura .3, %anel K!

+s mismo se observa en la igura .3, %anel +I el comportamiento de lacepa + en medio melaza al 3B 'pFv)! (n esta concentración hubo fase de

adaptación igual a la concentración de 23B 'pFv)! *a fase exponencial se

presentó de la hora 0 hasta la hora ., hora en la cual inicia la fase

estacionaria! *a hidrólisis arro#ó diferentes incrementos en los resultados al

igual que en las dos concentraciones anteriores debido a la producción de

azúcares reductores de fácil asimilación para la levadura en estudioI sin

embargo, se observa que la levadura alcanzó la fase estacionaria antes de

consumir la totalidad del sustrato, posiblemente porque la concentración de

melaza era muy alta como se observa en la igura .3, %anel K! (chegaray y

colaboradores, 2333, analizó los efectos de la concentración de melaza en la

producción de biomasa y consumo de sustrato y logró concluir que altas

concentraciones de melaza favorecen la acumulación de sustrato residual en

cultivos continuos o fed E batch!



K i o m a s a ' g F *

)

(n este estudio se realizó un cultivo discontinuo o batch, en el que el sustrato

se adiciona solo al comienzo de la fermentación y la producción de biomasa

es dependiente de la concentración de sustrato!

3

Kiomasa gF* .3B

25 KiomasagF* 23BKiomasagF* 3B

23

.5

.3

5A

3

253

233 "ustratogF*.3B"ustratogF* 23B"ustratogF* 3B



'horas)

:igra 1K. ermentación en erlenmeyer! Aelaza .3B, 23B y 3B 'pFv)!Cepa +!

+l analizar el comportamiento del sustrato residual se observó que la

fermentación a la concentración de melaza al .3B inició con una

concentración 3gF*, la del 23B con una concentración de .22gF* y la del

3B con una concentración de .5gF* debiendo comenzar cada

fermentación con una concentración de 3gF*, .23gF* y .03gF* de sacarosa

respectivamente ';abla <)! (n la concentración de 3B 'pFv) se observa que

se inició con un sustrato experimental menor al sustrato teórico, lo que se

atribuye a las dos razones previamente mencionadasI ya que al

centrifugar la melaza para retirar los sólidos presentes en ella pudo haber disminuido la cantidad de sustrato y el tiempo de esterilización tal vez se

excedió de 23 minutos a 23lb de presión lo cual hizo que se disminuyera el

sustrato inicial experimental!

+l evaluar la producción de biomasa en las tres concentraciones de melaza

de caña, se observó al final de cada fermentación una alta producción de

biomasa, lo cual es satisfactorio ya que indica que la levadura a estudiar seacopla rápidamente a las condiciones dadas por el medio melaza si hay una

adecuada reconstitución de la cepa al momento del preinóculo ';abla <)! De

esta manera, en la hora . se obtuvo el máximo crecimiento de

Saccharomyces cerevisiae teniendo en cuenta que los valores obtenidos en

la hora .0 son muy cercanos, obteniendo una concentración gF* de .,.3<

en .3B 'pFv)I 2,00. en 23B 'pFv) y 20,0/ en 3B 'pFv) como se muestra

en la siguiente tabla!



Ta!la >. Galores de biomasa y consumo de sustrato! ermentación enerlenmeyer! Aelaza.3B, 23B y 3B 'pFv)! Cepa +!

CE-A

Tie"##ras

1KG 2KG 'KGKioma

sa"ust!

4esidualKioma

sa"ust!

4esidualKioma

sa"ust!

4esidual

3 . 0 3 03 . .5/ .22 </2 . 35 .5 5/. 2,35< <.,2 2,2. .2,=/ 2,30 .0/,022 2,25< <2,00 2,./ ..5,20 2,33/ 232,< 2 ==/ 0. 5/ 2 =.5 .=0 < 2 530 2= 5.0= ,3.3 05,. 2,/< .5/,0.2 2,55 2,</5 200 .32 53 252 .< ./3 2 <2. 2<. /2= 5,/2 0/,3<3 ,=2 .0,=</ 2,//3 22.,53.0 <,==. ,055 ,<3 .,<23 ,25 .<=,52/

.3 . 50< = 5.3 .= 50 .33 0= . .. .20 0//

.2 .5,3=. 0,0. .<,3. 05,=/2 22,53< /,0=2

.= .5 <= 25 5</ 2. <5. 5= <2 2 3/ ..0 53/

. 19 1K> 23,<5 29 1 =2,252 2 9 //,<32

.0 .,232 .2,=</ 2,/23 2/,25 2/,3.3 /<,5223 .,53 .3,5/ 2<,3.3 2,= 2/,233 /,/3=

9.9.2 Ce"a (. Saccharomyces boulardii.

+l momento de realizar las fermentaciones con melaza al .3B 'pFv) a la cepa

K, se observó una fase de adaptación de la hora 3 a la hora , lo cual indica

que Saccharomyces boulardii , no se adapta tan fácil a los componentes del

medio melaza! *a fase exponencial se ve claramente de la hora 0 hasta la

hora .I "in embargo, la producción de biomasa es notablemente ba#a en

contraste a la cepa + '.,.3gF*), ya que se obtiene solo una concentración

de '2,535gF*) en la hora . de fermentación ';abla 0)! (n cuanto al consumo

de sustrato, se observan ciertas variaciones ya que a medida que el

microorganismo crece se hidroliza la sacarosa para producir azúcares

reductores y asimismo el microorganismo los consume lo cual se observa en

la igura .., %anel K, como incrementos a lo largo de las 23 horas de

fermentación!



+l analizar los resultados arro#ados con la melaza al 23B en la cepa K

'igura .., %anel +), se observó que el microorganismo se adaptó al medio

de la hora 3 a la hora y presenta la fase exponencial desde la hora 0 a la

hora .= obteniendo una concentración de biomasa de 2,/32gF* ';abla 0), por lo que fue muy ba#a en comparación a la cepa + '2,00gF*)! (l consumo de

sustrato presenta los incrementos caractersticos de la hidrólisis de la

sacarosa y por ende de la presencia de la enzima invertasa como se haba

mencionado anteriormente!

(n medio melaza al 3B 'pFv), se observa adaptación al medio por parte del

microorganismo de la hora 3 a la hora al igual que las concentraciones .3By 23B 'pFv) 'igura .., %anel +)! *a fase exponencial o logartmica se ve

claramente de la hora 0 a la hora .= obteniendo una concentración de

biomasa de ,3/3 gF* ';abla 0), lo que afirma que definitivamente en las tres

concentraciones de melaza traba#adas con la cepa K, se obtiene una muy

ba#a cantidad de biomasa en comparación a la cepa +!

%or otro lado, se observa que en el transcurso de la fermentación de la cepa

K la fase exponencial o logartmica va desde la hora 0 hasta la hora .=,

teniendo una fase de adaptación a las tres concentraciones! De esta manera

se obtuvo el máximo crecimiento de Saccharomyces boulardii , obteniendo

una concentración de 2,535 gF* en .3B 'pFv) en la hora .I 2,/32 gF* en 23B

'pFv) y ,3/3 gF* en 3B 'pFv) en la hora .= ';abla 0)!



K i o m a s a ' g F * )

,3

2,5

Kiomasa

gF* .3B

KiomasagF* 23B

KiomasagF* 3B

2,3

.,5

.,3

3,5 A

3,3

.53

"ustrato

gF* .3B

"ustrato

gF* 23B

"ustrato

gF*



;iempo'horas)

:igra 11. ermentación en erlenmeyer! Aelaza .3B, 23B y 3B 'pFv)!Cepa K!

*os resultados obtenidos anteriormente permiten deducir que tal vez la

variedad boulardii sea más susceptible a sustratos comple#os como melaza,

variaciones del p@, fuentes de nitrógeno entre otras, ya que el

comportamiento en caldo $%& fue muy similar a la cepa +, teniendo en

cuenta que la glucosa es una fuente de fácil asimilación!

Ta!la . Galores de biomasa y consumo de sustrato! ermentación enerlenmeyer! Aelaza.3B, 23B y 3B 'pFv)! Cepa K!

CE-A

Tie"#1KG 2KG 'KG

Kiomasa

"ust!4esidual

Kiomasa

"ust!4esidual

Kiomasa

"ust!4esidual

3 3 22 5 =/5 3 20 0= <2 3 2<. .3

. 3,203 5,03= 3,2/2 /3,<. 3,2// .==,33<2 3 2/ 5 0. 3 22 0 <3 3 2= .=/ .== 3,.0 3,333 3,= 0,0<2 3,/5 .3,00= 3 </ =/ ..3 3 = / 0. 3 =03 . 2<5 3,=<0 5,0=/ 3,=02 .33,/25 3,52 .35,=2 3 5/ 2 0. 3 55/ .3/ 0=3 3 .5 /0 3<0 .,/. ,2 .,<0 ../,2=< .,/== 05,/

.3 .,/0 /,52. 2,3=5 ,</ 2,<< 5,2=2

.2 2 20 3 .2 2 <3 52 2/ 2 03 5. 2</

.= 2,=.0 23,/=< 2 K2 =,<3 ' KK ,200

. 2 8K8 .< 0=2 2 /= == 0 .0= . 2

.0 2,52 .,/ 2,/0= 53,23 ,230 ,30223 2,5=0 .5,532 2,/0= =,03= ,22/ 2/,00

"egún los datos obtenidos anteriormente, se encuentra similitud entre la

cepa + y la cepa K en cuanto al comportamiento en las concentraciones de

melaza! Con concentraciones de 23B y 3B 'pFv) de melaza de caña no hay



una gran diferencia en la producción de biomasa para la cepa + como se

observa en la ;abla < y además la máxima obtención de biomasa es de

2,00. gF* y 20,0/ gF* a 23B y 3B 'pFv) respectivamente, notándose que

un aumento del .3B 'pFv) en la concentración de melaza no implicó un

cambio importante en la producción de biomasa! (sto se observa tambi1n

para la cepa K ';abla 0), donde la obtención máxima es gF* en 23B y 3B

'pFv) de melaza!

%or lo anterior, se deduce que la melaza es un medio apto para la producción

de Saccharomyces cerevisiae ya que tiene fuentes de carbono disponibles y

otros componentes que facilitan que el microorganismo los metaboliceI por

esto se dice que el medio melaza tiene un valor nutricional alto para el

microorganismo! *as melazas pueden ser satisfactoriamente utilizadas como

sustrato, sin embargo, Krandberg et al., 233 y olch et, al., 233=,

analizaron que para microorganismos más exigentes es necesario el

suplemento con ciertos aminoácidos libres o sulfato de amonio que le sirvan

de fuente de nitrógeno y sugieren controlar el p@ para que las muestras de

melaza se conviertan en un excelente sustrato para las fermentaciones

microbianas!

%ara las fermentaciones en erlenmeyer a las concentraciones de .3B, 23B y

3B 'pFv) se utilizó la t1cnica del ácido E5 dinitrosaliclico 'D9") con previa

hidrólisis de la sacarosa para la cuantificación de azúcares reductores! (n

cada gráfica se observan incrementos en el sustrato a lo largo de la

fermentación, lo cual indica que el microorganismo utiliza la poca glucosa

presente en el medio mientras que la enzima hidroliza la sacarosa en glucosa

y fructosa haciendo que aumente la concentración de glucosa!

+l comparar el consumo de sustrato entre la cepa + y la cepa K, se observó

que la cepa K consumió menos sustrato que la cepa +I esto se debe

probablemente a que la cepa nativa 'cepa +) al ser extrada directamente de

la caña de azúcar está habituada a las altas concentraciones de azúcar, por



lo que al realizar las fermentaciones en melaza de caña no le afectan estas

condiciones en comparación a la cepa K que es una levadura comercial

liofilizada para fines probióticos!

9.> SE*ECCIÓN DE *A CONCENTRACIÓN ADECUADA DEME*AZA

*os datos obtenidos fueron tabulados por el programa estadstico

"%"" versión .=! (l análisis estadstico realizado para cada cepa se

presenta a continuación!

9.>.1 Ce"a A. Saccharomyces

cerevisiae

*os datos fueron tabulados por el programa estadstico "%"" versión .= y

se realizó la prueba ;Estudent para dos muestras '.3B y 23B 'pFv))

suponiendo varianzas desiguales y se obtuvieron los siguientes datosH

Ta!la . Datos de media y varianza entre las concentraciones .3B y

23B 'pFv)! Cepa +!C#ncentraci,n 1KG C#ncentraci,n 2KG

Me$i 0,0/ ..,=/=arian& =5 3 ..< .

"egún la primera hipótesis planteada para esta cepa al inicio de la

investigación, se observa que hay diferencia significativa entre la media y

la varianza obtenida entre la concentración del .3B y 23B 'pFv)I por otro

lado, la%';]Vt) de dos colas que se obtuvo fue de 3,=5 que por ser

p]3!5 se rechaza la hipótesis nula '@o) y se acepta la hipótesis alterna

'@i), ya que la producción de biomasa obtenida a la concentración de

melaza al .3B 'pFv) difiere a la producción de biomasa obtenida a la

concentración de melaza al



23B 'pFv), obteniendo me#ores resultados en esta última

concentración! '+nexo @.)!

(n la fermentación realizada en erlenmeyer se obtuvo una producción de

biomasa de 2!00 gFl a la hora . con una concentración de melaza al

23B'pFv) y una producción de biomasa de 20!0/ gFl a la hora . con

una concentración de melaza al 3B 'pFv)! +l comparar las

concentraciones gFl obtenidas en las concentraciones de melaza 23B y

3B 'pFv) se observó que hubo un pequeño incremento en la producción

de biomasa al 3B 'pFv)I sin embargo, los datos al ser tabulados por el

programa estadstico y al realizar la prueba ;Estudent para dos muestras

suponiendo varianzas desiguales se obtuvo los siguientes datosH

Ta!la 1K. Datos de media y varianza entre las concentraciones 23B y3B 'pFv)! Cepa +!

C#ncentraci,n 2KG C#ncentraci,n 'KGMe$i ..,= .2,=

=arian& ..<,. .5=,=

"egún la segunda hipótesis planteada para esta cepa al inicio dela investigación no hay diferencia significativa entre la media obtenida

entre la concentración del 23B y 3B 'pFv)I por otro lado, la %';]Vt) de dos

colas que se obtuvo fue de 3,02 que por ser p^3!5 se acepta la hipótesis

nula '@o) y se rechaza la hipótesis alterna '@i), es decir que las

concentraciones del 23B y

3B 'pFv) de melaza de caña no muestran diferencias estadsticas ya quela

producción de biomasa obtenida a la concentración de melaza al 23B'pFv) no difiere a la producción de biomasa obtenida a la concentración de

melaza al 3B 'pFv) '+nexo @2)!

9.>.2 Ce"a (. Saccharomycesboulardii



(n los datos obtenidos anteriormente, se observo que la mayor

producción de biomasa se obtuvo a la concentración del 23B 'pFv)I sin

embargo, los datos fueron tabulados por el programa estadstico "%""

versión .= y se realizo la prueba ;Estudent para dos muestras

suponiendo varianzas desiguales y se obtuvo los siguientes datosH

Ta!la11. Datos de media y varianza entre las concentraciones .3B y 23B'pFv)! Cepa K!

C#ncentraci n 1KG C#ncentraci n 2KG

Me$i . 2 . =0=arian& .,3 .,=3

Como se observa, no hay diferencia significativa entre la media y la

varianza obtenida entre la concentración del .3B y 23B 'pFv)I por otro lado,

la %';]Vt) de dos colas que se obtuvo fue de 3,<. que por ser p^3!5 se

acepta la hipótesis nula '@o) y se rechaza la hipótesis alterna '@i), ya que la

producción de biomasa obtenida a la concentración de melaza al .3B 'pFv)

no difiere a la producción de biomasa obtenida a la concentración de

melaza al 23B 'pFv)! %or esta razón, entre estas dos concentraciones se

escogió la del 23B 'pFv) porque se obtuvo una concentración de biomasa

mayor que la del .3B 'pFv)! '+nexo -.)!

(n la fermentación realizada en erlenmeyer se obtuvo una producción de

biomasa de 2!/3 gFl a la hora .= con una concentración de melaza al

23B 'pFv) y una producción de biomasa de !3/ gFl a la hora .

con una concentración de melaza al 3B 'pFv)! +l comparar las

concentraciones gFl obtenidas en las concentraciones de melaza 23B y 3B'pFv) se observó que hubo un pequeño incremento en la producción de

biomasa al 3B 'pFv)I sin embargo, los datos al ser tabulados por el

programa estadstico y al realizar la prueba ;Estudent para dos muestras

suponiendo varianzas desiguales se obtuvieron los siguientes datosH



Ta!la 12. Datos de media y varianza entre las concentraciones 23B y3B 'pFv)! Cepa K!

C#ncentraci,n 2KG C#ncentraci,n 'KGMe$i .,=0 .,2

=arian& . =3 . <3

Como se observa, no hay diferencia significativa entre la media y la varianza

obtenida entre la concentración del 23B y 3B 'pFv)I por otro lado, la %';]Vt)

de dos colas que se obtuvo fue de 3,<5 que por ser p^3!5 se acepta la

hipótesis nula '@o) y se rechaza la hipótesis alterna '@i), ya que la

producción de biomasa obtenida a la concentración de melaza al 23B 'pFv)

no difiere a la producción de biomasa obtenida a la concentración de

melaza al 3B 'pFv)! De esta manera se afirma, que al no haber una

diferencia significativa entre las tres concentraciones se decidió tomar la

concentración del 23B 'pFv)! '+nexo -2)!

De acuerdo con las fermentaciones realizadas anteriormente y al llevar los

datos al programa estadstico "%"" versión .=, se analizaron las tres

concentraciones .3B, 23B y 3B 'pFv) tanto en la cepa + como en la cepa K

y se dedu#o por datos obtenidos como son la media, la varianza, porcenta#e

de variación, coeficiente de variación y la prueba ;Estudent %';]Vt) para dosmuestras suponiendo varianzas desiguales, que la concentración a

seleccionar es del 23B 'pFv), ya que en la producción de biomasa no existe

una diferencia significativa con la obtenida en 3B 'pFv) y esto hace

innecesario gastar .3B 'pFv) mas de melaza lo cual implicara costos y

energa!

9. :ERMENTACIONES EN (IORREACTOR 18*.

*uego de haber escogido la concentración adecuada de melaza '23B 'pFv))

en la cual se observó mayor producción de biomasa según los análisis

estadsticos arro#ados por las fermentaciones realizadas en erlenmeyer, se

llevaron a cabo las fermentaciones en biorreactor 'igura .2)!



:igra 12. Aonta#e debiorreactor .!5*! Aedio melaza23B 'pFv), <QC, .53rpm,

.vvm! uenteH +utores!

*os resultados obtenidos se observaron en la figura . en donde se puede

evidenciar que en la cepa + no hay fase de adaptación y su fase exponencial

llega hasta la hora .= a diferencia de la cepa K que tiene una fase de

adaptación de la hora 3 a la hora empezando su fase exponencial en la

hora = hasta la hora .=!



K i o m a s a ' g F * )

" u s t r a t o ' g F * )

=3 03

3 D3

Kiomasa gF* C(%+ +Kiomasa gF* C(%+ K"ustrato gF* C(%+ +

23 "ustrato gF* C(%+ K

=3

.3 23

3 33 2 = 0 .3 .2 .= . .0 23

;iempo 'horas)

:igra 1'. ermentación en biorreactor .,5*! Aelaza 23B 'pFv)! Cepa + ycepa K!

-nicialmente se traba#ó con un volumen efectivo de traba#o 'G(;) del <5B

'aproximadamente .* de medio), con el cual se presentaron problemas por la

cantidad de espuma generada, afectando la oxigenación a lo largo de la

fermentación! 9ahvi et al., 2332 comprobaron que la generación de espuma

es un interferente en el crecimiento del microorganismo por influir en lascondiciones aerobias del proceso, razón por la cual decidieron utilizar un

antiespumante como la silicona, obteniendo de esta manera me#ores

resultados al final de su investigaciónI por lo tanto, una de las soluciones era

adicionar un antiespumante, sin embargo en esta investigación, se decidió

disminuir el volumen efectivo de traba#o 'G(;) al 53B con las mismas



condiciones controladas de temperatura 3QC, agitación .53 rpm y aireación

. vvm para me#orar el proceso ya que la adición de antiespumantes genera

mayores costos y el ob#etivo de esta investigación fue producir mayor

cantidad de biomasa en un sustrato económico! (ste cambio en el volumen

de los fermentadores hizo que luego de . horas se obtuvieran resultados de

0,gF* en la cepa + y de ,2gF* en la cepa K al final de la fase exponencial

';abla .), resultados que me#oraban notablemente en cuanto a la cantidad

de biomasa comparada con los resultados obtenidos en las fermentaciones

hechas en los erlenmeyer para la cepa + 'igura .)!

*o anterior indica que la biomasa de Saccharomyces cerevisiae producida en

biorreactor logra me#ores resultados de biomasa a lo largo

de lafermentaciónI *os factores que se le atribuyen para la me#or producción de

biomasa en biorreactor son el suministro de aire '.vvm) y la agitación por

turbina 4ushton, lo que proporciona mayor homogenización al medio, mayor

transferencia de masa y oxgeno, en comparación a las fermentaciones

hechas en erlenmeyer las cuales tienen agitación sin turbina! (sto influyó

para que el medio melaza sirviera como un sustrato ideal para la producción

de Saccharomyces en biorreactor! "7ontzou et al., 233 evidenciaron en su

investigación que las condiciones deoxgeno suministradas en las

fermentaciones realizadas en biorreactor y en medios tan ricos en azúcares

como la melaza son de vital importancia para la obtención de biomasa

levaduriforme, ya que gracias a que suministraron .vvm obtuvieron una

concentración de 3gF* de crecimiento de levadura luego de 3 horas de

fermentaciónI la oxidación completa de la fuente de carbono a C:2 y

@2: presenta una producción celular óptima, donde el oxgeno es el

aceptor final de electrones en la fosforilación oxidativa durante la respiración':tterstedt et al., 233=)!



Ta!la 1'. Galores de biomasa y consumo de sustrato! ermentación enbiorreactor .,5*! Aelaza 23B 'pFv)! Cepa + y Cepa K!

Tie"#

#ras

CE-A CE-AKioma

sa 3 03. <0 0 3 53 0 <=<. = .50 0. 2 3 5<0 <. =02 5,<<< 2,50 3,0 =,</5 / .3 =0 02 3 <3 = 302= .=,2== =2,2/ .,==< ==,/25 . /<2 2/ /0 . <3. 2 00 22,33 3,// .,/=/ 2/,20.0 2,/< 2<,25 2,30 2=,3<.3 3,.2 2=,<3/ 2,5<= 2.,0<.2 =,22. 2,.5/ 2,/<0 .5,<=5.= 0,<<= 2.,<= ,20 .3,033. ' 9K' /,5. ' 29' <,<3/.0 0,50/ <,50 ,2<5 ,23 0,0.< ,.<0 ,25 5,22

+l analizar el consumo de sustrato se observó que la fermentación a la

concentración de melaza al 23B inició con una concentración <0gF* para la

cepa + y de 0 gF* para la cepa K debiendo iniciar en una concentración de

.23gF* de sacarosa ';abla .)! (sto se debe a que al centrifugar la melaza

se disminuyó la cantidad de sustrato y el tiempo de esterilización seexcedió de 23 minutos a 23lb de presión lo cual hizo que se disminuyera el

sustrato inicial experimental!

9. DETERMINACIÓN DE -AR<METROS CINHTICOS CON *A

CONCENTRACIÓN SE*ECCIONADA.

*os parámetros a determinar en este estudio fueron Xx Gelocidad

especfica de crecimiento 'hE.), $xFs 4endimiento de biomasa a partir de

sustrato 'gFg), td ;iempo de duplicación 'h) y productividad 'g*E.Fh)!

9..1 :erentaci,n en erlene3er a la c#ncentraci,n $e /2KG /"07

%ara determinar los parámetros cin1ticos en la fermentación llevada a cabo



( i # 2 a s a g 0 *

en erlenmeyer para la cepa +, se aplicó la cin1tica de orden ., sin embargo

esta cin1tica arro#o un valor de 42 inferior a 3,/3, por lo que no se logró

determinar la velocidad especfica de crecimientoI por lo tanto, se procedió a

aplicar cin1tica de orden 3 para esta serie de datos! "e tomó la faseexponencial de la hora 0 a la hora . ';abla .=), posteriormente se graficó la

concentración gF* en función del tiempo 'igura .=) y en base a esto se

estableció la ecuación en el gráficoH $ V 2,<x E ..,3 con un 42 de

3,/<<!Ta!la 16. Datos de ase exponencial! ermentación enerlenmeyer! Aelaza 23B 'pFv)! Cepa +!

CE-A

Tie # % -r# 0K *n 0#0 <3 . 333 3 333

.3 .= 50 2 .< 3 <<

.2 .<,3. 2,5<. 3,/==

.= 2.,<5. ,22 .,.<

. 2,00. ,//= .,05

3,3

25,3

23,3

.5,3

.3,3

5,3

3,3

y V 2,<x E..,3

42 V3,/<<2

3 5 .3 .5 23

Tie 2 "# /%1

:igra 16. Concentración gF* en función del ;iempo! Saccharomycescerevisiae en erelnemeyer! Aedio melaza 23B 'pFv)! Cepa +!



* n O 0 O #

+l analizar la fase exponencial de la cepa K en fermentaciones en

erlenmeyer '@ora 0 a .=) como se puede observar en la tabla .5, y aplicar

cin1tica de orden . se obtiene la siguiente ecuaciónH $ V 3,3032x E 3,5.

con un 42 de 3,//3! 'igura .5)!

Ta!la 18. Datos de ase exponencial! ermentación enerlenmeyer! Aelaza 23B 'pFv)! Cepa K!

CE-A

Tie # % -r# 0K *n 0#0 .,<0 .,333 3,333.3 2,3=5 .,.=5 3,.5

.2 2 <3 . 2< 3 20

.= 2,/32 .,25 3,=05

3,D

3,5

3,=

3,3,2

3,.

3,3

y V 3,3032x E3,D5D.

42 V3,//3D

E3,. 3 5 .3 .5

Tie 2 "#/%1

:igra 18. Gelocidad especfica de crecimiento de Saccharomycesboulardii en erlenmeyer! Aedio melaza 23B 'pFv)! Cepa K!

(n la ;abla ., se muestran los resultados de los parámetros cin1ticos

nombrados anteriormenteH



Ta!la 19. %arámetros Cin1ticos! ermentación enerlenmeyer! Aelaza 23B 'pFv)! Cepa + y Cepa K!

ER*ENMEER 2KG 07CE-A A CE-A (

P4 /%F 9D 3,3032 40s /g0g 3 2. 3 3.3

T$ % 2!0 0,=- /g*F1 0 % .,03 g*E.F h 3,23< g*E.F h

9DH 9o determinado

*a factibilidad económica de algunos procesos biotecnológicos depende

básicamente del costo de la materia prima! (n la práctica, la selección de un

microorganismo con elevado rendimiento de sustrato en biomasa favorece la

productividad del proceso! &eneralmente, cuando el sustrato es el factor limitante del crecimiento, la cantidad de biomasa producida es proporcional a

la cantidad de fuente de carbono consumida 'Duarte, .//0)!

+l analizar los datos obtenidos de rendimientos de biomasa en sustrato que

se muestran en la tabla ., se observa claramente que la cepa + presentó

un me#or rendimiento en comparación a la cepa K, lo que se ve refle#ado en

los datos de productividad ya que son directamente proporcionales! (n

cuanto al tiempo de duplicación se presentó gran diferencia entre las dos

cepas! "e obtuvo una alta producción de biomasa de la cepa nativa ya que al

ser extrada directamente de la caña de azúcar está habituada a las altas

concentraciones de azúcar, por lo que al realizar las fermentaciones en

melaza de caña no le afectan estas condiciones en comparación a la cepa

comercial que es una levadura liofilizada para fines probióticos!

%or otro lado se comparó el rendimiento de biomasa en sustrato'$xFs) obtenido por parte de Saccharomyces en el

medio $%& con las fermentaciones hechas

en melaza! %ara la cepa + se obtuvieron valores de

3,=3 gFg en $%& y de 3,2 gFg en medio melaza y para la cepa K se



obtuvieron valores de 3,<<= gFg en $%& y de 3,3= gFg en melaza! *o que

afirma que el medio melaza es un sustrato más comple#o rico en nutrientes

pero pobre en requerimientos nutricionales como fuentes de nitrógeno

necesarios para la formación de biomasa!

9..2 :erentaci,n en !i#rreact#r $e 18* a la c#ncentraci,n $e /2KG

/"07.

%ara determinar los parámetros cin1ticos en la fermentación llevada a cabo

en biorreactor de .,5* para la cepa +, se aplicó la cin1tica de orden ., sin

embargo esta cin1tica arro#o un valor de 42 inferior a 3,/3, por lo que no

se logró determinar la velocidad especfica de crecimientoI por lo tanto,

se procedió a aplicar cin1tica de orden 3 para esta serie de datos! "e

tomó la fase exponencial de la hora 3 a la hora .= ';abla .<),

posteriormente se graficó la concentración gF* en función del tiempo

'igura .) y en base a esto se estableció la ecuación en el gráficoH $ V

2,/=x N 2,022 con un 42 de 3,/03!

Ta!la 1>. Datos de ase exponencial! ermentación en

biorreactor .,5*! Aelaza 23B 'pFv)! Cepa +!

CE-ATie # % -r# 0K *n 0#

3 03. . 333 3 333. = .50 . 3/= 3 3/32 5 <<< . 523 3 =./ /,.3 2,==/ 3,0/= .=,2== ,<=< .,2.5 .,/<2 =,=5 .,=/ 22 33 5 </ . <5<0 2 /< < 32= . /=/

.3 3,.2 <,/2 2,3<3

.2 =,22. /,33 2,./0

.= 0,<<= .3,23. 2,22



( i # 2 a s a g 0 *

y V 2,/=x N2,022

42 V 3,/032

53=3

3

23

.3

3

3 5 .3 .5

Tie 2 "#/%1

:igra 19. Concentración gF* en función del ;iempo! Saccharomycescerevisiae en biorreactor! Aedio melaza 23B 'pFv)! Cepa +!

+l analizar la fase exponencial de la cepa K en fermentaciones en biorreactor

'@ora = a .=) como se puede observar en la tabla .0, y aplicar cin1tica de

orden . se obtiene la siguiente ecuaciónH $ V 3,3<02x N 3,<03. con un 42

de

3,/5! 'igura .<)!

Ta!la 1. Datos de ase exponencial! ermentación enbiorreactor .,5*! Aelaza 23B 'pFv)! Cepa K!

CE-ATie # % -r# 0K *n 0#

= .= 2== <=< . 2.5 . /<2 = =5 . =/ 22 33 5 </ . <5<

0 2 /< < 32= . /=/.3 3,.2 <,/2 2,3<3.2 =,22. /,33 2,./0.= 0,<<= .3,23. 2,22



* n O 0 O #

2,3

y V 3,3<02x N3,<03.

42 V

3,/D5

.,5

.,3

3,5

3,33 . 2 = 5 < 0 / .3 .. .2 .

.= .5

Tie "# /%1

:igra 1>. Gelocidad especfica de crecimiento de Saccharomycesboulardii en biorreactor! Aedio melaza 23B 'pFv)! Cepa K!

(n la ;abla ./, se muestran los resultados de los parámetros cin1ticos

nombrados anteriormenteH

Ta!la 1. %arámetros Cin1ticos! ermentación enbiorreactor .!5*! Aelaza 23B 'pFv)! Cepa + y Cepa K!

(IORREACTOR 2KG 07CE-A CE-A (

P4 /% 9D 3,3<02 40s /g0g 3 . 3 35

T$ % .,=.. 0,0- /g*F1 0 % 2,</ *E.F h 3,2 *E.F h

9DH 9o determinado +l analizar los datos obtenidos de rendimientos de biomasa en sustrato que

se muestran en la tabla ./, se observa claramente que la cepa + presentó

un me#or rendimiento en comparación a la cepa K, lo que se ve refle#ado en

los datos de productividad al igual que en los parámetros cin1ticos en

erlenmeyer!

(n la tabla ./, se observa que la cepa + presentó un tiempo de duplicación

de .,=.. horas lo que se ve refle#ado a lo largo de las fermentaciones



realizadas en biorreactor, ya que esta cepa nativa al tener un menor tiempo

de duplicación obtuvo mayor producción de biomasa alcanzando la fase

estacionaria a la hora .= al igual que la cepa K! "in embargo, esta última al

ser una cepa comercial y al no estar adaptada a concentraciones altas deazúcar presenta un tiempo de duplicación mas prolongado de 0,0 horas lo

que se ve refle#ado en una menor producción de biomasa!

+l comparar los parámetros cin1ticos de fermentaciones realizadas en

erlenmeyer y biorreactor de .!5*, se observa que en la cepa + hay un

rendimiento más alto en biorreactor que en erlenmeyer en comparación con

la cepa K que no mostró ninguna diferencia, lo que se puede corroborar con

la relación directa que existe entre la productividad y los rendimientos! (stas

diferencias observadas de la cepa + con la cepa K tanto en erlenmeyer como

en biorreactor pudo deberse a los factores en el laboratorio mencionados

anteriormente en cuanto a las condiciones mane#adas en el biorreactor!

%or literatura la respiración libera más energa que la fermentación, además

es el proceso preferido por las levaduras! +lgunas especies de

Saccharomyces cerevisiae son sensibles a la glucosa y su respiración es

reprimida a concentraciones de mas de .gF*! Ka#o estas condiciones se

disminuye la biomasa ';reybal, ./00)!

*os niveles altos de oxgeno disuelto no afectan la fermentación, indicando

que los niveles cercanos al 23B de saturación son necesarios para el

mantenimiento de las c1lulas y su crecimiento! %or otro lado, la alta

concentración de azúcares es tambi1n un efecto inhibitorio sobre el

crecimiento celular, aunque hay algunas cepas más tolerantes que otras! (n

fermentaciones oxig1nicas la tasa de crecimiento especfico de una cepa de

Saccharomyces cerevisiae ha demostrado que disminuye a medida que la

concentración de azúcar aumenta 'iechter et al., ./0.)! (n cultivos de



Saccharomyces es importante que la concentración inicial de azúcar en el

medio de cultivo no sea alta ya que puede inhibir el crecimiento de las c1lulas

debido a la alta concentración de sustrato, por lo que la mayora de veces, el

citoplasma celular posee una mayor concentración de solutos que el medioexterior de modo que el agua difunde hacia el interior celularI sin embargo,

cuando una c1lula está en un ambiente con ba#a actividad de agua, existe

una tendencia de salida del agua intracelular! Cuando una c1lula se introduce

en una solución con ba#a actividad de agua, tal como una disolución de

azúcar, pierde agua y se produce plasmólisis 'Carballo, 2333)!

De esta manera, se resalta que la concentración de melaza no puede ser tanalta porque puede inhibir el crecimiento como se observa al comparar la cepa

+ con la cepa K, indicando que la cepa + es más resistente a las altas

concentraciones de sustrato debido a que es una cepa nativa extrada de la

melaza de cañaI mientras que la cepa K al ser una cepa comercial liofilizada

no está adaptada a altas concentraciones de azúcar, lo que influyó para que

la producción de biomasa fuera menor! (n esta parte es claro que el p@ del

medio y la temperatura no influyeron en la producción de biomasa de la cepa

K, ya que esta cepa al ser probiótica debe ser tolerante a p@ ácidos y a

temperaturas hasta de <QC! Aantener el p@ en el rango que el cultivo

normalmente experimente durante la fermentación es lo mas adecuado y

generalmente esta en el rango de =!3 a 5!3 'uller, .//2)!



CONC*USIONES

o "e determinó que 23B 'pFv) fue la concentración adecuada de melaza de

caña como un medio de fermentación para la producción deSaccharomyces cerevisiae arro#ando rendimientos de biomasa a partir de

sustrato $xFs '3,.2 gFg), ;d '.,=.. h) y productividad '2,</ g*E.F h)!

o +l comparar estadsticamente la producción de biomasa al 23B y 3B 'pFv)

en erlenmeyer, se observó que no hay diferencia significativa entre estas

dos concentraciones por lo que la producción de biomasa obtenida al 23B

no difiere a la obtenida en la concentración del 3B!

o *a melaza de caña requiere de un preEtratamiento adecuado para ser

utilizada como sustrato en procesos biotecnológicos, debido a las

impurezas presentes por ser un producto agro industrial!

o "e comprobó que Saccharomyces posee la enzima invertasa la cual

hidroliza la sacarosa y es asimilada con mayor facilidad!

o "e estableció que la ampicilina es un buen agente control en las

fermentaciones ya que inhibió la flora acompañante en la melaza y la

levadura no fue afectada en la producción de biomasa!

o "e comprobó que el medio melaza de caña al 23B 'pFv) es un medio

medianamente productivo y altamente selectivo para Staphylococcus

aureus.



(I(*IORA:QA

Agirre A. 233! :btención de un biopreparado a partir de cepas nativas delevaduras para ser empleado como probiótico! ;esis de Aaestria

Aicrobiologa! acultad de Ciencias! Departamento de Aicrobiologa!

%ontificia Jniversidad Laveriana! Kogotá, Colombia! 2<E3p!

An,ni#. -nstituto Colombiano +gropecuario '-C+)! ./0.! -ndustrialización

de la Caña de +zúcar! Compendio 9o! =2! Kogotá, Colombia!

An,ni#. -nstituto Colombiano de 9ormas ;1cnicas '-C:9;(C)! .//=!

-ndustrias +limentarias e -ndustriales de bebidas! Aelaza de Caña 9;C!50<!

Kogotá, Colombia!

Ari&a (. 3 #n&ale& *. .//<! %roducción de %rotena Jnicelular a partir de

levaduras y melaza de caña de azúcar como sustrato! ;esis de pregrado

Kacteriologa! %ontificia Jniversidad Laveriana! acultad de Ciencias!

Departamento de Kacteriologa! Kogotá! Colombia! 22E2<p!

extraccion de melaza de caña como sustrato para la producción(acho sarzuri marisol)

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