UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA

Evaluación de la actividad antidiabética y antioxidante in vitro de extractos

polares de Justicia spicigera y elucidación estructural de los compuestos

fenólicos mayoritarios.

TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRÍA EN CIENCIAS:

PRODUCTOS NATURALES Y ALIMENTOS

PRESENTA:

I. A. NANCY GIRÓN CRUZ

DIRECTOR DE TESIS:

DR. RAÚL SALAS CORONADO

Huajuapan de León, Oaxaca, México, Junio 2014.

II

Este trabajo se realizó en las instalaciones de los Laboratorios de Productos Naturales y

Alimentos del Instituto de Agroindustrias de la Universidad Tecnológica de la Mixteca.

III

RESUMEN

En el presente proyecto se cuantificaron fenoles totales en los extractos obtenidos a

partir de infusiones, decocciones, y asistidos por ultrasonido, denominados extractos crudos.

Esta cuantificación, así como el contenido de flavonoides totales y actividad antirradicalar

frente al radical DPPH• también se realizó en extractos obtenidos a partir de una limpieza

realizada por extracción en fase sólida (SPE, por sus siglas en inglés), estos extractos se

denominaron extractos limpios. Para los extractos limpios, los flavonoides totales se

cuantificaron a tres diferentes longitudes de onda (405, 490 y 515 nm). También se calculó el

TEC50 con la primera derivada de los datos obtenidos a partir de las cinéticas correspondientes

(tiempo vs % DPPH• consumido), que posteriormente junto con el IC50 permitieron obtener las

eficiencias antirradicalares de todos los extractos. Los extractos crudos con el mayor

contenido de fenoles totales fueron el extracto de la decocción de la hoja fresca con 767.04 ±

0.01 mg EAG/100 g y el extracto de etanol 70% con 618.62 ± 0.01 mg EAG/100 g. Mientras

que los extractos limpios con mayor contenido de fenoles totales fueron el extracto de la

decocción de la hoja fresca y el extracto de etanol 70% con valores de 687.2 ± 0.01 mg

EAG/100 g y 486.05 ± 0.01 mg EAG/100 g, respectivamente. Los valores obtenidos para

flavonoides totales variaron significativamente en función de la longitud de onda utilizada

para la lectura de la absorbancia. Consecuentemente, se realizó una correlación de Pearson de

los valores de flavonoides totales calculados a las tres longitudes de onda para cada extracto

con el contenido de fenoles totales para encontrar la mejor correlación y de esa manera

proponer la mejor longitud de onda para cuantificar los flavonoides totales. La mejor

correlación se obtuvo con los valores calculados a una longitud de onda de 490 nm. El mayor

contenido de flavonoides totales se encontró en el extracto de la decocción de hoja fresca,

668.65 ± 0.01 mg equivalentes de quercetina (EQ)/100 g, seguido del extracto de etanol al

70%, 492.15 ± 0.01 mg EQ/100 g. El extracto limpio con la mayor actividad antirradicalar

correspondió a la fracción acuosa proveniente del extracto crudo de etanol al 70%, el cual

presentó un IC50 de 1115.00 ± 3.43 g/mL, un TEC50 de 18 min y una eficiencia antirradicalar

de 1 x 10-6 kg DPPH•/(g muestra seca*min).

IV

ÍNDICE

Página

RESUMEN………………………………………………………………………………….…II

ABREVIATURAS…………………………………………………………………………….V

ÍNDICE DE APÉNDICES………………………………………………………………...…VII

ÍNDICE DE FIGURAS………………………………………………………………...……VIII

ÍNDICE DE TABLAS………………...…………………………………...………………….IX

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1

2. ANÁLISIS DE FUNDAMENTOS ........................................................................................ 3

2.1. Características taxonómicas del género Justicia .............................................................. 3

2.2. Características taxonómicas y distribución geográfica de J. spicigera ............................ 4

2.3. Propiedades biológicas del género Justicia ...................................................................... 4

2.4. Plantas con propiedades antidiabéticas............................................................................. 7

2.5. Propiedades de los compuestos fenólicos ......................................................................... 9

2.6. Actividad antidiabética de extractos de plantas .............................................................. 11

2.6.1. Actividad antidiabética in vitro ............................................................................... 11

2.7. Actividad antioxidante de extractos de plantas .............................................................. 13

2.8. Métodos de extracción .................................................................................................... 16

2.9. Extracción en fase sólida (SPE)...................................................................................... 17

2.10. Elucidación estructural ................................................................................................. 18

2.10.1. Espectroscopía de infrarrojo .................................................................................. 19

2.10.2. Espectrometría de masa (MS)................................................................................ 19

2.10.3. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) ..................................... 20

V

3. ORIGINALIDAD ................................................................................................................. 23

4. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 24

4.1. Objetivo general ............................................................................................................. 24

4.2. Objetivos específicos ...................................................................................................... 24

5. METAS ................................................................................................................................. 25

6. METODOLOGÍA ................................................................................................................. 26

6.1. Equipos, reactivos y disolventes ..................................................................................... 27

6.2. Obtención de la muestra ................................................................................................. 27

6.3. Preparación de la muestra ............................................................................................... 28

6.4. Obtención de los extractos .............................................................................................. 28

6.5. Limpieza de los extractos por extracción en fase sólida (SPE) ...................................... 29

6.6. Cuantificación de fenoles totales en los extractos .......................................................... 29

6.7. Cuantificación de flavonoides totales en los extractos ................................................... 30

6.8. Evaluación de la actividad antirradical de los extractos ................................................. 31

6.9. Hidrólisis de los extractos............................................................................................... 32

6.10. Evaluación de la inhibición de la difusión de glucosa.................................................. 32

6.11. Evaluación de la inhibición de la actividad enzimática ................................................ 33

6.11.1. Inhibición de los extractos en presencia de α-amilasa ........................................... 33

6.11.2. Inhibición de la α-glucosidasa en presencia de los extractos. ............................... 34

6.12. Aislamiento de los compuestos fenólicos ..................................................................... 34

6.13. Caracterización de los compuestos fenólicos presentes en los extractos ..................... 35

6.14. Análisis estadístico ....................................................................................................... 36

7. RESULTADOS Y DISCUSIONES ..................................................................................... 37

7.1. Obtención de la muestra ................................................................................................. 37

VI

7.2. Obtención de extractos ................................................................................................... 38

7.3. Cuantificación de fenoles totales .................................................................................... 39

7.4. Cuantificación de flavonoides totales ............................................................................. 46

7.5. Evaluación de la actividad antioxidante ........................................................................ 51

8. REFERENCIAS ................................................................................................................... 56

9. ANEXOS .............................................................................................................................. 61

10. APÉNDICES ...................................................................................................................... 64

VII

ABREVIATURAS

A 1 Anexo 1

A 2 Anexo 2

ABTS•+ Catión radical ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolinal)-6-sulfónico

CID Disociación inducida por colisión

DMSO Dimetilsulfóxido

DPPH• Radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo

EAG Equivalentes de ácido gálico

EC Equivalentes de catequina

EQ Equivalentes de quercetina

FRAP Poder reductor del ion férrico

HPLC Cromatografía líquida de alta resolución

IC50 Concentración de extracto requerida para inhibir el 50% del DPPH•

IR Espectroscopía de infrarrojo

MS Espectrometría de masa

MS/MS Espectrometría de masa en cascada

OMS Organización mundial para la salud

ORAC Capacidad de absorción de radicales oxígeno

RMN Resonancia magnética nuclear

VIII

SPE Extracción en fase sólida

TEAC Capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox

UV/Vis Ultravioleta/visible

IX

ÍNDICE DE ANEXOS

Página

A 1. Relación entre el mecanismo de acción de fármacos y plantas. ........................................ 61

A 2. Medicamentos orales para el tratamiento de la diabetes Tipo 2. ....................................... 62

X

ÍNDICE DE APÉNDICES

Página

AP 1. Fenoles totales en extractos crudos de las hojas de J. spicigera. .................................... 64

AP 2. Flavonoides totales en equivalentes de catequina. .......................................................... 66

AP 3. Flavonoides totales en equivalentes de quercetina. ......................................................... 68

AP 4. Curva de calibración en equivalentes de ácido gálico para la cuantificación de fenoles

totales. ........................................................................................................................................ 70

AP 5. Curva de calibración en equivalentes de (+) - catequina para la cuantificación de

flavonoides totales. .................................................................................................................... 71

AP 6. Curva de calibración en equivalentes de quercetina para la cuantificación de flavonoides

totales. ........................................................................................................................................ 73

AP 7. Curva de calibración en equivalentes de ácido gálico para DPPH•................................ 75

AP 8. IC50 y TEC50 del BHT para el ensayo del DPPH•. ............................................................ 76

AP 9. IC50 y TEC50 de la decocción de la hoja fresca de J. spicigera, fracción acuosa para

DPPH•. ....................................................................................................................................... 77

AP 10. IC50 y TEC50 de la decocción de la hoja fresca de J. spicigera, fracción MeOH/H2O

para DPPH•. ............................................................................................................................... 78

AP 11. IC50 y TEC50 de la decocción del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción acuosa para

DPPH•. ....................................................................................................................................... 79

AP 12. IC50 y TEC50 de la decocción del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción MeOH/H2O

para DPPH•. ............................................................................................................................... 80

XI

AP 13. IC50 y TEC50 de la infusión del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción acuosa para

DPPH•. ....................................................................................................................................... 81

AP 14. IC50 y TEC50 de la infusión del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción MeOH/H2O

para DPPH•. ............................................................................................................................... 82

AP 15. IC50 y TEC50 del extracto H2O por ultrasonido del polvo de la hoja de J. spicigera,

fracción acuosa para DPPH•. ..................................................................................................... 83

AP 16. IC50 y TEC50 del extracto H2O por ultrasonido del polvo de la hoja de J. spicigera,

fracción MeOH/H2O para DPPH•. ............................................................................................. 84

AP 17. IC50 y TEC50 del extracto MeOH por ultrasonido del polvo de la hoja de J. spicigera,

fracción acuosa para DPPH•. ..................................................................................................... 85

AP 18. IC50 y TEC50 del extracto MeOH por ultrasonido del polvo de la hoja de J. spicigera,

fracción MeOH/H2O para DPPH•. ............................................................................................. 86

AP 19. IC50 y TEC50 del extracto EtOH 70% por ultrasonido del polvo de J. spicigera, fracción

acuosa para DPPH•. ................................................................................................................... 87

AP 20. IC50 y TEC50 del extracto EtOH 70% por ultrasonido del polvo de J. spicigera, fracción

MeOH/H2O para DPPH•. ........................................................................................................... 88

AP 21. IC50 y TEC50 del extracto acetona 70% por ultrasonido del polvo de J. spicigera,

fracción acuosa para DPPH•. ..................................................................................................... 89

AP 22. IC50 y TEC50 del extracto de acetona 70% por ultrasonido del polvo de J. spicigera,

fracción MeOH/H2O para DPPH•. ............................................................................................. 90

XII

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Hojas de J. gendarussa1, J. pectoralis2, J. isularis3, J. adhatoda4, J. flava5 y J.

procumbes6. ................................................................................................................................. 3

Figura 2. Hojas y flores de J. spicigera. ..................................................................................... 4

Figura 3. Compuestos fenólicos. ................................................................................................ 9

Figura 4. Biosíntesis de un lignano. ......................................................................................... 10

Figura 5. Modelo de Gallagher et al. (2003), Imagen de la Tesis de Cruz-Gallegos, 2012. .... 12

Figura 6. Extracción en fase sólida........................................................................................... 18

Figura 7. Procedimiento del tratamiento de la muestra. ........................................................... 26

Figura 8. Secado de hojas de J. spicigera. ............................................................................... 37

Figura 9. Diagrama para la obtención de extractos limpio. ...................................................... 39

Figura 10. Contenido de fenoles totales en extractos crudos de J. spicigera. .......................... 40

Figura 11. Contenido de fenoles totales en hojas de J. spicgera. ............................................. 41

Figura 12. Contenido de fenoles totales de las hojas de J. spicigera y del tallo J. gendarussa.

................................................................................................................................................... 42

Figura 13. Contenido de fenoles totales en hojas de diferentes plantas. .................................. 43

Figura 14. Contenido de fenoles totales de extractos limpios de J. spicigera.......................... 44

Figura 15. Comparativo de fenoles totales de extractos crudos y extractos limpios de J.

spicigera. ................................................................................................................................... 45

XIII

Figura 16. Contenido de fenoles totales en extractos limpios de J. spicigera.......................... 46

Figura 17. Flavonoides totales de la suma de fracciones en equivalentes de quercetina de las

hojas de J. spicigera. ................................................................................................................. 47

Figura 18. Contenido de flavonoides totales en hojas de J. spicigera. .................................... 48

Figura 19. Contenido de flavonoides totales en equivalentes de quercetina. ........................... 49

Figura 20. Flavonoides totales de la suma de fracciones en equivalentes de catequina de las

hojas de J. spicigera. ................................................................................................................. 50

Figura 21. IC50 de las fracciones de los extractos de J. spicigera. ........................................... 52

Figura 22. Cinética de la fracción acuosa de la decocción de la hoja fresca de J. spicigera. .. 53

Figura 23. Cinética de la fracción acuosa del extracto de etanol al 70% de J. spicigera. ........ 53

XIV

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Actividad biológica del género Justicia. ...................................................................... 5

Tabla 2. Metabolitos secundarios aislados del género Justicia. ................................................. 6

Tabla 3. Actividad antioxidante de algunas plantas. ................................................................ 14

Tabla 4. Actividad antioxidante de J. pectoralis. ..................................................................... 15

Tabla 5. Actividad antioxidante de J. gendarussa. ................................................................... 15

Tabla 6. Bandas del espectro de IR de algunos flavonoides..................................................... 19

Tabla 7. Desplazamiento químico de protón. ........................................................................... 21

Tabla 8. Desplazamientos químicos de varios tipos de carbonos de flavonoides. ................... 22

Tabla 9. Determinación de humedad en hojas de J. spicigera. ................................................ 38

Tabla 10. Correlación de Pearson entre fenoles y flavonoides. ................................................ 48

Tabla 11. TEC50 y eficiencia antirradicalar (AE) de los extractos de J. spicigera. ................... 55

1

1. INTRODUCCIÓN

La diabetes mellitus es un trastorno metabólico que se caracteriza por la pérdida de la

homeostasis de la glucosa con alteraciones en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y

proteínas. Esto se refleja en la secreción de insulina, la acción de la insulina o en ambos. De

acuerdo con datos de la OMS, se estima que el 3% de la población en el mundo padece

diabetes y se espera que se duplique para el año 2025 a 6.5% aproximadamente. Para la

comunidad médica continúa siendo un reto el empleo de medicamentos que no ejerzan efectos

negativos en la salud de los pacientes diabéticos (Basha et al., 2012).

La diabetes mellitus se puede clasificar en dos tipos principales, Tipo 1 o diabetes

juvenil (insulinodependiente) y Tipo 2 o diabetes de adultos (no insulinodependiente). La

diabetes Tipo 1 se presenta en la infancia, principalmente se debe a la destrucción de las

células pancreáticas β, lo cual trae como consecuencia a la deficiencia absoluta de insulina. La

diabetes Tipo 2 está más asociada con la edad adulta, en este caso se desconoce por qué se da

la resistencia a la insulina, sin embargo se asocia al impacto ambiental, los hábitos

alimentarios, obesidad, a una etapa en una enfermedad determinada, entre otros aspectos

(Hemalatha et al., 2012).

El uso de medicamentos está restringido por sus propiedades farmacocinéticas y por los

efectos secundarios adversos, A 2. Por ejemplo, la glibenclamida puede llegar a provocar

vómito, hipoglucemia, estreñimiento, hiperacidez gástrica, cefalea, entre otros. La metformina,

otro medicamento empleado para tratar la diabetes Tipo 2, puede llegar a causar diarrea, gases,

distensión abdominal, dolor muscular, etc. Por lo tanto la búsqueda de una nueva clase de

compuestos es esencial para superar problemas asociados con la diabetes (Basha et al., 2012).

De acuerdo a la OMS, aproximadamente el 80% de la población mundial,

especialmente las poblaciones rurales de los países en desarrollo, ingieren infusiones o

2

decocciones de plantas para tratar enfermedades como cáncer, diarrea, parasitarias, diabetes,

etc. (Kadir et al., 2012). Particularmente, personas con diabetes Tipo 2 utilizan plantas

medicinales para regular los niveles de glucosa en sangre, obteniendo resultados positivos. Sin

embargo, los tratamientos siguen siendo empíricos y generalmente se desconoce su

mecanismo de acción. Algunas plantas que comúnmente se utilizan para la diabetes en México

son las hojas de aguacate, el nopal, la sábila, el wereke y el muicle (Justicia spicigera). Esta

última, objeto del presente estudio, es un arbusto de hoja perenne con flores tubulares de color

naranja que crece en climas cálidos y se extiende desde México hasta América del Sur (Ortiz-

Andrade et al., 2012).

Actualmente existe un estudio reciente que está relacionado con la evaluación de la

actividad antidiabética in vivo e in vitro de J. spicigera, Ortiz-Andrade et al. (2012). En este

estudio se evaluó la actividad antidiabética in vivo de extractos etanólicos de J. spicigera. Los

resultados del estudio demostraron que esos extractos poseen una fuerte actividad

antidiabética respecto a la glibenclamida, repaglinida y saxagliptina, fármacos

hipoglucemiantes comerciales. Los autores proponen cinco posibles mecanismos por los

cuales se podría llevar a cabo la actividad antidiabética de los extractos de J. spicigera, los

extractos pueden modular la acción y/o secreción de la insulina, pueden involucrar la

participación de un sistema antioxidante, aumentar el metabolismo de la glucosa en las células

β, activar un sistema enzimático y pueden servir como un mensajero de derivados de

fosfolípidos. Cabe resaltar que, no existe mucha información en la literatura científica sobre

quiénes son los metabolitos secundarios y el mecanismo por el cual los extractos de J.

spicigera ejercen dicha actividad.

Debido a lo anterior, en el presente proyecto se evaluó la actividad antidiabética in

vitro de los extractos de J. spicigera a través de dos mecanismos, la inhibición de la difusión

de glucosa mediante el método modificado de Gallagher et al. (2003) y la inhibición

enzimática de las enzimas -amilasa y -glucosidasa. Adicionalmente se determinó la

actividad antirradical, y se cuantificaron los flavonoides y fenoles totales presentes en los

extractos. Finalmente, se caracterizaron los compuestos fenólicos mayoritarios presentes en

los extractos. Este estudio permitió cuantificar in vitro la actividad antidiabética y elucidar los

metabolitos secundarios que confieren a la planta dicha propiedad.

3

2. ANÁLISIS DE FUNDAMENTOS

En la presente sección se describirán las características taxonómicas de Justicia

spicigera y algunas propiedades biológicas tanto para esta planta como para otras del mismo

género. También se describirán los métodos utilizados para la determinación de la actividad

antidiabética y antioxidante, así como los métodos para la elucidación estructural de los

metabolitos secundarios a aislar.

2.1. Características taxonómicas del género Justicia

El Género Justicia, Figura 1, se encuentra ampliamente distribuido por todo el mundo y

se caracteriza por tener usos medicinales y algunos de estos usos se han estudiado.

Figura 1. Hojas de J. gendarussa1, J. pectoralis2, J. isularis3, J. adhatoda4, J. flava5 y J.

procumbes6.

1 2 3

4 5 6

4

2.2. Características taxonómicas y distribución geográfica de J. spicigera

Esta planta es nativa de México y puede llegar a crecer hasta en algunas regiones de

América del Sur. En algunos estados como Yucatán se conoce con el nombre de chak lool,

ts’i’its y yichkaan, y en la Huasteca Potosina se le conoce comúnmente como muicle o muite

(Ortiz-Andrade et al., 2012).

Se puede describir como una hierba erecta o trepadora perene. Sus hojas son pecioladas

con un margen de la hoja que generalmente es entero. Las brácteas y bractéolas son

generalmente visibles y superpuestas. La corola se puede observar, con un labio posterior que

es generalmente de dos lóbulos, un labio anterior que es de tres lóbulos, dos estambres, una

cápsula con cuatro semillas, y la porción basal estéril, Figura 2 (Ortiz-Andrade et al., 2012).

Figura 2. Hojas y flores de J. spicigera.

2.3. Propiedades biológicas del género Justicia

En la Tabla 1 se muestran algunas especies del género Justicia así como su actividad

biológica y en la Tabla 2 se muestran lo metabolitos secundarios presentes en el género

Justicia que poseen actividad biológica (Corrêa & Alcântara, 2012).

5

Tabla 1. Actividad biológica del género Justicia.

Especies Parte

estudiada Propiedades Ensayo País Referencia

neesii Planta entera Anticancerígenas Extracto

etanólico India

Chariandy et al.,

1999

Rajasekhar &

Subbaraju, 2000

pectoralis Hojas y tallo Antidiabéticas Infusión Colombia Lizcano et al.,

2010

sericea Parte aérea Antiinflamatorias Extracto

etanólico Perú Rojas et al., 2003

spicigera

Hojas Antiinflamatorias Decocción México Mecks et al., 2004

Parte aérea Anticancerígenas y

Antidiabéticas Decocción México

Vega - Ávila et al.,

2009

Alonso - Castro et

al., 2011

Hojas Antidiabéticas Infusión México Andrade - Cetto &

Heinrich, 2005

La infusión de las hojas de J. spicigera se emplea para la hipertensión, la anemia

durante periodos de menstruación en mujeres, parásitos intestinales y leucemia (Cáceres-

Cortés et al., 2001). También se le han atribuido propiedades anticancerígenas y antidiabéticas

(Ortiz-Andrade et al., 2012).

6

Tabla 2. Metabolitos secundarios aislados del género Justicia.

Compuesto Actividad

biológica Especie Extracto Referencia

Umbeliferona Antiinflamatorias pectoralis EtOH Lino et al., 1997

Leal et al., 2000

3´,4´-

Dihidroxiflavonol

Antioxidantes y

antidiabéticas cataractae EtOH

Jiménez et al., 2001

Woodman et al., 2005

Woodman & Malakul,

2009

Apigenina Antiinflamatorias

y antitumorales gendarussa EtOH

Wahi et al., 1974

Sawatzky et al., 2006

Cai et al., 2011

Kaempferitrina Antiinflamatorias

y antidiabéticas spicigera CHCl3 Dominguez et al., 1990

Vitexina Antiinflamatorias gendarussa EtOH Wahi et al., 1974

Sridhar et al., 2006

10H-Quindolina Antitumorales betonica EtOAc Caprio et al., 2000

Jusbetonina Antitumorales betonica MeOH Caprio et al., 2000

Subbaraju et al., 2004

Vasicina Antiinflamatorias adhatoda EtOH

Mehta et al., 1963

Claeson et al., 2000

Rachana et al., 2011

Alantoina Antiinflamatorias spicigera Dominguez et al., 1990

Niu et al., 2010

Helioxantina Antitumorales flava EtOH Chang et al., 2000

Taiwanina Antitumorales procumbes EtOH Chen et al., 2000

Justicidina B Antiinflamatorias

y citotóxicas purpurea MeOH

Baba et al., 1996

Gertsch et al., 2003

Rao et al., 2006

Diphyllina Citotóxicas

extensa

procumbens

ciliata

EtOH

MeOH

MeOH

Wang & Ripka, 1983

Fukamiya & Lee, 1986

Day et al., 1999

Elenosido Antiinflamatorias hyssopifolia EtOH Alonso et al., 1997

Navarro et al., 2001

Ciliatosido A Antiinflamatorias ciliata MeOH Day et al., 2000

(+) -

Isolariciresinol Antiinflamatorias flava EtOH Küpeli et al., 2003

7

2.4. Plantas con propiedades antidiabéticas

Se ha reportado la existencia de 800 plantas utilizadas para el control de la diabetes en

todo el mundo; de las cuales, se ha comprobado experimentalmente que 450 poseen

propiedades antidiabéticas. Sin embargo, el mecanismo de acción solo se ha comprobado en

109 plantas, A 1 (Kumar et al., 2011). Los mecanismos de acción antidiabética propuestos

para las plantas se enlistan a continuación, de los cuales los más estudiados son los

mecanismos 3 y 9 (Bhushan et al., 2010):

1. Estimulan la síntesis y/o liberación de insulina

2. Mimetizan a la insulina

3. Incrementan el metabolismo de la glucosa

4. Incrementan la utilización de glucosa periférica

5. Inhiben la absorción de glucosa en el tracto gastrointestinal

6. Reducen los niveles de glucosa en sangre por regeneración de células β

7. Reducen la insulinorresistencia

8. Disminuyen la gluconeogénesis y glicogénesis

9. Inhiben a la α-amilasa y α-glucosidasa

A continuación se mencionan algunos ejemplos representativos de mecanismos de

acción de plantas antidiabéticas:

Basha et al. (2012), evaluaron la actividad antidiabética in vitro de las hojas de Psidium

guajava. Los extractos metanólicos de esta planta presentan un efecto potencial de la

inhibición de la difusión de glucosa usando un tubo de diálisis. En ese estudio se muestra la

inhibición de la difusión y consecuentemente un posible efecto sobre el movimiento de la

glucosa en el tracto intestinal (Mecanismo 5).

Los extractos metanólicos de las partes aéreas de Passiflora incarnata, disminuyen los

niveles de glucosa en ratones con diabetes inducida con estreptozotocina. Los extractos

pueden estar involucrados en la liberación de insulina, aumentando la utilización de glucosa

periférica (Mecanismos 4 y 6), esto está asociado con la regeneración de los islotes de

8

Langerhans. Estos islotes contienen células β, las cuales son las encargadas de producir

insulina y se encuentran localizadas en el interior del páncreas (Gupta et al., 2012).

Ramkumar et al. (2010), evaluaron la actividad antidiabética in vitro con el uso de

enzimas α-amilasa y α-glucosidasa de los extractos etanólicos de las hojas de Gymnema

montanum. Los resultados obtenidos muestran que los extractos inhiben la actividad de estas

enzimas y por lo tanto se reducen los niveles de glucosa en sangre. Esto indica que los

extractos pueden suprimir la absorción de carbohidratos desde el intestino y con ello reducir la

hiperglicemia, mediante la inhibición enzimática (Mecanismo 9).

En un estudio en el cual se evaluó la actividad antidiabética in vivo de los extractos de

las hojas de Biophytum sensitivum, se encontró que estos extractos estimulan a las células β

del páncreas para liberar insulina en conejos machos diabéticos, ejerciendo así una actividad

hipoglucemiante. La administración del extracto B. sensitivum en ayunas a los conejos

diabéticos mostraron un aumento significativo en los niveles séricos de insulina, lo que sugiere

un modo de acción a nivel del páncreas. La respuesta hipoglicémica de esta planta es mediada

a través de la estimulación de la síntesis/liberación de insulina de las células β de los islotes de

Langerhans (Mecanismo 3) (Patel et al., 2012).

Los metabolitos secundarios presentes en plantas con propiedades antidiabéticas

pertenecen a los grupos de compuestos químicos llamados: terpenos, sapogeninas,

carotenoides, alcaloides, esteroles, taninos, polisacáridos, cumarinas, esteroides, ácidos

fenólicos, lignanos y flavonoides (Andrade-Cetto & Heinrich, 2005). Cabe mencionar que

tanto los lignanos como los flavonoides, son compuestos fenólicos que están presentes en los

extractos polares de plantas del género Justicia. Consecuentemente, a continuación se

describirán brevemente las propiedades biológicas de estos dos grupos de compuestos.

9

2.5. Propiedades de los compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios que poseen un anillo aromático

con uno o más grupos hidroxilo. Sus estructuras pueden variar de una molécula fenólica

simple a un polímero complejo de peso molecular alto. Los compuestos fenólicos se dividen

en diversas clases, basándose en el número de anillos aromáticos que contengan y a los

elementos estructurales que se encuentren unidos a esos anillos. Los principales grupos de

compuestos fenólicos son: ácidos fenólicos, taninos, estilbenos, flavonoides y lignanos, Figura

3 (Ignat et al., 2011). Los flavonoides y lignanos se han identificado en el género Justicia y se

les han atribuido una gran parte de las propiedades medicinales de esas plantas. A

continuación se describen brevemente las características estructurales de estas dos clases de

compuestos.

Figura 3. Compuestos fenólicos.

Nombre R1 R2 R3

Ácido p - hidroxibenzoico H OH H

Ácido gálico OH OH OH

Ácido protocatecuico OH OH H

Nombre R1 R2 R3 R4 R5 R6

trans - resveratrol OH H OH H OH H

Piceatannol OH H OH OH OH H

trans - astringina GlcO H OH H OH OH

Nombre R1 R2 R3 R4 R5 R6

Enterodiol CH2OH CH2OH OH H OH H

Secoisolariciresinol CH2OH CH2OH OCH3 OH OCH3 OH

10

La estructura básica de los flavonoides es un núcleo flavano que está constituido por 15

átomos de carbono en tres anillos (C6-C3-C6), nombrados como A, B, C. Las diferentes clases

de flavonoides difieren en el nivel de oxidación y saturación del anillo C, mientras que los

compuestos individuales difieren en la sustitución del anillo A y B. Las diferencias en la

estructura y sustitución influyen en la estabilidad del radical y por lo tanto en las propiedades

antioxidantes de los flavonoides (Wojdylo et al., 2007).

Los flavonoides tienen propiedades biológicas tales como, actividad antimicrobiana,

antiulcerosa, antiinflamatoria, antioxidante, antitumoral, antiespasmódica, antidiabética, entre

otras (Ghasemzadeh & Ghasemzadeh, 2011).

Particularmente, los lignanos son un grupo de compuestos comúnmente encontrados en

las plantas, están constituidos por la unión de dos moléculas de compuestos fenólicos con

cadenas insaturadas. En la Figura 4 se muestra un ejemplo de la biosíntesis de un lignano a

partir del alcohol coniferílico. Estos metabolitos secundarios poseen una gama amplia de

efectos benéficos a la salud, tales como actividad antioxidante, antiviral, antitumorigénica,

antidiabética, antiobesidad y contra enfermedades cardiovasculares (Smeds et al., 2012).

+MeO

OH

OH

Alcohol coniferílico

-H

MeO

O

OH

.O

OH

MeO

.

OH

O

OH

OMe

OH

OH

OMe

Lignano

. +H.

, + HO.

Figura 4. Biosíntesis de un lignano.

11

2.6. Actividad antidiabética de extractos de plantas

Los efectos antidiabéticos de los extractos de plantas pueden ser estudiados usando

modelos in vivo o usando una variedad de sistemas in vitro. Los sistemas in vitro juegan un

papel muy importante en la evaluación de la actividad antidiabética de los fármacos, y

proporcionan las herramientas iniciales para la selección de un gran número de candidatos

terapéuticos potenciales. Estos sistemas pueden proporcionar información útil sobre el

mecanismo de acción del agente terapéutico. Los materiales biológicos en los sistemas in vitro

pueden ser órganos enteros, tejidos, cultivos celulares, entre otros. En los sistemas in vivo, se

emplean animales vivos, los cuales son necesarios para estudiar cómo se comportan en

condiciones clínicas o fisiopatológicas (Thorat et al., 2012). Los métodos propuestos para

evaluar la actividad antidiabética de los extractos polares de J. spicigera en el presente

proyecto consistirán en modelos in vitro. Consecuentemente a continuación se describen de

manera breve.

2.6.1. Actividad antidiabética in vitro

Investigaciones recientes indican que niveles de glucosa postprandial altos en la sangre

son el factor más importante que favorece el inicio y desarrollo de la diabetes Tipo 2,

denominada hiperglicemia postprandial. Esta hiperglicemia es una absorción rápida de la

glucosa en el intestino después de ingerir alimentos, en la cual la α-amilasa y α-glucosidasa

juegan un papel importante debido a la hidrólisis del almidón y de oligosacáridos. La

inhibición de estas enzimas puede controlar la elevación de los niveles de glucosa en sangre.

Por lo tanto es importante establecer estrategias para reducir la hiperglicemia postprandial a

través de la inhibición de la actividad de estas enzimas (Dong et al., 2012).

Actualmente, los inhibidores de α-amilasa y α-glucosidasa como la acarbosa, voglibosa

y miglitol son ampliamente utilizados en pacientes con diabetes Tipo 2. Sin embargo, se ha

documentado que estos inhibidores sintéticos tienen efectos indeseables tales como diarrea y

cólicos abdominales. Hoy en día se han estudiado inhibidores de α-amilasa y α-glucosidasa

provenientes de fuentes naturales, especialmente de plantas del género Gymnema, tales como

G. sylvestre, G. inodorum y G. yunnanense (Ramkumar et al., 2010). También se ha

12

demostrado que extractos de la cáscara de Camellia sinensis tienen la capacidad de inhibir la

α-amilasa y α-glucosidasa (Wang et al., 2012). Los resultados obtenidos en este último estudio

mostraron que los responsables de la bioactividad de estos extractos son los compuestos

fenólicos.

Dentro de los métodos para evaluar la actividad antidiabética se encuentra la inhibición

de la enzima α-amilasa, este método se fundamenta en mezclar el extracto con una disolución

de la enzima. Después, esa mezcla se expone a una disolución de almidón. Posteriormente se

adiciona un reactivo colorimétrico y se miden los cambios de color con un espectrofotómetro

(Nickavar & Yousefian, 2011). De manera análoga, la inhibición de la α-glucosidasa se

determina por la adición de esta enzima al extracto a evaluar. Para iniciar la reacción es

necesario adicionar un sustrato (p-nitrofenil glucopiranósido), que al ser consumido durante la

reacción libera al p-nitrofenil. Éste último compuesto puede ser medido

espectrofotométricamente e indicar de manera indirecta el efecto del extracto sobre la

actividad enzimática (Eom et al., 2011).

Gallagher et al. (2003), evaluaron la actividad antidiabética in vitro de Agaricus

campestris, Agrimony eupatoria, Coriandrum sativum, Eucalyptus globulus, Juniperus

communis, Medicago sativa, Persea americana, Sambuus nigra, Urtica diocia y Viscum

álbum. Los extractos acuosos de estas plantas presentaron una inhibición de la difusión de

glucosa, lo cual está relacionado directamente con la reducción de la absorción de glucosa en

el tracto gastrointestinal. El método consiste en el uso de una membrana de diálisis, Figura 5.

Este método fue evaluado con 10 plantas con propiedades antidiabéticas.

Figura 5. Modelo de Gallagher et al. (2003), Imagen de la Tesis de Cruz-Gallegos, 2012.

13

En el presente estudio se utilizarán estos métodos de evaluación de la actividad

antidiabética.

2.7. Actividad antioxidante de extractos de plantas

En el cuerpo humano el desequilibrio entre especies antioxidantes y oxidantes conduce

al daño celular y problemas en la salud. Esto trae como consecuencia el desarrollo de

enfermedades degenerativas, cardiovasculares, cáncer, diabetes, entre otras. Por lo tanto es

necesario que el ser humano consuma fuentes de antioxidantes no enzimáticos, tales como,

ácido ascórbico, α-tocoferol, carotenoides, flavonoides, entre otros (Krishnaiah et al., 2011).

Las propiedades medicinales de las plantas han sido ampliamente investigadas

alrededor del mundo, debido a su actividad farmacológica y baja toxicidad. Los compuestos

bioactivos que se encuentran en las plantas han demostrado tener posibles beneficios como

actividad antioxidante, anticancerígena, antihipertensiva, antimutagénica, antidiabética, entre

otras. Los compuestos fenólicos en las plantas se componen principalmente de los ácidos

fenólicos y flavonoides (Rodríguez Vaquero et al., 2010).

Dentro de los métodos para determinar la actividad antioxidante de los extractos de las

plantas se encuentran el método del radical DPPH•, del catión radical ABTS•+, entre otros. El

método del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•), radical que produce un color azul

intenso en solución, es uno de los métodos más utilizados para evaluar la actividad

antioxidante de extractos. Este método se basa en la capacidad del DPPH• para reaccionar con

compuestos que pueden donar un radical hidrógeno, esta reacción induce una decoloración de

la solución que puede medirse espectrofotométricamente. Otro método muy utilizado es el del

radical catión ácido 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfonico (ABTS•+) que se basa en

su reducción en presencia de antioxidantes donadores de electrones. Esta reducción produce

una decoloración medible espectrofotométricamente (Krishnaiah et al., 2011).

La actividad antioxidante ha sido investigada ampliamente en diversas plantas. En la

Tabla 3, se muestran algunas plantas con los métodos más utilizados para determinar dicha

actividad (Wojdylo et al., 2007).

14

Tabla 3. Actividad antioxidante de algunas plantas.

Planta Parte

estudiada

Fenoles totales

(mg EAGb/100g peso

seco)

TEACª

(μM trolox/100 g peso seco)

ABTS•+ DPPH•

Tanacetum

vulgare Hoja 1.68 ± 0.02 37.30 ± 2.09 469.00 ± 9.00

Juglans

regia Hoja 0.24 ± 0.03 27.30 ± 0.34 119.00 ± 3.07

Archangelica

officinalis Hoja 0.29 ± 0.01 0.45 ± 0.01 7.34 ± 1.41

Salvia officinalis Toda la planta 8.25 ± 0.09 17.00 ± 0.23 41.20 ± 1.11

Melisa

officinalis Toda la planta 13.20 ± 0.13 10.60 ± 0.09 36.10 ± 1.03

aTEAC, Capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox.

bEAG, Equivalentes de ácido gálico.

Adicionalmente, existen estudios que demuestran una relación directa entre actividad

antioxidante y antidiabética. Khalil, et al. (2008), evaluaron la actividad antioxidante de los

extractos acuosos de las hojas de Bauhinia forficata y Cissus sicyoides, las cuáles poseen

actividad antidiabética. Los resultados obtenidos por el método de ABTS•+ fueron para B.

forficata IC50 = 8.00 ± 0.07 µg/mL y para C. sicyoides IC50= 13.0 ± 0.2 µg/mL expresados en

equivalentes de Trolox, estos resultados indican que los extractos acuosos de estas plantas

poseen actividad antioxidante, siendo los compuesto fenólicos responsables de diversas

actividades como la anticancerígena, antidiabética, entre otras. Esto demuestra que la actividad

antioxidante está asociada con la prevención del estrés oxidativo y éste último con la diabetes.

Chatterjee et al. (2012), evaluaron la actividad antioxidante y antidiabética de la

fracción de acetato de etilo de los extractos metanólicos acuosos de la semilla de Eugenia

jambolana. Los resultados obtenidos muestran que la fracción de acetato de etilo puede ayudar

a contrarrestar la diabetes y el estrés oxidativo, esto se debe a los fitoconstituyentes presentes

en los extractos como el ácido gálico.

15

Existen algunos reportes de la evaluación de la actividad antidiabética para algunas

especies de Justicia. Lizcano et al. (2010), evaluaron la actividad antioxidante de las hojas y el

tallo Justicia pectoralis, reportando los datos que se muestran en la Tabla 4, los resultados

están expresados por g de planta fresca.

Tabla 4. Actividad antioxidante de J. pectoralis.

Parte

estudiada

Fenoles

(mg EAGb/g)

Flavonoides

(mg ECc/g)

TEACa

(μmol Trolox/g)

ORACd

(μmol Trolox/g)

Hoja 5.65 ± 0.01 0.75 ± 0.04 18.80 ± 0.70 89.70 ± 3.70

Tallo 1.18 ± 0.00 0.12 ± 0.00 5.30 ± 0.70 21.90 ± 1.00

aTEAC, Capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox. bEAG, Equivalentes de ácido gálico. cEC, Equivalentes de catequina. dORAC, Capacidad de absorción de radicales oxígeno.

Los resultados están expresados en base fresca.

Sulaiman et al. (2011), evaluaron la actividad antioxidante del tallo de J. gendarussa

con diferentes disolventes, los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Actividad antioxidante de J. gendarussa.

Disolvente

Fenoles totales

(mg EAGa/100

g peso seco)

Flavonoides

totales

(mg EQb/100 g

peso seco)

FRAP

(mg EAGa/100 g

peso seco)

DPPH•

(mg EAGa/100 g

peso seco)

Acetona 70% 40.00 ± 0.10 120.00 ± 0.00 40.00 ± 0.00 70.00 ± 0.10

Etanol 70% 180.00 ± 1.20 210.00 ± 0.30 40.00 ± 0.00 40.00 ± 0.10

Metanol 70% 20.00 ± 0.10 110.00 ± 0.10 30.00 ± 0.00 10.00 ± 0.00

Agua destilada 10.00 ± 0.10 10.00 ± 0.00 10.00 ± 0.00 30.00 ± 0.00

aEAG, Equivalentes de ácido gálico. bEQ, Equivalentes de quercetina.

Los resultados anteriores muestran que la actividad antioxidante es dependiente de la

especie estudiada, la parte de esta planta, el disolvente y método utilizado para la extracción.

Además es importante mencionar que aunado a lo anterior también el estado de madurez de la

planta, condiciones ambientales donde crece la planta y el método de obtención de los

16

extractos también afectan significativamente la actividad antioxidante de los extractos de

plantas.

2.8. Métodos de extracción

Las técnicas de extracción para la obtención de compuestos bioactivos se pueden

clasificar en tradicionales y modernas. Dentro de las técnicas tradicionales se encuentran la

maceración, infusión, decocción y Soxhlet. En las técnicas modernas podemos encontrar a la

extracción asistida por microondas, extracción asistida por ultrasonido, extracción con fluidos

supercríticos, entre otras. La infusión y la decocción son técnicas comúnmente utilizadas, la

primera consiste en adicionar agua a punto de ebullición al material a extraer y se deja enfriar

para posteriormente filtrar, en la segunda se coloca el material a extraer con agua y se calienta

hasta alcanzar el punto de ebullición, se deja enfriar y se filtra (Brusotti et al., 2014).

Particularmente, para el presente estudio es de interés la extracción asistida por

ultrasonido. En este tipo de extracción por lo general, se trabaja en un intervalo de 20 kHz a

100 MHz. Las ondas de ultrasonido pasan a través de un medio creando compresión y

expansión. Este proceso produce un fenómeno llamado cavitación, que significa la

producción, el crecimiento y el colapso de las burbujas que se crean en el medio. El

mecanismo de extracción por ultrasonido implica principalmente dos fenómenos físicos, la

difusión a través de la pared de la célula, el crecimiento y rompimiento de la burbuja. Para que

una extracción por ultrasonido sea eficaz depende de diversos factores, tales como el

contenido de humedad de la muestra, el grado de molienda, el tamaño de las partículas, el

disolvente, la temperatura, el tiempo de exposición de la muestra a las ondas de ultrasonido

(Azmir et al., 2013).

Li et al. (2005) emplearon la extracción por ultrasonido con metanol por 30 min en las

hojas frescas, corteza fresca y corteza seca Eucommia ulmodies, ellos encontraron una

recuperación del 70% de ácido clorogénico, un compuesto fenólico, en comparación con las

técnicas de extracción convencionales.

17

2.9. Extracción en fase sólida (SPE)

Generalmente, las muestras obtenidas a partir de la extracción están constituidas de una

mezcla compleja de sustancias químicas, por lo que se torna importante un tratamiento

posterior previo al estudio de los componentes químicos, incluyendo el aislamiento y

caracterización. Para lograr esto, existen diversos pretratamientos que se pueden aplicar a una

muestra, los más comunes son: la extracción líquido-líquido y la extracción en fase sólida

(SPE). La SPE tiene las ventajas de realizarse en tiempos cortos, poder utilizar muestras

pequeñas (50 a 100 µL), y por lo tanto un consumo de disolventes reducido, entre otras. Los

cartuchos de SPE pueden estar constituidos por sorbentes en fase normal, en fase revesa, entre

otros (He et al., 2007).

Para llevar a cabo la extracción en fase sólida, se deben realizar los pasos siguientes

1. Acondicionamiento del cartucho

2. Aplicación de la muestra

3. Elución de solutos retenidos (interferencias)

4. Elución del analito de interés

5. Limpieza del cartucho

Los analitos de interés se retendrán por el sorbente y posteriormente serán eluidos

dependiendo de la afinidad que tengan con el material del sorbente y la fase móvil, Figura 6,

(Harris, 2007).

18

Figura 6. Extracción en fase sólida.

2.10. Elucidación estructural

Una vez obtenido el compuesto puro, (aproximadamente 30 mg de cada analito para la

caracterización) se obtendrán los datos espectroscópicos y espectrométricos, y mediante la

combinación de estos datos se elucidará la fórmula molecular de los flavonoides aislados.

Por la gran importancia que representan en el análisis químico moderno, se describirán

a continuación.

Analito Interferencias

19

2.10.1. Espectroscopía de infrarrojo

En la Tabla 6, se muestran las bandas del espectro de IR de flavonoides examinados,

así como también las asignaciones para los compuestos citados (Heneczkowski et al., 2001).

Tabla 6. Bandas del espectro de IR de algunos flavonoides.

Flavonoide

Flavona Fisetina Miricetina Quercetina

Grupo asignado a la

banda dada (cm-1)

Banda C=O

Vibraciones de

deformación -C-OH

1649 1619 1638 1638

1332 m 1377 1368, 1355, 1348

1313 w 1304 1333, 1326 1317, 1296

1283 w 1285 m, 1252 w 1245, 1211

1260 w 1252 w 1228, 1202

1224 m 1193 m 1186

Vibraciones de

estiramiento –C-OH

1129, 1112 m –

s 1168 s 1164 s, 1142 m

s – fuerte; m- mediano; w-débil; vw – muy débil.

, número de onda.

2.10.2. Espectrometría de masa (MS)

La espectrometría de masa es una técnica poderosa para el análisis de compuestos

fenólicos por su sensibilidad alta y por la posibilidad de combinarse con diferentes técnicas

cromatográficas. De manera independiente, esta técnica permite determinaciones cuantitativas

y cualitativas.

El detector en espectrometría de masa es crítico para la identificación de compuestos

fenólicos debido a la complejidad y diversidad estructural de estos compuestos y sus bajas

concentraciones en plantas. La sensibilidad y selectividad de la detección puede ser

incrementada usando espectrometría de masa en cascada (MS/MS), produciendo mayor

fragmentación de los precursores e iones hijos, por consiguiente proveen de información

estructural adicional para la identificación de flavonoides.

20

Los espectros de iones positivos obtenidos por Disociación Inducida por Colisión (CID,

por sus siglas inglés) se utilizan con gran frecuencia. A partir de estos se puede identificar la

pérdida de moléculas pequeñas o iones [M+H]+, tales como H2O, COCO, C2H2O, CO2CO y

CH3 se observan comúnmente y son útiles para identificar la presencia de grupos funcionales

específicos. De manera adicional, el modo de ionización negativo es bastante sensible para el

análisis de flavonoides, ya que se utiliza una energía de colisión alta para rendir una adecuada

fragmentación, proporcionando información complementaria en el espectro. En el modo de

ionización negativo varios iones (aniones radicales) tales como CH2CHOH, COCO, CO2CO, y

CH3 también son observados después de estudiar el espectro de masa.

En la identificación de glucosilflavonoides, se puede obtener información muy útil del

espectro de masa, tal como la masa molecular, la estructura de la aglicona, información acerca

de la acilación de los grupos hidroxilo de azúcares, metilación de los grupos hidroxilo de la

aglicona, número de azúcares, en algunos casos la posición de los enlaces glicosídicos. Sin

embargo, MS no provee información acerca de la estereoquímica del enlace glicosídico y no

distingue entre unidades de azúcar diasteroméricas.

2.10.3. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN)

2.10.3.1. RMN de 1H

El espectro de RMN-1H de los flavonoides permite reconocer características

estructurales importantes. Un resumen de los δ para los tipos de protones más comúnmente

hallados en los flavonoides se presenta en la Tabla 7.

21

Tabla 7. Desplazamiento químico de protón.

Desplazamiento químico

δ (ppm) Tipos de protones

1.0 – 1.2 Metilo de ramnosa (da)

1.7 Metilos del grupo isopentenilo

3.0 – 4.8 H de azúcares

3.5 Metileno del grupo isopentenilo

3.7 – 4.1 Metoxilos aromáticos

4.1 – 4.6 Protones 2 y 3 de isoflavanonas

4.2 – 6.0 H-1 de azúcares , protón 2 de flavanonoles y flavanonas

(dd)

5.4 H-2 de flavanonoles y flavanonas (dd)

5.9 – 6.0 Metilendioxi

6.0 – 6.8 H-3, 6 y 8 de flavonas

6.8 – 8.0 H aromáticos del anillo B

7.5 – 8.0 H-2 de isoflavonas

12.0 – 14.0 H de hidroxilo 5

da, doble ancho.

dd, doble de doble.

2.10.3.2. RMN de 13C

En el espectro de RMN-13C se pueden reconocer varios tipos de carbonos, en la Tabla 8

se presentan los desplazamientos químicos para varios tipos de carbonos de flavonoides.

22

Tabla 8. Desplazamientos químicos de varios tipos de carbonos de flavonoides.

Desplazamiento químico

δ (ppm)

Tipos de carbonos

18 C-6 de ramnosa

30 C-4 de flavan-3-oles

42 – 46 C-3 de flavanonas

56 – 61 Metoxilos

60 – 80 C-OH de carbohidratos

70 – 75 C-3 de flavanonoles

80 C-2 de flavanonas

85 C-2 de flavanonoles

100 – 115 C-3 de flavonas, C-1 de carbohidratos, C-10 de

flavonas 5-hidroxiladas

115 – 128 Aromáticos con H

145 C-3 de flavonoles, C-5 de flavonas 5-hidroxiladas, C-3

y C-4 de antocianinas

150 – 165 C aromáticos hidroxilados y metoxilados, C-2 de

flavonas, C-4´oxigenado, C-9 de flavonas.

175 – 178 Carbonilo C-4 sin OH en C-5 en flavonas, C-4 de

flavonoles

182 Carbonilo C-4 con OH en C-5 de flavonas

190 – 196 Carbonilo C-4 de flavanonas

197 – 200 Carbonilo C-4 de flavanonoles

Es posible también diferenciar entre un C-glicosilflavonoide y un O-glicosilflavonoide.

En los O-glicósidos, el C-1 presenta un desplazamiento químico alrededor de 100 ppm para

los carbohidratos más comunes, mientras que en los C-glicósidos este carbono se encuentra en

alrededor de 75 ppm. Por otro lado, en los C-glicósidos el carbono de la aglicona enlazado al

carbohidrato está en alrededor de 10 ppm a frecuencias más altas respecto a su valor normal

(sin sustituyente).

23

3. ORIGINALIDAD

El objeto del presente estudio es Justicia spicigera, una planta que tiene propiedades

antidiabéticas comprobadas (Ortiz-Andrade et al., 2012). Sin embargo no existe mucha

información en la literatura científica sobre quiénes son los metabolitos secundarios y el

mecanismo por el cual los extractos de J. spicigera ejercen dicha actividad.

24

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Determinar la actividad antioxidante y antidiabética in vitro de los extractos de Justicia

spicigera, así como relacionar esta actividad con los compuestos fenólicos presentes en los

extractos.

4.2. Objetivos específicos

1. Obtener extractos ricos en compuestos fenólicos a partir de las hojas de J.

spicigera.

2. Determinar la actividad antidiabética y antioxidante in vitro de los extractos.

3. Elucidar la estructura de los compuestos fenólicos mayoritarios presentes en los

extractos.

4. Correlacionar la actividad antioxidante y antidiabética de los extractos.

25

5. METAS

Objetivo 1.

1.1. Obtener una muestra homogénea de las hojas de J. spicigera.

1.2. Obtener un método eficiente de extracción de compuestos fenólicos de las hojas de J.

spicigera.

Objetivo 2.

2.1 Determinar la actividad antidiabética por el método de inhibición de difusión de

glucosa y mediante la inhibición de las enzimas α-amilasa y α-glucosidasa.

2.2 Determinar la actividad antioxidante mediante la reducción del DPPH•.

2.3 Cuantificar los fenoles y flavonoides totales de los extractos.

Objetivo 3.

3.1 Separar mediante métodos cromatográficos los compuestos fenólicos mayoritarios

presentes en el extracto que contenga el mayor contenido de estos compuestos.

3.2 Caracterizar los compuestos fenólicos aislados mediante técnicas espectrométricas y

espectroscópicas.

Objetivo 4.

4.1 Correlacionar la actividad antidiabética con la actividad antioxidante mediante una

correlación de Pearson.

26

6. METODOLOGÍA

Hojas de J.

spicigera

Secado

Molienda y

tamizado

Almacenamiento

-20 °C

Decocción Infusión

Ultrasonido: metanol,

acetona 70%, etanol

70%, agua

Limpieza del

extracto (SPE)

Fenoles totalesFlavonoides

totalesDPPH•

Elucidación

estructural (IR,

MS, RMN)

Actividad

antidiabética

Figura 7. Procedimiento del tratamiento de la muestra.

27

6.1. Equipos, reactivos y disolventes

El trabajo experimental se desarrolló en los laboratorios en Productos Naturales y

Alimentos del Instituto de Agroindustrias de la Universidad Tecnológica de la Mixteca. A

continuación se enlistan los equipos y reactivos utilizados en este proyecto.

Termobalanza, Balanza analítica Sartorius BL210S, molino ciclónico Foss Cyclotec

1093, Sonicador Ultrasonic Cleaner SB-3200 DTN, lector de microplacaS BioTek® ELx808,

parrillas de calentamiento CIMAREC®, vórtex, rotavapor de vacío IKA® RU10, recirculador

de agua ECO10 SEV, micropipeta, tamiz #60, balanza granataria OHAUS®, material de

vidrio.

Metanol 99.5%, etanol 99.5%, acetona 99.5%, ácido gálico monohidratado 98%, 2,2-

difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•) <100%, (+)-catequina hidratada 96%, reactivo de Folin-

Ciocalteau 2 M, hidróxido de sodio en lentejas 99%, carbonato de sodio 99%, nitrito de sodio

97%, cloruro de aluminio 99.4%, BHT 99%.

Los reactivos y disolventes utilizados fueron grado analítico. Los disolventes y el agua,

se destilaron y degasificaron antes de ser utilizados para cada experimento.

6.2. Obtención de la muestra

La muestra de J. spicigera se colectó en el mes de agosto del 2013 en el municipio de

Asunción Cuyotepeji, ubicado en la región de la mixteca, Oaxaca. El arbusto de J. spicigera se

ubicó a 1765 m de altitud, 17º 55’ 45.12’’ N y -97º 40’ 22.44’’ O. Posteriormente se

transportó a los laboratorios de la Universidad Tecnológica de la Mixteca (UTM). La planta se

envió a la Universidad Autónoma de Chapingo (UACh) para su identificación etnobotánica.

28

6.3. Preparación de la muestra

El proceso de secado consistió en colocar las hojas de J. spicigera entre papel

periódico. El papel periódico se cambió periódicamente hasta alcanzar una remoción del 90%

de humedad presente en las hojas. Las hojas deshidratadas de J. spicigera se molieron en un

molino ciclónico. La muestra se tamizó a través de una malla número 60 y el polvo obtenido

se almacenó en frascos de color ámbar a -20 °C.

6.4. Obtención de los extractos

Se utilizaron tres métodos de extracción: Decocción, infusión y por ultrasonido, en este

último método se usaron diferentes disolventes como metanol, etanol 70%, acetona 70% y

agua desionizada. El uso de estos tres métodos tiene como finalidad determinar el efecto del

método de extracción sobre la actividad antidiabética del extracto. A continuación se describe

brevemente cada uno de los métodos de extracción utilizados.

Decocción. Se pesaron 700 mg del polvo de J. spicigera y se adicionaron 5 mL de agua

desionizada. Esta mezcla se calentó en una parrilla eléctrica con agitación magnética. Una vez

alcanzado el punto de ebullición se retiró de la fuente de calor y se dejó enfriar.

Posteriormente se filtró sobre papel Whatman No. 1. El filtrado se almacenó a -20 °C en un

frasco color ámbar hasta su análisis (Cruz-Gallegos et al., 2012).

Infusión. A 700 mg del polvo de J. spicigera se le adicionaron 5 mL de agua

desionizada en ebullición. Se agitó y se dejó en reposo por 15 min. Posteriormente se filtró

con un papel Whatman No. 1. El filtrado se almacenó a -20 °C en un frasco color ámbar hasta

su análisis (Cruz-Gallegos et al., 2012).

Extractos por ultrasonido: metanol, etanol 70%, acetona 70%, agua. Se pesaron 100

mg del polvo de J. spicigera, se colocó en un tubo eppendorf y se adicionó 1 mL de

disolvente. Posteriormente se colocó en un baño de ultrasonido a 35 °C por 15 min. Después,

el extracto se centrifugó, decantó, y se colocó en un matraz bola, este procedimiento se realizó

29

por duplicado. El disolvente se removió en un rotavapor a 40 °C a vacío. Los extractos

obtenidos se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.

6.5. Limpieza de los extractos por extracción en fase sólida (SPE)

La etapa de limpieza de los extractos tuvo como objetivo eliminar las clorofilas, debido

a que estas absorben aproximadamente a 510 nm y por consiguiente interferían en la

determinación de flavonoides y DPPH•.

Se utilizaron cartuchos de extracción en fase sólida Supelco ENVI-18 en fase reversa.

El cartucho se acondiciono con 5 mL de H2O. Posteriormente se adicionó el extracto, en el

caso de los extractos de metanol, acetona 70% y etanol 70% se llevó a sequedad en un

rotavapor a 40 ºC y se redisolvió con 5 mL de H2O. Posteriormente se le adicionó 5 mL de

MeOH/H2O (50/50). Por último se le adicionó 5 mL de MeOH. Se obtuvieron dos eluatos por

cada extracto, el eluato acuoso y el de MeO/H2O. Todos los eluatos se almacenaron a -20 ºC

hasta su análisis.

6.6. Cuantificación de fenoles totales en los extractos

Preparación de soluciones.

EtOH acuoso al 90% (v/v). Se mezcló 90 mL de EtOH con 10 mL de agua.

Na2CO3 al 0.5% (p/v). Se pesaron 50 mg de Na2CO3, se disolvieron en agua y llevaron

hasta el afore a 10 mL.

Reactivo de Folin-Ciocalteu 0.1 M. Se midieron 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu

2 M, se disolvieron en agua en ausencia de luz y se llevaron hasta el afore a 10 mL.

Ácido gálico a 100 ppm. Se pesó 1 mg de ácido gálico y se disolvió en EtOH al 90%

hasta un volumen de 10 mL. Los estándares de ácido gálico 5, 10, 15, 20 y 25 ppm se

prepararon a partir de la disolución de ácido gálico de 100 ppm.

30

Cuantificación por el método Folin-Ciocalteau (Julián-Loaeza et al., 2011). 40 µL de

extracto o del estándar se mezclaron con 40 µL del Reactivo de Folin-Ciocalteau 0.1 M en una

microplaca. La mezcla se dejó en reposo por 3 min a temperatura ambiente y se agitó por 15 s

a baja velocidad. Pasado este tiempo, a la mezcla anterior se le adicionaron 40 µL de Na2CO3

al 0.5%. La mezcla se dejó reposar por 30 min a 40 oC y se agitó por 1 min a velocidad media.

La absorbancia de la muestra y de los estándares se determinó a 750 nm. Al blanco de la

muestra o del estándar se le adicionaron agua en lugar del reactivo de Folin-Ciocalteu. Se

utilizó el estándar de 25 ppm como blanco de los estándares. Para la curva de calibración se

utilizó ácido gálico como estándar. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

6.7. Cuantificación de flavonoides totales en los extractos

Preparación de soluciones.

NaNO2 al 1.5% (p/v). 375 mg de NaNO2 se disolvieron en agua y la mezcla se llevó a

un volumen de 25 mL.

AlCl3 al 3% (p/v). 300 mg de AlCl3•6H2O se disolvieron en agua y se llevó a un

volumen de 10 mL.

NaOH 1 M. 400 mg de NaOH, se disolvieron en agua y se llevó a un volumen de 10

mL.

(+)-Catequina 1000 ppm. 10 mg de (+)-catequina, se disolvieron en MeOH y se llevó a

un volumen de 10 mL en ausencia de luz. A partir de esta solución se prepararon estándares de

catequina de 10, 20, 30, 40 y 50 ppm.

Quercetina 1000 ppm. 10 mg de quercetina, se disolvieron en MeOH y se llevó a un

volumen de 10 mL en ausencia de luz. A partir de esta solución se prepararon estándares de

quercetina de 20, 40, 60, 80 y 100 ppm.

Cuantificación, Julián-Loaeza et al., (2011). En un vial ámbar se mezcló 1 mL del

extracto o del estándar contenido con 1 mL de NaNO2 al 1.5%. La mezcla se agitó por 5 min

31

en un vórtex a temperatura ambiente. 50 µL de esta mezcla se colocó en una microplaca.

Posteriormente, a esta mezcla se le agregaron 50 µL de AlCl3 al 3% y se agitó por 1 min.

Pasado este tiempo, se le adicionaron 50 µL de NaOH 1 M. Esta mezcla se agitó por 1 min.

Pasado este tiempo se determinó la absorbancia a 405, 490 y 515 nm. El blanco de la muestra

o del estándar contenía agua en lugar de AlCl3. Como blanco de los estándares se utilizó el

estándar de 50 ppm. Para la curva de calibración se utilizaron (+)-catequina y quercetina.

Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

6.8. Evaluación de la actividad antirradical de los extractos

Preparación de soluciones

Solución patrón de DPPH• al 0.1% (p/v). Se pesaron 10 mg de DPPH•, se disolvieron

en MeOH hasta un volumen de 10 mL en ausencia de luz. De esta disolución se preparó una

solución de DPPH• al 0.004%, que se resguardó de la luz y se dejó en refrigeración entre

mediciones.

Soluciones de estándares de ácido gálico 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 ppm. Primero se

preparó una solución patrón de 100 ppm de ácido gálico (1 mg de ácido gálico llevado a un

volumen final de 10 mL con EtOH al 90%). A partir de esta disolución se prepararon los

estándares antes mencionados.

Soluciones de extractos. Estas soluciones se prepararon a concentraciones que

permitieron reducir al DPPH• entre el 20 y el 90%.

Cuantificación (Julián-Loaeza et al., 2011). 70 µL del extracto o del estándar se

mezclaron con 70 µL de DPPH• al 0.004% en una microplaca, y se dejó en reposo por 30 min

a temperatura ambiente en ausencia de luz y con agitación. Posteriormente, se determinó la

absorbancia a 515 nm. La mezcla de 70 µL del DPPH• al 0.004% y 70 µL de MeOH se usó

como control. El blanco del estándar se obtuvo con el estándar menos concentrado. La

actividad antirradical se expresó como el % de inhibición [((Acontrol – Aextracto)/Acontrol) *

100]. El valor IC50, que corresponde a la cantidad de muestra requerida para reducir el 50%

del radical DPPH• se reportó en gramos de muestra/kg de DPPH•.

32

% Inhibición = [ADPPH• − AEXT

ADPPH•] x 100

Cinética de eficiencia antirradical. La cinética se realizó con el extracto a la

concentración que exprese el valor de IC50. Se realizó una lectura de absorbancia en intervalos

de 30 s durante 120 min. Los valores de absorbancia ajustados se graficaron contra el tiempo

para determinar el tiempo en el cual inicie el estado estable, ese punto se denomina TEC50. Con

los valores de IC50 y TEC50 se calculó el valor de la eficiencia antirradicalar (AE) expresada

como kg de DPPH•/kg muestra seca•min.

AE =1

IC50 x TEC50

6.9. Hidrólisis de los extractos

Se sometió a una hidrólisis ácida el extracto que presentó la mayor actividad

antidiabética, para emular las condiciones del estómago y así determinar posibles cambios en

la actividad antidiabética debido a los cambios sufridos por los compuestos bioactivos durante

su paso a través del mismo. La hidrólisis consistió en hacer reaccionar 1 g del polvo de J.

spicigera con 20 mL de HCl 2 M por 30 min. Después, la mezcla de reacción se llevó a

sequedad a 50 oC utilizando un rotavapor a presión reducida (Harborne, 1998).

Al extracto hidrolizado se le determinó la actividad antidiabética y la actividad

antirradicalar, de acuerdo a los procedimientos descritos en las secciones 6.8, 6.10 y 6.11.

6.10. Evaluación de la inhibición de la difusión de glucosa

Para evaluar la difusión de glucosa se empleó el método de Gallagher et al. (2003). Se

usó un tubo de diálisis de 6 cm x 15 mm (Spectra/Por, MWCO: 2000), en el cual se colocaron

15 mL del extracto correspondiente, 2 mL de una solución de NaCl 0.15 M y de una solución

de D-glucosa 0.22 mM, el tubo se selló. Una vez sellado, el tubo de diálisis se colocó dentro

de un tubo de centrifuga de 50 mL el cual contenía 45 mL de una solución de NaCl 0.15 M. Se

realizó una medición de la concentración de glucosa cada hora, durante 24 horas, tanto en la

33

solución externa como interna. Como blanco se utilizó una solución del extracto con NaCl

0.15 M en ausencia de D-glucosa. Estas mediciones se realizaron con un biosensor.

6.11. Evaluación de la inhibición de la actividad enzimática

6.11.1. Inhibición de los extractos en presencia de α-amilasa

Solución de almidón (0.5% p/v). A 0.25 g de almidón de papa se le adicionaron 50 mL

de agua desionizada, posteriormente se agitó y ebulló por 15 min.

Solución de la enzima. La solución de la enzima se preparó mezclando 1 mg de α-

amilasa de páncreas porcino en 100 mL de buffer de fosfato de potasio 20 mM (pH 6.9) que

previamente contenía NaCl 6.7 mM.

Reactivo colorimétrico. Se preparó con la mezcla de 20 mL de ácido 3,5-

dinitrosalicílico 96 mM, 8 mL de KNaC4H4O6•4H2O 5.31 M en NaOH 2 M, y 12 mL de agua

desionizada.

Generación de la reacción. 1 mL del extracto y 1 mL de la solución de α-amilasa se

mezcló y se incubó a 25 °C por 30 min. A 1 mL de la mezcla se le adicionó 1 mL de la

solución de almidón y se incubó a 25 °C por 3 min. Posteriormente, se adicionó 1 mL del

reactivo colorimétrico y se colocó en un baño de agua a 85 °C. Después de 15 min, la mezcla

se retiró del baño y se enfrió, después se realizó una dilución con 9 mL de agua destilada y se

determinó la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro. Se usó acarbosa como control

positivo. El porcentaje de inhibición de α-amilasa se calculó con la fórmula siguiente

(Nickavar & Yousefian, 2011).

Iα−amilasa =∆Acontrol − ∆Amuestra

∆Acontrol

Donde: ∆Acontrol = Aprueba − Ablanco

∆Amuestra = Aprueba − Ablanco

34

6.11.2. Inhibición de la α-glucosidasa en presencia de los extractos.

Solución de α-glucosidasa. Se utilizaron 0.2 U de α-glucosidasa por 1 mL de buffer de

fosfato (0.2 U/mL).

Solución de buffer de fosfato de potasio (pH 6.8). Se pesaron 1.36 g de K2HPO4 y 2.72

g de KH2PO4, se disolveron con agua destilada hasta aforar a 20 mL.

Solución de p-nitrofenil glucopiranósido 2.5 mM (sustrato). Se pesaron 7.53 mg del

sustrato en 10 mL del buffer de fosfato.

Solución de Na2CO3 0.2 M. Se pesaron 0.21 g de Na2CO3 en 10 mL de agua destilada.

Generación de la reacción. 8 µL del extracto en DMSO, se mezclaron con 112 µL del

buffer de fosfato y 20 µL de la solución de la enzima y se incubó a 37 oC por 15 min.

Posteriormente se le adicionaron 20 µL de la solución del sustrato y se dejó reaccionar a 37 oC

por 15 min. La reacción se terminó por la adición de 80 µL de Na2CO3. La actividad

enzimática se cuantificó por la liberación del p-nitrofenilo a 405 nm. Los datos de inhibición

enzimática se expresaron como EC50. Como control positivo se usó acarbosa. Las velocidades

inhibitorias (%) se calcularon de acuerdo a la fórmula siguiente (Li et al., 2011):

Velocidad de inhibición ((%))= (1-(Aensayo-Ablanco)

Control Aensayo-Control Ablanco) x 100 %

6.12. Aislamiento de los compuestos fenólicos

Previo a la separación por HPLC se llevó a cabo una etapa de limpieza del extracto,

mediante una extracción en fase sólida (SPE, por sus siglas en inglés) utilizando un cartucho

Supelco ENVI-18. El cartucho se acondicionó con 5 mL de H2O, posteriormente se adicionó

el extracto con mayor contenido de compuestos fenólicos al cartucho y se eluyó con 5 mL de

H2O. Posteriormente se le adicionaron 5 mL de MeOH/H2O al 50%. Por último se le

35

adicionaron al cartucho 5 mL de metanol. Los tres eluatos se almacenaron a -20 ºC hasta su

análisis. Para determinar que extracto se utilizó en la separación química, se le cuantificaron

los fenoles totales de acuerdo al procedimiento descrito en la sección 6.6. El extracto que

contenía la mayor cantidad de compuestos fenólicos se evaporó a sequedad para obtener el

extracto seco.

Una vez obtenido el extracto seco, se disolvió en acetonitrilo (Merck, grado HPLC) en

una concentración de 20 mg/mL (p/v) y se inyectó en un bucle de 500 µL de un equipo de

HPLC LC1150 de GBC.

La separación se llevó a cabo en una columna semipreparativa de fase reversa C18 (10

mm i.d. x 200 mm, 4 µm) (GENESIS, Número de catálogo 8P25960) con una fase

estacionaria de gel de sílice modificada con grupos octadecilos, a una temperatura de columna

de 25 oC. La fase móvil estuvo compuesta de acetonitrilo-agua-ácido acético (Merck, grado

HPLC), (50:50:1, v/v). Esta fase fue eluída isocráticamente a una velocidad de flujo de 0.2

mL/min, el eluato se monitoreó con un detector UV/Vis modelo LC1205 de GBC a 260 nm ya

que a esta longitud de onda absorben los compuestos fenólicos. Las distintas fracciones se

colectaron en viales de acuerdo al perfil detectado en el cromatograma.

6.13. Caracterización de los compuestos fenólicos presentes en los

extractos

La caracterización de los compuestos fenólicos puros aislados se realizó mediante el

análisis e interpretación de sus constantes físicas (punto de fusión, rotación óptica, solubilidad,

Rf, etc.) y datos espectroscópicos de UV, IR, RMN y espectrométricos (EM de baja y alta

resolución). El análisis e integración de la información proporcionada por los datos anteriores

condujeron a una hipótesis estructural; si se trata de un compuesto ya descrito, su estructura se

corroborará comparando los parámetros obtenidos con los parámetros reportados en la

literatura química. En caso de ser nuevos compuestos químicos no descritos en la literatura, se

realizará un estudio detallado por técnicas de Resonancia Magnética nuclear (RMN) en dos

dimensiones, tales como el HETCOR (correlación heteronuclear 1H-13C), NOESY

(Espectroscopía del Efecto Nuclear Overhauser en dos dimensiones) para determinar

36

interacciones a través del espacio entre 1H. Es importante señalar que todos los datos

espectroscópicos y espectrométricos se obtuvieron en el laboratorio de la Universidad del

Papaloapan a cargo del Dr. Lemuel Pérez Picasso.

6.14. Análisis estadístico

Para el análisis estadístico se realizó un ANOVA. Los valores promedio obtenidos de las

diferentes pruebas se analizaron mediante un comparativo de medias con un p<0.05, utilizando

la prueba de Duncan (Walpole et al., 1999). El objetivo de este análisis fue determinar si

existe diferencia significativa entre los valores obtenidos. También, se llevaron a cabo

correlaciones de Pearson para el contenido de fenoles totales, flavonoides totales, la actividad

antidiabética expresada como % de inhibición de difusión de glucosa e inhibición de la

actividad enzimática de la -glucosidasa y -amilasa, así como la actividad antirradical. Estas

correlaciones permitieron determinar si existe interdependencia entre las actividades

estudiadas.

37

7. RESULTADOS Y DISCUSIONES

7.1. Obtención de la muestra

La muestra ubicada a 1765 m de altitud, 17º 55’ 45.12’’ N y -97º 40’ 22.44’’ O se

colectó en el mes de agosto del 2013 en el municipio de Asunción Cuyotepeji, Oaxaca,

México. Se revisó que la muestra estuviera en buen estado, es decir, que no presentara ninguna

enfermedad o plaga. El proceso de secado se realizó con papel periódico, colocando una capa

de hojas frescas y una de papel periódico, y así sucesivamente, las muestras se almacenaron a

temperatura ambiente. Posteriormente las muestras se prensaron y se realizaron cambios de las

hojas de papel periódico diariamente por los primeros 4 días y posteriormente se cambiaron

cada 3 días hasta alcanzar una remoción del 87% de humedad, en un lapso de tiempo de 2

semanas y media.

Figura 8. Secado de hojas de J. spicigera.

38

La determinación de humedad se realizó en una termobalanza, tomándose muestras

tanto de hoja fresca como de hoja seca, las cuales se trocearon finamente. En la Tabla 9, se

muestran los resultados obtenidos para la determinación de humedad.

Tabla 9. Determinación de humedad en hojas de J. spicigera.

Como se puede observar en la Tabla 9, el contenido de humedad de la hoja fresca es de

63.87% y el porcentaje de humedad de la hoja después del proceso de secado fue de 8.30%.

Con base en estos resultados, se determinó que la remoción de humedad después del proceso

de secado fue del 87%. Una vez que se tuvo la muestra seca de procedió a la molienda y

tamizado del polvo.

La masa de la muestra fresca colectada fue de 6330.47 g, después del proceso de

secado se obtuvo una masa de 2287.20 g. La muestra seca se troceó manualmente para reducir

el tamaño de las hojas y con ello facilitar el proceso de molienda en el molino ciclónico, la

masa obtenida después del proceso de molienda fue de 2219.7 g con una rendimiento del

97.05%.

7.2. Obtención de extractos

Se obtuvieron dos tipos de extractos, los extractos crudos, obtenidos a partir de la

extracción de acuerdo al diagrama descrito en la Figura 9, y los extractos que se sometieron a

una etapa de limpieza con cartuchos de SPE, denominados extractos limpios. A los extractos

crudos se les cuantificaron fenoles totales y a los extractos limpios se les determinó fenoles

totales, flavonoides totales y actividad antioxidante. De los extractos limpios se obtuvieron dos

Réplica Masa inicial (g) Humedad hoja

fresca (%)

Humedad hoja

seca

(%)

1 0.99 62.73 7.34

2 1.00 65.14 8.46

3 1.00 63.74 9.09

Promedio 1.00 ± 0.00 63.87 ± 1.21 8.30 ± 0.89

39

eluatos uno contenido en agua y otro contenido en MeOH/H2O, en total se obtuvieron 14

eluatos, dos por cada extracto los cuales se almacenaron a -20 ºC. El eluato contenido en

MeOH se desechó debido a que en este se encuentran contenidas las clorofilas. En la Figura 9,

se muestra un esquema general de los extractos obtenidos.

Eluato

H2O

Limpieza por

SPE

Decocción

Polvo Hoja seca

Infusión

Polvo Hoja seca

H2O

MeOH

Etanol 70%

Acetona 70%

Decocción

Hoja Fresca

Ultrasonido

Polvo Hoja seca

Eluato

MeOH/H2O

Figura 9. Diagrama para la obtención de extractos limpio.

7.3. Cuantificación de fenoles totales

Se cuantificó el contenido de fenoles totales en siete diferentes extractos crudos de J.

spicigera. Como se puede observar en la Figura 10, el extracto obtenido por decocción de la

hoja fresca posee un contenido alto de fenoles totales con 767.04 ± 0.01 mg EAG/100 g en

comparación con los otros seis extractos. Así mismo, el extracto obtenido por ultrasonido con

etanol al 70% presenta un mayor contenido de fenoles totales con 618.62 ± 0.01 mg EAG/100

g en comparación con los diferentes extractos que se estudiaron a partir del polvo de J.

spicigera. Comparando entre los extractos obtenidos por decocción de la hoja fresca y del

40

polvo de las hojas se puede decir que las hojas frescas presentan un contenido alto de fenoles

totales en comparación con los deshidratados, esto se puede deber a la influencia del proceso

de secado en el cual se presentó una degradación de estos compuestos. Realizando una

comparación entre la infusión y la decocción del polvo de la hoja de acuerdo a la Figura 10, se

puede apreciar que la decocción presenta un mayor contenido de fenoles totales que en la

infusión.

Por otra parte, de los extractos obtenidos por ultrasonido el extracto etanólico al 70%,

presenta mayor contenido de fenoles totales, seguido por el extracto de acetona al 70%, el

metanólico y por último el acuoso. También dependiendo del disolvente empleado para la

extracción, el contenido de fenoles totales puede variar, esto se puede ver en los valores

reportados en la Figura 10.

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto obtenido por

decocción a partir de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca.

H2O-US, Extracto acuoso obtenido por ultrasonido. MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por

ultrasonido. EtOH-US, Extracto de etanol obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de

acetona obtenido por ultrasonido al 70%. Los datos expresados son el promedio de tres mediciones ±

desviación estándar. Todas las muestras son significativamente diferentes (p<0.05). Se usó la prueba

de Duncan y un ANOVA para el análisis estadístico.

Figura 10. Contenido de fenoles totales en extractos crudos de J. spicigera.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US

767.04 ± 0.01

509.91 ± 0.01

422.74 ± 0.01

220.72 ± 0.01

492.41 ± 0.01

618.62 ± 0.01

610.81 ± 0.01

mg E

AG

/100g

Extracto

41

Sepúlveda-Jiménez et al. (2009), cuantificaron fenoles totales a los extractos obtenidos

por maceración en agua y metanol de las flores, hojas y tallo de J. spicigera. Como se puede

observar en la Figura 11, el contenido de fenoles totales en el extracto metanólico es mayor en

comparación con el extracto acuoso en ambos casos. Esta diferencia en el contenido de fenoles

totales se puede atribuir a diferentes factores tales como: el mes de colección, la edad y el

entorno en el cual se encuentra la planta, el método de secado y al método de extracción.

Figura 11. Contenido de fenoles totales en hojas de J. spicgera.

Sulaiman et al. (2011), cuantificaron fenoles totales de la maceración del tallo de J.

gendarussa con diferentes disolventes. Comparando los resultados de Sulaiman et al., y los

valores para las hojas de J. spicigera, Figura 12, se puede ver que la hojas de J. spicigera

poseen un contenido alto de fenoles totales en comparación con el tallo de J. gendarussa. Así

mismo en ambos casos el extracto de etanol al 70%, es el mejor disolvente para extraer

compuestos fenólicos. Un factor que influye en el contenido de fenoles totales es la parte de la

planta de cual se va a realizar el análisis, esto se ve reflejado en la Figura 12, en el cual las

hojas llegan a tener un alto contenido de compuestos fenólicos en comparación con el tallo.

Otro factor importante y que de ello depende el contenido de fenoles es el tipo de extracción,

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

H2O MeOH

3850 ± 0.02 3910 ± 0.02

220.72 ±0.011

492.41 ± 0.003

mg

EA

G/1

00

g

Extracto

Sepúlveda-Jiménez et al.,

(2009).

Objeto de estudio de este

proyecto.

42

para extraer los compuestos fenólicos del tallo de J. gendarussa se usó maceración y para J.

spicigera se usó ultrasonido, claramente se pude ver la ventaja de usar la extracción del

ultrasonido reflejándose en el contenido de fenoles totales.

H2O, Extracto acuoso. MeOH, Extracto de metanol. EtOH 70%, Extracto de etanol al 70%. ACT 70%,

Extracto de acetona al 70%.

Figura 12. Contenido de fenoles totales de las hojas de J. spicigera y del tallo J. gendarussa.

Kirca & Arslan (2008), cuantificaron fenoles totales a los extractos metanólicos

obtenidos de una extracción sólido-líquido de las hojas de diferentes plantas, como se puede

observar en la Figura 13, los extractos de J. spicigera poseen un alto contenido en

comparación con las diferentes plantas mostradas en la misma figura. Se puede observar que a

pesar de ser el mismo disolvente, el tipo de extracción y la planta influyen en el contenido de

fenoles totales a obtener.

0

100

200

300

400

500

600

700

H2O MeOH EtOH 70% ACT 70%

220.72 ± 0.01

492.41 ± 0.01

618.62 ± 0.01 610.81 ± 0.01

10.00 ± 0.1 20.00 ± 0.1

180 .00± 1.2

40.00 ± 0.1

mg

EA

G/1

00

g

Extracto

J. spicigera

J. gendarussa

43

Figura 13. Contenido de fenoles totales en hojas de diferentes plantas.

También, se cuantificaron los fenoles totales en los extractos limpios provenientes de

la SPE, se obtuvieron dos fracciones, una fracción acuosa y otra de MeOH/H2O. En la Figura

14, se muestra la suma de las dos fracciones. El extracto de la decocción de la hoja fresca

posee el mayor contenido de fenoles totales 687.2 ± 0.01 mg EAG/100 g.

De las muestras obtenidas por ultrasonido el extracto de etanol al 70% posee un mayor

contenido de fenoles totales 486.05 ± 0.01 mg EAG/100 g, seguido por el extracto de acetona

al 70%, el extracto de metanol y por último el extracto acuoso.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

J. spicigera Vitex agnus-

castus

Laurus

nobilis

Sideritis

trojana

Cnicus

benedictus

492.41 ± 0.01

386.00 ± 0.06

340.50 ± 1.27

277.50 ± 0.42

164.00 ± 0.21

mg

EA

G/1

00

g

Extracto MeOH

44

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto obtenido por

decocción a partir de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca.

H2O-US, Extracto acuoso obtenido por ultrasonido. MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por

ultrasonido. EtOH-US, Extracto de etanol obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de

acetona obtenido por ultrasonido al 70%. Los datos expresados son el promedio de tres mediciones ±

desviación estándar. Todas las muestras son significativamente diferentes (p<0.05). Se usó la prueba

de Duncan y un ANOVA para el análisis estadístico.

Figura 14. Contenido de fenoles totales de extractos limpios de J. spicigera.

Sadiki & Martin (2012), realizaron un estudio de los compuestos fenólicos de la miel

de maple utilizando SPE, los autores varían las concentraciones de metanol en el eluyente y

determinan que la concentración de metanol influye en la recuperación de los compuestos

fenólicos presentes en una muestra. Comparando los resultados de fenoles totales de los

extractos crudos y de los extractos limpios de las hojas de J. spicigera, Figura 15, se puede

observar una disminución en dicho contenido en los extractos limpios. Esta disminución se

puede deber a la polaridad de los compuestos presentes en las muestras, así como también a la

polaridad del eluyente, lo cual provoca que exista una disminución en de los compuestos

fenólicos, los cuales se quedan retenidos en el cartucho de SPE y con ello existe una baja

recuperación de los compuestos fenólicos.

0

100

200

300

400

500

600

700

DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US

687.2 ± 0.01

192.3 ± 0.02

232.06 ± 0.02

178.05 ± 0.01

236.05 ± 0.02

486.05 ± 0.01

372.45 ± 0.02

mg

EA

G/1

00

g

Extracto

45

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto obtenido por decocción a

partir de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca. H2O-US, Extracto

acuoso obtenido por ultrasonido. MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido. EtOH-US,

Extracto de etanol obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de acetona obtenido por ultrasonido al

70%. Los datos expresados son el promedio de tres mediciones ± desviación estándar. Todas las muestras son

significativamente diferentes (p<0.05). Se usó la prueba de Duncan y un ANOVA para el análisis estadístico.

Figura 15. Comparativo de fenoles totales de extractos crudos y extractos limpios de J.

spicigera.

Sulaiman et al. (2011), cuantificaron fenoles totales de la maceración del tallo de J.

gendarussa con diferentes disolventes. Comparando los resultados de Sulaiman et al., y los

valores para las hojas de J. spicigera, Figura 16, se puede ver que la hojas de J. spicigera

poseen un alto contenido de fenoles totales en comparación con el tallo de J. gendarussa. Así

mismo en ambos casos el extracto de etanol al 70%, es el mejor disolvente para extraer

compuestos fenólicos. Tanto los resultados obtenidos de los extractos limpios y los extractos

crudos de las hojas de J. spicigera muestran un contenido alto de compuestos fenólicos en

comparación con los valores reportados para J. gendarussa.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

mg

EA

G/1

00

g

Extracto

Extracto crudo

Extracto limpio

46

H2O, Extracto acuoso. MeOH, Extracto de metanol. EtOH 70%, Extracto de etanol al 70%. ACT 70%,

Extracto de acetona al 70%.

Figura 16. Contenido de fenoles totales en extractos limpios de J. spicigera.

7.4. Cuantificación de flavonoides totales

Se cuantificaron flavonoides totales a las hojas de J. spicigera a tres longitudes de onda

(405, 490 y 515 nm). Como se puede observar en la Figura 17, para un mismo extracto

dependiendo de la longitud de onda el contenido de flavonoides totales puede aumentar o

disminuir. Para una longitud de onda de 405 nm el extracto de la decocción de la hoja fresca

posee el mayor contenido de flavonoides con 669.85 ± 0.01 mg EQ/100 g, seguido por el

extracto de la infusión de la hoja seca con 526.95 ± 0.01 mg EQ/100 g, de los extractos

obtenidos por ultrasonido el que mostro un mayor contenido en flavonoides es el extracto de

etanol al 70% con 459.75 ± 0.01 mg EQ/100 g.

A una longitud de onda de 490 nm el extracto acuoso de la decocción de la hoja fresca

posee el mayor contenido de flavonoides totales con 668.65 ± 0.01 mg EQ/100 g, seguido por

el extracto de etanol al 70% con un 492.15 ± 0.01 mg EQ/100 g. Para 515 nm el extracto de la

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

H2O MeOH EtOH 70% ACT 70%

187.18 ± 0.01

236.05 ± 0.02

486.05 ± 0.01

372.45 ± 0.02

10.00 ± 0.1 20.00 ± 0.1

180.00 ± 1.2

40.00 ± 0.1

mg

EA

G/1

00

g

Extracto

J. spicigera

J. gendarussa

47

decocción de la hoja fresca posee el mayor contenido de flavonoides totales con 428.90 ±

0.0031 mg EQ/100 g, seguido por el extracto etanólico con 391.25 ± 0.01 mg EQ/100 g.

Se realizó una correlación de Pearson del contenido de fenoles totales con el contenido de

flavonoides totales para el conjunto de valores de cada longitud de onda y se encontró que

existe una correlación de 0.95 y 0.96 de fenoles con flavonoides totales a 490 nm, Tabla 10.

λ

(nm) DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O MeOH EtOH 70% ACT 70%

• 405 669.85 ± 0.01 274.59 ± 0.01 526.95 ± 0.01 310.76 ± 0.01 326.40 ± 0.01 459.75 ± 0.01 368.80 ± 0.01

• 490 668.65 ± 0.01 275.27 ± 0.01 424.63 ± 0.01 275.10 ± 0.01 316.35 ± 0.01 492.15 ± 0.01 438.00 ± 0.01

•515 428.90 ± 0.01 154.12 ± 0.01 287.75 ± 0.01 192.27 ± 0.01 309.65 ± 0.01 391.25 ± 0.01 362.25 ± 0.01

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto obtenido por decocción a

partir de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca. H2O-US, Extracto

acuoso obtenido por ultrasonido. MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido. EtOH-US, Extracto

de etanol obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de acetona obtenido por ultrasonido al 70%. Los

datos expresados son el promedio de tres mediciones ± desviación estándar. De la fracción MeOH/H2O a 490 nm

entre los extractos H2O-US y MeOH-US no existe diferencia significativa (p<0.05). Se usó la prueba de Duncan

y un ANOVA para el análisis estadístico.

Figura 17. Flavonoides totales de la suma de fracciones en equivalentes de quercetina de las

hojas de J. spicigera.

0

100

200

300

400

500

600

700

DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US

mg

EQ

/10

0m

g

Extracto

48

Tabla 10. Correlación de Pearson entre fenoles y flavonoides.

Absorbancia

@ λ

Correlación

Fenoles/Flavonoides

nm (mg EAGa*100 g-1)/

(mg EQb*100 g-1)

(mg EAGa*100 g-1)/

(mg ECc*100 g-1)

405 0.77 0.61

490 0.95 0.96

515 0.84 0.84

aEAG, Equivalentes de ácido gálico. bEQ, Equivalentes de quercetina.

cEC, Equivalentes de catequina.

Sepúlveda-Jiménez et al. (2009), cuantificaron flavonoides totales a los extractos

macerados en agua y metanol de las flores, hojas y tallo de J. spicigera. Como se puede

observar en la Figura 18, el contenido de flavonoides totales en el extracto metanólico es

mayor en comparación con el extracto acuoso en ambos casos. Como en el caso para fenoles

totales la diferencia en dicho contenido se puede atribuir como ya se mencionó antes a el mes

de colecta, la edad y el entorno en el cual se encuentra la planta, la etapa de limpieza, el

método de secado y al método de extracción.

Figura 18. Contenido de flavonoides totales en hojas de J. spicigera.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

H2O MeOH

620.00 ± 0.13

980.00 ± 0.13

106.94 ± 0.003131.46 ± 0.003

mg

EC

/100g

Extracto

Sepúlveda-Jiménez et al., 2009.

Objeto de estudio para este

proyecto.

49

Sulaiman et al. (2011), cuantificaron flavonoides totales de la maceración del tallo de

J. gendarussa con diferentes disolventes en equivalentes de quercetina a 415 nm. Comparando

el contenido de flavonoides totales de J. gendarussa con J. spicigera se puede ver en la Figura

19, que todos los extractos J. spicigera poseen un mayor contenido de flavonoides totales. Así

como también en ambos casos se sigue la misma tendencia, el extracto de etanol al 70% posee

mayor contenido de flavonoides, seguido por el extracto de acetona al 70%, el extracto de

metanol y por último es extracto acuoso. Esta diferencia en el contenido de flavonoides se

debe al tipo de extracción, así como también de la parte de la planta estudiada y el disolvente

empleado.

Figura 19. Contenido de flavonoides totales en equivalentes de quercetina.

Cabe resaltar, como ya se mencionó anteriormente, que el tipo de extracción es

determinante debido a que dependiendo de la extracción el contenido de flavonoides puede

variar, como se pude observar en la Figura 20, la extracción asistida por ultrasonido es más

eficaz que la maceración, los valores reportados para J. spicigera son superiores a los

reportados para J. gendarussa.

Para una longitud de onda de 490 nm el extracto acuoso de la decocción de la hoja fresca

posee el mayor contenido de flavonoides totales con 251.15 ± 0.01 mg EC/100 g, seguido por

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

H2O MeOH EtOH 70% ACT 70%

310.76 ± 0.01 326.4 ± 0.01

459.75 ± 0.01

368.85 ± 0.01

10 ± 0.0

110 ± 0.1

210 ± 0.3

120 ± 0.0

mg E

Q/1

00g

Extracto

J. spicigera

J. gendarussa

50

el extracto de etanol al 70% con un 180.31 ± 0.01 mg EC/100 g. A 515 nm el extracto de la

decocción de la hoja fresca posee el mayor contenido de flavonoides totales con 129.40 ± 0.01

mg EC/100 g, seguido por el extracto etanólico con 118.00 ± 0.01 mg EC/100 g.

A si mismo se realizó una correlación de Pearson del contenido de fenoles totales con el

contenido de flavonoides totales para cada longitud de onda y se encontró que existe una

buena correlación de fenoles con flavonoides totales a 490 nm en equivalentes de catequina.

λ

(nm) DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US

• 405 375.35 ± 0.01 159.54 ± 0.01 346.58 ± 0.01 173.60 ± 0.01 147.80 ± 0.01 261.40 ± 0.01 183.95 ± 0.01

• 490 251.15 ± 0.01 101.37 ± 0.01 152.20 ± 0.01 106.94 ± 0.01 131.46 ± 0.01 180.31 ± 0.01 165.21 ± 0.01

• 515 129.40 ± 0.01 46.50 ± 0.01 86.75 ± 0.01 58.01 ± 0.01 93.35 ± 0.01 118.00 ± 0.01 109.25 ± 0.01

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto obtenido por decocción

a partir de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca. H2O-US, Extracto

acuoso obtenido por ultrasonido. MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido. EtOH-US,

Extracto de etanol obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de acetona obtenido por ultrasonido

al 70%. Los datos expresados son el promedio de tres mediciones ± desviación estándar. Todas las muestras

son significativamente diferentes (p<0.05). Se usó la prueba de Duncan y un ANOVA para el análisis

estadístico.

Figura 20. Flavonoides totales de la suma de fracciones en equivalentes de catequina de las

hojas de J. spicigera.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

mg E

C/1

00g

Extracto

51

7.5. Evaluación de la actividad antioxidante

Se evaluó la actividad antioxidante de los extractos frente al radical DPPH•. Como se

puede observar en la Figura 21, en general la fracción acuosa posee una mayor actividad

antioxidante en comparación de la fracción MeOH/H2O para los extractos de la hoja fresca, de

la decocción de la hoja seca, metanólico y el etanólico al 70%. La fracción acuosa del extracto

de la hoja fresca (EFD1) posee un IC50 415.00 ± 11.18 ppm, esto indica que tiene una mejor

actividad antioxidante en comparación con los otros extractos. El extracto de etanol al 70%,

fracción acuosa (ETOH1), tiene un IC50 de 1115.00 ± 3.43 ppm, este extracto posee una mejor

actividad antioxidante en comparación con los extractos obtenidos a partir del polvo

deshidratado. Sin embargo la fracción acuosa de la infusión del polvo de la hoja deshidratada

posee un IC50 de 9370.00 ± 503.59 ppm y la fracción de MeOH/H2O del extracto de metanol

presenta un IC50 de 12812.00 ± 88.36 ppm, estos valores indican que las fracciones de estos

extractos tienen una baja actividad antioxidante en comparación con los otras fracciones de los

diferentes extractos, por tal razón no se muestran en la Figura 21.

En la Figura 21, se puede observar que el tipo de disolvente influye en la actividad

antioxidante de un extracto, así como también el tipo de extracción puede afectar a la actividad

antioxidante del extracto. Comparando los valores de IC50 de la decocción de la hoja fresca

con los valores de la infusión y decocción de la muestra deshidratada se puede decir que las

fracciones de la hoja fresca poseen una mayor actividad antioxidante que las fracciones de los

extractos antes mencionados. De los extractos obtenidos por ultrasonido el extracto que

presento mayor actividad antioxidante fue el de etanol al 70%, se puede decir que el tipo de

disolvente influye en la actividad antioxidante de una fracción de un extracto.

52

EFD1 415.00 ± 11.18 DEC1 1375.00 ± 28.85 ETOH1 1115.00 ± 3.43

EFD2 1336.00 ± 22.80 DEC2 2264.00 ± 93.40 ETOH2 1528.00 ± 55.99

INF2 2567.00 ± 86.22 H2O US 3869.00 ± 113.76 ACET1 1314.00 ± 52.04

MEOH1 1195.00 ± 21.88 H2O US 1571.00 ± 70.76 ACET2 1262.00 ± 22.56

EFD1, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda, fracción acuosa. EFD2, Extracto obtenido por decocción de

muestra húmeda, fracción MeOH/H2O. DEC1, Extracto obtenido por decocción a partir de muestra seca, fracción acuosa.

DEC2, Extracto obtenido por decocción a partir de muestra seca, fracción MeOH/H2O. INF2, Extracto obtenido por infusión a

partir de muestra seca, fracción MeOH/H2O. H2O US1, Extracto acuoso obtenido por ultrasonido, fracción acuosa. H2O US2,

Extracto acuoso obtenido por ultrasonido, fracción MeOH/H2O. MeOH1, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido,

fracción acuosa. EtOH1, Extracto de etanol obtenido por ultrasonido al 70%, fracción acuosa. EtOH2, Extracto de etanol

obtenido por ultrasonido al 70%, fracción MeOH/H2O. ACET1, Extracto de acetona obtenido por ultrasonido al 70%, fracción

acuosa. ACET2, Extracto de acetona obtenido por ultrasonido al 70%, fracción MeOH/H2O. Los datos expresados son el

promedio de tres mediciones ± desviación estándar. Todas las muestras son significativamente diferentes

(p<0.05). Se usó la prueba de Duncan y un ANOVA para el análisis estadístico.

Figura 21. IC50 de las fracciones de los extractos de J. spicigera.

Se llevó a cabo la cinética para cada fracción de los extractos de J. spicigera. A partir

de los datos de las curvas de cinética, se calculó la primera derivada para conocer el TEC50. El

TEC50 de la fracción acuosa del extracto de la decocción de la hoja fresca fue de 35 min, Figura

22. El TEC50 de la fracción acuosa del extracto de etanol al 70% fue de 18 min, Figura 23.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

IC5

0(p

pm

)

Extracto

53

Figura 22. Cinética de la fracción acuosa de la decocción de la hoja fresca de J. spicigera.

Figura 23. Cinética de la fracción acuosa del extracto de etanol al 70% de J. spicigera.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 35 min

159 ppm

208 ppm

303 ppm

556 ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 18 min

769 ppm

1250 ppm

1818 ppm

3333 ppm

54

En la Tabla 11 se muestra el TEC50 para cada una de las fracciones, así como su

eficiencia antirradicalar expresada en kg de DPPH•/g muestra seca*min. Como se puede

observar en la tabla, la fracción acuosa obtenida de la SPE del extracto H2O asistido por

ultrasonido (H2O US1) presenta el menor TEC50, esto indica que el extracto reacciona

rápidamente frente al radical DPPH•. En general los extractos presentan tiempos pequeños esto

indica que reaccionan rápidamente frente a un radical, la capacidad antioxidante está

relacionada con su contribución potencial en la prevención de enfermedades de diversa

naturaleza; teniendo gran importancia su determinación en la eficiencia antirradicalar la cual

indica que tan efectivo es un extracto.

En la Tabla 11, se puede observar que a pesar de que un extracto posea un tiempo corto

no necesariamente indica que tenga una buena eficiencia antirradicalar, los extractos EFD1 y

ETOH1 muestran una mayor eficiencia antirradicalar en comparación con los otros extractos.

Sin embargo estos dos extractos reaccionan de manera diferente siendo más rápidos el extracto

ETOH1. El extracto de INF1 muestra una baja eficiencia antirradicalar así como también

reacciona de manera más lenta si se compara con las fracciones de los demás extractos. En

general se puede decir que las fracciones acuosas de los diferentes extractos son más eficientes

que las fracciones de MeOH/H2O, esto se pude atribuir a la diferente composición de

compuestos fenólicos presentes en ambas fracciones.

55

Tabla 11. TEC50 y eficiencia antirradicalar (AE) de los extractos de J. spicigera.

Extracto EC50

(kg m s/kg DPPH•)

TEC50

(min)

AE

(kg DPPH•/ kg m s *min)

EFD1 20.75 35 1.38

EFD2 66.80 22 0.68

DEC1 68.75 15 0.97

DEC2 113.20 33 0.27

INF1 468.50 46 0.05

INF2 128.35 20 0.39

H2O US1 193.45 11 0.47

H2O US2 78.55 22 0.58

MEOH1 59.75 18 0.93

MEOH2 640.60 16 0.1

ETOH1 55.75 18 1.00

ETOH2 76.40 28 0.47

ACET1 65.70 23 0.66

ACET2 63.10 28 0.57

BHT 1.42 83 0.01

EFD1, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda, fracción acuosa. EFD2, Extracto obtenido

por decocción de muestra húmeda, fracción MeOH/H2O. DEC1, Extracto obtenido por decocción a partir

de muestra seca, fracción acuosa. DEC2, Extracto obtenido por decocción a partir de muestra seca,

fracción MeOH/H2O. INF1, Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca, fracción acuosa.

INF2, Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca, fracción MeOH/H2O. H2O US1, Extracto

acuoso obtenido por ultrasonido, fracción acuosa. H2O US2, Extracto acuoso obtenido por ultrasonido,

fracción MeOH/H2O. MeOH1, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido, fracción acuosa. MeOH2,

Extracto de metanol obtenido por ultrasonido, fracción MeOH/H2O. EtOH1, Extracto de etanol obtenido

por ultrasonido al 70%, fracción acuosa. EtOH2, Extracto de etanol obtenido por ultrasonido al 70%,

fracción MeOH/H2O. ACET1, Extracto de acetona obtenido por ultrasonido al 70%, fracción acuosa.

ACET2, Extracto de acetona obtenido por ultrasonido al 70%, fracción MeOH/H2O.

56

8. REFERENCIAS

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61

9. ANEXOS

A 1. Relación entre el mecanismo de acción de fármacos y plantas.

Fármaco Mecanismo de acción Planta

Metformina Disminuyen la gluconeogénesis y

glicogénesis.

Psidium guajava

(Basha et al., 2012)

Glipizida

Glibenclamida

Glyvurida

Reducen los niveles de glucosa en sangre

por regeneración de células β.

Estimulan la secreción de insulina de

células β.

Passiflora incarnata

(Gupta et al., 2012)

Prandin

Starlix

Reducen los niveles de glucosa en sangre

por regeneración de células β.

Estimulan la secreción de insulina de

células β.

Passiflora incarnata (Gupta

et al., 2012)

Precose

Glyset

Reducen la absorción de glucosa

intestinal.

Inhiben a la α-amilasa y α-glucosidasa.

G. sylvestre, G. inodorum,

G. yunnanense

(Ramkumar et al., 2010)

Camellia sinensis

(Wang et al., 2012)

Asystasia gangetica

(Reddy et al., 2010)

Amaranthus viridis

(Kumar et al., 2012)

Indigofera stachyodes

(Li et al., 2011)

Januvia

Inician la liberación de insulina.

Estimulan la síntesis y/o liberación de

insulina.

Passiflora incarnata

(Gupta et al., 2012)

Actos

Avandia

Mimetizan a la insulina.

Disminuyen los niveles de glucosa en

sangre.

Incrementan la utilización de la glucosa

periférica.

Passiflora incarnata

(Gupta et al., 2012)

62

A 2. Medicamentos orales para el tratamiento de la diabetes Tipo 2.

Clase Medicamentos

orales Efecto Ventajas Desventajas

Biguanidas Metformina

Funciona impidiendo que el

páncreas produzca glucosa y

ayudando a que más glucosa

entre en la célula.

Bajo riesgo de hipoglucemia.

No causa aumento de peso.

No eleva la presión arterial.

Podría disminuir el colesterol

LDL.

Podría disminuir triglicéridos.

Bajo costo.

Alto riesgo de náusea y diarrea.

No pueden tomarlo personas

que tienen enfermedad renal o

insuficiencia cardiaca.

Debe tomarse 2 ó 3 veces al

día.

Sulfonilureas

Glipizida

Glibenclamida

Gliburida

Ayuda al páncreas a producir

más insulina.

Actúa con rapidez.

No eleva la presión arterial.

No eleva el colesterol LDL.

Bajo costo.

Debe tomarse 1 ó 2 veces al día.

Aumento de peso promedio

aprox. 2 a 5 kg.

Alto riesgo de hipoglucemia,

especialmente con la gliburida.

Meglitinidas Prandin

Starlix

Ayuda al páncreas a producir

más insulina.

Actúa con rapidez.

No eleva el colesterol LDL.

Prandin (repaglinida) podría

disminuir los triglicéridos.

Prandin (repaglinida) tiene alto

riesgo de hipoglucemia y

aumento de peso.

Starlix (nateglinida) no

disminuye los niveles de

glucosa con tanta eficacia

como otros medicamentos.

Debe tomarse 3 veces al día.

Mayor costo.

Inhibidores de la

α-glucosidasa

Precose

Glyset

Funciona disminuyendo la

rapidez de absorción de

glucosa por los intestinos.

Bajo riesgo de hipoglucemia en

comparación con otros fármacos.

No causa aumento de peso.

Disminuye los triglicéridos.

No eleva el colesterol LDL.

No disminuye los niveles de

glucosa con tanta eficacia

como la mayoría de los otros

fármacos.

Alto riesgo de náuseas y

diarrea, aunque no tanto como

la metformina.

Debe tomarse 3 veces al día.

Mayor costo.

Inhibidores de la

dipeptidil

peptidasa 4

Januvia Funciona ayudando al

páncreas a liberar insulina.

Bajo riesgo de hipoglucemia.

No causa aumento de peso.

Pocos efectos secundarios

No baja el azúcar sanguíneo

con tanta eficacia como otros

fármacos.

63

conocidos.

Debe tomarse 2 veces al día.

Es nuevo se sabe poco sobre

los posibles efectos

secundarios.

Es posible que funcione sólo

como un segundo

medicamento.

Mayor costo.

Tiazolidinedionas Actos

Avandia

Funciona ayudando a las

células a utilizar la glucosa.

Bajo riesgo de hipoglucemia.

Puede elevar ligeramente el

colesterol HDL.

Actos (pioglitazona) podría

disminuir los triglicéridos.

Debe tomarse 1 ó 2 veces al día.

Mayor riesgo de insuficiencia

cardiaca.

Aumento de peso promedio

aprox. 2 a 5 kg.

Mayor riesgo de edema

(retención de líquidos).

Mayor riesgo de anemia.

Eleva el colesterol LDL.

Avandia aumenta los

triglicéridos y podría aumentar

el riesgo de un ataque al

corazón.

Raro riesgo de causar

problemas del hígado.

No actúa con rapidez.

Mayor costo.

El A 2 se tomó parcialmente de Consumer Reports (Best Buy Drugs), http://www.consumerreports.org/health/resources/pdf/best-

buy-drugs/DbtesSp5Jan112008final.pdf (Accesado Febrero 2013).

64

10. APÉNDICES

AP 1. Fenoles totales en extractos crudos de las hojas de J. spicigera.

Extracto mg EAG/100g

DEC-MH 767.04 ± 0.01a

DEC-MS 509.91 ± 0.01b

INF-MS 422.74 ± 0.01c

H2O-US 220.72 ± 0.01d

MeOH-US 492.41 ± 0.01e

EtOH-US 618.62 ± 0.01f

ACT-US 610.81 ± 0.01g

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-

MS, Extracto obtenido por decocción a partir de muestra seca. INF-MS,

Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca. H2O-US,

Extracto acuoso obtenido por ultrasonido. MeOH-US, Extracto de

metanol obtenido por ultrasonido. EtOH-US, Extracto de etanol obtenido

por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de acetona obtenido por

ultrasonido al 70%. Los datos expresados son el promedio de tres

mediciones ± desviación estándar. Todas las muestras son

significativamente diferentes (p<0.05). Se usó la prueba de Duncan y un

ANOVA para el análisis estadístico.

65

Fenoles totales extractos limpios de las hojas de J. spicigera.

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto

obtenido por decocción a partir de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por

infusión a partir de muestra seca. H2O-US, Extracto acuoso obtenido por ultrasonido.

MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido. EtOH-US, Extracto de etanol

obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de acetona obtenido por

ultrasonido al 70%. Los datos expresados son el promedio de tres mediciones ±

desviación estándar. Todas las muestras son significativamente diferentes (p<0.05). Se

usó la prueba de Duncan y un ANOVA para el análisis estadístico.

Extracto

mg EAG/100g

Fracción

acuosa

Fracción

MeOH/H20

Suma de

fracciones

DEC-MH 114.20 ± 0.01ª 573.00 ± 0.02h 687.20 ± 0.02º

DEC-MS 83.70 ± 0.01b 108.60 ± 0.01i 192.30 ± 0.01p

INF-MS 192.09 ± 0.01c 39.97 ± 0.01j 232.06 ± 0.02q

H2O-US 132.40 ± 0.01d 45.65 ± 0.01k 178.05 ± 0.01r

MeOH-US 93.50 ± 0.01e 142.55 ± 0.01l 236.05 ± 0.01s

EtOH-US 308.00 ± 0.01f 178.05 ± 0.01m 486.05 ± 0.01t

ACT-US 153.05 ± 0.01g 219.60 ± 0.01n 372.65 ± 0.02u

66

AP 2. Flavonoides totales en equivalentes de catequina.

Extracto

λ = 405 nm λ = 490 nm λ = 515 nm

Fracción

acuosa

Fracción

MeOH/H2O

Fracción

acuosa

Fracción

MeOH/H2O

Fracción

acuosa

Fracción

MeOH/H2O

DEC-MH 141.35 ±

0.01

234.00 ±

0.01

66.45 ±

0.01a

184.70 ±

0.01

35.70 ±

0.01b

93.70 ±

0.01

DEC-MS 109.54 ±

0.01 50.00 ± 0.01

64.67 ±

0.01a 36.70 ± 0.01

29.27 ±

0.01

17.23 ±

0.01

INF-MS 315.45 ±

0.01 31.13 ± 0.01

125.29 ±

0.01 26.91 ± 0.01

74.12 ±

0.01

12.63 ±

0.01

H2O-US 74.20 ±

0.01 99.40 ± 0.01c

26.38 ±

0.01 80.56 ± 0.01d

15.66 ±

0.01

42.35 ±

0.01e

MeOH-US 88.25 ±

0.01 59.55 ± 0.01

64.10 ±

0.01a 67.36 ± 0.01

49.45 ±

0.01

43.90 ±

0.01e

EtOH-US 159.55 ±

0.01

101.85 ±

0.01c

100.45 ±

0.01 79.86 ± 0.01d

62.70 ±

0.01

55.30 ±

0.01

ACT-US 104.65 ±

0.01 79.30 ± 0.01

63.20 ±

0.01a

102.01 ±

0.01

38.60 ±

0.01b

70.65 ±

0.01

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto obtenido por decocción a partir

de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca. H2O-US, Extracto acuoso

obtenido por ultrasonido. MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido. EtOH-US, Extracto de etanol

obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de acetona obtenido por ultrasonido al 70%. Los datos

expresados son el promedio de tres mediciones ± desviación estándar. De la fracción MeOH/H2O a 405 nm los

extractos H2O-US y EtOH-US no existe diferencia significativa (p<0.05). En la fracción acuosa a 490 nm entre los

extractos DEC-MH, DEC-MS, MeOH-US y ACT-US no existe diferencia significativa (p<0.05). De la fracción

MeOH/H2O a 490 nm entre los extractos H2O-US y EtOH-US no existe diferencia significativa (p<0.05). En la

fracción acuosa a 515 nm entre los extractos DEC-MH y ACT-US no existe diferencia significativa (p<0.05). De la

fracción MeOH/H2O a 515 nm entre los extractos H2O-US y MeOH-US no existe diferencia significativa (p<0.05).

Se usó la prueba de Duncan y un ANOVA para el análisis estadístico.

67

Suma de las dos fracciones obtenidos después de la limpieza del extracto (eluato acuoso y

eluato MeOH/H2O).

Extracto λ = 405 nm λ = 490 nm λ = 515 nm

DEC-MH 375.35 ± 0.01 251.15 ± 0.01 129.40 ± 0.01

DEC-MS 159.54 ± 0.01 101.37 ± 0.01 46.50 ± 0.01

INF-MS 346.58 ± 0.01 152.20 ± 0.01 86.75 ± 0.01

H2O-US 173.60 ± 0.01 106.94 ± 0.01 58.01 ± 0.01

MeOH-US 147.80 ± 0.01 131.46 ± 0.01 93.35 ± 0.01

EtOH-US 261.40 ± 0.01 180.31 ± 0.01 118.00 ± 0.01

ACT-US 183.95 ± 0.01 165.21 ± 0.01 109.25 ± 0.01

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto

obtenido por decocción a partir de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por

infusión a partir de muestra seca. H2O-US, Extracto acuoso obtenido por ultrasonido.

MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido. EtOH-US, Extracto de etanol

obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de acetona obtenido por

ultrasonido al 70%.Los datos expresados son el promedio de tres mediciones ±

desviación estándar. Todas las muestras son significativamente diferentes (p<0.05). Se

usó la prueba de Duncan y un ANOVA para el análisis estadístico.

68

AP 3. Flavonoides totales en equivalentes de quercetina.

Extracto

λ = 405 nm λ = 490 nm λ = 515 nm

Fracción

acuosa

Fracción

MeOH/H2O

Fracción

acuosa

Fracción

MeOH/H2O

Fracción

acuosa

Fracción

MeOH/H2O

DEC-MH 242.35 ± 0.01 427.50 ±

0.01

160.65 ±

0.01

508.00 ±

0.01

118.40 ±

0.01

310.50 ±

0.01

DEC-MS 194.06 ± 0.01 80.53 ± 0.01 165.56 ±

0.01

109.71 ±

0.01

96.98 ±

0.01 57.14 ± 0.01

INF-MS 468.58 ± 0.01 58.37 ± 0.01 350.16 ±

0.01

74.47 ±

0.01

245.89 ±

0.01 41.86 ± 0.01

H2O-US 117.66 ± 0.01 193.10 ±

0.01a

63.60 ±

0.01

211.50 ±

0.01b

51.92 ±

0.01

140.35 ±

0.01

MeOH-US 180.05 ± 0.01 146.35 ±

0.01

152.35 ±

0.01

164.00 ±

0.01

164.05 ±

0.01

145.60 ±

0.01

EtOH-US 263.75 ± 0.01 196.00 ±

0.01a

283.15 ±

0.01

209.00 ±

0.01b

207.90 ±

0.01

183.35 ±

0.01

ACT-US 199.25 ± 0.01 169.55 ±

0.01

149.00 ±

0.01

289.00 ±

0.01

128.05 ±

0.01

234.20 ±

0.01

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto obtenido por decocción a partir

de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por infusión a partir de muestra seca. H2O-US, Extracto acuoso

obtenido por ultrasonido. MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido. EtOH-US, Extracto de etanol

obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de acetona obtenido por ultrasonido al 70%.Los datos

expresados son el promedio de tres mediciones ± desviación estándar. De la fracción MeOH/H2O a 405 nm los

extractos H2O-US y EtOH-US no existe diferencia significativa (p<0.05). De la fracción MeOH/H2O a 490 nm entre

los extractos H2O-US y EtOH-US no existe diferencia significativa (p<0.05). Se usó la prueba de Duncan y un

ANOVA para el análisis estadístico.

69

Suma de las dos fracciones obtenidos después de la limpieza del extracto (eluato acuoso y

eluato MeOH/H2O).

Extracto λ = 405 nm λ = 490 nm λ = 515 nm

DEC-MH 669.85 ± 0.01 668.65 ± 0.01 428.90 ± 0.01

DEC-MS 274.59 ± 0.01 275.27 ± 0.01a 154.12 ± 0.01

INF-MS 526.95 ± 0.01 424.63 ± 0.01 287.75 ± 0.01

H2O-US 310.76 ± 0.01 275.10 ± 0.01a 192.27 ± 0.01

MeOH-US 326.40 ± 0.01 316.35 ± 0.01 309.65 ± 0.01

EtOH-US 459.75 ± 0.01 492.15 ± 0.01 391.25 ± 0.01

ACT-US 368.80 ± 0.01 438.00 ± 0.01 362.25 ± 0.01

DEC-MH, Extracto obtenido por decocción de muestra húmeda. DEC-MS, Extracto

obtenido por decocción a partir de muestra seca. INF-MS, Extracto obtenido por

infusión a partir de muestra seca. H2O-US, Extracto acuoso obtenido por ultrasonido.

MeOH-US, Extracto de metanol obtenido por ultrasonido. EtOH-US, Extracto de etanol

obtenido por ultrasonido al 70%. ACT-US, Extracto de acetona obtenido por

ultrasonido al 70%.Los datos expresados son el promedio de tres mediciones ±

desviación estándar. De la fracción MeOH/H2O a 490 nm entre los extractos H2O-US y

MeOH-US no existe diferencia significativa (p<0.05). Se usó la prueba de Duncan y un

ANOVA para el análisis estadístico.

70

AP 4. Curva de calibración en equivalentes de ácido gálico para la cuantificación de fenoles totales.

y = 0.0152x - 0.0009

R² = 0.9956

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 5 10 15 20 25 30

Ab

s

ppm

y = 0.0124x + 0.0011

R² = 0.9963

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0 5 10 15 20 25 30

Ab

s

ppm

71

AP 5. Curva de calibración en equivalentes de (+) - catequina para la cuantificación de flavonoides

totales.

Curva a una longitud de onda de 405 nm.

Curva a una longitud de 490 nm.

y = 0.0054x - 0.013

R² = 0.9813

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 10 20 30 40 50 60

Ab

s

ppm

y = 0.0072x - 0.025

R² = 0.9848

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0 10 20 30 40 50 60

Ab

s

ppm

72

Curva a una longitud de onda de 515 nm.

y = 0.0063x

R² = 0.9824

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0 10 20 30 40 50 60

Ab

s

ppm

73

AP 6. Curva de calibración en equivalentes de quercetina para la cuantificación de flavonoides totales.

Curva a una longitud de onda de 405 nm.

Curva a una longitud de onda de 490 nm.

y = 0.0046x - 0.0833

R² = 0.9962

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0.450

0 20 40 60 80 100 120

Ab

s

ppm

y = 0.002x + 0.0064

R² = 0.9737

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0 20 40 60 80 100 120

Ab

s

ppm

74

Curva a una longitud de onda de 515 nm.

y = 0.0019x

R² = 0.9935

0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

0.160

0.180

0.200

0 20 40 60 80 100 120

Ab

s

ppm

75

AP 7. Curva de calibración en equivalentes de ácido gálico para DPPH•.

y = 27.012x + 2.381

R² = 0.9983

IC50 = 1.76

0

10

20

30

40

50

60

0 0.5 1 1.5 2 2.5

% I

nh

ibic

ión

ppm

76

AP 8. IC50 y TEC50 del BHT para el ensayo del DPPH•.

y = -0.0152x2 + 2.0072x + 5.228

R² = 0.9968

IC50 = 28.43 ± 0.104

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50 60

% I

nh

ibib

icio

n

ppm

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 83 min

10 ppm

28.43 ppm

40 ppm

77

AP 9. IC50 y TEC50 de la decocción de la hoja fresca de J. spicigera, fracción acuosa para DPPH•.

y = 21.544ln(x) - 79.875

R² = 0.9942

IC50 = 415 ppm ± 11.175

0

10

20

30

40

50

60

0 100 200 300 400 500 600

% I

nh

ibic

ión

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 35 min

159 ppm

208 ppm

303 ppm

556 ppm

78

AP 10. IC50 y TEC50 de la decocción de la hoja fresca de J. spicigera, fracción MeOH/H2O para DPPH•.

y = -2E-05x2 + 0.0683x - 5.5432

R² = 1

IC50 = 1336 ± 22.799

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

% I

nh

ibic

ión

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 22 min

625 ppm

909 ppm

1667 ppm

5000 ppm

79

AP 11. IC50 y TEC50 de la decocción del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción acuosa para DPPH•.

y = -2E-06x2 + 0.0295x + 13.366

R² = 0.9995

IC50 = 1375 ± 28.846

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

% I

nh

ibic

ión

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 15 min

959 ppm

1207 ppm

1657 ppm

2500 ppm

80

AP 12. IC50 y TEC50 de la decocción del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción MeOH/H2O para

DPPH•.

y = 7E-06x2 - 0.0049x + 25.238

R² = 1

IC50 = 2264 ± 93.404

0

10

20

30

40

50

60

70

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

% I

nh

ibic

ón

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

ema

nen

te

Tiempo (min)

TEC50 = 33 min

1522 ppm

1784 ppm

1944 ppm

2692 ppm

81

AP 13. IC50 y TEC50 de la infusión del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción acuosa para DPPH•.

y = -1E-07x2 + 0.0056x + 6.3131

R² = 0.9996

IC50 = 9370 ± 503.596

0

10

20

30

40

50

60

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

% I

nh

ibic

ión

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 46 min

2500 ppm

3889 ppm

8750 ppm

12727 ppm

82

AP 14. IC50 y TEC50 de la infusión del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción MeOH/H2O para

DPPH•.

y = 3E-06x2 + 0.0123x - 1.2167

R² = 0.9996

IC50 = 2567 ± 86.215

0

10

20

30

40

50

60

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

% I

nh

ibic

ón

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 20 min

1522 ppm

1944 ppm

2295 ppm

2692 ppm

83

AP 15. IC50 y TEC50 del extracto H2O por ultrasonido del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción

acuosa para DPPH•.

y = -2E-06x2 + 0.0248x - 16.016

R² = 0.9997

IC50 = 3869 ± 113.757

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2000 4000 6000 8000 10000

% I

nh

ibic

ón

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

ppm

TEC50 = 11 min

8333 ppm

4545 ppm

3125 ppm

1923 ppm

84

AP 16. IC50 y TEC50 del extracto H2O por ultrasonido del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción

MeOH/H2O para DPPH•.

y = -9E-06x2 + 0.0515x - 8.6826

R² = 1

IC50 = 1571 ± 70.760

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

% I

nh

ibic

ión

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 22 min

1250 ppm

1818 ppm

3333 ppm

10000 ppm

85

AP 17. IC50 y TEC50 del extracto MeOH por ultrasonido del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción

acuosa para DPPH•.

y = -3E-05x2 + 0.1315x - 64.311

R² = 1

IC50 = 1195 ± 21.882

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

% I

nh

ibic

ón

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 18 min

769 ppm

1818 ppm

1250 ppm

3333 ppm

86

AP 18. IC50 y TEC50 del extracto MeOH por ultrasonido del polvo de la hoja de J. spicigera, fracción

MeOH/H2O para DPPH•.

y = -5E-07x2 + 0.0185x - 104.95

R² = 1

IC50 = 12812 ± 88.356

0

10

20

30

40

50

60

70

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000

% I

nh

ibic

ón

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

ppm

TEC50 = 16 min

2500 ppm

10000 ppm

13333 ppm

16000 ppm

87

AP 19. IC50 y TEC50 del extracto EtOH 70% por ultrasonido del polvo de J. spicigera, fracción acuosa

para DPPH•.

y = -1E-05x2 + 0.0774x - 23.865

R² = 0.9995

IC50 = 1115 ± 3.427

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

% I

nh

ibic

ón

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 18 min

769 ppm

1250 ppm

1818 ppm

3333 ppm

88

AP 20. IC50 y TEC50 del extracto EtOH 70% por ultrasonido del polvo de J. spicigera, fracción

MeOH/H2O para DPPH•.

y = -2E-06x2 + 0.0335x + 3.5498

R² = 0.9919

IC50 = 1528 ± 55.998

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

% I

nh

ibic

ón

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 28 min

556 ppm

769 ppm

1667 ppm

2500 ppm

89

AP 21. IC50 y TEC50 del extracto acetona 70% por ultrasonido del polvo de J. spicigera, fracción acuosa

para DPPH•.

y = -7E-06x2 + 0.0464x + 1.1262

R² = 0.9986

IC50 = 1314 ± 52.038

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

% I

nh

ibic

ón

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 23 min

769 ppm

1250 ppm

1818 ppm

3333 ppm

90

AP 22. IC50 y TEC50 del extracto de acetona 70% por ultrasonido del polvo de J. spicigera, fracción

MeOH/H2O para DPPH•.

y = 34.469ln(x) - 196.12

R² = 0.9961

IC50 = 1262 ± 22.545

0

10

20

30

40

50

60

70

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

% I

nh

ibic

ión

ppm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140

% D

PP

H R

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 = 28 min

435 ppm

556 ppm

769 ppm

1667 ppm