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EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Pentacalia nítida Y EVALUACIÓN
DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO PROTEICO ACUOSO
LINA DANIELA LÓPEZ QUIMBAYO
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Microbióloga Industrial.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C.
2012
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Pentacalia nítida Y EVALUACIÓN
DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO PROTEICO ACUOSO
LINA DANIELA LÓPEZ QUIMBAYO
____________________ _________________________
Dra. INGRID SCHULER. JANETH ARIAS PALACIOS, M.Sc
Decana académica Directora de Carrera
Facultad de Ciencias Microbiología Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
2012
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Pentacalia nítida Y EVALUACIÓN
DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO PROTEICO ACUOSO
LINA DANIELA LÓPEZ QUIMBAYO
_______________________ ____________________
Dr. RICARDO VERA BRAVO Dra. ALIX E. LOAIZA
Director Jurado
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
2012
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y
porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en
ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución Número 13 de julio de 1946.
Este trabajo de grado se encuentra financiado bajo el proyecto de investigación de convocatoria
interna titulado “Evaluación de la actividad antimicrobiana y antifúngica de las fracciones proteicas
de los extractos polares de hojas y semillas de las especies Pentacalia nitida, Pentacalia ledifolia,
Conyza trihecatactis y Conyza bonariensis nativas de los páramos colombianos”. Dirigido por el
profesor Ricardo Vera, perteneciente al grupo GIFUJ del Departamento de Química de la Pontificia
Universidad Javeriana.
AGRADECIMIENTOS
Quisiera expresar mis agradecimientos a:
Dios por ser la razón de todo.
Mis padres por brindarme amor y apoyo incondicional durante toda mi vida, por que por ellos
puedo desarrollar este trabajo, muchas gracias papis por todo.
Mi hermanita por brindarme ánimo y alegría.
A la Pontificia Universidad Javeriana por brindarme los recursos y formarme como persona.
Profesor Ricardo Vera por su asesoría, conocimientos y acompañamiento durante el desarrollo del
trabajo de grado.
Profesor Alex Rodríguez por todo el tiempo dedicado, por sus sugerencias y conocimientos que
fueron de suma importancia.
Al grupo de Química de Macromoléculas: Diana Gómez por su colaboración incondicional con todo
en el laboratorio, a Max Martínez por su ayuda y a Juliana Vásquez por su amistad y ayuda
incondicional. Sin ustedes habría sido más difícil.
Dra. Ofelia Díaz por facilitarme los materiales necesarios para desarrollar el trabajo de laboratorio.
Felipe por su alegría, comprensión y ser incondicional siempre.
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................................................ 1
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................. 2
JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................ 3
MARCO TEÓRICO Y REFERENTES CONCEPTUALES ............................................................................. 4
1.1 Pentacalia nítida ............................................................................................................................ 4
1.2 Extracción y precipitación de proteínas en plantas ...................................................................... 5
1.3 Péptidos antimicrobianos.............................................................................................................. 5
1.4 Microorganismos patógenos ......................................................................................................... 7
1.4.1 Bacterias ..................................................................................................................................... 7
1.4.2 Hongos........................................................................................................................................ 7
OBJETIVOS........................................................................................................................................... 8
METODOLOGÍA ................................................................................................................................... 9
1. Recolección del material vegetal .................................................................................................... 9
2. Extracción y determinación del contenido de proteína .................................................................. 9
3. Obtención de proteína .................................................................................................................... 9
3.1.1 Sulfato de amonio ...................................................................................................................... 9
3.1.2 TCA-Acetona ............................................................................................................................. 10
3.1.3 Fenol-Tris .................................................................................................................................. 10
4. Cromatografía ............................................................................................................................... 11
5. Electroforesis ................................................................................................................................. 11
6. Cuantificación de Proteína ............................................................................................................ 11
7. Actividad antimicrobiana .............................................................................................................. 11
7.1 Prueba difusión en agar .............................................................................................................. 12
7.1.1 Bacterias ................................................................................................................................... 12
7.1.2 Hongos...................................................................................................................................... 12
7.2 Microdilución con cloruro de 2, 3, 5, - trifenil-tetrazolio (TTC) .................................................. 12
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................................... 13
1. Identificación de la planta ............................................................................................................. 13
2. Extracción de las proteínas de hojas y semillas de P. nítida ......................................................... 13
3. Obtención de proteínas y perfiles electroforéticos ...................................................................... 14
4. Cromatografía ............................................................................................................................... 18
5. Actividad antimicrobiana .............................................................................................................. 19
CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 21
RECOMENDACIONES ........................................................................................................................ 21
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 22
ANEXOS ............................................................................................................................................. 25
1
RESUMEN
Los estudios respecto a los productos naturales con actividad antimicrobiana han venido en auge,
debido a la importancia que esta cobrando la resistencia que presentan los microorganismos hacia
los antibióticos sintetizados químicamente que se usan ampliamente para combatir
enfermedades.
El objetivo de este trabajo de grado fue extraer y evaluar la actividad antimicrobiana del extracto
acuoso proteico a partir de las semillas y las hojas de la planta Pentacalia nitida, frente a las cepas
de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis
spp y Colletotrichum spp; para alcanzar los objetivos específicos propuestos primero se evaluaron
3 soluciones buffer para extracción: Tris-HCl, HEPES y Fosfato; la mayor recuperación de la
proteína se obtuvo con el buffer fosfato, además al evaluar el corrido electroforético este mostró
mejor definición de bandas respecto a los otros dos.
Para definir el perfil electroforético se realizaron 3 métodos de obtención de proteína: Sulfato de
amonio, TCA-Acetona y Fenol-Tris; a partir de los métodos de sulfato de amonio y TCA-Acetona se
definieron los perfiles electroforéticos de las hojas y semillas de Pentacalia nitida, mientras que el
método de fenol- Tris según el protocolo empleado, no permitió la definición del perfil
electroforético.
Para evaluar la actividad antimicrobiana, la obtención del extracto proteico se llevó a cabo con la
precipitación con sulfato de amonio, método no denaturante que conserva la actividad de las
proteínas. En la determinación de la actividad antimicrobiana se evaluaron dos métodos, el
primero por prueba de difusión en agar tanto para las bacterias como hongos, el segundo por
microdilución con 2,3,5,- trifenil-tetrazolio (TTC) para las bacterias, a partir de estas pruebas se
concluyó que los extractos proteicos acuosos en las concentraciones empleadas, tanto de semillas
y hojas de Pentacalia nítida no presentan actividad antimicrobiana frente a los microorganismos
evaluados.
2
INTRODUCCIÓN
Las plantas se han usado a lo largo de la historia de la humanidad como agentes curativos, esta
propiedad se descubrió por ensayos y errores donde los humanos seleccionaban aquellas que eran
benéficas para la salud, esta experiencia se ha transmitido de generación en generación (1); Las
plantas son fuente de innumerables recursos renovables que mejoran la vida de las personas, por
esto es necesario realizar estudios que permitan buscar compuestos biológicamente activos que
brinden alternativas frente a los medicamentos actuales mediante bioensayos que detecten la
actividad de los extractos de las plantas.
Las plantas del género Pentacalia se consideran plantas promisorias de Colombia, pertenecen al
orden Asterales, al que pertenecen aproximadamente 19.000 especies de plantas herbáceas (2) de
las cuales se han aislado y caracterizado metabolitos secundarios de diferente naturaleza química
los cuales han presentado actividades repelentes, plaguicidas, citotóxicas, antiprotozoarias,
tripanomicidas, antibacteriales y antioxidantes (3).
Pentacalia nítida, es un matorral que se encuentra en el Páramo de Sumapaz, entre 2000 a 3850
msnm (4). Los estudios realizados por el grupo de Fitoquímica de la Pontificia Universidad
Javeriana sobre esta planta se han dirigido a aislar y caracterizar diferentes metabolitos
secundarios como flavonoides, terpenos, cumarinas, mezclas de ácidos grasos, hidrocarburos
alifáticos tipo triacontano, esteroides y el cicloartano (3).
Este trabajo de grado pretende complementar los estudios realizados con esta especie,
estableciendo el perfil electroforético de los extractos proteicos y evaluar si estos presentan
actividad antimicrobiana, puesto que no se ha reportado hasta la fecha un estudio con estas
características de las hojas y semillas de Pentacalia nítida.
3
JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En los últimos años se ha incrementado la resistencia que presentan los microorganismos frente a
los antibióticos, debido a que las personas no siguen los esquemas de tratamientos médicos y
usan estos medicamentos indiscriminadamente; Los microorganismos desarrollan genes de
resistencia frente a los antibióticos que al transferirse horizontalmente agravándose el
problema(5).
Las plantas son una alternativa usada por nativos para tratar enfermedades, existen numerosos
productos naturales que poseen la misma actividad antifúngica y antibacterial que tienen los
mismos efectos que los productos sintetizados químicamente.
Las plantas del género Pentacalia han sido empleadas por los campesinos Cundiboyacenses para
curar forúnculos, tratar dolores de garganta, sus partes aéreas en decocción para contrarrestar los
efectos de venenos, las hojas maceradas como desinfectantes y cicatrizantes de heridas difíciles
(3). Este conocimiento tradicional de las comunidades cercanas a estas plantas se debe validar
con estudios para determinar su actividad biológica, ya que en un futuro podría ser alternativa
para tratar infecciones (6).
Algunas proteínas y péptidos exhiben actividad antimicrobiana y debido a que son de origen
natural pueden ser una alternativa para los problemas de resistencia a antibióticos, se podrían
usar como conservantes de productos alimenticios, en la industria farmacéutica, como controlador
biológico y como agentes antimicrobianos en el tratamiento de infecciones (7) además los
extractos proteicos con actividad antimicrobiana brindan una alternativa para productos
químicamente sintetizados puesto que son recursos renovables y no presentan efectos adversos
para el medio ambiente; son conocidos como péptidos antimicrobianos (AMPs de su sigla en inglés
Antimicrobial peptides) que constituyen mecanismos de defensa presente en plantas, insectos y
vertebrados, son componentes evolutivamente conservados y ejercen actividades
inmunomoduladoras (8), estos péptidos antimicrobianos se clasifican de acuerdo a su tamaño y
estructura (helicoidal y lineal) (7).
El género Pentacalia se considera como parte de las plantas promisorias de Colombia de las que
se han aislado metabolitos secundarios que presentan actividad biológica importante (9), sin
embargo no se han llevado a cabo estudios que permitan demostrar la actividad antimicrobiana de
los extractos proteicos acuosos de las hojas y las semillas de Pentacalia nítida.
4
MARCO TEÓRICO Y REFERENTES CONCEPTUALES
La purificación y extracción de proteínas se remonta hace más de 200 años; los primeros reportes
que existen de aislar sustancias a partir de plantas con propiedades similares a la albúmina del
huevo se llevaron a cabo por Foucroy en 1789; durante el siglo XIX se purificaron gran cantidad de
proteínas (10).
De Pentacalia nítida se conoce su morfología, la distribución geográfica en el país, las especies
asociadas y algunos metabolitos secundarios no proteicos que se han estudiado en la Pontificia
Universidad Javeriana (3) pero antes de la realización de este estudio no se tenía información a
cerca de la composición de los extractos proteicos de esta planta y si estos presentan algún tipo de
actividad antimicrobiana.
Los microorganismos que se usan para determinar la actividad antimicrobiana son patógenos, las
bacterias causan enfermedades transmitida por alimentos siendo de importancia para el estudio.
Escherichia coli es un habitante normal del intestino grueso de los seres humanos, que puede
llegar a causa enfermedades entéricas e infecciones urinarias (11). Staphylococcus aureus es un
patógeno humano que se conoce por ser causante de bacteriemia adquirida en los hospitales
ocasionando infecciones en pacientes (12). Listeria monocytogenes, que causa listeriosis que se
contagia por la ingesta de alimentos contaminados (13). Los hongos que se evaluaron son
patógenos de plantas siendo de importancia agrícola, pues causan enfermedades a los cultivos
afectando la economía y la productividad del sector agrícola del país.
1.1 Pentacalia nítida:
Es un arbusto reportado en Ecuador y Colombia, en nuestro país se encuentra en los
departamentos de Arauca y Cundinamarca. Su nombre común es Guasquín, Huasguín, Basgüín o
Guasgüín (14).
Los estudios que se han realizado en la Pontificia Universidad Javeriana han determinado la
presencia de productos naturales glicosilados, en los extractos de hojas de P. nítida, se
5
identificaron los glicósidos de fracciones más polares: Rutina y (1 hidroxi – 4 –oxo- 2,5- ciclohexan
– dienil) acetato de 6´-escopolinilo y un flavonoide identificado como 5-hidroxi, 3,7,4´- trimetoxi
flavona; los glicósidos son importantes a nivel farmacológico, algunos presentan actividad
antimicrobiana y se usan como colorantes (3).
1.2 Extracción y precipitación de proteínas en plantas:
Las plantas presentan poco contenido de proteínas comparado con los tejidos animales, puesto
que solo 1-2% de la célula es citoplasma donde están las proteínas y el resto del volumen celular lo
componen las vacuolas y la pared celular, estas dos secciones de la célula presentan gran cantidad
de fenoles, terpenos, pigmentos, ácidos orgánicos, carbohidratos y otros compuestos no proteicos
que son interferentes al extraer las proteínas y al definir el perfil electroforético de las plantas
(15).
El primer paso a considerar para la extracción es la lisis celular que permite liberar los
componentes de los compartimentos intracelulares, esta lisis debe conservar la integridad de la
proteína; otro factor importante es el buffer de extracción que depende de la naturaleza de la
célula y de la aplicación esperada (16); Para este trabajo se extrajeron las proteínas y se evaluó la
actividad biológica de los extractos proteicos acuosos por esto se aplicó el protocolo de
precipitación con sulfato de amonio que mantuvo intacta la estructura de la proteína y de forma
activa.
El buffer de extracción para las proteínas es un factor importante debido a que son muy sensibles
a los cambios de pH y permite que los resultados sean reproducibles; el buffer en que se haga la
extracción debe evaluarse desde diferentes puntos de vista considerándose las interacciones
posibles con otros componentes, la compatibilidad con técnicas de purificación, absorción UV y
costo (16).
1.3 Péptidos antimicrobianos:
Los organismos se exponen a infecciones por contacto o ingesta de microrganismos patógenos
(17) la sobrevivencia de este en el cuerpo depende del mecanismo de defensa que tenga el
hospedero (18), o de péptidos endógenos que pueden ser o no inducidos produciendo una
6
respuesta rápida y efectiva frente al microorganismo patógeno, estos se dominan péptidos
antimicrobianos (AMP´s) que hacen parte del sistema inmune primitivo presente en insectos,
animales y plantas. (19).
Los péptidos antimicrobianos hacen parte de la defensa antigua de los organismos, se sintetizan
de forma rápida para contrarrestar el ataque de microorganismos, además son pequeños y se
requiere de una mínima inversión de energía para su síntesis, poseen carácter anfipático
permitiéndoles una interacción a nivel de membrana con el patógeno, un ejemplo de estos
péptidos son las ceproninas que se acumulan en la hemolinfa de muchos vertebrados en respuesta
a una lesión o infección (20); por otra parte las plantas sintetizan péptidos antimicrobianos como
defensinas y tioninas al ser invadidas por microorganismos (21), estos hacen parte del sistema
inmune innato, se producen por diferentes tipos de células y se pueden expresar de forma
inducible o constitutiva, además poseen un amplio espectro frente a microrganismos (22).
Los péptidos antimicrobianos tienen pesos moleculares menores a 10 KDa (17), se clasifican es 5
grupos según su estructura y abundancia de aminoácidos en: alfa hélice, péptidos ricos en cisteína
que pueden ser catiónicos o aniónicos y estabilizados con puentes disulfuro, hojas betas, péptidos
ricos en aminoácidos regulares y aquellos que poseen aminoácidos modificados (19).
El modo de acción de estos péptidos depende de su naturaleza anfipática que le permite
interactuar con la membrana de la bacteria al ser reconocidos y produciendo una alteración de
esta (23), estos péptidos pueden formar poros transmembranales, donde las partes hidrofóbicas
del péptido interactúan con los lípidos de membrana, después el péptido se introduce en esta
formando un poro produciendo la muerte del microorganismo; otro mecanismo por el que estos
péptidos tienen actividad antimicrobiana es cuando están en alta concentración entran en
contacto con la cabeza de los fosfolípidos de la membrana permeándola, no se insertan en la parte
hidrofóbica de la membrana pero producen la desintegración de esta pues evita que tenga su
forma normal de bicapa (19).
Debido a su capacidad de destruir la membrana se les considera como un potencial
antimicrobiano, muchos estudios atribuyen a estos péptidos su capacidad para inhibir a bacterias
Gram positivas como Gram negativas así como a virus (24).
7
1.4 Microorganismos patógenos evaluados:
1.4.1 Bacterias:
Escherichia coli, es un bacilo Gram negativo, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae y de
origen entérico muy adaptable pues puede colonizar diferentes ambientes como el tracto
gastrointestinal de mamíferos y aves, además puede crecer en temperaturas de 7 a 45°C y a pH
entre 4 a 10; lo que lo hace un patógeno importante ya que puede estar presente en alimentos
que al ser ingeridos producen enfermedad diarreica; se estima que genera 76 millones de
enfermedades domésticas y 5000 muertes al año (25).
Listeria monocytogenes, es una bacteria Gram positiva, no formadora de esporas y móvil a 22°C,
causante de la enfermedad transmitida por alimentos denominada listeriosis, es una bacteria
oportunista pero también puede afectar a adultos, niños y mujeres en estado de embrazo siendo
las mas afectadas por esta bacteria pues se estima que se presentan 500 muertes por esta
enfermedad y un tercio de estas son mujeres en embarazo; esta bacteria es capaz de sobrevivir a
bajas temperaturas (25).
Staphylococcus aureus, coco Gram positivo, pertenece a la familia Micrococcaceae, causa
intoxicación alimentaria estaficocal, infecciones en la piel, osteomielitis, entre otras
enfermedades; Esta bacteria posee genes que le confieren resistencia a agentes antibacterianos,
siendo de importancia por que se hace difícil su tratamiento (25).
1.4.2 Hongos:
Los hongos evaluados son conocidos fitopatógenos que causan pérdidas económicas en el sector
agrícola; Botrytis sp es un hongo con conidióforos erectros y condios generados en el ápice
redondeados, por ejemplo Botrytis allii es causante de la podredumbre del cuello de cebolla con
efectos destructores del cultivo, por otra parte Fusarium oxysporum, presenta micelio hialino
septado con macroconidos y microconidios, se conoce por causar la amarillez del repollo, la
marchitez de la planta tomate, lo que afecta seriamente el rendimiento de estos cultivos;
Colletotrichum sp, presenta micelio tabicado, ramificado hialino en cepas jóvenes y forman
clamidosporas, es causante de la enfermedad de ahumado o podredumbre superficial de la
cebolla, por ejemplo C. lindermuthianum es causante de antracnosis de la judía causando daños
en la parte aérea de la planta (26).
8
OBJETIVOS
General:
Evaluar la actividad antimicrobiana del extracto acuoso proteico a partir de las semillas y las hojas
de la planta Pentacalia nitida, frente a las cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis spp y Colletotrichum spp.
Específicos:
Obtener el extracto proteico acuoso a partir de semillas y hojas de Pentacalia nítida.
Definir el perfil electroforético del extracto proteico acuoso.
Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos frente a las cepas
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporium,
Botrytis spp. y Colletotrichum spp.
9
METODOLOGÍA
1. Recolección del material vegetal:
La planta Pentacalia nítida se recolectó en el Páramo de Sumapaz, ubicado en el departamento de
Cundinamarca a 3575 msnm con temperatura promedio de 0 a 4 °C, allí se tomaron los tallos de la
planta y se empacaron en bolsas negras luego se transportaron a temperatura ambiente, después
en el laboratorio el material vegetal se conservó en congelación (-20 °C); un ejemplar se llevó al
Herbario de Pontificia Universidad Javeriana para su identificación taxonómica.
2. Extracción y determinación del contenido de proteína:
El material vegetal se maceró en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. Con el fin de
evaluar el mejor buffer de extracción, se tomaron las hojas maceradas en nitrógeno líquido, a 0,1 g
de material vegetal se le agregó 1 ml por cada buffer de extracción, se evaluaron las siguientes
soluciones buffer: Tris-HCl, HEPES y fosfato, cada buffer contenía 0,1 M con KCl 1 mM, EDTA 2
mM y Polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1,5% se ajustó a pH 7.5, se extrajo por 4 horas a 4 °C;
pasado este tiempo se centrifugó a 10.000 gravedades por 5 minutos, la fase acuosa resultante se
precipitó toda la noche a 4 °C con sulfato de amonio al 70% (27). Después se centrifugó a 10.000
gravedades por 10 minutos a 4°C y el pellet se resuspendió en cada uno de los buffers evaluados,
posteriormente se dializó en membrana de diálisis (Spectra/Por® 6 MWCO 1KDa) por 4 horas a
4°C, luego se cuantificó con el método de ácido bicinconinico (BCA) y se realizó electroforesis.
3. Obtención de proteína:
Se realizaron 3 métodos para obtener la proteína:
3.1.1 Sulfato de amonio:
Se tomaron las hojas y las semillas de Pentacalia nítida y se maceraron en nitrógeno liquido hasta
obtener un polvo fino (24), a este se le hicieron 3 lavados con acetona, para 0,1 g de material
vegetal se agrega 1 ml de acetona por cada lavado, se homogenizó y se centrifugó a 10.000
gravedades por 3 minutos, este pre tratamiento permitió extraer del material vegetal clorofilas y
carotenoides y otros compuestos (28), a continuación se dejó secar el material vegetal toda la
noche para que se evapore la acetona en su totalidad.
10
De este material vegetal se tomó 1 g para realizar la extracción con buffer fosfato 0,1 M con KCl 1
mM, EDTA 2 mM y Polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1,5% y a un pH 7.5 (27), se dejó en extracción a
4 °C por 4 horas, después se centrifugó a 10.000 gravedades por 5 min a 4 °C, el extracto acuoso
obtenido se precipitó toda la noche a 4°C con sulfato de amonio al 70% agregándolo en polvo y
disolviéndolo (27). Pasado este tiempo se centrifugó a 10.000 gravedades por 10 minutos a 4°C y
el pellet se resuspendió en buffer fosfato, posteriormente se dializó en una membrana de diálisis
(Spectra/Por® 6 MWCO 1KDa) con buffer fosfato a 4°C por 4 horas, finalmente el extracto
dializado se pasa por un filtro de 0,22 µm.
Este procedimiento de precipitación de la proteína con sulfato de amonio se utiliza para realizar
los ensayos de actividad antimicrobiana y para la cromatografía.
3.2 TCA-Acetona:
Las semillas y hojas de Pentacalia nítida se maceraron en nitrógeno líquido, luego se les agregó
0,0025g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) por cada 1 g de material vegetal, posteriormente a este
material vegetal se le realizaron 3 lavados con acetona fría, centrifugando a 10.000 gravedades
por 3 min a 4°C entre cada lavado.
Por cada 0,1 g de material vegetal se adicionó 1 ml de buffer fosfato con 1,5% PVPP, 10mM KCl y 2
mM EDTA, pH 7.5, se dejó en extracción por 2 horas a 4°C, después se centrifugó a 12.000
gravedades por 20 minutos a 4°C al sobrenadante se adicionó la solución de precipitación que
contiene 10% de ácido tricloroacetico (TCA) y 0,07% de betamercaptoetanol en 2 ml de acetona
fría, luego se sonicó la muestra por 30 min y se dejó precipitar toda la noche a -20°C. Después se
centrifugó a 12.000 gravedades por 20 minutos a 4 °C, se descartó el sobrenadante y al pellet se le
realizó tres lavados con 400 µL de acetona fría centrifugando a 10.000 gravedades por 5 minutos a
4°C entre cada lavado, finalmente el remanente de acetona presente en el pellet se dejó secar y
este se resuspendió en buffer fosfato (29).
3.3 Fenol-Tris:
A partir de 0,1 g de material vegetal macerado en nitrógeno líquido y con 2,5% de
Polivinilpolipirrolidona (PVPP), se le agregó 0,2 ml de buffer que contiene: Tris-HCl 500 mM, EDTA
50 mM, Sucrosa 700 mM, KCl 100 mM, 2% de betamercaptoetanol y Pefabloc 4 mM a un pH 8, se
agitó en hielo por 5 min y se agregó 0,2 ml de buffer Tris saturado con fenol y se dejó 10 min a
temperatura ambiente, posteriormente se centrifugó a 10.000 gravedades por 10 minutos. Se
recuperó la fase superior (fenólica) y se adicionó 0,2 ml de buffer de extracción, se agitó y se
centrifugó 10.000 gravedades por 10 min después se recuperó la fase fenólica; a esta fase se le
adicionaron 4 volúmenes de solución de precipitación (Acetato de amonio 0,1 M en metanol) y se
11
dejó toda la noche a -20°C, después se centrifugó a 10.000 gravedades por 10 min, se realizaron 3
lavados con solución de precipitación fría y un lavado con acetona fría, se deja secar el pellet y
resuspendió (30).
4. Cromatografía:
Se realizó cromatografía en columna de intercambio iónico Q- Sepharose, con flujo de 4,5 ml/ min,
volumen de 5 ml; La columna previamente fue equilibrada con buffer fosfato 500 mM pH 7.5, se
añadió 1 ml del extracto proteico acuoso de las hojas de la planta que se obtuvo por el método de
sulfato previamente descrito. Las proteínas se eluyeron de la columna con buffer fosfato 500 mM
con NaCl pH 7.5, con 2 gradientes 50% y 100% del buffer eluyente, se monitoreó la absorbancia de
las proteínas eluidas a 280 nm.
5. Electroforesis:
Se realizó electroforesis de una dimensión SDS-PAGE con el sistema de Laemmli (31) en cámara de
electroforesis Mini-PROTEAN® Tetra cell, a partir de los extractos proteicos acuosos de semillas y
hojas obtenidos por los métodos de: TCA-Acetona, fenol-Tris y sulfato de amonio, también de las
tres soluciones buffer: Tris-HCl, HEPES y fosfato; se llevaron a cabo en geles del 12% de acrilamida,
se corrieron a 120 V constantes por aproximadamente 1 hora y fueron teñidos con azul de
Comassie (32) y con plata (33). El peso molecular de las proteínas se determinó por la
comparación de la movilidad electroforética de la muestra con el patrón.
6. Cuantificación de Proteína:
Las proteínas obtenidas por los diferentes métodos que se llevaron a cabo en el trabajo, se
cuantificaron por el método del BCA por sus siglas en ingles ácido binciconico, se realizó según el
protocolo del Kit de Thermo Scientific: Pierce Microplate BCA Protein Assay Kit No. 23252. (34).
7. Actividad antimicrobiana:
Para determinar la actividad antimicrobiana de los extractos proteicos acuosos de las hojas y las
semillas obtenidos de Pentacalia nítida se evaluaron 2 metodologías:
12
7.1 Prueba Difusión en agar:
7.1.1 Bacterias:
A 1 ml de la bacteria con 105 UFC/ ml se le adicionó 7 ml de agar semisólido Tripticasa soya (TSA),
se homogenizó y se agregó a una caja de Petri con agar TSA para Escherichia coli, Staphylococcus
aureus y TSA suplementado con 0,6% de extracto de levadura para Listeria monocytogenes,
después de que el agar se solidificó se realizaron pozos con una pipeta Pasteur y se agregó 50 µL
de: Extracto proteico acuoso de hojas o semillas, control positivo se usa Cloranfenicol (1 mg/ml) y
control negativo Buffer Fosfato pH 7.5 en cada pozo (35), se realizó por triplicado.
7.1.2 Hongos:
Los hongos se sembraron por punción central en agar papa dextrosa (PDA) suplementado con
cloranfenicol al 0,02%, se incubaron por 5 días y después de este tiempo los hongos presentaron
un crecimiento radial de aproximadamente 4 cm; se realizaron pozos en el agar con una pipeta
Pasteur y se agregó 50 µL de: Extracto proteico acuoso de hojas o semillas, control positivo se usa
Terbinafina 2,5 mg/ml y control negativo Buffer Fosfato pH 7,5 en cada pozo (35), se realizó por
triplicado.
7.2 Microdilución con cloruro de 2, 3, 5, - trifenil-tetrazolio (TTC):
Esta técnica se desarrolló en microplacas de 96 pozos, en cada pozo se adicionó: 50 µL de
suspensión bacteriana con 105 UFC/ ml, 50 µL del extracto proteico acuoso de semillas o hojas y
100 µL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) para Escherichia coli, Staphylococcus aureus y para
Listeria monocytogenes caldo BHI con 0,6% de extracto de levadura, se homogenizó y se incubó a
37°C por 24 horas. Posteriormente se le agregó a cada pozo 20 µL de TTC (20mg/ml) y se dejó
incubar por 1 hora a 37°C, después de este tiempo se observó el crecimiento del microorganismo
por medio de la aparición de una coloración roja que indica crecimiento de la bacteria es decir que
no hay inhibición (36).
13
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Identificación de la planta:
La planta Pentacalia nítida fue identificada en el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana
donde le asignaron el siguiente número de identificación HPUJ: 27544, estableciendo que
efectivamente era el género Pentacalia y especie nítida.
2. Extracción de las proteínas de las hojas y semillas de P. nítida:
Para realizar la extracción de las proteínas de la planta es necesario hacer lisis de los tejidos pues
las células vegetales son complejas, ricas en polisacáridos y otros compuestos que son difíciles de
destruir, la forma más común de realizarlo es utilizando maceración con nitrógeno líquido que
minimiza la degradación de la proteína, además el éxito de la extracción de la proteína depende
de la fineza del polvo del tejido obtenido (37), por esto en las tres metodologías evaluadas se
maceró el material vegetal con nitrógeno líquido, ya que es ampliamente usado en protocolos
para extracción de proteínas de tejidos vegetales (30, 38).
Otro aspecto importante en la extracción de proteínas es el buffer a utilizar, en el trabajo se
evaluaron 3 buffers de extracción: Tris-HCl, HEPES y fosfato a un pH 7.5, como se observa en la
tabla 1, los resultados muestran que la mayor concentración de la proteína se obtiene con el
buffer fosfato, la segunda con HEPES y por último con el buffer Tris-HCl pero cabe mencionar que
este es un interferente con el método de BCA desde 2.5 mM (39); El buffer fosfato presentó la
concentración de proteína mas alta y este buffer no interfiere con el método de cuantificación
BCA, además se ha reportado en la literatura que es compatible con cromatografía y es económico
(16), siendo ventajas para la extracción de proteínas a partir del material vegetal.
14
Tabla 1: Concentración de la proteína de hojas de Pentacalia nítida extraída con 3 soluciones
buffer, y precipitada con sulfato de amonio. Cuantificación con BCA, se realizó por triplicado.
En un estudio realizado por Chun y colaboradores en 2007, donde se extrajeron y aislaron
proteínas del tipo globulinas a partir de semillas de soya, evaluaron diferentes pH (7.5, 8, 8.5 y 9)
para el buffer de extracción Tris-HCl, y establecieron que el mayor porcentaje de proteína que se
recuperó fue con el buffer pH 8.5 y con pH 7.5 se obtuvo el menor valor de proteína (40);
comparando con los resultados obtenidos en este trabajo el pH del buffer Tris-HCl no fue el más
adecuado, puesto que a pH mas alcalinos se extrae mayor proteína y al ser interferente con el
método de cuantificación no es el ideal para la extracción.
El buffer fosfato es el más apropiado para la extracción de proteínas a partir del material vegetal
de Pentacalia nítida pues presenta una alta concentración de proteína y en el corrido
electroforético este buffer permitió definir mas bandas comparando con los otros dos buffers
evaluados, como se observa en la figura 13 del anexo donde se realizó electroforesis a partir de
los 3 buffers de extracción.
3. Obtención de proteínas y perfiles electroforéticos:
Los primeros resultados obtenidos en el trabajo presentaron problemas al obtener el perfil
electroforético de los extractos proteicos acuosos por precipitación con sulfato de amonio, debido
a que no se tenía una resolución de bandas, entonces fue necesario buscar otros métodos que
permitieran definir el perfil, por tal razón se compararon los 3 métodos: TCA-Acetona, fenol-Tris y
sulfato de amonio, estos diferentes métodos de obtención de proteína se evaluaron con el fin de
determinar cual permitía una mayor recuperación de la proteína y una mejor definición del perfil
electroforético.
Buffer Proteína µg/ml
Tris-HCl 134 ± 20
HEPES 182,3 ± 6,6
Fosfato 657,3 ± 18,3
15
Las plantas son ricas en metabolitos secundarios que interfieren con la separación de las proteínas
afectando la calidad de la electroforesis, la expresión de estos depende de la edad y el desarrollo
de la planta; compuestos como los fenoles pueden construir complejos irreversibles con las
proteínas, además la oxidación de compuestos fenólicos puede generar puntos en electroforesis
de 2 D (37) por eso para evitar estas interferencias con compuestos fenólicos, el buffer de
extracción usado contenía Polivinilpolipirrolidona (PVPP), un polímero de adsorción selectiva de
polifenoles, mediante la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos fenólicos y el
oxígeno del grupo amida del anillo pirrolidona (41) este compuesto permite desde el momento de
la extracción eliminar los polifenoles del material vegetal.
Los métodos para extraer proteínas deben ser reproducibles para todos los tipos de plantas y con
poca contaminación de otras moléculas, en cuanto a los métodos de TCA-Acetona y fenol-Tris son
ampliamente reportados para electroforesis de 2D (29). El método de TCA- Acetona permite
inhibir las proteasas, fenolidasa y peroxidasas, la forma en que se precipita la proteína se debe a
que la proteína se desnaturaliza en el medio ácido dado por el ácido tricloroacético y esta se
precipita al exponer sus residuos insolubles (37); este método se considera compatible con una
gran variedad de tejidos de plantas, es desnaturalizante e inhibe las proteasas que podrían afectar
la muestra de proteínas (30) por esta razón los extractos obtenidos con este método no se usaron
para determinar actividad antimicrobiana puesto que al desnaturalizar la proteína su actividad
biológica se pierde.
El método del fenol-Tris es un método alternativo al de TCA-Acetona ya que permite retirar
lípidos, polisacáridos y compuestos fenólicos que son interferentes en la electroforesis (30), de
acuerdo a los resultados obtenidos este método no resultó eficiente pues no se logró una
definición de bandas como se observa en la figura 1 y 2. Lo que no concuerda con lo reportado de
este método, ya que es un método eficiente para proteómica (30).
Tabla 2: Concentración de la proteína de hojas y semillas de Pentacalia nítida extraída con 3
métodos diferentes para realizar la electroforesis, cuantificado por medio del protocolo BCA
TCA-Acetona
Proteína µg/ml
Sulfato
Proteína µg/ml
Fenol
Proteína µg/ml
Hojas 494,71±17,85 1435,42±12,85 3109±10,71
Semillas 1096,14±13,57 1350,42±13,57 3415,42±18,85
16
Según los resultados obtenidos en la cuantificación de proteína mediante los métodos
desarrollados para definir el perfil electroforético (ver la tabla 2), la mayor concentración se
obtuvo con el método de fenol-Tris, lo que no concuerda con los resultados obtenidos en los geles
de electroforesis (figura 1 y2) donde este método no definió el perfil electroforético
comparándolo con los otros 2 métodos, lo que indica que con fenol-Tris no se logró una
recuperación alta de las proteínas, lo que sugiere que el método de cuantificación puede ser
interferente con fenol-Tris. Por otra parte la concentración de proteína de los extractos acuosos de
semillas presenta valores similares entre los métodos de TCA-Acetona y sulfato, lo que indica que
con estos dos métodos se obtiene una recuperación de proteínas semejantes.
Figura 1: Electroforesis SDS PAGE, gel 12%, doble tinción: Azul de Comassie y plata. Extractos de
Hojas de Pentacalia nitida por el método de TCA-Acetona, Sulfato de Amonio y Fenol-Tris.
TCA-Acetona Sulfato de Amonio
Fenol-Tris
17
En la figura 1 donde se muestran los perfiles electroforéticos de las hojas de P. nitida; el método
de sulfato de amonio y TCA-acetona mostraron el mismo número de bandas, algunas de las
bandas son similares en los dos métodos, pero con el método de TCA-acetona se logró definir
bandas de alto peso molecular y de bajo peso molecular como de 9, 8 y 6 KDa que no se
obtuvieron por el método del sulfato de amonio, mientras con el de sulfato de amonio se logró
definir un banda 4 KDa. En cuanto al método de fenol-Tris no se definieron tantas bandas como
con los obtenidos con los otros 2 métodos.
Figura 2: Electroforesis SDS PAGE, gel 12%, doble tinción: Azul de Comassie y plata. Extractos de
Semillas de Pentacalia nitida por el método de Sulfato de Amonio y TCA-Acetona.
En la figura 2 los perfiles electroforéticos de las semillas de la planta obtenidos por el método de
sulfato de amonio y el de TCA- Acetona permite definir bandas con pesos moleculares similares:
91, 68, 50 y 24 KDa; el método de TCA- Acetona al igual como sucedió con el perfil obtenido de las
hojas se logran obtener bandas de alto peso molecular respecto al perfil que se obtuvo con el
método de sulfato de amonio. Comparando con el perfil electroforético de las hojas, el de las
semillas no presentó proteínas de menos de 7 KDa.
Para complementar el perfil electroforético de los extractos proteicos de semillas y hojas de la
planta se realizó electroforesis con Tricina (Tricina SDS-PAGE), este método permite separar
proteínas con pesos moleculares entre 1 a 100 KDa ya que la acrilamida en el gel se encuentra en
baja concentración, permitiendo la separación de proteínas de bajo peso molecular (42). En el
anexo en la figura 14 donde este electroforesis definió proteínas de bajo peso molecular tanto en
el extracto de semillas y hojas obtenidos por precipitación con sulfato de amonio, con las semillas
TCA-Acetona Sulfato de Amonio
18
no se definió tantas bandas como con hojas, las bandas de bajo peso molecular que se definieron
fue de 16 KDa para hojas y en semillas una de 19 KDa.
4. Cromatografía:
Con el fin de complementar el trabajo de grado se realizó cromatografía de intercambio aniónico
en la que se obtuvieron 3 picos, en el primero se separaron aquellas proteínas que no se
retuvieron en la columna es decir, aquellas con carga positiva o sin carga; para el segundo pico se
eluyó la columna con 50% de buffer fosfato con NaCl 500 mM y 50% de buffer fosfato, en este se
separaron las proteínas que poseían carga negativa pero no son fuertemente retenidas por la
columna; en el tercer pico se eluyó la columna con 100% de buffer fosfato con NaCl 500mM y en
este se separaron aquellas proteínas que poseían una carga negativa alta y se adhirieron
fuertemente a la columna.
Figura 3: Cromatografía de intercambio aniónico del extracto proteico acuoso de hojas de
Pentacalia nitida en columna Sepharosa, fase móvil buffer Fosfato 0,05 M pH 7.5 y buffer
eluyente Fosfato pH 7.5 NaCl 500 mM con flujo de 4,5 ml/min.
La cromatografía es un método que permite separar moléculas de acuerdo a su distribución entre
la fase móvil y la estacionaria, en la de intercambio iónico las proteínas están cargadas
dependiendo de su punto isoeléctrico y del pH en el que se encuentren, lo que les permite
interactuar con la fase estacionaria o la columna (43). En cuanto a los péptidos antimicrobianos
existe una gran variedad, pueden ser aniónicos aquellos que contienen gran cantidad de ácido
aspártico y ácido glutámico, mientras que los catiónicos son aquellos que ricos en arginina y lisina,
pero la gran mayoría de los reportados son catiónicos (44); con la cromatografía se separaron las
19
proteínas por cargas, lo que permitiría determinar en que fracción se encuentra las proteínas que
tengan actividad antimicrobiana.
5. Ensayos de actividad antimicrobiana:
El método de difusión en agar es ampliamente usado para detectar la actividad antimicrobiana de
una sustancia y el método de microdilución en microplaca con TTC es considerado como una
alternativa a los métodos en caja de Petri, ya que son útiles para determinar la concentración
mínima inhibitoria de los extractos. Se ha sugerido que este método de microdilución se emplee
para determinar la actividad antimicrobiana de extractos de plantas como un método estándar y
rápido (45), el método de microdilución con TTC que se realizó es sencillo y fácil de analizar pues
permite probar el extracto proteico frente a varias bacterias al mismo tiempo y los resultados
obtenidos cualitativamente son fáciles de interpretar.
Los extractos proteicos acuosos de hojas y semillas, no presentaron actividad frente a las bacterias
y hongos fitopatógenos evaluados por los dos métodos, como se observa en el anexo en las figuras
1-11, así como de las fracciones obtenidas por cromatografía a partir de las hojas de la planta, no
presentaron actividad ver el anexo figura 4.
El método de TTC es una sal de tetrazolio que permite detectar por coloración rojiza las células
viables, puesto que el compuesto cloruro de 2,3,5,-trifenil-tetrazolio toma los hidrógenos
liberados por la enzima deshidrogensa, que resultan de la reducción de las células vivas
formándose el compuesto rojizo estable e insoluble llamado Trifenilformazan (46). Como se
observa en la figura 4 y 8 del anexo donde la prueba de microdilución con TTC reveló que los
extractos de las semillas y de las hojas así como las fracciones de la cromatografía no presentaron
inhibición frente a las 3 bacterias que se probaron presentaron color rojo debido a que los
microorganismos están viables.
Los extractos proteicos acuosos de las semillas y las hojas de P. nítida no presentaron inhibición
del crecimiento de los tres hongos fitopatógenos evaluados, es decir que estos extractos proteicos
acuosos obtenidos no presentan proteínas con la capacidad de unión hacia la quitina presente en
el ápice de la hifas impidiendo el crecimiento del hongo, cambian su morfología o producen un
hinchamiento de las hifas, este tipo de proteínas antifúngicas se han aislado de hojas de
remolacha y de hojas de rosas (47).
20
La proteína obtenida tanto en el extracto crudo de hojas y en las fracciones de la cromatografía se
cuantificaron mediante el método BCA, el extracto crudo presentó una concentración de 1147
µg/ml, mientras que las fracciones obtenidas de la cromatografía de las que se evaluó actividad
antimicrobiana en la prueba por difusión en agar presentaron concentraciones de proteína para el
pico 1 de 71 µg/ml y para el pico 2 fue de 13 µg/ml, son concentraciones bajas que no ejercen
efecto frente a los microorganismos evaluados.
21
CONCLUSIONES
Se obtuvo el extracto proteico acuoso a partir de las hojas y semillas de Pentacalia nítida y se
determinó que el buffer fosfato extrae la mayor cantidad de proteína, permitiendo obtener una
concentración de 657,3 µg/ml, respecto a la obtenida con HEPES de 182,3 µg/ml y Tris-HCl de 134
µg/ml; el buffer fosfato no presenta interferencias con el método de cuantificación de proteína
por BCA.
Se definió el perfil electroforético a partir del extracto proteico acuoso de las hojas y semillas de
Pentacalia nítida, por medio de 3 métodos: Sulfato de amonio, TCA-Acetona y Fenol-Tris, se
obtuvo resultados similares con los métodos de sulfato de amonio y TCA-Acetona, mientras que
con el método de Fenol-Tris no se obtuvo un perfil electroforético comparable con los otros dos
métodos, de esta forma se complementa la información sobre P. nítida.
Se determinó que los extractos proteicos acuosos a partir de semillas y hojas según el protocolo de
sulfato de amonio que se empleó en este trabajo no presentaron actividad antimicrobiana frente a
las cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium
oxysporium, Botrytis spp. y Colletotrichum spp.
Se propuso el pre-tratamiento del material vegetal con acetona que permite una mejor definición
del perfil electroforético de los extractos proteicos acuosos de hojas y semillas de P. nítida.
RECOMENDACIONES
Para determinar actividad antimicrobiana concentrar la proteína extraída a partir del material
vegetal.
22
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25
ANEXO
1. Actividad antimicrobiana:
Hojas de Pentacalia nítida
Pruebas difusión en agar, Bacterias:
Figura 1: Prueba de difusión de agar E. coli frente a extracto crudo (Ext), Pico 1 (3), Pico 2 (18), Control positivo: Cloranfenicol 0,5 mg/ml (C+) y control negativo: buffer fosfato pH 7.5 (C-). Se realizó por triplicado.
Figura 2: Prueba de difusión de agar S. aureus frente a extracto crudo (Ext), Pico 1 (3), Pico 2 (18), Control positivo: Cloranfenicol 0,5 mg/ml (C+) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (C-). Se realizó por triplicado.
Figura 3: Prueba de difusión de agar L. monocytogenes frente a extracto crudo (Ext), Pico 1 (3), Pico 2 (18), Control positivo: Cloranfenicol 0,5 mg/ml (C+) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (C-). Se realizó por triplicado.
Prueba en Microplaca con TTC:
26
Figura 4: Prueba de inhibición con TTC frente a E. coli, S. aureus y L. monocytogenes frente al Extracto crudo de Hojas, fracciones: 3, 18, 23, 35 y control positivo Cloranfenicol (1mg/ml) y control negativo buffer fosfato pH7.5.m.o: Microorganismo-BHI:Caldo infusión cerebro corazón.
Semillas de Pentacalia nitida
Figura 5: Prueba por difusión en agar frente a S. aureus de Extracto crudo de Semillas 869 µg/mL (Ext), control positivo: Cloranfenicol 1 mg/ml (C+) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (C-). Se realizó por triplicado.
Figura 6: Prueba por difusión en agar frente a E. coli de Extracto crudo de Semillas 869 µg/mL (A), control positivo: Cloranfenicol 1 mg/ml (B) y control negativo: Buffer fosfato (C). Se realizó por triplicado.
E. coli S. aureus L. monocytogenes
Pico 1
Pico 2 f1
Pico 2 f2
Pico 3
BHI + m.o
Controles
BHI + m.o + BPS
Cloranfenicol+ m.o
Extracto Extracto+BHI
BHI+Cloranfenicol+m.o
B
C A
27
Figura 7: Prueba por difusión en agar frente a L. monocytogenes de Extracto crudo de Semillas 869 µg/mL (A), control positivo: Cloranfenicol 1mg/ml (B) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (C). Se realizó por triplicado.
Prueba en Microplaca con TTC:
Figura 8: Prueba de inhibición con TTC frente a E. coli, S. aureus y L. monocytogenes frente al Extracto crudo de Hojas, Extracto crudo Hojas diluido (1/2), Extracto crudo de Semillas, Extracto crudo Semillas diluido (1/2), control positivo Cloranfenicol (1mg/ml) y control negativo buffer fosfato pH 7.5. -m.o: Microorganismo.-BHI: Caldo Infusión Cerebro Corazón.
Prueba difusión en agar, Hongos:
Figura 9: Prueba por difusión en agar frente a Fusarium oxysporum de Extracto crudo de Semillas (A), Extracto crudo Hojas (B), control positivo: Terbinafina 2,5 mg/ml (C) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (D). Se realizó por triplicado.
A
C
B
E. coli S. aureus L. monocytogenes Controles
Ext Hojas 1/2
Ext Hojas
Ext Semillas
C
Ext Semillas 1/2
Cloranfenicol+ m.o
BHI+ m.o+Buffer
BHI+ m.o
BHI+Buffer
BHI+Ext Hojas
BHI+Ext Semillas
BHI+ Cloranfenicol+ m.o
A
B D
28
Figura 10: Prueba por difusión en agar frente a Collecotrichum de Extracto crudo de Semillas (A), Extracto crudo Hojas (B), control positivo: Terbinafina 2,5 mg/ml (C) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (D). Se realizó por triplicado.
Figura 11: Prueba por difusión en agar frente a Botrytis sp de Extracto crudo de Semillas (A), Extracto crudo Hojas (B), control positivo: Terbinafina 2,5 mg/ml (C) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (D). Se realizó por triplicado.
2. Cuantificación de Proteína:
Figura 12: Curva patrón BCA para cuantificación de proteínas. Absorbacia vs concentración
(µg/mL).
B
D
A
C
D
A
B
C
29
3. Perfiles electroforéticos:
Figura 13: Electroforesis SDS PAGE, gel 12%, tinción con Azul de Comassie. Extractos de Hojas de
Pentacalia nitida por el método de Sulfato de Amonio con diferentes buffers de extracción: HEPES
(H), Tris HCl (T) y Fosfato (F).
Figura 14: Electroforesis Tricina (Tricina SDS PAGE), gel 16% y 10%, tinción con Azul de Comassie y
plata. Extractos de Hojas (H 2:1, H 3:1, H 4:1) y semillas (S 2:1, S 3:1 y S 4:1) de Pentacalia nitida
por el método de Sulfato de Amonio.