Práctica N° 4

EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Y LÍPIDOS

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN CELULAR 1DRA. Souza Arroyo Verónica

Grupo: BC02ALUMNOS:

García Meza José Luis López López Juan Jesús

Martínez Hernández Lucía Muñoz Santos Isaac

INTRODUCCIÓNLas proteínas y lípidos son fundamentales, tanto como para la estructura, como para la función de las células. Los lípidos son compuestos orgánicos, químicamente heterogéneos entre sí. Se puede definir como lípidos a aquellos compuestos que son insolubles en agua, pero solubles en solventes orgánicos como etanol, éter, acetona, etc. Lo cual indica la naturaleza no polar de los lípidos, esto debido a la presencia de las cadenas hidrocarbonadas en la estructura de estas moléculas. Los componentes principales de las membranas celulares son los fosfolípidos, que además de estos compuestos de una cadena hidrocarbonada apolar, presentan otros grupos con carga negativa.

Las proteínas son macromoléculas formada por monómeros conocidos como aminoácidos, son las biomoléculas más abundantes en los seres vivos y las que presentan gran diversidad de funciones.

La yema que contiene el huevo tiene un peso aproximadamente de 10g, contiene un 50% de agua, 17% de proteínas y 33% de lípidos; entre los cuales los fosfolípidos (lípidos que contienen fosforo) representan un tercio de la masa lipídica y se componen esencialmente de lecitinas (70%) y cefalinas (25%).

FUNDAMENTO

Los compuestos químicos, de origen biológico, que son solubles en disolventes orgánicos (acetona, éter, cloroformo, se consideran loss componentes de la fracción lipídica. Dicha fracción, está formada por moléculas muy diversas, cuyas estructuras sólo tienen en común que son solubles en disolventes orgánicos, por lo tanto, poco solubles o0 insolubles en agua.

La propiedad de la solubilidad de los lípidos en compuestos orgánicos, se puede aprovechar com0 un método de extracción de estos a partir de tejidos de origen animal o vegetal. Los disolventes más comunes para lña extracción total de los lípidos son etanol, metanol, cloroformo, éter, éter de petróleo, hexano, o bien, mezclas de ellos. La extracción se incrementa cuando estos disolventes están calientes.

OBJETIVOS

Extraer fosfolípidos y proteínas de la yema de huevo Conocer las diferencias químicas de las proteínas y los lípidos, las cuales permiten aislarlos de la

misma muestra. Obtener dichas biomoléculas por medio de su solubilidad en varios disolventes.

MATERIAL2 VASOS DE PRECIPITADOS DE 100ml3 pipetas de 10 ml1 pipeta de 5ml1 probeta de 100ml1 varilla de vidrio1 embudo de vidrio2 tubos de ensayo1 matraz Erlenmeyer de 100mlPapel filtroGooglesGuantes

MATERIAL BIOLOGICOREACTIVOSEtanolSulfato de Amonio anhídro (NH4)2 SO4PM 132.14g/molÉter Acetona

SOLUCIONESSulfato de amonio al 60% a pH11

EQUIPOParrilla de calentamientoCentrífuga

1 Huevo2 frascos de 20ml con tapa

METODOLOGÍA

1.- Se pesó un vaso de precipitados de 50ml y una probeta de 100ml2.- Se hizó una pequeña perforación en el huevo para permitir la salida de la clara.3.- Se colocó la clara en la probeta y la yema en el vaso de precipitados4.- Se pesó la probeta con la clara5.- Se pesó el vaso de precipitados con la yema.

EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS (LECITINA Y CEFALINA)

1.- Se colocó el vaso de precipitados con la yema dentro, en la campana de extracción, para agregarle éter hasta cubrir totalmente la yema

.

2.- Se agitó con una varilla hasta obtener una mezcla homogénea, así se agitó lentamente (y sin dejar de agitar) y se le agregó un volumen de acetona igual al del éter.

3.- Se dejó reposar 5 minutos. Mientras se preparó papel filtro en un embudo de vidrio.

4.-Pasados lo 5 minutos de reposo, se pasó la yema al papel filtro colocado en el embudo, con una varilla se agitó cuidadosamente para que obtener la lecitina y la cefalina, restante en el papel filtro. El líquido que salió del embudo se desechó.

5.-Se colocó un tubo de ensayo bajo el embudo, y se lavó el precipitado (papel filtro), con etanol frío.

6.- El filtrado recibido en el tubo de ensayo es la lecitina, que es más soluble en el alcohol frío. En el papel filtro queda la cefalina.7.- Se evaporó el etanol, lentamente en baño maría (para obtener la lecitina).

8.- Se dejó secar los precipitados y se pesaron.9.-Los frascos con las muestras se guardarán en refrigerador para la práctica de determinación de lípidos.

AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS DE LA CLARA DE HUEVO (ALBÚMINAS)

1.- Se pasó la clara que se encontraba en una probeta, a un matraz de 250ml.

2.- Se adicionó un volumen igual al de la clara de agua destilada, y se agitó con una varilla de vidrio.

3.- Se adicionó 30ml de sulfato de amonio al 60% y se mezclo perfectamente con una varilla de vidrio.

4.- Se dejó reposar 10 minutos.5.-Se colocó la mezcla de clara y sulfato en tubos para centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos.

6.-Se separó el sobrenadante en un tubo y se recuperó el precipitado.

7.- Se pesó el precipitado y se guardó para la próxima práctica.8.- Se guardó 1ml del sobrenadante para la práctica de cuantificación.

Discusiones Tuvimos dificultades al filtrar la yema de huevo. El papel filtro se quebró derramándola mezcla de yema en el vaso de precipitado. Volvimos a filtrarlo en otro papel filtro con un embudo más chico, la cantidad de mezcla que nos quedo fue menor. Por lo que al momento de agregar el etanol nos tardamos más en obtener lecitina, la cual fue una cantidad menor a comparación de otros equipos. A lo cual suponemos que la cantidad de producto que obtendremos será muy pobre.Al momento de agregar los 100ml de sulfato de amonio al 60 % a la mezcla de calra se debían mezclar con la varilla y luego dejar reposar por 10 minutos sin mezclar, pero no nos detuvimos en mezclarla cerca de 8 minutos por lo que suponemos que las proteínas se rompieron y los resultados no serán los esperados.

CONCLUSIONES

Los lípidos generalmente se encuentran enlazados a proteínas y polisacáridos de los tejidos, formando complejos con diferentes grados de estabilidad, por lo que para romper estos complejos se requiere el empleo de condiciones de extracción capaces de desnaturaliza o separar las proteínas asociadas con los lípidos. El etanol, por ejemplo, desnaturaliza proteínas y separa los complejos de lipoproteínas.

La separación de los lípidos se basa en sus diferencias de solubilidad, son desafortunadamente casi siempre, parcialmente satisfactorias, debido a que la solubilidad de los constituyentes de las mezclas de lípidos es bastante diferentes a las de los lípidos puros.

La yema de huevo, el tejido cerebral y ciertas semillas son fuentes ricas en fosfolípidos y otros materiales lipídicos.

Para realizar la extracción total de los lípidos, es común el empleo de metanol al 95%, etanol al 95% o de mezclas metanol, como: cloroformo (3:1) o etanol: éter (2:1). Es conveniente adaptar las condiciones de extracción tanto al tipo de tejido empleado, así como a la cantidad y naturaleza de lípido deseado.

a) ¿Qué importancia bilógica tiene los fosfolípidos?

Los fosfolípidos tiene dos extremos con propiedades muy distintas: el extremo que contiene al grupo fosfato tiene un carácter hidrófilo distintivo; el otro lado, compuesto por las dos puntas de ácido graso, tiene un carácter hidrófobo característico. Estas características sirven para que la membrana tenga una columna estructural y además establezca una barrera que impida los desplazamientos aleatorios de materias hidrosolubles hacia dentro y fuera de la célula.

Actúan como mensajeros en la transmisión de señales al interior de la célula, como la adenil ciclasa es una enzima liasa. Forma parte de la cascada de señalización de la proteína G que transmite señales químicas desde el exterior de la célula a su interior a través de la membrana celular.

Son componentes esenciales de los ácidos biliares, éstos cumple la función de solubilizar el colesterol, si existe una baja concentración de fosfolípidos, se pueden producir cálculos biliares de colesterol.

b) ¿Qué diferencia estructural existe entre las lecitinas y cefalinas?

La fosfatidilcolina, componente de la lecitina, es un fosfolípido que ayuda a solubilizar los ácidos biliares. Forma parte importante de las membranas celulares. Contiene ácido palmítico o ácido esteárico en la posición C1 y ácidos de 18 carbonos (oleico, linoleico o linolenico) en la posición C-2.

La Fosfatidil etanolamina -cefalina- tiene en el segundo alcohol a la etanolamina.

c) Investigar el contenido de lípidos y proteínas en el huevo de gallina

Composición de la clara

La albúmina es una solución viscosa (coloidal), que rodea a la yema y se encuentra contenida entre las membranas del cascarón.

Constituyentes

Sus constituyentes son 88% agua, 11% proteínas, 1% carbohidratos y 0.5% minerales.

Básicamente se trata de una solución de proteínas globulares que contienen fibras de ovomucina ( existen más de treinta proteínas diferentes). Son ricas en aminoácidos esenciales. Esta tres glucoproteínas suman más del 80% del total de proteínas en la clara de huevo.

OVOALBÚMINA: La principal proteína de la clara del huevo, más de la mitad del total, es la ovoalbúmina. Esta proteína (o grupo de moléculas protéicas estrechamente relacionadas) se desnaturaliza fácilmente por el calor, una característica de interés cuando los huevos se utilizan en la preparación de alimentos. Es llamada fosfoglucoproteína integrada por tres fracciones, A1, A2 y A3, en una proporción de 85:12:3, respectivamente, que se diferencian por su contenido en fósforo. Es rica en cisteína y metionina y presenta grupos sulfhidrilos.

CONALBÚMINA: Otra proteína que suma alrededor del 14% del total de las proteínas en la clara de huevo es la conalbúmina y también se coagula por el calor. Es una proteínas no fosforilada formada por dos cadenas polipéptídicas. No presenta grupos sulfhidrilo pero es rica en enlaces disulfuro. Contiene restos de manosa y glucosamina. Tiene gran poder quelante de metales, en especial el hierro, y en este caso se vuelven más termorresistentes. La capacidad secuestrante del hierro le confiere propiedades antioxidantes y antimicrobianas.

OVOMUCOIDE: Una tercera proteína, el ovomucoide representa el 12% del total. El ovomucoide no se coagula con el calor. Es una glucoproteína rica en glucosamina (14%) y aminoácidos azufrados (12%). Presenta manosa, galactosa y ácido neuramínico. Es rica en enlaces disulfuro. Es un factor antitripsina y alergénico.

LISOZIMA: Además la clara de huevo contiene aproximadamente un 7 % de globulinas, incluyendo la lisozima, una proteína interesante ya que disuelve las paredes celulares de ciertas bacterias, en especial los mucopolisacáridos de los microbios Gram positivos.

OVOMUCINA: Existe aproximadamente menos de un 2% de otra proteína llamada ovomucina que contribuye al espesor de la clara gruesa. Es una glucoproteína más rica que el ovomucoide en ácido neuramínico y siálico. Es un inhibidor de la hemoaglutinación vírica. Es una proteína muy electronegativa. Estable a la desnaturalización por calor.

AVIDINA: Existe un pequeño porcentaje de ésta y posee la capacidad de fijar y sintetizar la biotina. La avidina se desnaturaliza fácilmente cuando se cuecen los huevos. OVOFLAVOPROTEÍNA: Existe una cantidad pequeña de esta proteína a la que se fija la riboflavina de la clara de huevo.

Composición de la yema

La yema es la porción amarilla del huevo, está recubierta por la membrana vitelina que la separa de la clara y la protege de una posible rotura. El color está determinado principalmente por la dieta de la gallina. Puede presentar una

mancha rojiza, que corresponde al disco germinativo, a partir de la cual se desarrollaría el pollo en caso de que el huevo hubiera sido fecundado. Es una dispersión de diferentes tipos de partículas suspendidas en una solución proteíca. La cantidad de proteína sobre sustancia seca es de 31,1% y la de grasa del 65,8%, con gran cantidad de lipoproteínas de baja densidad (LDL) ricas en colesterol. La fase continua (78%) está formada por un extracto seco de proteínas globulares y LDL, mientras que la fase dispersa(20%) lo está con proteínas globulares y lipoproteínas de baja densidad(HDL).

Constituyente

PROTEÍNAS

La principal proteína de la yema es la vitelina. Además la yema de huevo contiene:

- FOSFIVITINA (4%) : es una proteína con grandes cantidades de fósforo, rica en serina (30%) , no contiene cisteína y fija fácilmente el hierro.

LIPOVITELINA (68%): es una proteína alta en azufre, lipoproteína de lata densidad (HDL) rica en cisteína . Presenta un 20% de lípidos (dos tercios de fofolípidos y uno de colesterol, lípidos neutros y triglicéridos).

– LIPOVITELENINA (16%): es una lipoproteína de baja densidad pobre en cisteína. Presenta un 88% de lípidos (un tercio de fosfolípidos y dos de lípidos neutros y colesterol). Existen restos glucídicos, hexosas y ácido neuramínico.

- LIVETELINA (10%): proteínas globulares alfa, beta, gamma.

- OVOVITELINA: rica en aminoácidos fosforiladosy azufrados. Coagula por acción de la quimosina.

En la fase acuosa de la yema se encuentra dispersa, sólo una pequeña cantidad de vitelina. En partículas suspendidas llamadas gránulos, podemos encontrar proteínas y grasas. En la fase sólida se han visto tres tipos de partículas, esferas, gránulos grandes , que contienen grasa en forma esterificada y colesterol; y micelas que contienen casi el 90% de los triglicéridos en forma de microemulsión. En el centro de la micela se encuentra una gota de grasa rodeada por una capa de fosfolípido-proteína.

GRASAS

El contenido total de grasas es de 4 a 4.5 g por unidad de las cuales 1.5g son grasa saturada y el resto insaturada (predominando las monosaturadas, que son benéficas para el organismo). El principal fosfolípido es la lecitina (fosfatidilcolina) con algo de fosfatidiletanolamina y pequeñas cantidades de fosfatidilserina. Los

ácidos grasos que se encuentran en los triglicéridos de la yema de huevo, son oleico, palmítico, esteárico y linoleico, en ese orden.

BIBLIOGRAFÍA

Hernández L. R. Bioquímica Experimental. Editorial Limusa. México, 1979. Voet D, Voet J. Bioquímica. Ediciones Omega. España. 1992

Gerald Karp . (2014). Biología celular y molecular . México,D.F: Mc Graw Hill.http://avalon.cuautitlan2.unam.mx/pollos/m2_9.pdf