EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GIBERELÍCO DE BACTERIAS NATIVAS DEL GENERO Azospirillum sp AISALADA DE SUELOS DEL

DEPARTAMENTO CORDOBA

CARMEN LUCÍA LUNA RAMOSMIGUEL EDUARDO MONTOYA RAMOS

DIRECTORA:Ph.D CECILIA LARA MANTILLA

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBAFACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICAPROGRAMA DE QUÍMICA

MONTERÍA-2014

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la producción de ácido giberelíco de bacterias nativas del genero

Azospirillum sp aisladas de suelos del departamento de Córdoba.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Multiplicar las bacterias nativas de genero Azospirillum sp existentes en el

banco de muestras del laboratorio de biotecnología teniendo en cuenta las

condiciones nutricionales y factores de crecimiento.

Evaluación de la producción del ácido por el método de reactivo ácido

fosfomolíbdico (folling-wu).

Seleccionar las mejores bacterias teniendo en cuenta su producción de

ácido.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Actualmente los altos costos de los fertilizantes químicos, así como de los

problemas de contaminación que ocasionan, han generado otras formas de

producción, en donde se incentiven a la práctica de nuevas tecnologías. Estudios

de costos de producción señalan la reducción en la utilización de agroquímicos por

los agricultores en los últimos ocho años, debido a los altos costos que generan

estos insumos, para lograr el máximo rendimiento de los cultivos (Laria et al.,

2003).

Es por esto, que una de las alternativas que puede contribuir con la disminución

de fertilizantes de síntesis química, es la generación de técnicas de producción

agrícola, enfocada al uso eficiente de los recursos que tiendan a una agricultura

sostenible y de bajo impacto agrícola. En este sentido, el interés de adoptar

tecnologías limpias, mediante el manejo de microorganismos con potencial

biofertilizantes, se ha convertido en la mejor alternativa para reducir estos

impactos, y así mismo contribuir con el mejoramiento de las condiciones

medioambientales, económicas y sociales (Laria et al., 2003).

INTRODUCCIÓN

El crecimiento normal de la planta es ocasionado en forma armónica por

sustancias que funcionan como hormonas. Los principales grupos de ellas son las

auxinas, Giberilinas, citoquininas, etileno e inhibidores de crecimiento. Estos

compuestos actúan en bajas proporciones. Durante el desarrollo fenológico de las

plantas, estas varían de acuerdo con el estado de desarrollo, mediante un

delicado balance hormona-inhibidor. Una forma de ataque del patógeno consiste

en alterar ese equilibrio, ya sea mediante la obtención de reguladores de

crecimiento, para aumentar su concentración y así crear los inhibidores de esas

hormonas (Aguilar-Piedras, J.J. 2008).

Las Giberilinas (GAs), como reguladores de crecimiento están estrechamente

asociadas a la promoción de la germinación de las semillas, crecimiento del tallo,

inducir la brotación de yemas y el desarrollo de los frutos. Existen varios tipos de

Giberilinas, siendo las más comunes: Giberelina A1 (GA1), ácido Giberelíco (GA3),

Giberelina A4 (GA4), Giberelina A7 (GA7) y Giberelina A9 (GA9). Químicamente son

un grupo de diterpenoides que se definen más por su estructura que por su

actividad biológica, contrario a lo que ocurre con las auxinas y las citoquininas

(Yamaguchi y Kamiya 2000).

Únicamente las Giberilinas biológicamente activas pueden cumplir con estas

funciones, las Giberilinas no bioactivas existen en el tejido vegetal como

precursores de las formas bioactivas o como metabolitos desactivados. Se ha

dilucidado que existe una necesidad estructural, como requerimiento para la

afinidad con el recientemente descubierto receptor de Giberilinas en arroz (GID1),

y sus homólogos en otras especies (Nakajima et ál. 2006). Parece ser que la

regulación de la biosíntesis de Giberilinas y de sus receptores, y vías de

señalización dependen de la especie de estudio (Yamaguchi 2008).

Teniendo en cuenta lo anterior es importante el estudio de bacterias productoras

de Giberilinas.

ANTECEDENTES

En algunos estudios de campo realizados con cereales se ha llegado a observar

una promoción del crecimiento vegetativo (Kapulnik et al., 1983). También se ha

reportado un efecto a simple vista sobre el crecimiento de varios vegetales como

tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), berenjena (Solanum melongena L.),

pimiento (Capsicum annuum) y algodón (Gossypium barbadense) (Bashan et al.

1989)

Bashan & Levanony (1990), Summer (1990), Fages (1994), Okon y Labandera-

González (1994), citados por Dobbelaere et al. (2001), concluyen que la

inoculación con Azospirillum sp. Incrementó significativamente de un 5-30 % en el

rendimiento de materia seca foliar, granos y proteína foliar, así como en el

desarrollo radical, en alrededor de 60 -70 % de los experimentos en campo.

Richards eta, (2001) dice que las Giberilinas son hormonas que regulan el

crecimiento y desarrollo de las plantas; a través de la promoción de la división y

elongación celular Matusa-göttgens y Hedden, (2009).

Weaver (1996) afirma que las Giberilinas son las únicas sustancias químicas

capaces de promover floración en plantas, que de otro modo permanecerían

vegetativas, al remplazar condiciones ambientales específicas que controlan la

formación de flores. Sin embargo, Salisbury y Ross (1994) mencionan que

también las Citoquininas han estimulado la formación de flores en algunas

variedades de crisantemo (Dedranthema sp.) con el empleo de una combinación

de Citoquininas (Benziladenina) y AG5.

Ngamau (2001) probó aplicaciones de BAP (Benzilaminopurina) y/o AG3 sobre

plantas de la variedad ´Green Goddess` de Z. aethiopica. Estas promovieron la

emergencia temprana e incrementaron el número de brotes visibles y el desarrollo

de estos. De Pascale et al. (2003) demostró que la Giberilinas adelantó floración

en aproximadamente 100 días respecto al testigo.

Luria y Weiss (2005) concluyeron que se incrementó el número de brotes y se

obtuvo hasta cinco veces más flores con tratamientos combinados de BA y AG3.

Reiser (1998) reportó que aplicaciones de AG3 en Z. aethiopica y Z. ´Green

Goddess` incrementaron el número de flores por planta de 1.3 a 3.4 y de 1.3 a 3.8,

respectivamente.

JUSTIFICACIÓN

Debido a la problemática mundial existente hoy en día por el uso indiscriminado de

productos fertilizantes de síntesis química, se han implementado con el paso de

los años soluciones amigables y sostenibles que permitan disminuir el efecto

adverso generado por dichas aplicaciones; de allí que nació el uso de productos

biofertilizantes basados en la potencialización de procesos naturales donde los

actores principales son los microorganismos promotores de crecimiento vegetal

Aguilar-Piedras, (2008).

Las plantas para su desarrollo, no solo realizan procesos fotosintéticos o toman

sustancias minerales del suelo, también llevan a cabo en su interior una serie de

procesos fisiológicos que ayudan a dicho desarrollo. De la misma manera, las

plantas también se ven afectadas y de cierta forma reguladas por algunos de los

procesos que ocurren en el suelo, la mayoría de los cuales se llevan a cabo por

los microorganismos (Pedraza et al. 2008; Molina-Favero et al. 2008).

El desarrollo normal de una planta depende de la interacción de factores externos:

luz, nutrientes, agua y temperatura, e internos: hormonas. Una definición global

del termino hormona, es considerar bajo este nombre a cualquier producto

químico de naturaleza orgánica, que sirve de mensajero y que es producido en

una parte de la planta, tiene como “blanco” otra parte de ella (Conney, Nonhebel,

1991).

Dentro de las bacterias que producen se tiene el género Azospirillum; este se

caracteriza por ser un microorganismo promotor de crecimiento vegetal, que ha

sido ampliamente estudiado, a partir de sus capacidades para generar efectos

benéficos por su inoculación a distintas especies vegetales. Sin embargo aún falta

información a nivel genético y bioquímico, de la regulación y capacidad de cada

uno de sus componentes enzimáticos presentes en procesos como la producción

de Auxinas. (Carreño-Lopez et al. 2000; Costacurta et al.. 1994; Ryu & Patten,

2008; Sergeeva, et al. 2007; Pedraza et al. 2004; Contesto et al. 2010).

Azospirillum ha sido ampliamente estudiado como bacteria promotora de

crecimiento vegetal, ya que tiene la capacidad por un lado, de producir sustancias

como sideróforos, definidos como moléculas de bajo peso molecular que

presentan una alta afinidad por Fe generando un efecto quelante en éste,

igualmente tiene la capacidad de producir bacteriocinas como sustancias

antimicrobianas que generan un efecto de control contra patógenos que puedan

llegar a atacar a las plantas (revisado en Baca, 2009; Somers et al. 2005; Borisov

et al. 2007).

Las Giberilinas son un grupo de diterpenoides que se definen más por su

estructura que por su actividad biológica, contrario a lo que ocurre con las auxinas

y las citoquininas (Yamaguchi y Kamiya 2000).

Las Giberilinas biológicamente activas, actúan como reguladores esenciales del

desarrollo de las plantas, y cubren todos los aspectos de la historia de vida de las

plantas, modulando varias respuestas del crecimiento como la germinación de

semillas, el crecimiento del tallo, la partenocarpia, la expansión foliar, la

elongación de la raíz, la floración y la liberación de enzimas hidrolíticas en algunos

tejidos (Ueguchi-Tanaka et ál. 2007). Únicamente las Giberilinas biológicamente

activas pueden cumplir con estas funciones, las giberelinas no bioactivas existen

en el tejido vegetal como precursores de las formas bioactivas, o como

metabolitos desactivado (Castro-Guerrero, et al, 2011).

MARCO TEÓRICO

BACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO

Definición

Las bacterias promotoras de crecimiento en vegetales (PGPRs) son un grupo de

diferentes especies de bacterias que pueden incrementar el crecimiento y

productividad vegetal (Bashan y Holguín, 1998). Dentro de los microorganismos

promotores de crecimiento vegetal se clasifican una gran variedad de géneros

dentro de los cuales se incluyen Azospirillum, Azotobacter, Pseudomonas,

Bacillus, Rhizobium (Baca, 2009; Klopper, 1993).

Son capaces de colonizar los diferentes sistemas radicales de las plantas y

promover el crecimiento de éstas, pueden alterar el crecimiento de los tejidos

vegetales directa o indirectamente; indirectamente las PGPR juegan un papel

importante en la disminución o prevención de otros fitopatógenos que puedan

atacar las plantas, mientras que las directamente las PGPR promueven el

crecimiento de la planta al sintetizar compuestos (por ejemplo reguladores del

crecimiento vegetal) que le facilita a la planta la toma de nutrientes del ambiente

(Gray & Smith, 2004).

Historia de Azospirillum sp: Spirillum lipoferum, ahora llamado Azospirillum, fue

descrito por primera vez en 1925 por Martinus Willem Beijerinck, luego de lo cual

la bacteria permaneció en el olvido por varias décadas. Las observaciones de

Juan José Peña-Cabriales y Johanna Döbereiner en 1973, inician la época

moderna de este microorganismo.

Hiltner en 1904, observó por primera vez la acumulación de microorganismos en la

zona radical y propuso el término rizósfera. Los exudados radiculares,

conformados por sustancias diversas crean alrededor de las raíces, un ambiente

nutricional enriquecido que favorece el crecimiento bacteriano.

Generalidades Género Azospirillum sp: El género Azospirillum sp, es una

bacteria Gram negativa, perteneciente a la subclase alfa de las proteobacterias, en

el orden de las Rhodospirillaceae, dentro de sus principales características

Las bacterias del género Azospirillum sp., tienen la capacidad de producir auxinas,

citoquininas y giberelinas en medios de cultivo. No obstante, el mecanismo

analizado con mayor amplitud ha sido la producción de auxinas, que puede

modificar el contenido de fitohormonas de las plantas conduciendo a la

estimulación del crecimiento de las mismas, como el caso del Ácido Indol Acético

(AIA), el cual induce al aumento de pelos radiculares, logrando una mayor

captación de nutrimentos.

Metabolismo de Azospirillum sp: Las especies de Azospirillum sp, difieren en su

capacidad para utilizar diferentes compuestos como fuentes de carbono y

nitrógeno. Estas bacterias usan para su crecimiento unos pocos monosacáridos y

disacáridos así como alcoholes polihidroxilados, y principalmente diversos ácidos

orgánicos tales como málico y succínico y algunos aminoácidos (Hartmann &

Burris, 1988). Para el uso de diferentes fuentes de carbono, tanto A. lipoferum

como A. brasilense tienen todas las enzimas de la vía de Embden-Meyerhof-

Parnas y de la vía de Entner-Doudoroff (Westby et al, 1983), así como todas las

enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Martínez et al, 1984). Tanto A.

lipoferum como A. brasilense tienen la capacidad de crecer autotróficamente con

H2 y CO2, proceso en el que participa la ribulosa-1,5- difosfato carboxilasa (Tilak

et al, 1986).

Efectos de factores fisicoquímicos sobre Azospirillum sp.

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo óptimo y bajo

condiciones adecuadas de incubación, ocurre un incremento en el número de

células en períodos muy cortos. En algunas especies se alcanza la población

máxima en 24 horas, en cambio, en otras se necesita un período más prolongado

para alcanzar el máximo desarrollo; para determinar el desarrollo se necesita

medir cuantitativamente la población de células al tiempo de sembrar y

nuevamente después de la incubación. El ciclo de desarrollo de las poblaciones

bacterianas es el procedimiento más importante en la multiplicación de los

microorganismos (Peoples & Craswell, 1992).

pH: Azospirillum sp., tiene un crecimiento óptimo en un rango de pH de 6,5 -7,0.

Si el microorganismo no cuenta con el pH correspondiente, esto provocaría la

inhibición de su crecimiento y desarrollo (Sánchez, 1964). Para Azospirillum

brasilense: pH 6,0-7,8; Azospirillum lipoferum: pH 5,7-6,8; Azospirillum

amazonense: pH 5,7-6,5; Azospirillum halopraeferens: pH 6,0-8,0; Azospirillum

doebereinerae: pH 6,0-7.0.

Temperatura: Muchas especies de Azospirillum sp., requieren una temperatura

óptima de crecimiento cercana a los 30 ºC, excepto para Azospirillum largimobile

que presenta una temperatura de 28 ºC y Azospirillum halopraeferens 41º C. La

modificación de la temperatura, tiene un efecto notable sobre un proceso. Si el

valor utilizado no es adecuado puede disminuir o aún impedir la formación de un

metabolito determinado.

Además, la temperatura puede modificar los requerimientos nutritivos de algún

microorganismo, lo que significa que al modificarse el valor de un factor puede

cambiar los requerimientos de otro.

LA GIBERELINA: Son reguladores del crecimiento de las plantas superiores que

regulan numerosos aspectos del desarrollo vegetal. Ellas promueven el

crecimiento celular debido a que incrementan la hidrólisis de almidón, fructanos y

sacarosa con lo que se originan moléculas de fructosa y glucosa.

Las respuestas que producen o modulan las Giberilinas afectan tanto la regulación

del crecimiento reproductivo de la planta (Azcon & Bieto, 2000). Ellas son

determinantes en el control de la elongación del tallo, también modifican

sustancialmente los procesos reproductivos de los vegetales, participando en el

control del inducción de la floración, en la producción, crecimiento, y desarrollo de

los frutos. Así mismo sustituyen los requerimientos de luz o frio que precisan

muchas de las semillas para germinar (Azcon & Bieto, 2000; Salisbury, 1994).

Para determinar las Giberilinas se usa el método Reactivo de folling-Wu (ácido

fosfomolíbdico); es un método utilizado en la detección de Giberilinas, como un

método sencillo y practico de detección, basado en la reacción de reducción que

presenta el ácido molíbdico frente a soluciones de ácido giberelíco a diferentes

concentraciones. La reacción de reducción ocasiona un cambio de color del

reactivo a azul mostrando la reducción ocasionada por la presencia de Giberilinas

en la solución (Graham & Henderson, 1960)

METODOLOGÍA

EVALUACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

ACTIVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

Las cepas a utilizar pertenecen al banco de cepas del laboratorio de

Biotecnología GRUBIODEQ de la Universidad de Córdoba. Los microorganismos

serán activados utilizándose como medio de cultivo: Nfb; de acuerdo a lo anterior,

se comenzará con la inoculación de los microorganismos y seguidamente se hará

una dilución de dicho inóculo (Solución madre), para así determinar la cantidad de

células de las que se partirá.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MICROBIANA: Para esta determinación se emplearán los siguientes métodos:

MEDIO DE CULTIVO NFB (Dobereiner et al, 1997)

El medio de cultivo que se utilizó para realizar estos estudios será el NFB, que se

usará en la multiplicación de bacterias del género Azospirillum sp. El cuál será

preparado de la siguiente manera; Para 500mL de este medio pesamos 0.25g

K2HPO4, 0.025g FeSO4*7H2O, 0.005g MnSO4*H2O, 0.05g MgSO4*7H2O, 0.01g

NaCl, 0.005g CaCl2, 0.001g NA2M0O4, agregamos 500mL de agua destilada y

ajustamos el pH entre 6.6 a 7.0. Luego lo colocamos en autoclave por un tiempo

de 20 minutos a una temperatura de 121°C aproximadamente, dejamos enfriar a

temperatura ambiente e inoculamos los diferentes microorganismos

DETECCIÓN COLORIMETRICA DE GIBERELINAS: REACTIVO ÁCIDO FOSFOMOLÍBDICO (FOLLING-WU)

La determinación de ácido giberélico con el reactivo Folling-Wu, se realizará a

partir de soluciones stock de Giberilinas comercial Merck; a diferentes

concentraciones, buscando establecer una curva de calibración para la detección

de GA3 en base al reactivo.

Se separarán 500mL del reactivo Folling-Wu, a partir de 35g de ácido molibdico y

5g de Tugstanato de Sodio fueron agregados a un Becker de 1L, luego se agregó

200 cc de NaOH al 10% y después 200 cc de agua destilada. Calentar

vigorosamente el contenido del frasco por 40 minutos para remover cualquier

rastro de amonio presente en el ácido molibdico.

Dejar enfriar y diluir la mezcla hasta 350 cc con agua destilada y agregar 125 cc

de ácido fosfórico al 85%. Finalmente la mezcla fue transferida a un matraz de

500 cc y aforada con agua destilada.

Una vez preparadas las soluciones de reguladores de crecimiento se realizó la

evolución del reactivo, a una proporción de 25mL de la muestra por 15mL del

reactivo, el tiempo de relación será de 60 minutos, a baño en ebullición. El tiempo

cero será estimado luego de 2min de sumergidos los tubos, pasados los 60min se

retirarán del baño y se dejan enfriar en un baño de hielo por unos 5 minutos

aproximadamente.

RECURSOS

MATERIALES Y REACTIVOS

Horno Tugstanato de sodio NaCl

Caja de Petri Hidróxido de sodio MgSO4*7H2O

Pipeta Analítica Ácido fosfórico MnSO4*H2O

Vidrio de Reloj GA3 de grado analítico Gradilla

Espectrofotómetro

Génesis 20

FeCl3*6H2O Agua destilada

Pipeta de vidrio HCl Frasco lavador

Autoclave Agar

Becker CaCl2

Tubos de ensayo FeSO4*7H2O

Espátula K2HPO4

Campana de esterilización Agitador de vidrio

Balanza analítica Pera

RECURSO HUMANO

Ph.D Cecilia Lara Mantilla.

INFRAESTRUCTURA

Laboratorio de investigación en biotecnología GRUBIODEQ (Programa de

Química, Universidad de Córdoba).

RECURSOS ECONÓMICOS

GRUBIODEQ (Programa de química, Universidad de Córdoba).

CRONOGRAMA

ACTIVIDAD TIEMPO (MESES)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

RECOLECCIÓN DE LA MATERIA PRIMA

CULTIVO DE MICROORGANISMO

S

CUANTIFICACIÓN DE GIBERELÍNAS

CON REACTIVO DE FOLLING-WU

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

REDACCIÓN DEL INFORME FINAL

PRESUPUESTO

RUBROS JUSTIFICACIÓN VALOR TOTAL

REACTIVOS

Necesario para el cultivo de

las bacterias, extracción y

cuantificación de la GA3.$7’000.000°°

VIDRIERÍA

Necesaria para el desarrollo

total del proyecto.$4’000.000°°

EQUIPOS:

Autoclave,

espectrofotómetro,

horno, balanza

analítica, Campana de

esterilización.

$9’000.000°°

VALOR TOTAL $11’000.000°°

REFERENCIAS

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de crecimiento vegetal (ácido indol acético y Giberilinas) en cultivos

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