experto en genética médica y genómica · 2021. 2. 10. · pcr reacción de cadena de la...

Experto en Genética Médica y Genómica

Sesión 2.1 Técnicas de diagnóstico molecular

¿Como hacemos hoy un Diagnóstico Genético?

Historia Genética

Estudio Genético

ConsejoGenético

El Diagnóstico Genético es un PROCESO

Planificación del Estudio Genético

Historia Genética

Estudio Genético

ConsejoGenético

Interpretación basada en la experiencia

Historia Genética

Estudio Genético

ConsejoGenético

Planificación del Estudio Genético

Historia Genética

Estudio Genético

ConsejoGenético

Utilización de la tecnología adecuada

Historia Genética

Estudio Genético

ConsejoGenético

PCRReacción de Cadena de la Polimerasa

9


Es una técnica de amplificación enzimática “in vitro”. Permite amplificar unfragmento específico de ADN situado entre dos regiones de secuenciaconocida.

11


La visualización del ADN amplificado durante la PCR se realiza mediante electroforesis


...AGTCCTGGCCTGAACACCACCAC...CACCACCACTCCTTAACTGGT...

...TCAGGACCGGACTTGTGGTGGTG...GTGGTGGTGAGGAATTGACCA...

REGIÓN MICROSATELITE

( CAC)n

➢ Regiones del genoma que son repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucleótidos ( cac, gaca, ta, gt, ctt,... )

➢ No están asociados a ninguna patología

➢Mediante marcadores polimórficos “etiquetamos” cada uno de los genes

➢ Hacemos haplotipos, árboles familiares

➢Estudios indirectos

Microsatélites (SSR)

I:1 I:2

II:1 II:2II:3

III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6

II:4

III:7 III:8III:9

IV :1 IV :2 IV :3 IV :4 IV :5 IV :6

III:10

IV :7 IV :8

III:11

IV :9

III:12

IV :10

7q32.2

I:1117 119157 155222 214276 276220 198104 102151 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875D7S530

D7S2544

I:1123 119157 155220 214276 276212 198100 102151 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875

D7S530D7S2544

I:2125 119153 157214 218274 266202 200100 100153 153

?

II:1119 119155 157214 218276 266198 200102 100153 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875

D7S530D7S2544

ADN-2089

IMEGEN-198

ADN-2081

IMEGEN-197

ADN-2080

IMEGEN-196

ADN-2094

IMEGEN-195

Distrofia muscular de cinturas

Autosómica dominante

ligada a la región 7q32.2

I:1117 119157 155222 214276 276220 198104 102151 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875D7S530

D7S2544

I:1123 119157 155220 214276 276212 198100 102151 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875

D7S530D7S2544

I:2125 119153 157214 218274 266202 200100 100153 153

?

II:1119 119155 157214 218276 266198 200102 100153 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875

D7S530D7S2544

ADN-2089

IMEGEN-198

ADN-2081

IMEGEN-197

ADN-2080

IMEGEN-196

ADN-2094

IMEGEN-195

Análisis de ligamiento

I:1246 242193 197146 146130 126

D15S646D15S128D15S122D15S210

I:2242 244195 199142 148130 128

?

II:1242 244195 199142 148130 128

D15S646D15S128D15S122D15S210

Síndrome del Prader-Willi (15q11_13)

➢ Deleción en el cromosoma de origen paterno

➢ Disomia uniparental materna

➢ Defectos en el imprinting del cromosoma 15 paterno

D15S646

D15S128

D15S122

D15S210

REGIÓN PW/ ANG

Análisis de ligamiento

Cariotipo

➢ Alteraciones cromosómicas

➢ Cultivo celular 2-3 semanas

QF-PCREstudio prenatal

➢ Alteraciones numéricas

➢ Técnica rápida para la detección de:

➢ Cromosoma 21: Síndrome de Down (trisomía)

➢ Cromosoma 18: Síndrome de Edwards (trisomía)

➢ Cromosoma 13: Síndrome de Patau (trisomía)

➢ Cromosomas sexuales X e Y:

➢ Síndrome de Turner: X0 (monosomía)

➢ Síndrome de Klinefelter: XXY

➢ Otras aneuploidías: XXX; XY


✓ Detecta el 70-80% de las aberraciones cromosómicas causantes de defectos congénitos

✓ Detecta el 99.9% de las aneuploidías en embarazos de bajo riesgo


(CAG)nHD, SCA

5’UTR 3’UTRExón Intrón

(CGG)nFRAXA

(CTG)nDM

(GAA)nAF

(GCG)nOPMD

Exón

➢ Regiones del genoma que son repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucleótidos ( cac, gaca, ta, gt, gata,... )

➢ No están asociados a ninguna patologíaMicrosatelites (SSRs)

➢ Regiones del genoma que son repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucleótidos ( tripletes CGG, CAG... )

➢ Están asociados a una patología

Mutaciones dinámicas


Inestabilidad de repeticiones de tripletes en tándem

❑ Número de repeticiones es polimórfico en población❑ Adquieren un tamaño patológico❑ Inestabilidad Intergeneracional ❑ Fenómeno de anticipación❑ Enfermedades neurológicas

ACTATATGCTAGCTAGCTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGACTGATCTAGCTGATCGT

ACGATCAGCTAGATCAGTCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTAGCTAGCTAGCATATAGT

Núm. repeticiones = A - (B + C)

3

AB C


(CAG)nHD

5’UTR 3’UTRExón Intrón ExónEnfermedad de Huntington

➢ Alelos normales. 6-26 repeticiones➢ Alelos intermedios: 27-35 repeticiones➢ Alelos asociados al HD: > 36 repeticiones. ➢ Forma juvenil 60 rep

118 pb 17 rep197 pb 43 rep

127 pb 20 rep191 pb 41 rep

124 pb 19 rep

146 pb 26 rep


5’UTR 3’UTRExón Intrón

(CTG)nDM

ExónDistrofia Miotónica

➢Alelos normales. 5-34 repeticiones➢ Alelos pre-mutados : 35-49 repeticiones➢Alelos asociados a DM1 mínima : 50-150 repeticiones➢Alelos asociados a DM1 clásica: ~100- ~1000 repeticiones➢Alelos asociados a DM1 congénita: > 2000 repeticiones

91 pb 12 rep ¿ ?

66 pb 5 rep ¿ ?

66 pb 5 rep 94 pb 13 rep

88 pb 11 rep ~253 pb 66 rep


TP-PCR (Triplet repeat primed PCR)

…ACTACGTAGCTGACTGCTGCTGCTGCTGCTG…CTGCTGCTGCTGCTGCACTGATGCTACGTG…

…TGATGCATCGACTGACGACGACGACGACGAC…GACGACGACGACGACGTGACTACGATGCAC…


Distrofia Miotónica


X Frágil (FMR1; Xq27.3) Interrupción de las repeticiones


Detección de deleciones/ duplicaciones

MLPA

dPCR

CGH array

NGS

A pequeña escala A gran escala

1 experimento permite la cuantificación relativa de hasta 48 secuencias distintas de ADN.

Es rápido, sencillo y.... barato

MLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification

3-PCR con los primers universales X e Y

2-Ligación

1-Hibridación

4-Electroforesis capilar

Control

Paciente

Interpretación de los resultados


➢ Detección de aneuploidías

➢Análisis de las regiones subteloméricas

➢ Detección de duplicaciones/ deleciones desde un exón a todo un gen o región cromosómica (MLPA diseñado para más de 300 genes)

➢Detección de duplicaciones/ deleciones regiones cromosómicas (20 síndromes distintos de microdeleción)


➢ Detección de aneuploidías

Diagnóstico prenatal de aneuploidías (P095)

Reordenamientos subtelomericos submicroscopicos

Chr 8

Chr 16

Traslocación 8:16


Control

Paciente con del 6q


ControlControl

Deleción 18q

Aborto espontaneo: 46, XY, (18) (18:20) (q21:p13) mat

Madre: 46, XX, t(18:20) (q21:p13)

Duplicación 20p


Reordenamientos subtelomericos submicroscopicos

64

65 66 67

Control

Paciente con DMD

Gen DMD


Diagnóstico de CNV

Control

Paciente con DMD; dup2-7


PMP22

Duplicación= CMT1A

Deleción= HNPP

Multiplex-A Multiplex-B

CONTROL NEGATIVO

CHMT- 1A

HNPP

D17S1356D17S1357

D17S261

D17S955D17S261

D17S261 D17S1358D17S921

D17S1356 D17S261

D17S955 D17S1357

D17S1356D17S261 D17S955

D17S1357

D17S1358D17S921D17S261D17S261

D17S261 D17S261D17S921

D17S1358

Limitaciones: Marcadores no informativos. A veces difícil interpretación

Duplicación / Deleciónde la región 17p11


Salsa Mix P033

Control

HNPP

CMT1A


1p36 deletion syndrome*2p16 microdeletion 3q29 microdeletion9q22.3 microdeletion15q24 deletion syndrome*17q21 microdeletion*22q13 / Phelan-McDermid*Cri du Chat syndrome, 5p15*DiGeorge syndrome 22q11*DiGeorge region 2, 10p15Langer-Giedion syndrome, 8qMiller-Dieker syndrome, 17p*NF1 microdeletion syndromePrader-Willi / Angelman*MECP2 / Xq28 duplication*Rubinstein-Taybi syndromeSmith-Magenis syndrome*Sotos syndrome 5q35.3*Wagr syndromeWilliams syndrome*Wolf-Hirschhorn 4p16.3*


Síndromes de microdeleción

dup 7q11 no por FISH pero… si por MLPA


3-PCR

2-Ligación

1-Hibridación

Falso positivo: Presencia de una mutación puntual en una zona de unión de la sonda


45

PCR a tiempo real

46

Nº de ciclos

Log [ADN]

Detección

en agarosa

1. Exponencial: En cada ciclo se duplica la cantidad inicial del ADN diana

(asumiendo un 100% de eficiencia).

2. Lineal: Los componentes de la reacción empiezan a consumirse, la reacción

es mas lenta y algunos de los reactivos o enzimas empiezan a degradarse.

3. Plateau: La amplificación está parada, no se producen nuevos productos.

Algunos productos de PCR se pueden degradar. Esta fase es la que se detecta

en la PCR tradicional.

PCR a tiempo real

47

Plateau

Lineal

Exponencial

Ciclos

Pro

du

cto

PC

R

Análisis a tiempo final en gel de agarosa

o ?

Ct

PCR a tiempo real

48

Análisis en fase exponencial Análisis en tiempo final

◼ Alta concentración/Alta Eficiencia◼ Alta concentración/Baja Eficiencia◼ Baja concentración/Alta Eficiencia

PCR a tiempo real

49

PCR a tiempo real

50

Sondas TaqMan

PCR a tiempo real

Desnaturalización

PCR a tiempo real

Hibridación de primers y sonda

PCR a tiempo real

Amplificación y degradación de la sonda

PCR a tiempo real

PCR a tiempo real

65

• Detección mediante dos sondas Taqman de los alelos diana.

• Técnica muy rápida e interpretación de los resultados sencilla

-Preparación de la PCR

-Amplificación PCR a tiempo real

-Interpretación de los resultados (máxima precisión y fiabilidad)

Detección de mutaciones

Factores de coagulación

Homocigoto normal Heterocigoto Homocigoto mutante

66

Detección de SARS-CoV-2

67

PCR a tiempo real

Sondas FRET

68

Análisis curvas de melting

Mismatch

Perfect match

Temperatura

baja media alta

PCR a tiempo real

69

Policitemia vera JAK2 (p.Val617Phe )

Método semicuantitativo

Tm aa (p.Val617Phe) Genotipo

59ºC - Val / ValHomocigoto

normal

59ºC 63ºC Val / Phe Heterocigoto

- 63ºC Phe / PheHomocigoto

mutante

PCR a tiempo real

70

Fundamentos de la Cuantificación mediante PCR en Tiempo Real

Cuantificación mediante PCR a tiempo real

▪ Dependiendo de la concentración inicial se detectará antes o después la fluorescencia

▪ En el termociclador se detecta, en tiempo real, la cantidad de amplificado existente

2x105 copias

2x104 copias

Nn =No x E n

- Nn es la concentración de una muestra enun número de ciclos dado

- No es la concentración de partida de lamuestra

- E es la eficiencia de la reacción

- n es el número de ciclos

71

Fundamentos de la Cuantificación mediante PCR en Tiempo Real

❑ Con una serie de patrones sepuede realizar una recta deregresión, empleando estarecta se puede cuantificar unamuestra

❑ Para cuantificar una muestra debemos obtener el nº de ciclo en el quese detecta la fluorescencia y comparar con un estándar con cantidadesconocidas del analito


72

Reordenamientos en Oncohematología: BCR-ABL p210

➢ Cuantificación Enfermedad Mínima Residual

➢ Análisis reordenamiento y gen de referencia

➢ Límite de Cuantificación 0,01%

ABLBCR-ABL


73

Cuantificación de Quimeras Hematopoyéticas

ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL


74

Cuantificación de Quimeras Hematopoyéticas

➢ Cuantificación polimorfismos de inserción/deleción y alelos nulos

➢ Análisis InDel y gen de referencia

➢ Comparación frente a un calibrador (muestra pre-trasplante)


➢ Límite detección 0,01%


PCR Digital

76

© 2015 IMEGEN – Información confidencial. Todos los derechos reservados.

PCR Digital

PCR Digital

78

PCR Digital

PCR Digital

80

La PCR a tiempo real basa su resultado en la estimación de un Ct

Mediante PCR digital se obtienen resultados en copias por ml.

Resultado Método Variabilidad

La PCR a tiempo real permite realizar cuantificaciones relativas

Mediante PCR digital se pueden obtener resultados absolutos sin necesidad de estándares

La PCR a tiempo real se ve afectada por la eficiencia de la reacción, el equipo empleado, el material de referencia, inhibición en el ADN

PCR Digital

81

dPCR

AVG1.75

SD0.74

AVG3.25

SD0.86

AVG1.75

SD0.1

AVG3.25

SD0.3

dPCR

PCR Digital


Mismatch

Perfect match

Temperatura

baja media alta

PCR Digital


Método semicuantitativo

PCR Digital

➢Enfermedad neuromuscular infantil

➢Autosómica recesiva

➢Frecuencia de portadores 1/50

➢Gen SMN1 (5q13)

➢Gen SMN2 Modificador del fenotipo

Atrofia muscular espinal

❑ Estudios de ligamiento

❑ PCR a tiempo real

❑ MLPA

❑ PCR digital

• Gen normalizador

• Cuantificación de SMN1

• Cuantificación de SMN2




❑ MLPA

❑ PCR digital

1 1 2 2

1 x SMN1

2 x SMN2


4 x SMN1

0 x SMN2

1 1 2 2


3 x SMN1

1 x SMN2

1 1 2 2




❑MLPA

❑ PCR digital


90

Cuantificación de Quimeras hematopoyéticas

ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL

91

➢ Cuantificación polimorfismos de inserción/deleción y alelos nulos

➢ Análisis InDel y gen de referencia

➢ Comparación frente a un calibrador (muestra pre-trasplante)


➢ Límite detección 0,01%


92

Receptor 49,87%Donante 0%Quimera 0,32%Quimera 3,79%


93

Sample Informative marker FAM/VIC* Het Conversion

XXX-T1 Q116-3i 1.04% 2.07%

XXX-T1 Q116-7i 1.04% 2.08%

XXX-T1 Q116-32i 1.05% 2.10%

XXX-T2 Q116-3i 16.63% 33.26%

XXX-T2 Q116-7i 16.64% 33.28%

XXX-T2 Q116-32i 16.32% 32.63%

XXX-T3 Q116-3i 35.87% 71.75%

XXX-T3 Q116-7i 36.92% 73.83%

XXX-T3 Q116-32i 34.33% 68.66%

XXX-T1

XXX-T2

XXX-T3


94

A-pre A-post

Q116-10d; 1.37%

Average*2 (Heterozygous correction): 2.60 | STD DEV: 0.14%

Q116-10d, Negative Control

Cuantificación de Quimeras hematopoyéticas Q116-11i; 1.23%

95

Clinical Chemistry 59:12 (2013)

Detección de DNA libre circulante post-transplante de hígado


Secuenciación ADN

• Secuenciación automática, 1986Basado en el método Sanger

Marcaje fluorescente

Aplicación de electroforesis capilar

Secuenciación ADN

Método enzimático de terminación de cadena = Método dideoxi de Sanger

~ PCR pero con dNTPs y ddNTPs (terminadores)

Secuenciación ADN

Análisis de enfermedades mediante secuenciación

▪ Extracción de ADN▪ Amplificación por PCR de exones y zonas adyacentes▪ Secuenciación automática ▪ Análisis de secuencias▪ Comparación con secuencias de referencia▪ Análisis de los cambios detectados (polimorfismos, mutaciones, …)

Gen APC

c.1581G>A

p.Ala527Ala


Gen PKD1

c.9616C>T

p.Gln3206*


Gen PKD1

c.11713-2A>G

Procesado


Gen PKD1

c.5014delA

p.Arg1672fs50*


Limitaciones de la técnica de Sanger

- Genes grandes con altos costes

- Heterogeneidad genéticaEnfermedades con muchos genes

dificultad de diagnóstico diferencial

- Enfermedades complejas y multifactorialesDiagnóstico genético todavía no resuelto

- Confirmación de mutaciones detectadas por NGS

Secuenciación NGS

NextSeq S5 NovaSeq

MGIGeneReader MiSeq

PacificBiosciences

Nanopore

107

Muchas gracias

experto en genética médica y genómica · 2021. 2. 10. · pcr reacción de cadena de la...

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