estudo de moleculas de dna
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Estudar as moléculas de DNA e Estudar as moléculas de DNA e RNARNA
Características físicas e químicas dos ácidos nucleicos, importantes para o
seu estudo
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Estabilidade da molécula de DNAEstabilidade da molécula de DNA
• Pontes de hidrogénio (entre as cadeias)
• Forças de Van der Walls (entre as bases empilhadas)
Emparelhamento de bases , devido àcomplementaridade entre as bases
tem um papel importante nasTécnicas de hibridação
(manipulação dos ácidos nucleicos)
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Medição da concentração da dos ácidos Medição da concentração da dos ácidos nucleicosnucleicos em soluçãoem solução
As propriedades de absorção da luz podem ser usadas para:
- detecção- quantificação- teste de pureza
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Medição da concentração da dos ácidos Medição da concentração da dos ácidos nucleicosnucleicos em soluçãoem solução
Bases aromáticas absorvem UV a 260 nm (cdo máximo). P u>Py
As bases aromáticas são menos acessíveis à luz UVquando em DNAds
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RNA absorve mais luzlogo
o valor de absorção para uma dada e mesma concentração
de DNA e RNA, é maior para o RNA
DO260 (DNA)= 1 50µµµµg/ml
DO260 (RNA)= 1 40µµµµg/ml
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Nucleic acids purity
- Pure dsDNA has A260/A280 = 1,8
> 1,8 RNA contamination
<1,8 Protein contamination
- Pure RNA has A260/A280 = 2
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Denaturation Renaturation
RenaturaçãoRenaturação da molécula de DNAda molécula de DNA
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Desnaturação dos ácidos Desnaturação dos ácidos nucleicosnucleicosTmTm-- temperatura de fusãotemperatura de fusão
Tm (melting temperature)- temperatura à qual metade da sequência de bases de determinada molécula de DNA, está desnaturada. Melting point ou temperatura de fusão dos ácidos nucleicos
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% G/C em diferentes organismos% G/C em diferentes organismos
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Factores que afectam a Factores que afectam a desnaturação/desnaturação/ renaturaçãorenaturação da dupla héliceda dupla hélice
• % G/C
• Sequência do DNA (DNA repetitivo)• % incompatibilidade de pb
• Dimensão da molécula• Concentração do DNA
• Força iónica (Na+, neutraliza P-; logo quando a concentração salina é mais baixa, a dupla hélice fica mais instável, logo maior a restringência quando se realizam hibridações)
• Agentes desnaturantes (formamida, ureia, etc)
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Alguns agentes de desnaturação dos ácidos Alguns agentes de desnaturação dos ácidos nucleicosnucleicos
• Temperatura (calor)- altera o estado tautomérico das bases, ionizando-as e rompendo ligações por pontes de H
• Soluções alcalinas (NaOH)• Formamida• Ureia
Agentes químicosque destabilizampontes de H
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Bases:-Alteram estado tautomérico das bases, rompendo asinteracções por ponte de H, desnaturandodesnaturando a dupla hélice, ou estruturas secundárias dos ácidos nucleicos
Ácidos:--HidrolizamHidrolizam os ácidos nucleicos nos seus componentes: bases, açúcares e fosfatos. Soluções ácidas moderadas, clivam ligações clivam ligações glicosídicasglicosídicas, gerando locais apurínicos
Sais:- Estabilizam os grupos fosfato com carga negativa
Acção de ácidos, bases e sais sobre a Acção de ácidos, bases e sais sobre a molécula dos DNAmolécula dos DNA
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iminoamino
keto enol
(tautomeric forms)
keto enol
amino imino
-NH2 =NH
C-OHC=O
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Isolar DNAIsolar DNA(ex.)(ex.)
O álcool exclui as moléculas de água do DNA, precip itando-o
Grande variedade de técnicas consoante o tipo de estrutura que envolve o DNA: vírus, célula bacteriana, fungos e leveduras, células de eucariotas superiores (plantas e animais).
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Exemplo de um método de separação e purificação das Exemplo de um método de separação e purificação das diferentes conformações da molécula de DNAdiferentes conformações da molécula de DNA
Linear and nickedcircular DNA
Covalently closedcircular DNA
RNA
Protein andmembrane
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EthidiumEthidium bromidebromide allowsallows DNA DNA visualizationvisualization ononagaroseagarose gelsgels
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Visualização do DNAVisualização do DNA
Restrição do DNAElectroforese em gel de agarose
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DNA DNA restrictionrestriction
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CÁTODOpólo ou eléctrodo negativo para onde se dirigem os catiões (iões de carga positiva )
ÂnodoPólo ou eléctrodo positivo para onde sedirigem os aniões (iões de carga negativa )
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ElectroforeseElectroforese em gel de em gel de agaroseagarose
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RestrictionRestriction ofof a DNA a DNA fragmentfragment andand migrationmigrationonon agaroseagarose gel gel ofof resultingresulting productsproducts
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Marcadores de peso molecularMarcadores de peso molecular
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DNA DNA migrationmigration onon agaroseagarose gel: DNA gel: DNA fragmentsfragmentsdimensiondimension vsvs agaroseagarose concentrationconcentration