evaluación de aislamientos nativos de beauveria bassiana y
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL
UNIDAD SINALOA
TESIS
Evaluación de aislamientos nativos de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae
para el control del gusano del fruto Heliothis virescens (Fabricius 1771) en el cultivo de
tomate Solanum lycopersicum (Mill) en Guasave, Sinaloa
PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
LUIS ALBERTO GAXIOLA CASTRO
GUASAVE, SINALOA, MÉXICO DICIEMBRE 2012
RECONOCIMIENTO A PROYECTOS Y BECAS
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de biotecnología agrícola del
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR)
Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue
apoyado económicamente a través del proyecto de investigación “diseño y
evaluación de formulaciones micro y nanoencapsuladas para el control de plagas de
hortalizas” (Con número de registro 20120464). El alumno Luis Alberto Gaxiola
Castro fue apoyado con una beca CONACYT con clave 369370.
A la beca institucional del IPN por haberme apoyado durante el quinto semestre.
Al COECyT por apoyarme en la culminación del trabajo (impresión y empastado de la
tesis).
DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS
A Dios:
Por permitirme dar este paso tan importante en mi vida y por todas las cosas en las
que me ayudara en el futuro.
A mis padres:
Por ser los seres más maravillosos que hay sobre la tierra y por apoyarme en todo
momento en las buenas y malas.
A mis hermanas:
Por ser mis compañeras y confidentes a lo largo de la vida, las quiero mucho.
Al Dr. Cipriano:
Por haberme dado la oportunidad de participar en su equipo de trabajo y por la
paciencia que me tuvo durante la realización del mismo.
A mi comité tutorial:
Un especial agradecimiento al Dr. Adolfo Dagoberto Armenta Bojorquez, al Dr.
Edgardo Cortez Mondaca, al Dr. Juan Carlos Sainz Hernández y al M en C Jesús
Ricardo Camacho Báez, por sus atinadas aportaciones en la realización del trabajo
A los compañeros de laboratorio:
Gracias en general por el apoyo brindado durante la realización del trabajo, (Prof.
Chevi, Nadia, Arely, compadre Miguel, Claudia, Arturo, Mancillas).
i
ÍNDICE GENERAL
INDICE GENERAL I
GLOSARIO V
ÍNDICE DE FIGURAS VIII
ÍNDICE DE CUADROS IV
RESUMEN X
ABSTRACT XI
I. INTRODUCCIÓN 1
II. ANTECEDENTES 3
2.1. Importancia del tomate 3
2.1.2. Origen del tomate 4
2.1.3. Taxonomía 4
2.2. Plagas que afectan el desarrollo y la producción del cultivo de tomate 5
2.2.1. Minador de la hoja Liriomyza spp. 5
2.2.2. Gusano soldado Spodoptera exigua (Hübner) 6
2.2.3. Mosquita blanca Bemisia tabaci (Gennadius) Biotipo “B” 6
2.2.4. Gusano alfiler Keiferia lycopersicella (Walsingham) 6
2.2.5. Gusano del fruto Heliothis virescens (Fabricius) 6
2.2.5.1. Origen y distribución 7
2.2.5.2. Taxonomía 8
2.2.5.3. Biología y hábitos 8
2.3. Presencia de H. virescens en el cultivo de tomate 10
2.3.1. Monitoreo 10
2.3.2. Muestreo 10
2.4. Estrategias de control de H. virescens 11
2.4.1. Control cultural 11
2.4.2. Control químico 11
ii
2.4.3. Control biológico 11
2.5. Los bioplaguicidas 12
2.6. Organismos entomopatógenos 14
2.6.1. Virus 14
2.6.2. Bacterias 14
2.6.3. Nemátodos 16
2.6.4. Hongos entomopatógenos 16
2.6.4.1. Mecanismos de acción de hongos entomopatógenos 16
2.6.4.2. Características morfológicas de M. anisopliae (Metschnikof) 19
2.6.4.3. Taxonomía 20
2.6.4.4. Importancia en el control de insectos plaga 20
2.6.4.5. Características morfológicas de B. bassiana (Vuillemin) 20
2.6.4.6. Taxonomía 21
2.6.4.7. Importancia en el control de insectos plaga 21
2.7. Técnicas que apoyan el control biológico de plagas 22
2.7.1. Importancia de la cría de insectos 22
2.7.2. Cría de noctuidos 23
2.8. Producción masiva de hongos entomopatógenos en medio líquido 24
III. JUSTIFICACIÓN 25
IV. HIPÓTESIS 26
V. OBJETIVOS 26
5.1. Objetivo general 26
5.2. Objetivos específicos 26
VI. METODOLOGÍA 27
6.1. Colecta de H. virescens en campo 27
6.2. Establecimiento de la cría H. virescens 27
6.3. Aislamientos nativos de B. bassiana y M. anisopliae 29
iii
6.4. Propagación de los aislamientos en medio PDA 30
6.5. Obtención del inóculo 31
6.6. Estimación de la concentración de esporas 32
6.7. Evaluación de la patogenicidad de los aislamientos 32
6.8. Determinación de los indicadores de virulencia DL50 y TL50 33
6.9. Evaluación de la efectividad de los aislamientos en campo 33
6.9.1. Establecimiento de la parcela experimental de tomate 33
6.9.2. Control de plagas y malezas 35
6.9.3. Infestación artificial de la parcela experimental de tomate con
H. virescens 36
6.10. Producción del hongo B. bassiana en medio líquido 37
6.11. Productos biorracionales 38
6.12. Conteo de larvas vivas después de la infestación 38
6.13. Aplicación de los tratamientos 39
6.14. Conteo de larvas muertas después de la aplicación de los tratamientos 40
6.15. Evaluación del rendimiento en frutos 40
6.16. Evaluación de daño en frutos causados por H. virescens 41
6.17. Análisis estadístico 41
VII. RESULTADOS 42
7.1. Ciclo biológico de H. virescens en laboratorio 42
7.2. Bioensayo con aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae sobre H. virescens 44
7.3. Determinación de indicadores de virulencia (DL50 y TL50) 47
7.4. Evaluación de la efectividad de los aislamientos B1 y en cultivo de tomate
infestado con H. virescens 47
7.5. Rendimiento en fruto de cultivo de tomate 48
iv
VIII. DISCUSION 50
IX. CONCLUSIONES 56
X. RECOMENDACIONES 57
XI. BIBLIOGRAFIA 58
v
GLOSARIO
Agricultura orgánica. Sistemas agrícolas de producción que prescinden del empleo
de productos de síntesis química para el mejoramiento de la calidad de los suelos y
el tratamiento de plagas y enfermedades en los cultivos. Se fundamenta en optimizar
las condiciones edáficas (características físicas y químicas de los suelos) a partir de
enmiendas orgánicas, abonos verdes, sustancias minerales, y de prácticas culturales
tales como la labranza mínima, la asociación y rotación de cultivos. Con ello,
además, disminuye la probabilidad de ocurrencia de plagas y enfermedades
específicas y la extracción desbalanceada de nutrientes del suelo. Para los
tratamientos fitosanitarios se emplean productos de síntesis natural, de muy baja
toxicidad y sin efectos residuales sobre el suelo y los productos cosechados.
Agroquímico. Sustancia química o una mezcla de sustancias, destinadas a matar,
repeler, atraer, o interrumpir el crecimiento de seres vivos considerados plagas.
Apresorio. Estructura adhesiva, despuntada, a partir de la cual se origina una hifa
afilada que rompe la cutícula de una célula epidérmica del huésped por punción
permitiendo la penetración del micelio para establecer la infección de un hongo
parásito de plantas superiores.
Biorracional. Son sustancias que se derivan de microorganismos, plantas o
minerales. También pueden ser sustancias sintéticas idénticas a las que hay en la
naturaleza.
Ciclo agrícola. Ciclo agrícola es todo el "desarrollo de vida" de la planta cultivada.
Va desde la siembra hasta la cosecha generalmente. Hay plantas cuyo ciclo agrícola
es anual, otra bianual, y otras como los árboles frutales son perennes.
Cutícula. Capa exterior no celular de la pared del cuerpo de los artrópodos.
Defoliador. Insecto con aparato bucal masticador que se alimenta de del follaje de
las plantas.
vi
Dieta artificial. Mezcla de sustancias nutritivas para la alimentación de las colonias
en la cría masiva de insectos.
DL50. Cantidad de una substancia tóxica requerida para matar al 50 % de una
población de organismos.
Estadío larval. Se conoce como el espacio de tiempo comprendido entre muda y
muda generalmente pasan 5 o 6 previo al estado de pupa. (5 ó 6 dependiendo de la
especie)
Entomófago. Animal que se alimenta de insectos ya sea matándolo o comiéndolo
vivo.
Entomopatógeno. Organismo causante de enfermedades en los insectos,
normalmente, bacterias, virus, protozoos u hongos.
Fertilidad. Es una cualidad resultante de la interacción entre las características
físicas, químicas y biológicas del mismo y que consiste en la capacidad de poder
suministrar condiciones necesarias para el crecimiento y desarrollo de las plantas.
Hemocele. Parte corporal de los insectos donde se encuentran los cuerpos grasos
o adiposos.
Hortaliza. Es toda aquella planta de la que se puede consumir raíz, tallo, hojas y
fruto en estado fresco.
Metabolito. Es cualquier sustancia producida durante el metabolismo (digestión u
otros procesos químicos corporales).
Umbral económico. Grado de daño que puede soportar un cultivo al ser afectado
por insectos plaga y enfermedades sin causar pérdidas económicas.
TL50. Tiempo requerido para matar al 50 % de una población de organismos.
Virulencia. Intensidad de producir enfermedad; habilidad para invadir y afectar al
huésped o alguno de sus órganos o tejidos.
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Frutos inmaduros de tomate 3
Figura 2. Larva de H. virescens perforando frutos de tomate 7
Figura 3. A) Adulto de H. virescens en planta de tomate B) Pupa de H. virescens
en el suelo 9
Figura 4. Cultivo de M. anisopliae en medio PDA 19
Figura 5. Cultivo de B. bassiana con medio PDA 21
Figura 6. Colecta de H. virescens en el cultivo de tomate 27
Figura 7. A) Larva de H. virescens alimentándose de dieta artificial. B) Pupa de H.
virescens obtenidas en laboratorio. C) Trampa para colectar los adultos al
emerger de las pupas. D) Bolsas de papel donde se lleva a cabo la cópula, la
oviposición y la eclosión de huevecillos. E) Bolsa de papel de las cuales se
obtienen larvas recién eclosionadas. F) Generación (F1) colocadas en recipientes
de plástico. 29
Figura 8. Propagación de los aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae en
medio PDA. 31
Figura 9. Tubos falcón con inóculo de B. bassiana y M. anisopliae utilizado
para realizar bioensayos 31
Figura 10. Cámara de Neubauer utilizada para el coteo de esporas. 32
Figura 11. Bioensayo para determinar la patogenicidad de B. bassiana y
M. anisopliae sobre larvas de H. virescens. 32
Figura 12. Parcela experimental de tomate a los dos meses después del
trasplante. 35
Figura 13. Control de malezas en el cultivo de tomate. 36
viii
Figura 14. A) Huevecillos utilizados en la infestación B) Larvas
de primer estadío utilizadas en la infestación. 36
Figura 15. A) Incubadora agitadora utilizada para la producción en
medio líquido de los aislamientos B1 y B2 de B. bassiana
B) Matraz con inóculo crecido después de 72 horas. 37
Figura 16. Aplicación de los tratamientos en la parcela
experimental. 39
Figura 17. Rendimiento en el tratamiento Versa®. 40
Figura18. Frutos dañados en la parcela experimental de H.virescens. 41
Figura 19. Ciclo de vida de H. virescens en laboratorio. 41
Figura 20. A) Larva infectada con el aislamiento B1 y micosada a las 120 horas. B) Larva infectada con el aislamiento B2 y micosada a las 120 horas. 46
Figura 21. A) Larva de H. virescens infectada con el aislamiento B2 y micosada a las 120 horas B) Larva de H. virescens infectada con el aislamiento B1 y micosada a las 120 horas C) Larva de H. virescens infectada por nematodos a las 48 horas observada al estereoscopio. 48
ix
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Formulaciones comerciales de M. anisopliae producidos y
comercializados en México. 20
Cuadro 2. Formulaciones comerciales de B. bassiana producidas
y comercializadas en México. 22
Cuadro 3. Sitios de muestreo de suelo en el estado de Sinaloa para
la obtención de aislamientos con potencial entomopatógeno contra H.
virescens. 30
Cuadro 4. Larvas vivas de H. virescens a las 72 horas después
de la infestación. 38
Cuadro 5. Tratamientos, dosis y número de aplicaciones 39
Cuadro 6. Virulencia de aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae,
expresado en % de mortalidad de larvas. 46
Cuadro 7. % de mortalidad de larvas de H. virescens en campo con
diferentes tratamientos. 48
Cuadro 8. Rendimiento de tomate en los diferentes tratamientos
probados contra H. virescens en campo. 49
x
Resumen
En el presente trabajo se evaluaron en laboratorio 10 aislamientos nativos de hongos
entomopatógenos, tres de M. anisopliae y siete de B. bassiana sobre larvas de
segundo y tercer estadío de gusano del fruto (Heliothis virescens) provenientes de
una cría axénica; los dos aislamientos más patogénicos fueron B. bassiana con clave
B1 y B2, por presentar mortalidad de larvas superior a 55%. Con estos mismos
aislamientos se realizó un bioensayo para determinar la DL50 y la TL50. También se
evaluó su efectividad biológica comparándola con otros tratamientos a base de
biorracionales; B1 (B. bassiana), B2 (B. bassiana), Versa® (B. thurringiensis),
Abatec® (S. carpocapsidae) y el insecticida químico Abatec® (piretrinas), aplicados
en una parcela experimental de tomate en el ciclo agrícola (otoño-invierno 2011-
2012), las plantas fueron infestadas artificialmente con larvas neonatas de H.
virescens y las variables evaluadas en campo fueron: mortalidad de larvas, fruto
dañado y rendimiento. Los datos se analizaron con un ANOVA. La DL50 y la TL50
para B1 fue de 2.1 x 106 esporas/ml con un tiempo letal de 3 días y para el
aislamiento B2 1.6 x 106 esporas/ml en 2.7 días. Los mejores tratamientos para el
control de larvas fueron Versa® con 39.66%, Abatec® 32.33% y Capsanem®
23.33% de mortalidad de larvas a las 72 horas; hubo diferencia significativa (p=0.05),
de estos tratamientos respecto a B1 con 6.66% y B2 con 6.33% y estos no fueron
diferentes al control 2.66%. Respecto al porcentaje de fruto dañado no hubo
diferencia entre Versa® 1.8%, para Abatec® 3.2% y Capsanem® con 5.9%, pero no
entre el aislamiento B1 8.5% y Capsanem, así también el tratamiento B2 10.2% y el
control 13.8%. En cuanto al rendimiento, no hubo diferencia entre Versa® con 16.900
t h -1, Abatec® con 16.400 t h -1, Capsanem® con 16.200 t h -1 y B1 con 14.800 t h -1;
pero si hubo diferencia con respecto al tratamiento B2, el cual rindió 13.200 t h -1 y el
control que rindió 11.100 t h -1. Por lo anterior se concluye que los aislamientos
nativos de hongos entomopatógenos tuvieron alta mortalidad en laboratorio y baja
efectividad en el control de H. virescens en el cultivo de tomate a nivel de campo por
lo que se recomienda hacer formulaciones a base de hongos entomopatógenos para
aumentar así la efectividad y la persistencia en campo.
xi
Abstract
In this laboratory study evaluated 10 native isolates of entomopathogenic fungi, three
of M. anisopliae and seven of B. bassiana on larvae of second and third stage of
budworm (Heliothis virescens) from an axenic rearing the two most pathogenic
isolates were B. bassiana with key B1 and B2, by presenting larval mortality
exceeding 55%. With these same isolates trial was carried out to determine the LD50
and LT50. We also evaluated its biological effectiveness compared with other
treatments based biorational; B1 (B. bassiana), B2 (B. bassiana), Versa ® (B.
thurringiensis) Abatec ® (S. carpocapsidae) and the chemical insecticide Abatec ®
(pyrethrins), applied in an experimental plot in tomato crop season (autumn-winter
2011-2012), plants were artificially infested with neonate larvae of H. virescens and
field variables evaluated were mortality of larvae, and damaged fruit yield. Data were
analyzed using ANOVA. The DL50 and TL50 for B1 was 2.1x106 spores/ml with a lethal
time of 3 days and for the isolation B2 1.6x106 spores/ml in 2.7 days. The best
treatments for control of larvae were Versa® with 39.66%, Abatec® 32.33% and
Capsanem® 23.33% mortality of larvae at 72 hours, there was significant difference
(p=0.05), these treatments with respect to B1 6.66 % and B2 with 6.33% and these
were not different to the control 2.66%. Regarding the percentage of damaged fruit
there was no difference between Versa® 1.8% Abatec® to 3.2% and Capsanem®
with 5.9%, but no isolation between 8.5% and Capsanem B1 10.2%, B213.8% and
also treatment and control. With the performance, there was no difference between
Versa® with 16,900 t h -1, with 16,400 t h -1, Abatec®, with 16,200 t h -1 Capsanen®
and B1 with 14,800 t h -1, but there was difference regarding treatment B2, the which
yielded 13,200 t h -1 and 11,100 t h -1 surrendered control. It is confirmed that the
native isolates of entomopathogenic fungi in the laboratory had high mortality and low
effectiveness in controlling H. virescens in tomato crop field level so it is
recommended based formulations and entomopathogenic fungi to increase the
effectiveness and persistence in the field
1
I. INTRODUCCIÓN
El tomate Solanum esculentum (Mill) es atacado durante su crecimiento y
desarrollo fenológico por una diversidad de insectos fitófagos, destacando el
complejo de larvas del orden Lepidoptera, formado por el gusano soldado
Spodoptera exigua (Hübner), gusano del fruto Heliothis zea (Boddie) Heliothis
virescens (Fabricius) y gusano alfiler Keiferia lycopersicella (Walsh) además de otros
de menor importancia (Gastelum et al., 2008). Trumble y Alvarado-Rodríguez (1993)
reportan que en tres Sinaloa, en ausencia del control químico los, daños en frutos de
tomate causados por S. exigua y las especies de Heliothis spp, oscilaron entre 11 y
17% según la región y la fecha de plantación. Estudios realizados por Brewer et al.,
(1990) establecieron que el número de aplicaciones de insecticidas químicos
necesarias para el control de estos Lepidopteros usualmente es de 29 a 40 por ciclo
de cultivo en el estado de California, Estados Unidos.
El gusano del fruto es controlado principalmente mediante insecticidas
convencionales, cuyo uso irracional a través del tiempo ha causado daños en el
medio ambiente, se estima que 5 millones de toneladas de productos químicos son
aplicados anualmente en el mundo. Por otra parte, a pesar de su eficiencia, estos
compuestos carecen de selectividad, por lo que resultan altamente perjudiciales para
la salud humana y los ecosistemas (Hajek y St. Leger, 1994). Además, debido a su
persistencia en el medio ambiente, favorecen la selección de insectos resistentes a
ellos, lo que ha motivado el uso de dosis cada vez mayores o de productos cada vez
más tóxicos (Asaff et al., 2002). Así mismo, el abuso de estos productos trae como
consecuencias la disminución de la fertilidad del suelo, la reducción de la
biodiversidad, la contaminación de aguas subterráneas, ríos y lagos, además de las
consecuencias globales negativas sobre la atmósfera y el clima (García y Medrano,
2006).
Las estrategias de control biológico son congruentes con las exigencias en la
producción agrícola mundial, orientadas a buenas prácticas agrícolas más limpias y
amigables con el medio ambiente, de ahí que el uso de organismos
2
entomopatógenos nativos como B. bassiana y M. anisopliae representa una
alternativa, dentro de una estrategia para el control de esta plaga.
Dentro de esta estrategia de control, los insecticidas biológicos elaborados a
base de hongos entomopatógenos, se consideran como candidatos promisorios,
dado su bajo impacto ambiental además de tener algunas ventajas únicas entre los
entomopatógenos (bacterias, virus y nemátodos entomopatógenos), ya que son
capaces de infectar al hospedero, por contacto y adhesión de las esporas a las
paredes bucales, membranales, intersegmentales o a través de los espiráculos, por
lo que la ingestión del microorganismo es innecesaria para lograr la infección (Hajek
y Leger, 1994). La aplicación por el método inundativo de microorganismos benéficos
específicos contra el insecto plaga, no es dañino a la fauna benéfica; además son
biodegradables e inocuos para el humano, de tal forma que se pueden aplicar con
las aspersores comunes. El uso de hongos entomopatógenos es una alternativa que
además de disminuir los daños antes mencionados, puede favorecer e impulsar la
industria local y/o regional para la elaboración, formulación y distribución de los
bioplaguicidas (García y Medrano., 2006).
En el presente trabajo se evaluó la virulencia de aislamientos nativos de B.
bassiana y M. anisopliae provenientes de suelos agrícolas de Sinaloa, contra el
gusano del fruto H. virescens en el cultivo del tomate; con la finalidad de contribuir a
desarrollar un método de control de esta plaga mas inocuo con el medio ambiente.
3
II. ANTECENTES
2.1. Importancia del tomate
El tomate rojo (jitomate) es una de las hortalizas más importantes del mundo
no solo por la superficie que se destina para este cultivo y la producción obtenida,
sino además por la alta remuneración económica, generación de empleos y
propiedades nutricionales que posee la hortaliza (Figura 1) (Ramírez y Sainz, 2006). En México, durante 2009 se sembraron 53,572.62 hectáreas de tomate, con una
producción de 2,043,814.55 ton; siendo el rendimiento promedio de 39.2 ton/ha. El
tomate se siembra en toda la República Mexicana, aunque la producción se
concentra en cinco estados principalmente: Sinaloa, Jalisco, Michoacán, Baja
California y San Luis Potosí (S.I.A.P-SAGARPA, 2009). Durante el ciclo agrícola
2009-2010, al igual que en el caso del maíz cultivado en Sinaloa se ubicó como el
primer productor nacional de tomate se sembraron 14,907.13 ha, cosechándose
668,302.70 ton que representaron el 32.7% de la producción nacional, con un
rendimiento promedio de 45.02 ton/ha, generando así un ingreso económico de
3,056 millones de pesos.
Figura1. Frutos inmaduros de tomate
4
2.1.2. Origen del tomate
El tomate es una planta perenne, pertenece a la familia solanácea y su centro
de origen se localiza en la región de los Andes integrada por Colombia, Bolivia, Chile
y Perú, donde existe la mayor variabilidad genética y abundancia de especies
silvestres. Sin embargo, México es considerado como el centro de origen más
importante en cuanto a la domesticación del tomate; ya que la utilización de las
formas domésticas en nuestro país es muy antiguo; sus frutos eran bien conocidos y
empleados como alimento para las culturas indígenas que habitaban el centro y sur
de México quienes lo llamaban en su lengua náhuatl “tomatl” (Ramírez y Sainz,
2006).
2.1.3. Taxonomía
El tomate es una planta dicotiledónea perteneciente a la familia de las
solanáceas. Los miembros de esta familia presentan haces bicolaterales y sus flores
son radiales y con cinco estambres. El ovario es súpero y bicarpelar; contiene
numerosos primordios seminales, produciendo bayas polispermas. Los carpelos se
presentan en posición oblicua con respecto al plano mediano de la flor (Nuez, 1995).
Con la domesticación y cultivo es frecuente observar flores con mayor número de
pétalos y sépalos así como ovarios multioculares, en adición al bilocular que se
podría considerar normal. De acuerdo con Spooner et al., (2003), la taxonomía
general aceptada es:
Clase: Dicotyledoneas
Orden: Solanales
Familia: Solanacea
Subfamilia: Solanoideae
Género: Solanum
Especie: Solanum lycopersicum (Mill)
5
2.2. Plagas que afectan el desarrollo vegetativo y la producción del cultivo del tomate
2.2.1. Minador de la hoja Liriomyza spp.
El adulto del minador de la hoja o mosquita minadora, mide alrededor de 2 mm
de Iongitud, tiene el cuerpo rechoncho, de color amarillo y el tórax negro; las alas son
de color transparente y con el sol se aprecian de colores brillantes. Durante el día los
adultos son muy activos, se dedican a ovipositar y alimentarse de las hojas
causando pequeñas perforaciones; insertan los huevecillos en el follaje y al
eclosionar las larvas se empiezan a alimentar del mesófilo, causando pequeñas
galerías; en la medida que la larva se desarrolla, las galerías son de mayor tamaño y
grosor; en ataques severos producen un sinnúmero de galerías en las hojas y es
capaz de defoliar al cultivo.
Está considerado como una plaga secundaria, sin embargo, en algunas
ocasiones la incidencia se incrementa considerablemente, por la eliminación de los
enemigos naturales que en condiciones normales mantienen reguladas sus
poblaciones, debido a la aplicación temprana de insecticidas sintéticos de amplio
espectro. En esta situación, la plaga causa severas defoliaciones que reducen el
área foliar y con ello la actividad fotosintética de las plantas, y finalmente afecta el
rendimiento, a menos que se controle con insecticidas específicos de elevado precio
(Cortez, 2005).
2.2.2. Gusano soldado Spodoptera exigua (Hübner)
Los adultos son palomillas de color café grisáceo, miden alrededor de 1.5 cm
de Iongitud; generalmente durante el día es difícil observarlas, ya que su mayor
actividad ocurre por las noches. Las hembras depositan masas de 50 a 150
huevecillos en el follaje en las hojas de la parte inferior de las plantas y los cubre con
las escamas de su cuerpo; éstos inicialmente son esféricos, de color blanco y en la
medida que pasa el tiempo, se toman de color oscuro, después de tres a cinco días
de ovipositados, dependiendo de las condiciones ambientales, emergen las larvas
que son de color verde claro, con la cabeza oscura (Cortez, 2005).
6
En los últimos ciclos agrícolas, el gusano soldado ha alcanzado el estatus de
plaga principal en diferentes cultivos; esto se debe a que se presenta en poblaciones
elevadas y ocasiona defoliaciones que originan reducción en los rendimientos al no
llevar a cabo normalmente el proceso fotosintético la planta; además, este insecto es
difícil de controlar, y se encuentra durante gran parte del ciclo vegetativo del cultivo.
El cambio del gusano soldado a plaga principal seguramente se debe al repetido
empleo de plaguicidas en los cultivos en los que se presenta, posiblemente por la
selección de poblaciones resistentes a los insecticidas que se utilizan para su control
(Cortez, 2005).
2.2.3. Mosquita blanca Bemisia tabaci (Genadius) Biotipo “B”
La mosquita blanca se presenta en altas poblaciones, ocasiona un daño
severo al cultivo al alimentarse de la savia de las plantas, pero es más importante su
papel como vector de virus, pues afecta fuertemente al cultivo causando siniestros
parciales o totales. Para aspirar a tener un manejo satisfactorio de la mosquita
blanca de la hoja plateada (MBHP) es necesario realizarlo de manera integrada, ya
que ninguna práctica por sí sola es efectiva para controlarla (Cortez, 2005).
2.2.4. Gusano alfiler Keiferia lycopersicella (Walsingham)
La hembra oviposita en el haz y envés de las hojas, tallos y frutos. Si al
emerger la larva, el cultivo no tiene frutos, actúa como minador de la hoja durante los
dos primeros estadios, en el tercero sale de la mina y une los bordes de la hoja lo
que se conoce como hoja de empanada. Cuando hay frutos, los penetra en el
pedúnculo alimentándose en el interior de éste el resto de los estadíos. Si el
huevecillo se depositó en el fruto, no actúa como minador (Cortez, 2005).
2.2.5. Gusano del fruto Heliothis virescens (Fabricius)
Es una especie polifaga que se desarrolla continuamente en varios cultivos
hospederos como algodon Gossypium hirsutum (L), garbanzo Cicer arietinum (L)
tabaco Nicotiana tabacum (L) y tomate Solanum sculentum (Mill) (Figura 2); su
amplia adaptacion a diferentes cultivos le permite permanecer en el campo aún
7
cuando las fuentes de alimento sean mínimas. Tiene una amplia capacidad de
movimiento a diferentes escalas, lo que le permite adaptarse al cambio espacial y
temporal de sus hospederos; otras características que contribuyen al éxito de esta
plaga insectil son su alta fecundidad y su corto periodo generacional (Fitt., 1989). El
gusano del fruto es una de las plagas principales del tomate, ya que daña
directamente el producto a cosechar y frecuentemente rebasa el umbral económico.
Figura 2. Larva de H. virescens perforando un fruto de tomate
2.2.5.1. Origen y distribución
Es una especie distribuida por todo el este y suroeste de los Estados Unidos
incluyendo California. En general, resiste el invierno con éxito sólo en el sur de
Estados Unidos ocasionalmente sobrevive en climas fríos en invernaderos y otros
lugares protegidos. El gusano del fruto se dispersa hacia el norte cada año y se
puede encontrar en Nueva Inglaterra, Nueva York, y el sur de Canadá durante el
verano. También tiene una amplia distribución en el Caribe, y de forma esporádica en
América Central y América del Sur (Capinera, 2001). En nuestro país se encuentra
distribuido en todas las zonas productoras de tomate del Noroeste (Bautista, 2006).
8
2.2.5.2. Taxonomia
Capinera (2000) describe la siguiente clasificacion:
Clase: Insecta
Orden: Lepidoptera
Familia: Noctuidae
Genero: Heliothis
Especie: Heliothis virescens (Fabricius)
2.2.5.3. Biología y Hábitos
Los adultos de H. virescens, son de color crema, con tres bandas oblicuas de
color café verdoso en las alas superiores (Figura 3). Durante el periodo reproductivo
las hembras pueden poner de 300 a 500 huevecillos, depositados en forma individual
cerca de las terminales fructificativas: botones florales, flores y frutos, los cuales se
pueden ver a simple vista; son esféricos, de un diámetro aproximado de 0.6 mm, con
10 a 15 estrías ubicadas de la base al tope o parte apical del huevecillo; recién
ovipuestos son de color blanco-hialino, posteriormente se tornan color crema y
finalmente café oscuro y eclosionan a los dos o cinco días (Bernhardt y Phillips,1985;
Fye y McAda,1972).
Las larvas presentan una coloración verde claro, con bandas longitudinales de
color variable, que va del color crema al café oscuro y diversas hileras de colores a lo
largo del dorso, así como numerosas espínulas en grandes porciones del cuerpo.
Las larvas se desarrollan por espacio de dos a tres semanas a través de cinco o seis
instares larvales y llegan a medir 30.6 mm de largo. Durante los primeros estadìos
larvarios se les encuentra en el follaje, posteriormente pasan a las fructificaciones,
ocasionándoles una perforación irregular por donde penetra para alimentarse; una
característica importante que se debe considerar es que una larva se puede
alimentar de varios frutos, ya que durante un periodo corto de tiempo permanece en
9
un fruto, ocasionándole mordeduras, luego lo abandona y se desplaza a otra
originado un daño similar y así continua, dañando varios frutos (Capinera, 2001).
Al finalizar su desarrollo la larva se deja caer al suelo donde buscan una grieta
para pupar aunque algunas pupan en la superficie (Figura 3), ésta es de color café y
mide 18.2 mm de largo y 4.7 de ancho el adulto emerge dependiendo de las
temperaturas presentes en el ambiente tarda 22 días a una temperatura de 20 oC,
13 días a una temperatura de 25 oC y 11.2 días a una temperatura de 30 oC
(Henneberry, 1994). En Sinaloa el periodo de siembra del cultivo de tomate es del 1
de septiembre al 31 Diciembre. Las siembras tardías a partir de noviembre son más
susceptibles al daño provocado por H. virescens debido al aumento en las
temperaturas por las cuales incrementan las generaciones de esta plaga (SIAP-
SAGARPA, 2010).
Figura 3. A) Pupa de H. virescens en el suelo B) Adulto de H. virescens en planta de
tomate
A
B A
10
2.3. Presencia de H. virescens en el cultivo de tomate
2.3.1. Monitoreo
De manera preventiva se recomienda monitorear las poblaciones de adultos a
partir de la última semana de Febrero, inspeccionar la presencia de huevecillos en el
cultivo de tomate para prevenir una alta incidencia del insecto. Para el monitoreo de
adultos es posible recurrir a trampas con feromonas, sin embargo, puede no ser
viable por el costo de las mismas y debido a que poblaciones de adultos de lotes
vecinos son atraídos al cultivo de interés y no todas las palomillas pueden ser
capturadas en las trampas. En estudios realizados se ha observado que las primeras
poblaciones del gusano del fruto pueden encontrarse en el cultivo a partir del mes de
enero, pero se incrementa durante el mes de marzo, alrededor de la segunda
semana. Durante enero y febrero las temperaturas frías y los enemigos naturales
mantienen a la población baja (Cortez, 2005).
2.3.2. Muestreo
Se recomienda realizar un muestreo en ocho a diez sitios del terreno,
distribuidos regularmente en diez hectáreas del cultivo, inspeccionando tres o más
plantas completas en cada sitio. En la inspección de huevecillos es importante
diferenciar aquellos que estén parasitados por tricograma Trichogramma sp.
(Hymenoptera: Trichogramatidae) y considerar la proporción de sanos contra
parasitados, con el fin de tener una idea de la magnitud de la siguiente generación de
larvas. Los huevecillos parasitados se tornan de color negro, mientras que los viables
adquieren una coloración oscura cerca de la eclosión. Una forma práctica de
determinar el porcentaje de parasitismo es recolectar huevecillos y confinarlos en
cápsulas de gelatina y esperar a que emerja la larva de la plaga alrededor de tres
días o la avispita tricograma después de cinco días (Cortez, 2005).
11
2.4. Estrategias de control de H. virescens 2.4.1. Control cultural
Considerando la población de la plaga a través de la temporada del cultivo, la
práctica más importante y efectiva para su control es el establecimiento de éste en la
fecha de siembra recomendada. En la región, las siembras anteriores al mes de
noviembre tienen menor posibilidad de tener la presencia de las plagas primarias,
aunque siembras muy tempranas pueden ser infestadas con gusano soldado y
minador de la hoja. Es importante también no establecer el cultivo de tomate aledaño
a otros cultivos hospederos de la misma plaga, de mayor tiempo de desarrollo,
próximos a la madurez fisiológica (Cortez, 2005).
2.4.2. Control químico
La aspersión de insecticidas se sugiere cuando se encuentren varios
huevecillos viables por planta y/o las primeras larvas dañando frutos. Entre los
insecticidas sintéticos se pueden emplear, diflubenzuron (Dimilín®), clorpirifos
(Lorsban®), cyalotrina (Karate®), metomil (Lanate®), clorfenapyr (Sunfire®),
benzoato de ememectina (Proclaim®) y metamidofos (Tamaron®), entre otros, a la
dosis indicada en la etiqueta. El gusano del fruto posee un complejo enzimático más
variado y abundante que el del gusano elotero, por lo que es más difícil de controlar
con insecticidas, sobre todo selecciona muy rápido poblaciones resistentes a
insecticidas piretroides, por lo que una medida general recomendada es no emplear
insecticidas de este grupo hasta después de la mitad de desarrollo del cultivo y de
preferencia en una sola ocasión (Cortez, 2005).
2.4.3. Control biológico
La actividad de los enemigos naturales depredadores y parasitoides se ve
favorecida cuando no se realizan aplicaciones de insecticidas convencionales, pero
con la aplicación de éstos, los primeros insectos en ser exterminados son los
benéficos, ya que son generalmente más susceptibles a los plaguicidas. Las
12
primeras generaciones de gusano del fruto, son controladas de manera natural por
los insectos benéficos, pero con la primera aspersión de insecticidas se elimina el
control biológico natural, aunque el control del gusano sea defectuoso y en ocasiones
se requiere realizar nuevas aplicaciones, ya que la plaga queda libre de los insectos
entomófagos, que se alimentan de ella. En éste caso sería muy oportuno utilizar
alguno de los insecticidas biorracionales mencionados (Bacillus thuringiensis o
Baculovirus), ya que no afectan directamente a la fauna benéfica, puesto que tienen
que ser ingeridos para entrar en acción. En laboratorios de reproducción masiva de
organismos benéficos de la región se ofrece a la venta la avispa tricograma
Trichogramma pretiosum (Riley) y crisopa Chrysoperla carnea (Stephens)
parasitoide y depredador de la plaga respectivamente. El empleo adecuado de estas
alternativas de control biológico (en la época y el momento oportuno, cantidad y
forma de liberación requerida), pueden ser suficientes para el control efectivo del
gusano del fruto, sobre todo si el cultivo se establece en el periodo de siembra
recomendado. Las liberaciones de tricograma y crisopa se recomiendan a partir de la
última semana de febrero cuando se observen las primeras oviposturas de la plaga;
antes de la mitad de febrero los insectos benéficos no prosperan adecuadamente,
por las temperaturas bajas que predominan en la región y falta de insectos blanco.
Se sugiere liberar alrededor de 20 pulgadas cuadradas/ha de tricograma al inicio e
incrementarlas hasta 30 o más de acuerdo con el desarrollo del cultivo y la
abundancia de la plaga, de preferencia, en dos ocasiones por semana; en el caso de
crisopa se recomienda liberar alrededor de 10 mil huevecillos por hectárea
(Cortez,2005).
2.5. Los bioplaguicidas
El combate de insectos plagas de importancia agrícola ha sido una
preocupación del hombre desde tiempos remotos. Muchas sustancias de diversos
orígenes (químico, vegetal y animal) fueron empleadas para combatirlos. Los chinos
(2,700 A.C.) ya conocían enfermedades en el gusano de seda y en las abejas, y los
sumerios (2,500 A.C.) utilizaban el azufre para controlar algunas plagas de insectos.
Posteriormente, los egipcios (1,200 A.C.) empezaron a utilizar cicuta Conium
13
maculatum (L) y acónito Aconitum napellus (L) plantas bien conocidas por sus
propiedades venenosas para el control de algunas plagas.
Para el año 70 A.C. Plinio el grande recomendó el uso de arsénico para matar
insectos, pero fue en realidad hasta el siglo XVI cuando los chinos usaron este
elemento además de sulfuro para el mismo propósito (García y Medrano, 2006). En
el siglo XVIII Réamur (1726) había identificado el hongo Cordyceps atacando a un
lepidóptero. Pero no fue sino hasta los siglos XIX y XX que los hongos fueron
utilizados preponderantemente para el control de plagas en los primeros trabajos en
el control microbiano. Esto se vio claramente reflejado cuando en 1835 Agostino
Bassi comprobó que el hongo B. bassiana era el causante de la muscardina blanca
en el gusano de seda (Alves, 1998).
En 1873 Le Conte hizo la primera propuesta formal para hacer uso del control
microbiano de insectos y cinco años más tarde Metchnikoff, aplicó por primera vez el
hongo M. anisopliae para controlar larvas de Anisopliae austriaca y a partir de este
hallazgo de 1879 a 1884 Metchnikoff junto con Krassilstschik experimentaron con el
hongo M. anisopliae y establecieron la primera planta operacional de producción para
un agente de control microbiano para aplicarlo a un curculiónido en betabel cultivado
en Ucrania (Lord, 2005).
Después de la segunda guerra mundial, los insecticidas químicos así como
algunos otros agroquímicos formaron parte de la llamada “Revolución Verde” y
ofrecieron grandes ventajas junto con los fertilizantes químicos, la mecanización y el
uso de variedades altamente productoras. Esto dio como resultado una disminución
considerable en las poblaciones de una gran variedad de insectos plaga. El uso de
estos compuestos se hizo muy popular, debido a la larga acción residual y al amplio
aspecto de toxicidad que presentaban.
No obstante, la era de los verdaderos insecticidas químicos sintéticos empezó
a partir de 1940 con el descubrimiento de los insecticidas organoclorados y
organofosforados y a finales de esta misma década los Estados Unidos se había
hecho altamente dependiente del uso de los insecticidas químicos, como el DDT
14
(Dicloro-Difenil-Tricloroetano) los cuales eran aplicados durante toda la temporada
de cultivo para combatir a los insectos en toda su fase de desarrollo (García y
Medrano, 2006).
El uso indiscriminado de estos compuestos causó a principios de la década de
1950, el resurgimiento de las plagas debido a la eliminación de sus enemigos
naturales, la aparición de organismos previamente inocuos que se transformaron en
plagas primarias, la resistencia debido a la difícil eliminación aun cuando se aplicaran
químicos en dosis muy altas, y los riesgos causados por la presencia de residuos
químicos sintéticos en productos comestibles, agua y aire; lo que trajo como
consecuencias serios problemas ambientales.
Estos hechos condujeron a enfocar la atención hacia el uso y la aplicación de
los agentes de control biológico, entre los que se incluyen enemigos naturales tales
como depredadores, parasitoides y patógenos (Margalith y Ben, 2000).
2.6. Organismos entomopatógenos
Los bioinsecticidas son productos que contienen este tipo de organismos
entomopatógenos, como ingrediente activo, o bien metabolitos del microorganismo
que se extraen mediante procedimientos que no alteran su composición química.
Estos pueden estar constituidos por toda o una parte de la sustancia extraída,
concentrada o no, en combinación o no a sustancias coadyuvantes (De Liñán, 2001).
2.6.1. Virus
Entre las familias de virus que atacan insectos se encuentran: Baculoviridae,
Reoviridae, Iridoviridae y Polydnaviridae, aunque las más utilizadas son las primeras
tres (Faulkner y Boucias, 1985). La utilización de virus entomopatógenos, puede dar
resultados a corto y largo plazo en diferentes cultivos y entre los casos exitosos se
tiene el control de los nóctuidos: gusano falso medidor Trichoplusia ni (Hübner),
gusano elotero del maíz Heliothis zea (Boddie), por mencionar algunos.
Los virus necesitan ser ingeridos por el insecto para causar la enfermedad y la
muerte posterior. Los síntomas de la enfermedad en los insectos incluyen: pérdida de
15
apetito, lentitud en el movimiento, flacidez corporal, ablandamiento del integumento y
un cambio de color hacia el marrón o negro. Además los insectos adoptan un
comportamiento geotrópico negativo y cuando llegan al extremo de la planta,
adoptan una posición colgante quedando con la cabeza hacia abajo y permanecen
sujetas por las patas posteriores (Wightman, 1991).
2.6.2. Bacterias
Las bacterias son organismos cuya actividad varía desde el saprofitismo,
comensalismo, simbiosis hasta la patogénesis. Algunas especies son capaces de
ocasionar graves enfermedades en larvas de insectos plaga. Su modo de acción
provoca que las larvas se vuelvan lentas, dejan de crecer y expulsan una sustancia
liquida por la boca y el ano; al morir se vuelven obscuras y negras presentan un
cuerpo blando, con los tejidos internos transformados en una masa viscosa
contenida dentro de la piel (Gladstone et al., 2003). La bacteria Bacillus thuringiensis
es un miembro del género Bacillus, un diverso grupo de bacterias aeróbicas,
grampositivas, formadoras de espora, que contiene más de veinte especies que
difieren en sus propiedades biológicas básicas. Además de Bt, otros miembros
importantes de este grupo son B. subtilis, una fuente de enzimas industriales; así
como B. cereus y B. anthracis, agentes causales de intoxicaciones de alimentarias y
ántrax respectivamente (Smith y Couche, 1991). Actualmente en todo el mundo es
amplia la utilización de la bacteria B.turhingiensis para el control de insectos plaga.
Esta bacteria durante la esporulación, produce cristales en forma de diamante que
contienen una toxina llamada delta-endotoxina, la cual paraliza el intestino de las
larvas de especies lepidópteros. Las larvas susceptibles después de consumir cierta
cantidad del ingrediente activo mueren. Esta bacteria puede infectar insectos de
diversos órdenes, que incluyen a los coleópteros, dípteros, himenópteros, ortópteros
y lepidópteros (Heimpel, 1967; Vergara, 2004).
16
2.6.3. Nemátodos
Una de las alternativas de manejo de plagas más amigable con el medio
ambiente, lo constituyen los nemátodos entomopatógenos, organismos han cobrado
gran importancia en la última década, por su facilidad para ser aplicados tanto en
suelo como en plantas y su relativa facilidad para ser multiplicados en forma masiva
Los nemátodos entomopatógenos conocidos que tienen potencial para su uso en el
control biológico se encuentran en cuatro órdenes de importancia: Rhabditida,
Mermitida, Tylenchida y Aphelenchida (Smart y Nguyen, 1994). Dentro del orden
Rabditida se encuentran la mayoría de los nemátodos de vida libre, que incluyen a
las familias Steinermatidae y Heterorhabditidae, parásitos facultativos de insectos
(Tanada y Kaya, 1993). Los nemátodos pueden penetrar por los espiráculos, boca y
ano o a través de partes suaves del integumento, luego de atravesar las paredes
internas y pasar al hemocele, el nemátodo comienza a liberar la bacterias de los
géneros (Xhenorhabdus y Photorhabdus), la cuales son capaces de matar insectos
en 48 horas convirtiendo los cadáveres en un hábitat propicio para el crecimiento y
reproducción del nemátodo (Smart, 1995).
2.6.4. Hongos entomopatógenos
2.6.4.1. Mecanismos de acción de los hongos entomopatógenos
Los hongos penetran a través de la cutícula, la cual está compuesta
principalmente de proteínas, quitina, lípidos y compuestos fenólicos, los cuales
funcionan como una barrera contra la invasión de microorganismos y medio
ambiente (Hegedus y Khachatourians, 1995).
El proceso se inicia cuando la espora se adhiere a la cutícula del insecto,
luego se desarrolla un tubo germinativo y un apresorio, con éste se fija en la cutícula
y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se da la penetración al
interior del cuerpo del insecto. La germinación ocurre aproximadamente a las 12
horas post-inoculación y la formación de apresorios se presenta de 12 a 18 horas
post-inoculación.
17
En la penetración participa un mecanismo físico y uno químico, el primero
consiste en la presión ejercida por la estructura de penetración (apresorio), la cual
rompe las áreas esclerosadas y membranosas de la cutícula. El mecanismo químico
consiste en la acción enzimática, principalmente, lipasas, proteasas y quitinasas, las
cuales causan descomposición del tejido en la zona de penetración, lo que facilita el
ingreso del hongo.
Los propágulos germinativos de los hongos, están continuamente en
movimiento a través de diferentes partes durante la penetración cuticular, éstos
responden a cambios por estímulo de los procesos bioquímicos hasta originar una
diferenciación celular y formar estructuras morfológicas específicas (Hajek y Leger,
1994). Las interacciones hidrofóbicas, la producción de mucosidad y apresorios por
el hongo influyen en la adhesión del hongo a la cutícula del insecto (Bidochka et al.,
1997).
Los tubos germinativos (apresorios) detectan constantemente su medio y se
adaptan para colonizar el tejido del insecto y contrarrestar el potencial de respuestas
del hospedero, estas estructuras infecciosas probablemente evolucionaron como un
mecanismo con el cual el patógeno supera las barreras del hospedero (Hajek y
Leger, 1994). Durante la infección, la epicutícula es la primer barrera en cruzar
(Leger et al., 1988), la penetración de ésta puede realizarse por infección a través de
ganchos producidos por apresorios, o por la entrada directa de los tubos
germinativos, las hifas que penetran en la procutícula (Leger, 1993). Una vez que la
epicutícula es perforada, el inicio de la penetración a través de la cutícula puede ser
vía directa por hifas o estructuras que se pueden extender lateralmente, esta
expansión lateral puede causar fracturas que favorecen el proceso y facilitan la
dispersión de las enzimas fúngicas degradadoras de la cutícula (Hajek y Leger,
1994).
Después de la penetración, la hifa se ensancha y ramifica dentro del tejido del
insecto, colonizando completamente la cavidad del cuerpo del insecto, esto sucede
en 3 ó 4 días después de la inoculación. Al invadir el hemocele, el hongo prolifera, y
el micelio de los tubos germinativos libera blastosporas (Hegedus y Khachatourians,
18
1995). Las blastosporas se desarrollan para su dispersión a través del hemocele
(Leger, 1993). Éstas usualmente germinan a las 48 h después de la infección
(Todorova et al., 1994). El hongo prolifera dentro del cuerpo del hospedero,
frecuentemente como un estado de vida que no sobrevive naturalmente fuera del
hospedero (Hajek y Leger, 1994). El insecto infectado muere debido a la reducción
drástica de su hemolinfa, nutrientes y la toxemia causada por los metabolitos tóxicos
del hongo (Feng et al., 1994), o bien, por la combinación de éstos con el daño
mecánico producido por el crecimiento del hongo (Hajek y Leger, 1994; Bidochka et
al., 1997). En ocasiones el cuerpo graso puede ser infectado inmediatamente
después de la penetración a la cutícula, mientras que otros tejidos y órganos
permanecen intactos por más de una semana, o son colonizados hasta después de
la muerte (Hegedus y Khachatourians, 1995).
Bajo condiciones húmedas, uno o dos días después de que el hospedero
muere, el hongo emerge y produce una capa de conidios en la superficie del cadáver
(Feng et al., 1994; Goettel et al., 1995). A partir de la muerte del insecto se forman
pequeñas colonias y estructuras del hongo, lo que corresponde a la fase final de la
enfermedad la cual ocurre 4 ó 5 días después de la inoculación.
La patogenicidad, virulencia y agresividad son conceptos comunes en el
lenguaje técnico propuesto para los hongos entomopatógenos, la patogenicidad es
definida como la capacidad de un microorganismo para causar enfermedad, la
virulencia es la intensidad con que un organismo mata a un hospedero específico y
agresividad como la habilidad de un patógeno para invadir a su hospedero (Carrillo y
Blanco, 2009). La importancia de estos mecanismos varía con el aislado específico
del hongo o el hospedero (Hajek y Leger, 1994).
En el transcurso de los años, el humano ha encontrado en los
microorganismos una fuente de insecticidas altamente selectivos, eficientes y
amigables con el medio ambiente, de los microorganismos más estudiados se sabe
que los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae producen una serie de
toxinas, como subtilisinas PR1H, serina proteasas y tripsina; las cuales son
eficientes en el control biológico de insectos plaga (García y Medrano, 2006).
19
2.6.4.2. Características morfológicas de M. anisopliae
El hongo, a los 15 días de desarrollo, presenta un micelio de aspecto
algodonoso de color verde oliva (Figura 3), La colonia es completamente redonda, de
color oliváceo, de color amarillento-verdoso a marrón oscuro, dependiendo de la
cepa (Ames y Cañedo, 2004). Éste hongo produce la enfermedad conocida como
“muscardina verde”. Es capaz de infectar más de 300 especies de insectos
pertenecientes a los órdenes Coleóptera, Ortóptera, Hemíptera, Díptera y
Lepidóptera (Leger et al., 1992). Los conidios son producidos en cadenas cortas o
cabezas mucilaginosas diferentemente arregladas; los conidios son cilíndricos u
ovales. Miden 3.5 a 9 μm de longitud por 1.5 a 3.5 μm de diámetro. Los conidióforos
nacen del micelio y están irregularmente ramificados con dos a tres ramas en cada
septa. Miden 14 μm de longitud y 2.5 μm de diámetro.
Figura 4. Cultivo de M. anisopliae en medio PDA
20
2.6.4.3. Taxonomía
Clase: Sordariomycetes
Orden: Hypocreales
Familia: Clavicipitaceae
Género: Metarhizium
Especie: Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin
2.6.4.4. Importancia en el control de insectos plagas
Por el rápido desarrollo de estrategias de control biológico en los últimos
años, éste hongo ha adquirido gran importancia económica en el país, debido a que
su reproducción y comercialización es eficaz, de igual manera que otro hongos
entomopatógenos como B. Bassiana, I. fumosoroseae, y bacterias del genero
Bacillus. En el cuadro 1 se muestran algunos formulados de M. anisopliae que se
encuentran en el mercado.
Cuadro 1. Formulaciones comerciales de M.anisopliae producidos y Comercializados en México (Tamez – Guerra et al., 2001).
Producto Insectos que controla Compañía productora
Bio-blast Termitas y cucarachas Eco-Sience
Meta-sin Plagas caseras Agrobionsa
Fitosan-M Gallina ciega y chapulines CESAVEG
Fuente: CESAVEG: Comité Estatal de Sanidad Vegetal del estado de Guanajuato
2.6.4.5. Características morfológicas de B. bassiana
El hongo, a los 15 días de desarrollo forma un micelio de aspecto algodonoso
de color blanco (Figura 5). A medida que va pasando el tiempo se vuelve amarillento.
El revés es de color rojizo al centro y amarillento en la periferia, este hongo produce
una enfermedad conocida como “muscardina blanca” debido a que los insectos
21
presentan una morfología característica algodonosa en su cuerpo. El micelio se
ramifica formando conidióforos simples e irregulares que terminan en vértices en
formas de racimo, el conidióforo es abultado en su base, surgiendo un
adelgazamiento en el área donde se insertan los conidios los cuales son globosos de
3 μm de largo y 2 μm de ancho (Ames y Cañedo, 2004).
Figura 5. Cultivo de B. bassiana en medio PDA
2.6.4.6 Taxonomía
Clase: Sordadimycetes
Orden: Hypocreales
Familia: Cordypcipitaceae
Género: Beauveria
Especie: Beauveria bassiana (Vuillemin).
2.6.4.7 Importancia en el control de insectos plaga
Este hongo ha cobrado una gran importancia económica en nuestro país,
gracias a su reproducción masiva destinada a la comercialización. La producción de
B. bassiana se realiza en los estados de Colima, Oaxaca, Guanajuato y Sinaloa; se
destina al control de plagas de hortalizas, gramíneas y leguminosas (Tamez-Guerra
22
et al., 2001). En el Cuadro 2 se muestran algunos formulados de B. bassiana que se
encuentran en el mercado.
Cuadro 2. Formulaciones comerciales de B. bassiana producidas y comercializadas
en México (Tamez-Guerra et al., 2001).
Producto Insectos que controla Compañía productora
Bea-Sin Plagas de cultivos Agrobionsa, Culiacán ,Sin
Botani-gard Plagas de invernaderos Mycotech, México, DF
Mycontrol Plagas de cultivos Mycotech
B. bassiana Broca del café, Mosca blanca, Chapulines CNRCB2 Tecomán, Colima
Bio-Fung Chapulín en frijol y Maíz CESAVEG3,Irapuato, Guanajuato
CNRCB. Centro Nacional de Referencia en Control Biológico CESAVEG. Comité Estatal de Sanidad Vegetal del estado de Guanajuato.
2.7. Técnicas que apoyan el control biológico de plagas
2.7.1. Importancia de la cría de insectos
Los problemas de índole entomológica que han sido importantes para la
humanidad, han dado pauta al establecimiento de crías de insectos, básicamente
para realizar estudios de control y transmisión de enfermedades. Actualmente la
finalidad de criar insectos está dividida en cuatro grupos:
1) Cría para uso industrial (uso de derivados de insectos)
2) Cría para consumo humano y animal
3) Cría para el control de insectos dañinos (cría masiva o a grande escala)
4) Cría para la investigación y enseñanza (cría en laboratorio o en pequeña escala)
En estos últimos dos grupos se encuentra la mayor diversidad de insectos que
se han criado debido a la importancia que ello implica para las ciencias agrícolas,
medica y veterinaria. Entre los principales objetivos de la crianza de insectos están
23
los de proporcionar material biológico sano en cantidad y calidad para la enseñanza,
evaluación de sustancias toxicas en campo y laboratorio (pruebas de efectividad y
susceptibilidad), evaluación de atrayentes y repelentes, selección de plantas
resistentes a insectos, cultivo de microorganismos, transmisión de patógenos a
plantas y animales, liberación de parasitoides y depredadores de insectos, liberación
de insectos estériles, estudios genéticos, biológicos, y de comportamiento entre otros
(Bautista et al., 2004)
Sin duda alguna la cría de insectos ha proporcionado grandes beneficios a la
humanidad, ya que han podido proporcionar alivio ante el eminente peligro de los
insectos hematófagos, han incrementado la producción de alimentos mediante el
control de insectos plaga (con insecticidas seleccionados mediante bioensayos,
feromonas, liberación de parasitoides y depredadores, insectos estériles, etc.),
también han proporcionado conocimientos de aspectos genéticos y fisiológicos, entre
otros beneficios (Bautista et al., 2004).
El conocimiento para establecer crías de insectos es una necesidad actual,
por tanto muchas instituciones y empresas privadas, así como programas del
gobierno realizan estudios para criar insectos como una manera de combatir las
plagas (Bautista et al., 2004).
2.7.2. Cría de noctuidos
La familia Noctuidae se caracteriza por tener especies de hábitos
crepusculares, es decir al caer el sol los adultos de salen a realizar sus actividades
como: alimentación, cópula y oviposición, al volver la mañana estos se esconden en
pequeños agujeros en la tierra o en el envés de las hojas protegiéndose de
depredadores y de los rayos solares. Para realizar la cría se colectan los adultos y
son colocados en el interior de las jaulas para la copula y la ovoposición. La hembra
oviposita sobre un papel en el interior de las jaulas. El papel con los huevos es
retirado y sustituido diariamente. Los huevos son desprendidos del papel,
esterilizados, lavados y luego mediante un pincel son colocados en discos de papel
filtro o papel ligeramente humedecido. Cuando éstos se secan, se transfieren a la
24
parte interior de la tapa del vaso de plástico, el cual contiene dieta artificial para las
larvas, donde se desarrollan hasta el tercer instar (Rizo, 2001). El 5% de esta
producción se transfiere a vasos individuales para mantener el pie de cría de cada
una de las especies. El pie de cría es revisado tres veces por semana para sacar las
pupas, las cuales son colocadas en cajas plásticas, donde permanecen hasta la
emergencia del adulto. Los adultos nuevos se trasladan cada día a jaulas de
oviposición para repetir el ciclo (Rizo, 2001).
2.8. Producción masiva de hongos entomopatógenos en medio líquido
La fermentación en cultivo líquido es el método ms económico para la
producción de esporas. Los factores del medio (temperatura, aireación y el pH), son
más fáciles de controlar que en sustratos sólidos. Este tipo de cultivo permite
mantener un medio nutricional homogéneo fácil de ser monitoreado, simplificando la
producción y recolección del producto (García y Medrano, 2006).
La producción de esporas de hongos entomopatógenos en medio líquido es
un proceso biotecnológico conveniente desde el punto de vista de eficiencia y
rentabilidad si se compara con la producción de esporas en sustrato solido o
fermentación difásica ya que en los procesos líquidos los nutrientes se encuentran
en solución. La producción de cuerpos hifales: esporas, micelio y conidios, con miras
a su utilización en gran escala y comercialización como agentes infectivos, para
hacer más competitivos a los hongos entomopatógenos se han desarrollado técnicas
de producción sumergidas en medios líquidos que implica el uso de fermentadores.
La producción masiva de hongos se puede llevar a cabo empleando diferentes
medios de cultivo, elaborado a base de sales minerales, como fuente de carbono se
utiliza melaza de caña de azúcar o etanol y como fuente de nitrógeno sulfato de
amonio. Se ajusta el medio a un valor de 5.4 pH óptimo para el adecuado desarrollo
de los hongos, para lo cual se utiliza NaOH y H2SO4 al 0.1 (Segovia, 1999).
25
III. JUSTIFICACIÓN
El tomate es el cultivo hortícola más importante del estado de Sinaloa ocupa
el primer lugar nacional con una producción de 668 mil toneladas con un promedio
por hectárea de 45 ton/ha, generando un valor en producción de 3056 millones de
pesos, sin embargo esta producción se ve mermada por fitopatogenos y plagas
defoliadoras dentro de las que destaca H.virescens, causando un daño directo al
fruto, mermando así la calidad y la cantidad de tomate comerciales.
Esta plaga se controla principalmente con insecticidas químicos sin embargo
las exigencias de los mercados internacionales a ofertar productos libres de
pesticidas a los consumidores, han venido cambiando paulatinamente el control
químico de plagas por una estrategia de manejo más inocua al consumidor libre de
residuos químicos.
Dentro de esta estrategia el uso de insecticidas a base de hongos
entomopatógenos nativos es una herramienta así como, la implementación de este
tipo de productos por parte de los productores hortícolas, dando con esto una opción
más de mercado y mercado libre de pesticidas, que favorecen a obtener un mejor
precio del tomate con menor impacto ambiental así como un mejor precio de sus
productos ya sea en el mercado nacional o internacional. También se pretende con
este tipo de estudios contribuir en un MIP (Manejo Integrado de Plagas), que
reduzca la aplicación de insecticidas sintéticos.
El modo de acción de los hongos entomopatógenos brinda ventajas al tener un
efecto más rápido en comparación con otros entomopatógenos ya que estos no
necesariamente tienen que ser ingeridos para actuar como la bacteria B.
thuringiensis o los virus que atacan insectos del orden Lepidoptera, ya que las
esporas al entrar en contacto con la cutícula del insecto empiezan a germinar sobre
el insecto causando cambios en el comportamiento del insecto como falta de
movimiento, inanición y muerte.
26
IV. HIPÓTESIS
La aplicación de los bioinsecticidas líquidos a base de aislamientos nativos de
B. bassiana y M. anisopliae son efectivos para el control de gusano del fruto H.
virescens en el cultivo de tomate en condiciones de campo en Sinaloa.
V. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
• Evaluar la actividad biológica de aislamientos nativos de B. Bassiana y M.
anisopliae contra el gusano del fruto H. virescens en el cultivo de tomate.
5.2 Objetivos específicos
• Establecer y determinar el ciclo de vida de gusano del fruto H. virescens en
condiciones de laboratorio.
• Seleccionar aislamientos patogénicos de B. bassiana y M. anisopliae contra H.
virescens en primer y segundo estadio larval en condiciones de laboratorio.
• Determinar la Dosis Letal Media (DL50) y el Tiempo Letal Medio (TL50) de los
aislamientos más virulentos B. bassiana y M. anisopliae en larvas de primer y
segundo estadío de H. virescens.
• Evaluar la efectividad de los dos aislamientos más virulentos seleccionados y
compararlos con biorracionales Versa®, Capsanem® y un insecticida químico
de origen natural Abatec® para el control de H. virescens en condiciones de
campo.
27
VI. METODOLOGÍA
6.1. Colecta de larvas de H. virescens en campo
Para comenzar la cría de gusano del fruto fue necesario muestrear lotes de
tomate y de garbanzo que son cultivos hospederos de esta plaga. El muestreo se
realizo en el Campo Experimental del Valle del Fuerte (CEVAF-INIFAP) el mes de
marzo en el ciclo agrícola Primavera-Verano en el 2011. Se colectaron 100 larvas de
cuarto y quinto estadío larval, las cuales sirvieron como pie de cría; las larvas fueron
colectadas directamente del cultivo de frutos de tomate infestados, colocándolos
individualmente en recipientes de plástico (del No.1) transparentes con tapadera
para ser trasladados al laboratorio.
Figura 6. Colecta de H. virescens en el cultivo de tomate.
6.2. Establecimiento de la cría de H. virescens Para la alimentación de las larvas se utilizó una dieta meridica una mezcla de
ingredientes naturales y artificiales, a base de harinas, vitaminas, minerales, un
agente fungistático y medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar (PDA), que se utiliza para
dar consistencia (Hernández et al., 1989). Se mantuvieron condiciones ambientales
28
óptimas para tener una cría exitosa; la temperatura se mantuvo a 28 ± 2 o C y una
humedad relativa entre 50 y 60% para esto se empleo un humidificador marca (Bio-
Rad®).
La reproducción del insecto se inició con el pie de cría, dejando pupar las
larvas dentro de los recipientes de plástico, éstas se colocaron en una trampa de
emergencia de la cual a los seis u ocho días se obtuvieron los adultos (palomillas),
los adultos se colocaron en bolsas de papel (veinte adultos por bolsa, diez hembras
y diez machos), posteriormente se les colocó un recipiente con algodón humedecido
con agua y miel para la alimentación de los mismos dentro de la bolsa se realizó la
cópula así como la oviposición.
A los dos días se obtuvieron huevecillos y la eclosión de larvas se efectúo a
los tres días después de la oviposición, las larvas fueron tomadas de la bolsa con la
ayuda de un pincel y colocadas de manera individual en los recipientes de plástico, a
éstos se les colocó un trozo de dieta para su alimentación y se realizó cambio de
dieta y limpieza de residuos cada tres días; las larvas se desarrollaron en el
recipiente hasta completar los cinco estadìos larvales.
La reproducción masiva se realizó con el fin de obtener una cría axénica y
eliminar agentes biológicos que las larvas traen del campo, con el fin de realizar la
evaluación de la patogenicidad y virulencia con hongos entomopatógenos. La F4 fue
la primera generación que se utilizó para realizar bioensayos en el laboratorio. Para
realizar la medición de los cuerpos de las larvas en cada estadío se utilizó una hoja
milimétrica y un estereoscopio marca (ZEISS®).
29
Figura 7. A) Larva de H. virescens alimentándose de dieta artificial B) Pupa de H.
virescens obtenidas en laboratorio C) Trampa para colectar los adultos al emerger
de las pupas D) Bolsas de papel donde se lleva a cabo la cópula, la oviposición y la
eclosión de huevecillos E) Bolsa de papel de las cuales se colectan larvas recién
eclosionadas F) Recipientes de plástico con una larva de la generación (F1).
6.3. Aislamientos nativos de B. bassiana y M. anisopliae
Para la elaboración del presente trabajo se utilizaron aislamientos de hongos
entomopatógenos provenientes de suelos de los municipios de El Fuerte, Choix,
Sinaloa de Leyva y Guasave (Cuadro 3). Se realizaron muestreos en lugares
impactados por la actividad antropogénica, así como en lugares no impactados. En
cada punto se tomaron aleatoriamente cinco muestras, éstas fueron colectadas de
15 a 30 cm de profundidad y colocadas en bolsas negras de plástico de 2 kg de
capacidad, etiquetadas con fecha, número de muestra y sitio de colecta. Luego se
trasladaron al laboratorio de Bioinsecticidas del CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa, en
donde se mantuvieron a una temperatura de 27 a 30°C. Los puntos de muestreo
fueron georeferenciados con un GPS (Garmin®).
E F
30
Cuadro 3. Sitios de muestreo de suelo para la obtención de aislamientos de hongos
entomopatógenos
6.4. Propagación de los aislamientos en medio PDA
Se seleccionaron diez aislamientos, siete de B. bassiana con claves (B1, B4,
B5, B6, B10, B17, B18) y tres de M. anisopliae con claves (M1, M2, M3), de la
colección de hongos que se encuentra resguardada en sílica gel a 4 oC en el
laboratorio de Bioinsecticidas del CIIDIR-Sinaloa. Éstas se seleccionaron de acuerdo
a sus características de velocidad de crecimiento y esporulación en medio PDA.
Los hongos se propagaron en cajas petri con medio de cultivo PDA (Figura 8),
se resembraron tres réplicas para cada aislamiento con el fin de obtener suficiente
inóculo para realizar los ensayos. La resiembra se llevó a cabo en una cámara de
bioseguridad (TelStarTM®) para evitar una posible contaminación. Las resiembras se
colocaron en una incubadora (FELISA ®) por 15 días a 27 oC en ausencia de luz
para el desarrollo de los hongos.
Municipio Comunidad Ubicación geográfica N S
Ecosistema Clave Aislamiento
Choix Vado 26o 43.707 108o18.577 Selva B 1 B. bassiana
Choix Vado Selva B 2 B. bassiana
Choix Vado Selva B 3 B. bassiana
Choix Vado Selva B 4 B. bassiana
Choix Guayabito 26o 43.014 108o24.260 Selva B 5 B. bassiana
Choix Colexio 26o 40. 017 108o23.009 Selva B 6 B. bassiana
Sinaloa de Leyva Bacubirito 25o 48.675 107o54.909 Selva B 10 B. bassiana
Guasave Cofradía 25o 30.468 108o26.193 Agroecosistema B 17 B. bassiana
Guasave Cofradía Agroecosistema B 18 B. bassiana
Sinaloa de Leyva Cubiri 25o46.098 108o15.732 Agroecosistema M 1 M. anisopliae
Sinaloa de Leyva Cubiri Agroecosistema M 2 M. anisopliae
Guasave Uva 25o29.324 108o27.870 Agroecosistema M 3 M. anisopliae
31
Figura 8. Propagación de los aislamientos de los aislamientos de
B. bassiana y M. anisopliae en medio PDA.
6.5. Obtención del inóculo
Una vez que los aislamientos presentaron buen crecimiento y esporulación se
procedió a obtener el inóculo. Con una asa bacteriológica se realizó un raspado de
esporas, las cuales fueron colocadas en tubos Falcon (Neptune) (Figura 9) que
contenían 10 mL de agua destilada estéril con Tween 80 al 0.1%. Posteriormente se
resuspendieron empleando un Vórtex a 200 rpm durante 2 min. Este procedimiento
se realizó individualmente para cada uno de los aislamientos.
Figura 9. Tubos Falcon con inóculo de B. bassiana y M. anisopliae utilizados para
realizar bioensayos.
32
6.6. Estimación de la concentración de esporas
Para el ensayo de patogenicidad se utilizó una sola concentración de 1X108
en todos los aislamientos, para determinar la concentración del inóculo se colocaron
10µl de la suspensión de conidios en hematocitómetro (cámara de Neubauer) (Figura
10). Los conidios se contabilizaron específicamente en los cuadrantes marcados de
color verde. Una vez tomadas las lecturas, la concentración de conidios se determinó
mediante la siguiente ecuación según Ames y Cañedo (2006).
Número de esporas/mL= (x/4) (fd) (10,000).
En donde X= total de células contadas en los 4 cuadrantes y fd= factor de dilución.
Figura 10. Cámara de Neubauer utilizada para el conteo de esporas
6.7. Evaluación de la patogenicidad de los aislamientos
Para determinar si los aislamientos tenían patogenicidad sobre H. virescens se
emplearon 330 larvas de segundo estadío larval, éstas se confinaron individualmente
en un recipiente de plástico transparente No 1 con tapadera; un día previo a la
elaboración del bioensayo se colocó 1 cm2 de dieta meridica elaborada el mismo día
para su alimentación. La inoculación se efectúo de manera tópica con la ayuda de
una micropipeta (Labmate®) adicionando 50 µL a cada larva tratando de cubrirlo
totalmente con la suspensión de esporas.
33
En la a evaluación de cada aislamiento se utilizó una concentración de 1X108
mL, los insectos inoculados se colocaron sobre un estante de metal a una
temperatura de 28 oC ± 2 y con una HR del 60% (Figura 11). Las lecturas de
mortalidad fueron tomadas cada 24 hr hasta el quinto día. Las larvas que
presentaban alteraciones en sus actividades normales como movimientos lentos e
inanición se colocaron en cámara húmeda para facilitar el crecimiento del hongo.
Figura 11. Bioensayo de patogenicidad de B. bassiana y M. anisopliae sobre larvas
de H. virescens.
6.8. Determinación de indicadores de virulencia DL50 y TL50
Para determinar el Tiempo Letal Medio (TL50) y la Dosis Letal Media se
seleccionaron B1 y B2 ya que fueron los dos aislamientos que presentaron mayor
mortalidad en el bioensayo, se resembraron por triplicado en cajas de Petri en medio
PDA a los 15 días se realizó un raspado de esporas sobre el cultivo que sirvió como
inoculo el cual fue diluido a cuatro concentraciones (105-108) que fueron los aplicados
sobre las larvas, más un testigo que solo recibió agua destilada con Tween 80. Para
34
esta prueba se utilizaron 300 larvas de segundo estadío larval, 150 para cada
aislamiento. Se infectaron con la ayuda de una micropipeta adicionando 50 µL a cada
larva. Una vez inoculadas las larvas se mantuvieron en un cuarto bajo una
temperatura de 28oC y una H.R de 60-70 %. Los conteos de mortalidad se llevaron a
cabo cada 24 horas por 5 días. Los insectos muertos se colocaron en cámaras
húmedas para estimular el desarrollo del micelio del hongo en los cadáveres de las
larvas.
Los datos de mortalidad obtenidos en laboratorio fueron corregidos mediante la
fórmula de Abott (1925).
% de mortalidad Corregida: Y-Y(100) Donde Y= Mortalidad en el Tratamiento
100 – X X= Mortalidad en el Testigo
6.9. Evaluación de la efectividad de los aislamientos en campo
6.9.1. Establecimiento de la parcela experimental de tomate
Para la evaluación de la efectividad en campo se estableció una parcela de
cultivo de tomate ubicada en los lotes experimentales del CIIDIR-Sinaloa (Figura 12).
El experimento consistió en un diseño de bloques completamente al azar, con tres
repeticiones, se preparo el terreno de acuerdo a la tecnología regional a una
distancia entre surcos de 1.6 m por 10 m de largo y una distancia entre planta de 25
cm, la parcela útil consistió en un tramo de 3 m centrales del surco para eliminar el
efecto orillas. Para delimitar la parcela útil se diseñaron unas estructuras de madera
de 3 m de largo por 1.5 m de ancho y 1 m de altura forradas con malla antiafidos de
color blanco y se colocaron en la mitad de los tratamientos colocando 1 para cada
repetición de cada tratamiento, a los costados del experimento se plantaron 3 surcos
de tomate que sirvieron como barreras. La plantación se realizó el día 15 de
noviembre de 2011 sobre un suelo de tipo aluvión.
35
Figura 12. Parcela experimental de tomate a los 60 días después de trasplante
(d.d.t).
6.9.2 Control de plagas y maleza Para el control de plagas chupadoras como mosquita blanca, trips y pulgones,
se aplicaron productos biorracionales a base de extractos vegetales, Nim (Feanim®),
Canela (Striker®) y Ajo (Buldox®). El control de malezas se realizó de manera
manual con la ayuda de herramientas de trabajo (machetes, palas y azadones)
(Figura 13). Las malezas que se presentaron en el cultivo fueron correhuela
Convolvulus arvensis (L), Bledo Amarantus palmeri (S), Chuales Chenopodium spp.
Zacate Jhonson Shorgum halepensis (L).
36
Figura 13. Control de malezas en la parcela experimental
6.9.3. Infestación artificial de la parcela experimental de tomate con H. virescens
Para asegurar la presencia del insecto plaga en la parcela experimental se
realizó la infestación en plantas con huevecillos y larvas de primer estadío
H.virescens de la décima generación filial (Figura 14). Se colocaron 150 larvas por
repetición en cada tratamiento, las larvas fueron puestas en las inflorescencias de la
planta ya que los adultos ponen los huevecillos en los racimos florales.
Figura 14. A) Huevecillos utilizados en la infestación B) Larvas de primer estadío
utilizadas en la infestación.
37
6.10. Producción del hongo B. bassiana en medio líquido
Para la evaluación de los aislamientos de los entomopatógenos en campo se
realizó la propagación masiva de los aislamientos B1 y B2. Se resembraron en medio
PDA dejándolos crecer por 15 días a una temperatura de 28 oC con el fin de tener el
inóculo para llevar a cabo la producción en líquido. Para cultivar cada aislamiento en
medio líquido se emplearon 6 matraces de 500 ml. Se añadieron 200 mL de medio
de cultivo, los cuales se esterilizaron con calor húmedo a 121 0C por 15 minutos,
posteriormente se dejaron enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiental y se
pusieron 20 mL de inóculo a una relación 1-10; la inoculación se llevó a cabo en una
cámara de bioseguridad (TelStarTM®) (Figura 15), para evitar una posible
contaminación; los matraces se colocaron en cámara incubadora agitadora por 72
horas a 200 rpm a una temperatura de 28 oC ± 1. A las 72 horas se hizo un conteo de
esporas obteniendo una concentración de 2.1x106 esporas/mL, para el aislamiento
B1 y 1.6x108 esporas/mL para el aislamiento B2.
Figura 15. A) Producción en medio líquido de los aislamientos B1 y B2 de
B. bassiana B) Inóculo del aislamiento B1 crecido después de 72 hr.
38
6.11. Productos biorracionales
Una vez comprobada la patogenicidad de los aislamientos nativos sobre larvas
de segundo y tercer estadío de H. virescens a nivel laboratorio, se procedió a realizar
una prueba en campo para conocer su efectividad en el control de H. virescens en el
cultivo de tomate. Para contrastar y comparar estos resultados se evaluaron otros
productos biorracionales comerciales: Capsanem®, un producto a base de
nemátodos Steinernema carpocapcidae (Weiser) Versa® producto a base de Bacillus
turhingiensis Abatec® un producto a base piretrinas Chrysanthemum cinerariaefolium
(Vis) que sirvió como testigo químico.
Cuadro 4. Larvas vivas de H. virescens a las 72 hr después de la infestación
6.12. Conteo de larvas después de la infestación
El conteo de larvas vivas de H. virescens se llevo a cabo a las 72 horas de
haber hecho la infestación tomando en cuenta solo las parcelas útiles de cada
tratamiento, para facilitar. El conteo se realizo a las primeras horas del día ya que las
temperaturas bajas reducen el movimiento de los insectos; esta se realizó de
manera visual con la ayuda de una lupa entomológica y un contador manual.
Tratamiento Repetición 1 2 3 Total
B 1 (B. bassiana) 38 31 32 101 B 2 (B. bassiana) 30 33 37 100 Capsanem® (Nemátodos) 33 37 35 105 Abatec® (Piretrinas) 29 32 35 96 Versa® (Bt) 28 41 33 102 Control 35 40 28 103
39
6.13. Aplicación de los tratamientos
Los seis tratamientos aplicados consistieron en dos aislamientos de B. bassiana que
mostraron mayor virulencia in vitro (B1 y B2); Capsanem®, Versa®, Abatec® y un
control con agua más Tween 80 al 0.1 %. La aplicación de los tratamientos se llevó
a cabo de manera convencional con una bomba de mochila marca Truper ® con
capacidad de 3.8 L. La dosis aplicada de los productos comerciales fue la
recomendada por el fabricante para una hectárea ésta se obtuvo en la etiqueta del
producto. La dosis utilizada fue 2.1 x106 esporas/ml para el aislamiento B1 y 1.6 x106
esporas/ml para el aislamiento B2.
Cuadro 5. Tratamientos, dosis y número de aplicaciones
Figura 16. Aplicación de los tratamientos en la parcela experimental.
Tratamiento Dosis/Ha Ingrediente activo Aplicaciones
B 1 2.1 X10 6 B. bassiana 1
B 2 1.6 X10 6 B. bassiana 1
Capsanem® (Nemátodos) 50 millones S. carpocapseae 1
Abatec® (Piretrinas) 250 gr Piretrinas 1
Versa® (Bt) 300 gr B. turhingiensis 1
Control 200 lt Agua 1
40
6.14. Conteo de larvas muertas después de la aplicación de los tratamientos
La evaluación de la efectividad biológica de los productos aplicados cada 24 hr
se tomaron lecturas de mortalidad de larvas en la parcela útil para esto se retiraron
los túneles de madera para facilitar el conteo. Con la ayuda de una lupa
entomológica se revisó todo el follaje de las plantas colectando las larvas muertas y
trasladándolas al laboratorio. Con la ayuda de un estereoscopio (ZEISS®) se
observaron las larvas para corroborar la muerte del insecto, las larvas colectadas en
los tratamientos B1, B2 y Capsanem se colocaron en cámaras húmedas para
favorecer el desarrollo de los nemátodos así como la esporulación del hongo.
6.15. Evaluación del rendimiento de frutos
La cosecha de tomate se realizó de forma manual, colectando frutos maduros
únicamente de la parcela útil, se utilizaron cubetas de 20 L de capacidad, se pesaron
los frutos de cada tratamiento en una báscula digital marca TORO REY® (Figura 15);
y se clasificaron los frutos de tomate por el tamaño que presentaron. Los resultados
de rendimiento se extrapolaron a ton ha-1.
Figura 17. Rendimiento en el tratamiento con Versa®
41
6.16. Evaluación de daño en frutos causados por H. virescens
Una vez que se obtuvo el rendimiento de tomate en la parcela útil se procedió a
sacar el porcentaje de frutos dañados. Se contaron los frutos que presentaron el
daño característico causado por la larva, que son perforaciones irregulares en todo el
fruto.
Figura 18. Frutos dañados en el tratamiento control por H. virescens.
6.17 Análisis estadístico
Los resultados de patogenicidad obtenidos en laboratorio fueron corregidos
con la fórmula de Abbot (1925), para establecer una línea de respuesta logaritmo-
dosis-mortalidad y determinar así los aislamientos más patogénicos. Para determinar
DL50 y TL50 se utilizo el programa estadístico PC Probit.
Los datos obtenidos de campo fueron analizados a través de un análisis de
varianza y un análisis de comparación de medias por la prueba de Tukey con un
nivel de significancia del 95% (alpha≤0.05) empleando el programa estadístico SAS.
42
VII. RESULTADOS
7.1. Ciclo biológico de H. virescens en laboratorio
La cría del insecto dio inicio a partir de marzo del 2011 hasta abril del 2012,
obteniéndose diez generaciones filiales del insecto en laboratorio. En cada
generación se obtuvieron alrededor de 1500 a 2000 larvas. A continuación se
describe el ciclo de vida del insecto reproducido en laboratorio a una temperatura de
28 ± 2 oC.
Los huevecillos de H. virescens fueron ovipositados individualmente, éstos son
esféricos, al ser recién ovipositados presentan un color blanco hialino, conforme
avanza el desarrollo de la larva se torno de color gris obscuro. Midieron de 0.8 a 1.1
mm de ancho y 0.8 a 1.0 mm de altura, ésta etapa de desarrollo duro 3 días desde la
oviposición hasta la eclosión.
La larva del primer estadío tuvo una duración de 3.2 días en promedio,
presentaron la cabeza de color negro, con un tamaño de 0.25 mm de largo y de 0.3
mm de ancho. El tamaño de las larvas recién eclosionadas fue de 1 mm de largo, 0.2
mm de altura y 0.2 de ancho. Antes de mudar la larva midió 3 mm de largo, 0.7 mm
de altura y 0.7 mm de ancho; mientras que la cápsula cefálica midió 0.35 mm de
largo y 0.45 mm de ancho.
El segundo estadío tuvo una duración 2.2 días en promedio, la larva midió 3
mm de largo, 0.7 mm de altura y 0.7 mm de ancho; y la cápsula cefálica midió 0.35
mm de largo y 0.45 mm de ancho. Antes de pasar al siguiente estadio la larva midió
7.2 mm de largo, 1.2 mm de altura y 1.2 mm de ancho, y la cápsula cefálica midió
0.40 mm de largo y 0.90 de ancho.
En el tercer estadío larval duro 2.3 días; la cabeza ya no presento color negro
intenso, sino que cambio a un color más claro. La larva midió 7.2 mm de largo, 1.2
mm de altura y 1.2 mm de ancho; la cápsula cefálica midió 0.40 mm de largo y 0.90
mm de ancho. Antes de mudar al siguiente estadío la larva midió 13 mm de largo,
2.75 mm de altura y 2.75 mm de ancho; y la cápsula cefálica midió 1.2 mm de largo y
43
1.3 mm de ancho. Las larvas en éste estadío se tornaron de diferentes colores:
amarillo claro, rosa, verde claro y grises.
Para el cuarto y quinto estadío las larvas presentaron las mismas medidas
durando 2.8 días y 3.3 días, respectivamente, la cabeza midió de 4.0 mm de altura y
4.0 de ancho; y la larva 35 mm de largo y 5 mm de ancho. Para el quinto estadío la
larva alcanzo su máximo tamaño; al finalizar este estadío las larvas se mantuvieron
por 24 horas en prepupa. La larva empezó a engrosar, tomando un tamaño más
pequeño, durante este periodo las larvas no se alimentaron sólo se cubrieron con la
dieta y los desechos corporales preparándose para pupar.
La pupa es de tipo obtecta, recién formada presentó un color verde a café
claro conforme se aproximo a la emergencia del adulto se torno café obscuro, las
medidas fueron de 17.2 a 19.8 mm de largo y de 4.0 a 4.7 mm de ancho, el estado
de pupa duro de 10 ± 2 días a una temperatura de 28 ± 2 oC.
En los adultos (palomillas), la cabeza tuvo una coloración amarillenta, en la
cual se podían observar las antenas filiformes, el aparato bucal tipo sifón la cual tiene
forma de espiral o enrollado cuando está en reposo. Su expansión alar fue de 30 a
36 mm y tardaron de 2 a 3 días en ovipositar, los adultos presentaron una longevidad
de 10 ± 5 días.
44
Figura 19. Ciclo de vida de H. virescens en laboratorio.
7.2. Bioensayo con aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae sobre H. virescens.
Después de 24 horas de incubación, posteriores a la inoculación de la solución
de esporas sobre las larvas de H. virescens. No se observó mortalidad en ninguno de
los aislamientos y en el control.
A las 48 horas hubo mortalidad de larvas. Se observo diferencia significativa
entre los diferentes aislamientos probados. Los aislamientos de B. bassiana fueron
los que presentaron mayor virulencia; el aislamiento B1 presentó la mayor
mortalidad con un 30% de mortalidad, mientras que B2 mostró la segunda mortalidad
más alta con un 16.66%. A las 48 horas los aislamientos B1 y B2 de B. bassiana
mostraron mayor virulencia que los aislamientos de M. anisopliae.
45
A las 72 horas de incubación los porcentajes de mortalidad se incrementaron,
probablemente conforme se desarrollo la infección del hongo dentro del insecto. De
la misma forma los aislamientos de B. bassiana B1 y B2 mostraron los mayores
porcentajes de mortalidad con 53.33% y 26.66%, respectivamente. Hasta este
tiempo transcurrido los tres aislamientos de M. anisopliae probados, M4 y M5
presentaron 23.33% y 10% de mortalidad, relativamente bajos si los comparamos
con el aislamiento B1 que presentaron mayor mortalidad que estos. B1 fue el único
aislamiento que mostró diferencia significativa respecto a los demás tratamientos.
A las 96 horas de incubación, ambos aislados (B1 y B2) mostraron los mismos
porcentajes de mortalidad, y las larvas comenzaron a mostrar crecimiento de micelio
blanco sobre su cuerpo, característica particular de B. bassiana (muscardina blanca).
Los aislados B7 y B8 mostraron 23.33 % de mortalidad en ambos casos. Hasta éste
periodo de tiempo podemos inferir que el aislamiento B1 fue el mejor tratamiento, ya
que fue el único que mostró diferencia significativa respecto a los demás,
incluyendo el control, igual que a las 72 hr.
A las 120 horas el porcentaje de mortalidad del aislamiento B1 siguió siendo el
mejor en cuanto a la mayor mortalidad, incrementando su porcentaje de 53.3% a
70.0%, mientras que el aislamiento B2 aumentó su porcentaje de 26.6% a 56.6% de
mortalidad, así mismo el aislamiento B8 aumento de 23.3% a 50.0%
A las 120 horas de incubación se muestran más contundentes los efectos del
hongo entre los diferentes aislamientos, siendo B1, B2 y B8 las cepas que mostraron
diferencia significativa respecto a los demás aislamientos probados, incluyendo el
control. De acuerdo a lo anterior B1 y el B2 fueron seleccionados para realizar las
pruebas de efectividad en campo, a pesar de que B7 obtuvo el mismo porcentaje de
mortalidad que B2 56.6 %; sin embargo la agresividad de B2 fue evidente ya que
empezó a mostrar mortalidad desde las 48 horas a diferencia de B7 con mortalidad
hasta las 96 horas.
46
Cuadro 6. Virulencia de aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae, expresado en %
de mortalidad de larvas.
Aislamiento Tiempo en horas 48 72 96 120
B1 30.00 a 53.33 a 53.33 a 70.00 a B2 16.66 a 26.66 b 26.66 b 56.66 a b B3 0.00 b 23.33 b 23.66 b c 43.33 b c d M4 0.00 b 23.33 b 23.33 b 23.33 b c d M5 0.33 b 10.00 b c 10.00 b c 20.00 b c B6 0.00 b 6.66 b c 6.66 c 36.66 b c d B7 0.00 b 0.00 c 23.33 b 56.66 a b B8 0.00 b 0.00 c 23.33 b 50.00 a b c M9 0.00 b 0.00 c 0.00 c 0.00 e B10 0.00 b 0.00 c 0.00 c 30.00 c d
Control 0.00 b 0.00 c 0.00 c 0.00 e En cada columna se presenta el promedio de tres repeticiones por tratamiento. Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos, de acuerdo a prueba de Tukey (p≤ 0.05).
Figura 20. A) Larva de H. virescens infectada con el aislamiento B1 y micosada a las 120 hr. B) Larva de H.virescens infectada con el aislamiento B2 y micosada a las 120 hr.
A B
47
7.3. Determinación de indicadores de virulencia DL50 y TL50
Para el aislado B1 la DL50 y TL50 del aislamiento fue de 2.1 x 106 esporas/ml
con límites de confianza inferior y superior de 2.3 x 105 a 2.2 x 107 esporas/ml en un
tiempo de 3 días y límites de 2.5 a 3.1 días respectivamente,
Para el aislamiento B2, a mayor concentración de esporas mayor porcentaje
de mortalidad de larvas de H. Virescens, determinando la DL50 y TL50 de 1.6 x 106
esporas/ml con límites de confianza de 1.9 x 105 a 2.6 x 106 esporas/ml en 2.7 días
con límites de 2.4 a 2.9 días, respectivamente.
7.4. Evaluación de la efectividad de los aislamientos B1 y B2 en cultivo de tomate infestado de H. virescens.
La aplicación de los tratamientos en la parcela experimental se llevó a cabo a
las 72 horas después de la infestación con larvas de H. virescens, las lecturas de
mortalidad en la parcela útil indican cual fue tratamiento con mayor efectividad
biológica. En la primera lectura, a las 24 hr de aplicación se observó que el
tratamiento que mostró diferencia significativa fue Versa (B.t) presentando 5.0% de
mortalidad, siendo el tratamiento más efectivo, seguido por Abatec y Capsanem con
una efectividad de 2 y 3% de mortalidad respectivamente, en cuanto a los 2
tratamientos con aislamientos B. bassiana no mostraron mortalidad, mientras que
con el control se observó un 0.33 % de mortalidad.
A las 48 horas después de aplicados los tratamientos se observaron
porcentajes de mortalidad más altos con el tratamiento de Versa® 16.66%, seguido
por el Capsanem® 9.33% mientras que Abatec® mostro una mortalidad de 4.66 %, y
los aislamientos B1 y B2 mostraron mortalidad por primera vez de 2.33% y 3.0%.
A las 72 hr Los tratamientos: Versa®, Abatec® y Capsanem® mostraron un
39.6%, 32.3% y 23.3% de efectividad respectivamente. B1 y B2 tuvieron 6.6 % y 6.3
% mientras el control 2.6% de mortalidad.
48
Cuadro 7. Porcentaje de mortalidad de larvas de H. virescens en campo con diferentes tratamientos.
Tratamiento Tiempo en horas 24 48 72 B1 (B. bassiana) 0.00 c 2.33 c 6.66 c
B 2 (B. bassiana) 0.00 c 3.00 c 6.33 c
Capsanem® (Nemátodos) 2.00 b c 9.33 b 23.33 b
Abatec® (Piretrinas) 3.00 a b 4.66 c 32.33 a
Versa® (B. turrhingiensis) 5.00 a 16.66 a 39.66 a
Control 0.33 c 2.33 c 2.66 c En cada columna se presenta el promedio de tres repeticiones por tratamiento. Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamiento, de acuerdo a prueba de Tukey (p≤0.05).
Figura 21. A) Larva de H. virescens infectada con el aislamiento B2 y micosada a las 120 horas B) Larva de H. virescens infectada con el aislamiento B1 y micosada a las 120 horas C) Larva de H. virescens infectada por nematodos a las 48 horas observada al estereoscopio.
7.5. Rendimiento de fruto del cultivo del tomate
En el Cuadro 9 se presenta el rendimiento de la cosecha de tomate en
relación a los productos evaluados, tanto de rendimiento comercial como de fruto
dañado (extrapolada a ton ha-1). Entre Versa® y Abatec® se diferenciaron
estadísticamente del resto de los tratamientos, mostrando el menor porcentaje de
daño obteniéndose un porcentaje de daño en fruto más bajo 1.8% para el primero,
B
C
A
A B C
49
(3.2%) para Abatec® y (5.9%) para Capsanem®. Así mismo éste último no
presento diferencia significativa con el aislamiento de B. bassiana B1 (8.5% de
pérdida). Finalmente entre B2 y el control no hubo diferencia significativa, obteniendo
los porcentajes de perdida más altos (10.2 % y 13.8 %) respectivamente. Se obtuvo
diferencia significativa entre los tratamientos, Capsanem®, Abatec®, Versa®,
respecto a B2 y el control, de igual forma B2 fue diferente significativamente del
control. B1 no se diferenció de B2.
Cuadro 9. Rendimiento de tomate en los diferentes tratamientos probados contra H.
virescens en campo.
Tratamiento % en fruto dañado Producción comercial (t h -1)
B 1 (B. bassiana) 8.5 b 14.800 ab
B 2 (B. bassiana) 10.2 a 13.200 b
Capsanem® (Nemátodos) 5.9 ab 16.200 a
Abatec® (Piretrinas) 3.2 c 16.400 a
Versa® (Bt) 1.8 c 16.900 a
Control 13.8 a 11.100 c En cada columna se presenta el promedio de tres repeticiones por tratamiento. Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamiento, de acuerdo a prueba de Tukey (p≤0.05).
50
VIII. DISCUSIÓN
García (1960), reporta la cría de H. virescens en laboratorio para el desarrollo
de investigaciones de susceptibilidad de insecticidas, así como en el estudio de
depredación y parasitismo de esta especie. Lezama (1993), realizó una dieta de
gusano cogollero en laboratorio para determinar la patogenicidad de hongos
(Hyphomycetes) y del nematodo entomopatógeno Heterorhabditis bacteriophora
(Poinar). Vázquez et al., (2002), con el fin de realizar bioensayos con el virus SfVPN
en larvas libres de contaminantes químicos y biológicos establecieron una cría de
gusano cogollero en laboratorio para lo cual colectaron larvas de quinto estadío larval
en cultivos de maíz infestados con esta plaga.
Se obtuvieron en total diez generaciones filiales (F10), de H. virescens en el
laboratorio durante 13 meses que duró la cría. López, (2010) obtuvo 7 generaciones
de Spodoptera frugiperda durante 8 meses de cría donde estudio su ciclo de vida a
diferentes temperaturas, la diferencia en el número de generaciones se debe a las
temperaturas utilizadas durante el desarrollo de los dos trabajos.
Los huevecillos presentaron medidas de 0.8 – 1.1 mm de ancho y 0.8 - 1.0
mm de altura, los huevecillos tardaron en eclosionar 3 días lo que concuerda con
Bernhardt y Phillips (1985) quienes realizaron su estudio a una temperatura de 280C.
Las hembras ovipositaron de 300 - 400 huevecillos, lo que concuerda por lo
reportado (Fye y McAda, 1972).
Las larvas pasaron por 5 estadios larvales coincidiendo con lo reportado por
López, (2010), en contraste Murua et al.,(2003) reportan que obtuvieron de 6 a 8
estadios larvales en una cría de gusano cogollero, utilizando una dieta meridica
similar a la utilizada en el presente trabajo, sometiendo la cría a una temperatura de
25± 2 oC, 70-75 % de H.R, y 14-10 horas de fotoperiodo, mientras que en el presente
trabajo se obtuvieron solo 5 a una temperatura de 28± 2oC, 60 % de H.R, la
diferencia en cuanto al número de estadios se debe los rangos de T, HR y
fotoperiodo utilizados ya que estos afectan directamente el desarrollo del insecto
51
(López, 2010). Los rangos de tamaño en las larvas fueron similares a los obtenidos
por (Fye y McAda 1972;).
La pupa duró de 10±2 días a una temperatura de 28 oC, los resultados
concuerdan con Henneberry (1994), quien reporta una duración del estado de pupa
de 13 días a una temperatura de 25 oC y 11.2 días a una temperatura de 30 oC.
Los adultos (palomillas), presentaron 30-36 mm de expansión alar tardaron de
2 a 3 días en ovipositar, presentaron una longevidad de 10-12 días con alimentación,
Tumlinson et al., (1975) reportaron un rango de longevidad de 25 días cuando las
temperaturas son de 20 oC y de 15 días cuando las temperaturas son de 30o C.
A nivel de campo el ciclo de vida de H. virescens no está reportado con
exactitud, pero la importancia del estudio del ciclo de vida en laboratorio sirve como
información básica para el estudio del ciclo de vida en campo en el norte de Sinaloa.
Al someter los aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae a prueba de
patogenicidad en larvas de segundo estadío de H. virescens, en condiciones de
laboratorio se determinó que nueve de los diez aislamientos fueron patogénicos en
porcentajes que van desde el 30% al 70 % para los siete aislamientos de B.
bassiana, y de 0 a 23 % para dos los aislamientos de M. anisopliae, a las 120 horas
de exposición. En comparación con Castro (2009), quien evaluó dos aislamientos de
hongos entomopatógenos y obtuvo mortalidades de 100 % con B. bassiana con
clave (CCB-LE265) y 86 % con M. anisopliae con clave (CCB-LE302) en larvas de
primer estadío larval de H. virescens.
A las 48 horas posteriores a la inoculación solo dos aislados mostraron
mortalidad el B1 y el B2, conforme aumento el tiempo de incubación se observó que
la mortalidad de larva fue mayor. La mayor virulencia se determino en B. bassiana y
particularmente en el aislamiento B1 con una mortalidad total del 70% a una
concentración de (1X108) en un periodo de 120 horas, en contraste Castro (2009)
obtuvo mortalidades de 96% usando la misma concentración de esporas en el mismo
tiempo de incubación sobre larvas de H. virescens.
52
Así también, la mortalidad causada por el aislamiento B1 fue menor a la reportada
por Luna (2009) a las 120 horas posteriores a la inoculación, pero en larvas de
gusano cogollero S. frugiperda, inoculadas en segundo estadio, observo 88% de
mortalidad y además utilizo una concentración más alta (1X109)
En cuanto a los aislamientos de M. anisopliae de los tres aislamientos
evaluados solo dos presentaron patogenicidad el M4 y el M5 con 23.33 % y 20.00 %
respectivamente. En contrataste Castro (2009), obtuvo mortalidades del 86%, 80% y
78% en concentraciones de 1.5x108, 1.0x107, y 1.0x106 respectivamente, a las 120
horas de incubación.
Lo anterior nos indica que aunada a la concentración del inoculo la
patogenicidad de los hongos entomopatógenos se ve afectada por el origen o fuente
de donde se aisló, ya que aislamientos del mismo género presentan virulencias
diferentes contra el mismo insecto blanco (Vélez et al., 1999; Samuels et al., 2002).
Esto probablemente ocurre por la variación de los factores que definen la virulencia
de los aislamientos como niveles de proteasas, quitinasas y lipasas (Bridge et al.,
1990; Valera y Morales, 1996) así como los mecanismos de defensa de los insectos
(barreras físicas y químicas, grosor de la cutícula, sistema inmune innato y de
comportamiento como cambios de temperatura (Neves y Hirose, 2005).
En el presente trabajo el porcentaje de mortalidad mayor fue con el aislamiento B1
de 70% a una concentración de (1X108) a las 120 hr posteriores a la inoculación lo
que sugiere que aumentando la concentración se podría alcanzar una mortalidad
más alta. Sin embargo, se obtuvieron evidencias de que los aislamientos nativos de
la región norte del estado de Sinaloa, aislados de agroecosistema y de suelos no
impactados fueron patogénicos contra larvas de segundo estadío larval de H.
virescens.
53
Al evaluar los aislamientos B1 y B2 para determinar los parámetros de
virulencia (DL50 y TL50), se obtuvieron resultados, que difieren con otros
investigadores en cuanto a concentraciones utilizadas, Méndez et al., (2004),
reportaron una DL50 de 9.5X105 esporas /mL-1 y un TL50 de 4.4 días para gusano
cogollero con un aislamiento de Nomuraea rileyi (Nr-003). En contraste nuestros
resultados fueron: con el aislamiento B1 se obtuvo una DL50 de 2.1x106 esporas/mL-1,
y una TL50 de 3 días; para el aislamiento B2 una DL50 de 1.6x106 esporas/mL-1 y
una TL50 de 2.7 días.
Los resultados del presente estudio, con los dos aislamientos son
relativamente similares tomando en cuenta lo que reporta Hafes et al., (1994),
quienes señalaron que los niveles de infección se deben al contacto entre el inoculo
de una cepa virulenta y la susceptibilidad de la cutícula del insecto a la germinación,
penetración del tubo germinativo y finalmente de la micosis del insecto, esto es
cuando los insectos utilizados provienen de una cría de laboratorio donde se les ha
dado el mismo cuidado a todos los individuos por lo tanto tienen las mismas
defensas contra patógenos.
Los mejores tratamientos en la reducción del porcentaje de frutos dañados por
H. virescens fueron: Versa®, Piretrinas® y Abatec®, donde hubo promedios por
debajo del umbral de económico recomendado por la Universidad de California
(1999), que es de (3.25 %) para tomate industrial, por su parte Capsanem® presento
un 5.9 %. Aunque no hubo diferencias significativas dentro de los tres tratamientos
Nematodos Capsanem presento un porcentaje por encima del umbral económico
recomendado, en cuanto a nuestros aislamientos se obtuvieron porcentajes
relativamente altos para B1 se obtuvo un 8.5% y B2 un 10.2 % más, sin embargo se
observo mortalidad en campo lo que no se había podido observar con aislamientos
de otra región.
Los porcentajes de efectividad en campo causada por B bassiana sobre el
insecto H. virescens a las 120 horas de evaluación probablemente se debe al
mecanismo lento de infección de los hongos para causar mortalidad en insectos; en
cambio el porcentaje de eficacia causada por el insecticida a base de Bt
54
probablemente se debe a la actividad de las δ-toxinas que actúan en la post-sinapsis
del impulso nervioso causando un efecto de mortalidad inmediato. El efecto lento de
infección de los hongos para producir mortalidad en insectos, es una desventaja
frente a los productos químicos que causan una muerte rápida; pero a diferencia de
éstos no generan poblaciones de insectos resistentes.
Al comparar los resultados causados por los hongos en estudio en laboratorio
y en campo, se corrobora que no siempre los porcentajes de mortalidad de
laboratorio son equivalentes a los obtenidos en campo, ya que la cantidad de inóculo
que capta el insecto en campo es menor que en laboratorio; y la influencia de los
factores ambientales.
En las cepas de B. bassiana se obtuvieron resultados muy por debajo de los
esperados, tomando en cuenta los aspectos por los cuales se obtuvieron estos
resultados a nivel de campo tenemos tres que son los más importantes que son:
temperatura y H.R (Quesada et al., 2006), dosis (Hafes et al., 2004) y la presencia
de aleloquimicos como la tomatina presentes en la hojas de tomate que es conocida
por sus propiedades antifungicas y pueden retardar la infección de Beauveria ya que
estudios realizados por Tanada y Kaya., (1993), reportan que inhibe la germinación y
el desarrollo de esporas a nivel in vitro de la colonias de B. bassiana.
En diferentes trabajos se menciona que la efectividad para el control de plagas
agrícolas se atribuye a la calidad del bioinsecticida, el equipo de aspersión, las
condiciones ambientales especialmente temperatura, humedad relativa, topografía y
dinámica de la plaga al momento de la aspersión (Vélez y Montoya, 1993; Bustillos et
al., 1996). Edginton et al., (2000), observó que las esporas de B. bassiana fueron
completamente inactivadas por la acción de la luz después de 60 minutos de
exposición. Esto hace pensar en el desarrollo de nuevas tecnologías como los
nanoencapsulados, protectores solares, antidesecantes, abrillantadores que reflejen
la luz solar.
Al analizar los resultados de rendimientos obtenidos en un solo corte
podemos observar que el mejor tratamiento fue Versa®, con 16.900 t ha-1. Los
55
resultados obtenidos con los aislamientos (B1 y B2) fueron de 13.200 t ha-1 y 16.200
t ha-1 respectivamente en un solo corte de fruto, no existiendo diferencias
significativas en cuanto al control y siendo buenos rendimientos ya que el promedio
por hectárea para el estado de Sinaloa es de 45 t ha -1 y se realizan tres o más
cortes (Airola, 2010).
56
IX. CONCLUSIONES
El ciclo de vida completo de H. virescens en laboratorio a temperatura de 28 oC±2 y
una H.R de 60-70 % fue de 36 ±2 días.
Al realizar las pruebas de virulencia en laboratorio obtuvimos que nueve de los diez
aislamientos evaluados causaron mortalidad contra larvas del primero y segundo
estadío larval de H. virescens, con porcentajes de mortalidad del 20 al 70% a las 120
hr.
La DL50 y TL50 del aislamiento B1 fue de 2.1 x 106 esporas/mL a los tres días y para
el aislamiento B2 fue de 1.6 x 106 esporas /mL en 2.7 días, por lo que ambos
aislamientos se consideran virulentos contra el insecto de prueba.
Los aislamientos B1 y B2 fueron mostraron toxicidad aguda contra H. virescens en
condiciones de campo, causando porcentajes de mortalidad de larvas de 6. 3 al
6.6%.
El tratamiento Versa® tuvo el menor daño en fruto 1.8 %, seguido Abatec® y
Capsanem®; los aislamientos B1 y B2 mostraron 8.5 % y 10.2 % de daño
respectivamente,
El tratamiento Versa obtuvo el mejor rendimiento de frutos con 16.9 t h -1 mientras
con los aislamientos B1 y B2 se obtuvo 14.6 t h -1 y 13 .2 t h -1.
57
X. RECOMENDACIONES
Realizar más muestreos en suelos agrícolas y no agrícolas con el fin de obtener
aislamientos de hongos entomopatógenos, hasta encontrar cepas que presenten
una virulencia superior al 90% sobre larvas de H. virescens de primer y segundo
estadío larval en condiciones de laboratorio.
Realizar aplicaciones en cultivos de tomate infestados con larvas de H. virescens
a concentraciones mayores a las que se utilizaron en el presente trabajo.
Realizar formulaciones de hongos entomopatógenos con el fin de mejorar la
efectividad y la persistencia de los hongos entomopatógenos en campo
58
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