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Práctica: Práctica: Práctica: Práctica: Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) Polimerasa (PCR) Polimerasa (PCR) Polimerasa (PCR)
Dra. Diana OrtizCátedra de Inmunología
Escuela de Medicina José María Vargas - UCV
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Genoma:“Es la totalidad de la información genética que posee unorganismo en particular y que codifica para él.En humanos, el genoma consiste de 23 pares de cromosomas”
Alelo:“Diferentes formas o variantes de una gen”
Genotipo:“Conjunto particular de alelos para todos los genes portados porun individuo”
GenotipificaciónGenotipificaciónGenotipificaciónGenotipificación::::
Determinación del genotipo de un individuo.
Algunos conceptos
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Un poco de historia…
1953
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Para determinar la estructura tridimensional o disposición espacial de las
moléculas de ADN, se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se
recoge la difracción de los rayos sobre una película fotográfica. La película se
impresiona en aquellos puntos donde inciden los rayos X, produciendo al
revelarse, manchas. El ángulos de difracción presentado por cada una de las
manchas en la película suministra información sobre la posición en la molécula
de ADN de cada átomo o grupo de átomos. Mediante esta técnica de
difracción de rayos X se obtuvieron los siguientes resultados:
1. Las bases púricas y pirimidínicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a
lo largo del eje del polinucleótido a una distancia de 3,4. Las bases son
estructuras planas orientadas de forma perpendicular al eje (Astbury,
1947).
2. El diámetro del polinucleótido es de 20 °A y está enrolladlo
helicoildalmente alrededor de su eje. Cada 34°A se produce una vuelta
completa de la hélice.
3. Existe más de una cadena polinucleotídica enrollada helicoidalmente
(Wilkins et al., 1953, Franking y Gosling, 1953).
Estudios de difracción por rayos X del ADN
Rosaling Frankling
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Estudios de difracción por rayos X del ADN
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Watson (23 años) y Crick (34 años)Laboratorio Cavendish, Cambridge,
Inglaterra 1953.
Descripción de la estructura y propiedades fisicoquímicas del ADN.
Premio Nobel 1962 junto con Maurice Wilkins (colega
de Franklin)
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Duplicación semiconservativa del ADN
1957
Meselsson y Stal
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El Código Genético
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Diagnóstico Microbiológico
Detección rápida y la caracterización de patógenos específicos
Identificación demicroorganismos
Características fenotípicas.Caracterización bioquímica.
Identificación demicroorganismos Identificación genotípica .
Avances en Biología Molecular
Hasta el siglo pasado
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Identificación Características
Tradicional fenotípicas
- Habilidad para crecer en un medio determinado
- Resistencia a los antimicrobianos
- Propiedades bioquímica
Identificación de distintas especies de microorgani smos
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Menor número de características observables
No cultivables
Tasa de mutación elevada mayor variabilidad genética
Flexibilidad en la adquisición de material genético
Influencia ambiental más pronunciada
En microorganismos
… Limitaciones
Identificación de distintas especies de microorgani smos
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Ventajas el ADN
� Biomolécula muy fuerte
� Fácil de manipular
� Se puede obtener de diferentes fuentes.
Diagnosticar e investigar múltiples procesos patológicos
al nivel más fundamental.
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Consideraciones
� ¿ Qué organismos se pueden analizar?
� ¿ Cuáles son los tipos de muestras clínicas que sepueden utilizar?
� ¿ Si las pruebas moleculares disponibles incluyenlos criterios de alta sensibilidad y especificidad,rapidez, simplicidad, y relevancia clínica?
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EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
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EXTRACCIÓN DE ADN
� El éxito en la obtención de ácidos nucleicos depend e de:� Inhibición de las endonucleasas que degradan a los á cidos
nucleicos.
� Eliminación de las proteínas.
� Separación del ácido nucleico del resto de los comp onentes.
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FUENTES DE ADN
� Gotas de sangre seca� Semen� Tumores� Cabellos� Tejidos Antiguos� Raspados bucales� Sangre Periférica (Más frecuente)
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Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN
• Cantidad de material• Número de copias de las moléculas de ADN• Cantidad de tejido
• Condiciones en las que se encuentra el material (fresco, congelado, fijado)
• Contaminantes e interferentes en el material biológico.
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SELECCIÓN DEL MÉTODOSELECCIÓN DEL MÉTODOSELECCIÓN DEL MÉTODOSELECCIÓN DEL MÉTODO
� Fuente de ADN
� Cantidad
� Aplicación posterior
� Calidad requerida
� Conservación a largo plazo
� Costo
� Volumen de trabajo
«Caseros»:- Cloroformo-
fenol-isoamil
alcohol.
- Calentamiento
Comerciales: - Estuches «kits»
ADN:ADN:ADN:ADN:TotalTotalTotalTotalPlasmídicoPlasmídicoPlasmídicoPlasmídico
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EXTRACCIÓN DE ADN CON PROTEINASA K A PARTIR DE BIOPSIASEXTRACCIÓN DE ADN CON PROTEINASA K A PARTIR DE BIOPSIASEXTRACCIÓN DE ADN CON PROTEINASA K A PARTIR DE BIOPSIASEXTRACCIÓN DE ADN CON PROTEINASA K A PARTIR DE BIOPSIAS
1.- Incubar las biopsias con 100 ul de Buffer Lisis ( Tris- HCl 10 mM, pH: 8.0 + 0.1% Sarcosina ) + proteinasa K ( 1000ug/ml) a 55 °C por tres horas o toda la noche a 50° C.
2.- Agregar igual volumen de Cloroformo: Fenol: Cloroformo: Fenol: Cloroformo: Fenol: Cloroformo: Fenol: IsoamilIsoamilIsoamilIsoamil alcoholalcoholalcoholalcohol, centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos.
3.- Tomar la fase acuosa y transferirla a otro tubo y agregar igual volumen de cloroformo, mezclar por inversión y centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos.
5.- Tomar la fase acuosa y transferirla a otro tubo. Agregar 1/10 volúmenes de acetato de amonio o de sodio 3M y el doble de volumen de etanol absoluto frío. Mezclar suavemente por inmersión y dejar precipitando toda la noche a –20°C.
Al día siguiente:Al día siguiente:Al día siguiente:Al día siguiente:
6.- Centrifugar a 14.000 rpm durante 20- 30 minutos.
7.- Descartar el sobrenadante y colocar los tubos en posición invertida en una estufa a 37°C por 20.
8.- Resuspender el pellet en 50 ul de agua destilada libre de nucleasas.
9.- Guardar los tubos a –20°C hasta el momento de su uso.
Métodos «Caseros»Métodos «Caseros»Métodos «Caseros»Métodos «Caseros»
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Estuches comerciales
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EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ARN
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EXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARN
1.- a)Tejidos: b) Monocapa de células: c) Células en suspensión: TRIZOL
2.- Fase de separación: Incubar por 5 minutos a 15-30ºCAñadir cloroformo frío Agitar vigorosamente por 30 segDejar reposar 10 minutosCentrifugar a 14.000rpm por 15 min. a 4ºC. Se obtienen 3 fases: Acuosa: (ADN, ARN), Proteínas, Orgánica.Recuperar la fase acuosa:Por cada ml de Trizol agregar 500µl de isopropanol fríoInvertir suavementeDejar precipitando toda la noche a –20ºCCentrifugar a 14.000rpm por 10 min. a 4ºCSe forma el pellet, descartar el isopropanol
3.- Lavado de ARN:Lavar con 1 ml de etanol frío al 75% (diluido con agua con DEPC)MezclarCentrifugar a 7500g (aprox. 6000rpm) durante 5 min 4.- Descartar el etanol5.- Resuspender en 30µl de agua libre de DNAasa y RNAasa
---- Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.Tratar todo con extremas condiciones de esterilidad y puntas con filtro.---- El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.El etanol al 75% debe está diluido con agua con DEPC.---- Trabajar todo en frío.Trabajar todo en frío.Trabajar todo en frío.Trabajar todo en frío.
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Determinación de absorbanciaDeterminación de absorbanciaDeterminación de absorbanciaDeterminación de absorbancia
Cuantificación: Cuantificación: Cuantificación: Cuantificación: una unidad de absorbancia a 260nm = 50 µg por ml de ADN doble hebra de en una cubeta de
1cm de camino óptico.
Pureza: Pureza: Pureza: Pureza: Abs 260/ Abs 280 = 1, 8 – 2 (alto grado de pureza de ADN)
< 1,8 alto grado de contaminación con proteínas
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSCUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSCUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSCUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
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TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSMÁS UTILIZADAS
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos
Amplificación de blancos
RT- PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
PCR
PCR en tiempo real
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Amplificación de BlancosReacción en Cadena de la Polimerasa
� Desarrollada en 1985.
� Permite replicar pequeñascantidades de ADN.
� Se basa en la actividad de laenzima ADN polimerasa defabricar una cadena de ADNcomplementaria a otra yaexistente.
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Componentes de una PCR
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Aplicaciones practicas más comunes de la PCR
Diagnóstico de
Enfermedades Hereditarias
� Aislar y marcar segmentos de ADN� Seleccionar sitios de mutación� Terapia genética� Complementa la clonación
� Leucemia mieloide crónica� Cáncer de cervix uterino y el VPH� Cáncer de Córnea� Todo tipo de oncogenes
� Drepanocitosis� Talasemia� Fibrosis quística� Hemofilia
Investigación
Diagnóstico delcáncer
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� VIH
� Hepatitis
� Identificación de una muestra de sangre, semen o cabello.
Diagnóstico de
Infecciones
Patología Forense
Antropología
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RT- PCR
� Amplifica blancos de ADN.
� Detección de las infecciones por virus de ARN.
� Detección de las especies de Mycobacterium .
� Determinación de la terapia antimicrobiana.
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5´ 3´
5´3´
3´
3´
3´
3´
5´
5´
5´
5´
5´ 3´
5´ 3´
5´ 3´
Síntesis cDNA con laTranscriptasa reversa
RNAm
cDNA
cDNA con los reactivosde PCR
Amplificación del cDNA
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SecuenciaciónMicroorganismo
Secuenciación
Genoma
Banco de genes
bioinformática
Pruebas en animales
Ensayos clínicos
Desarrollo de nuevos agentesTerapéuticos y/o vacunas
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Métodos para la Identificación de losProductos Amplificados
Electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida.
Transferencia del ADN • Southern Blot• Dot Blot y Slot Blot
Sistemas de Detección con híbridos marcadoscon digoxigenina.
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Electroforesis en gel de Agarosa1 2
43
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TRANSFERENCIA DEL ADN
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� Fenotipo de Adherencia localizada está
correlacionado con ECEP.
� Inducen el fenotipo de adhesión- destrucción.
� Las cepas ECEP presentanun plásmido de 50 a 70 Mda(FAE) y el gen cromosomaleaeA.
Escherichia coli Enteropatógena(ECEP)
APLICACIONES DE LA PCR•Detección del gen cromosomal eaeA y FAE deEscherichia coli
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Análisis de la Presencia del GenCromosomal eaeA. Línea 1: PM;Línea 2: Control Negativo;Línea 3 y 4: Cepas ECEP.
Análisis de la Presencia del Factor de Adherencia . Línea 1: PM; Línea 2: Control Negativo; Línea 3: Controlpositivo;Líneas 4, 5 y 6: Cepas ECEP.
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6
400 pb
1000 pb
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DetecciónMicroscópica
Carece de sensibilidad y especificidad.
Microscopia directa
No permite distinguir entre MTB y las (MNTB).
Necesidad de utilizar pruebas diagnósticasespecíficas para el inicio de un tratamiento
específico en forma rápida y oportuna.
Identificación Por cultivo
Requiere hasta cuatrosemanas.
DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS
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DETECCIÓN DE Mycobacterium tuberculosisPOR PCR
� Se puede detectar a partir de:sangre, LCR, líquido pleural,esputo, lavadobronquioalveolar, orina ybiopsia.
� Se pueden identificar muestras con concentraciones de menos de 500 bacilos/ml.
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VirusPapilomaHumano
Cáncer de Cuello Uterino
Incidencia25.54% 3000 nuevos
casosCada año
Edad entre25 y 64 años
DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VPH
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Tipos de VPH más comunes
Lesiones Tipos de VPH más comunes
Verrugas comunes de mano
2, 4
Verrugas plantares 1, 2, 4
Verrugas planas cutáneas
3, 10
Verrugas genitales 6, 11
NIC, SCC cervical 16, 18
Otras neoplasias anogenitales
16, 18
NIC = Neoplasia intraepitelial cervical; SCC = Carcinoma de células escamosas
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Tipo de Muestra
� Hisopado uretral� Hisopado cervical� Biopsia
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Procesamiento de la Muestra
� Lisis Alcalina
� Amplificación
� Multiplex
Detección:� Primers MY09/ MY11
Tipificación:�Enzimas de Restricción
Multiplex PCR.
� Alto Riesgo : 16, 18 y 31
� Bajo Riesgo : 6 y 11
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1 2 3 4 5 6 7
Detección de VPH medianteLa RCP.
Tipificación del VPH utilizandoEnzimas de restricción.
Visualización del Producto Amplificado
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Foto.- Detección y Tipificación del VPH:
Línea 1: PM; Línea 2 y 3:ADN de pacientes;
Línea 4 y 5 : Control Positivo (multiplex).
144 pb (tipo 11)
263 pb (tipo 6)
360 pb (tipo 33)
401 pb (tipo 18)
601 pb (tipo 16)
1 2 3 4 5
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Multiplex PCRDetección del gen cagA de H. pylori
• Bacilo gram- negativo.
• Coloniza la mucosa gástrica
• Infección está influenciada por :la susceptibilidad genética delhospedador, por factoresambientales y por la virulenciade la cepa infectante.
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1 2 3 4 5 6 7 8
600bp
Figure 1. PCR amplification of m1/m2 region of the
vacA gene. Lane 1: ladder, lane 2 -6 DNA samples from
strains, lane 7: positive control, lane 8: negative control.
Figure 3. PCR amplification of urec gene. Lane 1: ladder,
lane 2 -11 DNA samples from strains, lane 12: negative
control, lane 13: positive control.
294 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
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1 2 3 4 5 6 7 8
Figura No. 8 .- Análisis deHelicobacterpyloricon MPCR. Línea 1: Marcador de PM;Línea 2:Control Positivo; Líneas 3- 7: ADN dePacientes;Línea 8: Control Negativo.
Cag A ( 348 pb )UreaC ( 315 pb )Flagelina ( 152 pb )16S ( 110 pb )
Fig.No.9.-Análisis deHelicobacter pylori conMPCR. Línea 1: Marcador de PM; Líneas 2-4:ADN de Pacientes; Línea 5 : Control Positivo ;Línea 6: Control Negativo.
1 2 3 4 5 6