Estudio in vitro del riesgo de Estudio in vitro del riesgo de fototoxicidad de ffototoxicidad de fáármacosrmacos

IntroducciIntroduccióónn

Fototoxicidad Fototoxicidad (mecanismos y t(mecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón)n)PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídica dica (Da(Dañño celular)o celular)ModificaciModificacióón de proten de proteíínas nas (Fotoalergia)(Fotoalergia)DaDañño al ADN o al ADN (Fotogenotoxicidad)(Fotogenotoxicidad)

FotogenotoxicidadFotogenotoxicidadSSBSSBComet AssayComet AssaySecuenciaciSecuenciacióónn

FotoalergiaFotoalergiaDiferenciaciDiferenciacióónn ((reccionesrecciones fotoalfotoaléérgicas/rgicas/fotoirritantesfotoirritantes))SensibilizaciSensibilizacióón y proliferacin y proliferacióón linfocitosn linfocitos

Fototoxicidad SistFototoxicidad Sistéémicamica

Existen compuestos, que sin tener un efecto Existen compuestos, que sin tener un efecto ttóóxico por si mismos, son capaces de absorber xico por si mismos, son capaces de absorber radiaciradiacióón ultravioleta y producir un efecto n ultravioleta y producir un efecto adverso (toxicidad).adverso (toxicidad).

FOTOSENSIBILIZACIFOTOSENSIBILIZACIÓÓNN

FFáármaco rmaco Sin efecto tSin efecto tóóxicoxicoLuzLuz Sin efecto tSin efecto tóóxicoxicoFFáármacormaco + + LuzLuz ToxicidadToxicidad

Riesgos FotobiolRiesgos Fotobiolóógicosgicos

TERMOSFERATERMOSFERA

MESOSFERAMESOSFERA

ESTRATOSFERAESTRATOSFERA

TROPOSFERATROPOSFERA

Nivel del mar

TIERRATIERRA

1010--16 Km16 Km

50 Km50 Km

85 Km85 Km

500 Km500 Km

I.R.,

Vis

, UV

: I.R

., V

is, U

V:

λλ>

330

nm>

330

nm

UV

: U

V:

λλ20

020

0 --33

0 nm

330

nm

UV

U

V

λλ<

100

nm<

100

nm

RadiaciRadiacióón Solarn Solar

-90º

+15º

-56º

-2º

Infrarrojo (IR):Infrarrojo (IR): Longitud de onda > 760 Longitud de onda > 760 nmnm

Visible (Visible (VisVis):): 400 400 -- 760 760 nmnm

Ultravioleta (UV):Ultravioleta (UV):

UVUV--A: 320 A: 320 -- 400 400 nmnm

UVUV--B: 290 B: 290 -- 320 320 nmnm (absorbida estrato corneo)(absorbida estrato corneo)

UVUV--C: < 290 C: < 290 nmnm (filtrada por la atm(filtrada por la atmóósfera)sfera)

Espectro SolarEspectro Solar

*

RadiaciRadiacióón Solar y la Pieln Solar y la Piel

UVCUVC

UVC: UVC: no llega a la pielno llega a la piel

UVBUVB UVAUVA VISVIS

UVB: UVB: eritema, quemaduraseritema, quemaduras

UVA/VIS: UVA/VIS: fototoxicidad, fototoxicidad, fotoalfotoaléérgiargia

+ Fotosensibilizante+ Fotosensibilizante UVA/VIS:UVA/VIS: Alcanza capilares Alcanza capilares sangusanguííneosneos

FARMACOS FOTOSENSIBILIZANTESFARMACOS FOTOSENSIBILIZANTES

NaproxenoNaproxeno

SuprofenoSuprofeno AcidoAcido TiaprofTiaprofééniconico

KetoprofenoKetoprofeno

CarprofenoCarprofeno

NH

Cl

COOH

CH3

COOH

CH3OCOOH

CH3

H3CO

HOOC

CH3

OS

OS

COOH

CH3

AINESAINES

FARMACOS NO FOTOSENSIBILIZANTESFARMACOS NO FOTOSENSIBILIZANTES

FlurbiprofenoFlurbiprofenoFenoprofenoFenoprofeno

IndoprofenoIndoprofenoIbuprofenoIbuprofeno

H3C

H3CN

O

COOH

Me

COOH

MeO

F

COOH

MeCOOH

CH3

REACCIONES FOTOTOXICASREACCIONES FOTOTOXICAS

0102030405060

Aci

doTi

apro

feni

co

Prom

etac

ina

Car

prof

eno

Clo

rpro

mac

ina

Fent

iclo

r

Rea

ccio

nes f

otR

eacc

ione

s fot

óó tox

icas

(%)

toxi

cas (

%)

FOTOTOXICIDAD (ley de FOTOTOXICIDAD (ley de GrotthusGrotthus))

UVAUVA

OO22

11OO22

··

DaDaññoocelularcelular

FFáármacormaco

Los efectos tLos efectos tóóxicos pueden ser debidos a:xicos pueden ser debidos a:

Intermedios de vida media Intermedios de vida media muy cortamuy corta(estados activados, radicales etc.)(estados activados, radicales etc.)

Intermedios de vida media Intermedios de vida media cortacorta(especies reactivas de ox(especies reactivas de oxíígeno)geno)

FotoproductosFotoproductos establesestables

Estrategia racional para investigar los efectos Estrategia racional para investigar los efectos fotobiolfotobiolóógicosgicos de nuevos compuestosde nuevos compuestos

La intervenciLa intervencióón relativa de las foton relativa de las foto--reacciones primariasreacciones primarias

La accesibilidad del compuesto La accesibilidad del compuesto fotoactivadofotoactivado al lugar de al lugar de acciaccióónnEl grado de daEl grado de dañño causado a biomolo causado a biomolééculasculas

Los efectos biolLos efectos biolóógicos producidos por un gicos producidos por un compuesto fototcompuesto fototóóxico, van a depender de la xico, van a depender de la contribucicontribucióón de los siguientes factores:n de los siguientes factores:

Propiedades FotofPropiedades FotofíísicassicasEstudios FotoquEstudios Fotoquíímicos con biomolmicos con biomolééculasculasCorrelaciCorrelacióón estructura/actividadn estructura/actividadFotosensibilizaciFotosensibilizacióón in vitro n in vitro (aguda)(aguda) efectos efectos citotcitotóóxicosxicosFotogenotoxicidad, Fotogenotoxicidad, mutagmutagéénesisnesis y y carcinogcarcinogéénesisnesisEfectos inmunolEfectos inmunolóógicos inducidos por la luzgicos inducidos por la luzFototoxicidad sistFototoxicidad sistéémica; fototoxicidad de mica; fototoxicidad de

metabolitosmetabolitos

Estrategia racional para investigar los efectos Estrategia racional para investigar los efectos fotobiolfotobiolóógicosgicos de nuevos compuestos (II)de nuevos compuestos (II)

InvestigaciInvestigacióón n inin vitrovitro del potencial del potencial fototfototóóxico de fxico de fáármacos rmacos

Abu

ndan

cia

rela

tiva

1.4

nm

Abs

orba

ncia

Abs

orba

ncia

0

1

2

00

0.30.3

0.60.6

0.90.9

1.21.2

250 300 350 400

Espectro SolarEspectro Solar

FFáámacomaco No FotosensibilizanteNo FotosensibilizanteFFáámacomaco FotosensibilizanteFotosensibilizante

SuperposiciSuperposicióón de los espectros de absorcin de los espectros de absorcióón de fn de fáármacos y rmacos y el espectro de luz solar incidente en la pielel espectro de luz solar incidente en la piel

Fototoxicidad Fototoxicidad

FFáármacormaco** DaDañño Celular o Celular (interacci(interaccióónn con Lcon Líípidos, Protepidos, Proteíínas o nas o DNA)DNA)

DaDañño celular. To celular. Téécnicas de ancnicas de anáálisislisis

PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotoFoto--uniunióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (FotoFoto--genotoxicidadgenotoxicidad))

Fototoxicidad Fototoxicidad

FFáármaco* interacciona con Lrmaco* interacciona con Líípidos Protepidos Proteíínas o ADN (Danas o ADN (Dañño Celular)o Celular)

Mecanismos y tMecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón del dan del dañño celularo celular

PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotoFoto--uniunióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (FotoFoto--genotoxicidadgenotoxicidad))

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60 TPA DTPA Control

LA h

ydro

pero

xide

s (µ

M)

Irradiation time (min)

(up to 4 isomers; two trans,cis-dienesand two trans,trans-dienes)

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

9- and 13-Hydroperoxides

Abso

rptio

n

Wavelength (nm)

(D)TPA Fotosensibiliza la (D)TPA Fotosensibiliza la PeroxidaciPeroxidacióónnde los de los áácidos grasos (cidos grasos (acac. . LinolLinolééicoico))

Photosensitizer

O2R R ´

LAhv

R R ´

OOH

9- and 13-HydroperoxidesR R ´

OOH

FotoperoxidaciFotoperoxidacióónn LipLipíídicadica

ÁÁcido cido LinoleicoLinoleico

FFáármacormaco

233 233 nmnm

233 233 nmnm¡

¡

AbsAbs

AbsAbs

Fototoxicidad Fototoxicidad

FFáármaco* interacciona con Lrmaco* interacciona con Líípidos Protepidos Proteíínas o ADN (Danas o ADN (Dañño Celular)o Celular)

Mecanismos y tMecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón del dan del dañño celularo celular

PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotoFoto--uniunióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (FotoFoto--genotoxicidadgenotoxicidad))

AT

hν(2X)

OH

OHProteína

AT O O ··ATHATH··

Proteína

OH

ATHATH··Proteína

Proteína

OH

Proteína

Modificaciones de proteModificaciones de proteíínasnas

Tyr, Trp, HisTyr, Trp, His

UniUnióónn covalentecovalente

FotocrosslinkingFotocrosslinking

• Chem. Res. Toxicol. 11, 172-177 (1998).• Eur. J. Org. Chem, 497-502 (1999)

FotoFoto--uniunióón a proten a proteíínas (uninas (unióón covalente)n covalente)EspectrofotometrEspectrofotometríía / a / FluorimetrFluorimetrííaa (previa purificaci(previa purificacióón o extraccin o extraccióón)n)DotDot blotblot / / westernwestern blotblot **ELISA ELISA **Radioactividad (compuestos marcados)Radioactividad (compuestos marcados)

FotoFoto--uniunióón a cn a céélulaslulasVisualizaciVisualizacióón directa al microscopio n directa al microscopio (solo compuestos fluorescentes)(solo compuestos fluorescentes)InmunotiniInmunotinióónn **DotDot blotblot / / westernwestern blotblot **CitometrCitometríía de flujo a de flujo **

* Son necesarios anticuerpos especSon necesarios anticuerpos especííficosficos

FormaciFormacióón de aductosn de aductos

FFÁÁRMACO RMACO --COOHCOOH + +

ObtenciObtencióón de Anticuerpos Fn de Anticuerpos Fáármacormaco--EspecEspecííficosficos

RSARSA

NHNH22 EDCEDC

InmunizaciInmunizacióón de los conejosn de los conejos

HaptenoHapteno + + AdjuvanteAdjuvante

sangrsangrííaa

AnticuerposAnticuerpos

HaptenoHapteno

OOFFáármacormaco--CC--NHNH--RSARSA

UVAUVA

GelGel--filtracifiltracióónn

Monitorización espectrofotométrica

FFáármacormacolibrelibre

AductoAductoFFáármacormaco--ProteProteíínana

FotoFoto--uniunióónn a a proteproteíínasnas

BSA-TPA

0

0,5

240 280 320 360 400

nm

Abs

TPA

1

FormaciFormacióón de aductos de proten de aductos de proteíína na

Análisis mediante gel-filtración y monitorización espectrofotométrica

FotoFoto--uniunióónn a a proteproteíínasnas

BSA

Western blotWestern blot

ElectroforesisElectroforesis

TinciTincióón de n de proteproteíínasnas

cpm

+ + SustratoSustrato FFáármacosrmacosradioactivosradioactivos

FotoFoto--uniunióónn a a proteproteíínasnas

33HH1414CC

Western blotWestern blotFFáármacosrmacos marcadosmarcados

MezclasMezclas de de irradiaciirradiacióónn (UV, HSA, (UV, HSA, FcoFco))

Densitometria Densitometria

Proteína Western3 horas

Modificaciones en proteModificaciones en proteíínas fotosensibilizadas por TPAnas fotosensibilizadas por TPA

M BSA + TPA

24 -

198 -

75 -

49 -

Kd

0 15’ 1h 3hTiempoTiempo de de irradiaciirradiacióónn

+ + SustratoSustrato

ELISA ELISA ((EnzymeEnzyme--LinkedLinked ImmunosorbentImmunosorbent Assay)Assay)

LavadoLavado LavadoLavado

SIEMBRA:SIEMBRA:MezclasMezclas de de irradiaciirradiacióónn (UV, HSA, (UV, HSA, FcoFco.) .) AntAntíígeno fotoqugeno fotoquíímicomicoAntAntíígeno sintetizadogeno sintetizado ququíímicamentemicamente

pmolpmol TPA/pocilloTPA/pocillo0.10.1 11 1010

Abs

orba

ncia

(10

Abs

orba

ncia

(10-- 33

))

200200

400400

600600

800800

10001000

12001200

14001400

CuantificaciCuantificacióón de foton de foto--aductos por medio de ELISAaductos por medio de ELISA

AbsAbs = 825 x 10= 825 x 10--33

BSA irradiado TPABSA irradiado TPA

pmol = 1

Curva patrCurva patróónn

FotoFoto--uniunióón a proten a proteíínasnas

Fototoxicidad Fototoxicidad

FFáármaco* interacciona con Lrmaco* interacciona con Líípidos Protepidos Proteíínas o ADN (Danas o ADN (Dañño Celular)o Celular)

Mecanismos y tMecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón de dan de dañño celularo celular

PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotouniFotounióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (Fotogenotoxicidad)Fotogenotoxicidad)

Ruptura de ADNRuptura de ADNModificaciones de basesModificaciones de basesMutacionesMutaciones

Especies Especies reactivasreactivas

hhννFFáármacormaco

Daño al ADN

- -

FOTOGENOTOXICIDAD FOTOGENOTOXICIDAD

EfectosEfectos biolbiolóógicosgicosDaDañño al ADNo al ADN (ruptura de ADN, da(ruptura de ADN, dañño oxidativo)o oxidativo)MutagMutagéénesisnesisCarcinogCarcinogéénesisnesis

TTéécnicas experimentalescnicas experimentalesModificaciModificacióón de ADN n de ADN (rupturas de cadena, bases, Comet (rupturas de cadena, bases, Comet

assayassay))TestTest de reparacide reparacióón de n de SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae mutantemutanteCarcinogCarcinogéénesisnesis in vivoin vivo (e.g. (e.g. SkhSkh--1 1 mousemouse))

FOTOGENOTOXICIDAD FOTOGENOTOXICIDAD

FOTOGENOTOXICIDAD FOTOGENOTOXICIDAD

- -

••SecuenciaciSecuenciacióónn••Ruptura de ADN (SSB)Ruptura de ADN (SSB)••Comet AssayComet Assay

PlPláásmido smido SuperSuper--enrolladoenrollado

FFáármacormaco

Ruptura de Ruptura de cadenacadena SimpleSimple(el pl(el pláásmido se smido se circularizacirculariza))

Ruptura de Ruptura de cadenacadena DobleDoble(el pl(el pláásmido se smido se linearizalineariza))

Forma I

Forma II

Forma III

Ruptura de ADN (SSB)Ruptura de ADN (SSB)

PbrPbr 322322

PbrPbr 322322 PbrPbr 322 + TPA 0.25 mM322 + TPA 0.25 mM

Forma II (circular)Forma III (lineal)Forma I (empaqueta

Forma II

0 15 45 75 105 135

Irradiación UVA (minutos)

0 135

Ruptura de ADN (SSB)Ruptura de ADN (SSB)

00

2020

4040

6060

8080

100100

120120

Control Control 135 135 00

TiempoTiempo de de irradiaciirradiacióónn UVA (UVA (minutosminutos))

1515 4545 7575 135135

% F

orm

a II

y III

% F

orm

a II

y III Forma IIIForma III

Forma IIForma II

CuantificaciCuantificacióón de la n de la abundanciaabundancia relativarelativa de de laslas formasformas II y III II y III ((mediantemediante densitomerdensitomerííaa de un gel)de un gel)

00TPA 0.25 mMTPA 0.25 mM

UtilizaciUtilizacióónn de enzimas de enzimas especespecííficosficos parapara revelarrevelardadaññosos en el ADNen el ADN

T4 T4 EndonucleasaEndonucleasa V: V: Revela los dRevela los díímeros de timidina, meros de timidina, citosina (pirimidinas) y los sitios sin bases.citosina (pirimidinas) y los sitios sin bases.

FpgFpg ((FormamidoFormamido pyrimidine pyrimidine glycolaseglycolase)) :: Revela daRevela dañño oxidativo en o oxidativo en guaninas (8guaninas (8--oxoguaninaoxoguanina) y adeninas. ) y adeninas.

EndonucleasaEndonucleasa III: III: Revela daRevela dañños oxidativos en os oxidativos en timidinastimidinas, , citosinascitosinas y los sitios sin bases.y los sitios sin bases.

NO ENZYMENO ENZYME FPGFPG ENDO IIIENDO III

2,5

2,5

µµ M n

o U

VA

M n

o U

VA

UV

AU

VA

alon

eal

one

1 1 µµ MM

2,5

2,5

µµ MM

0,5

0,5

µµ MM

UV

A 1

5U

VA

15

’’

2,5

2,5

µµ M n

o U

VA

M n

o U

VA

UV

AU

VA

alon

eal

one

2,5

2,5

µµ MM

0,5

0,5

µµ MM

2,5

2,5

µµ M n

o U

VA

M n

o U

VA

UV

AU

VA

alon

eal

one

2,5

2,5

µµ MM

0,5

0,5

µµ MM

1 1 µµ MM

1 1 µµ MM

UV

A 1

5U

VA

15

’’

UV

A 1

5U

VA

15

’’

UtilizaciUtilizacióónn de enzimas de enzimas especespecííficosficos parapara revelarrevelardadaññosos en el ADN en el ADN porpor TPATPA

ESTRUCTURA DEL ADNESTRUCTURA DEL ADN

PlPláásmidosmido

Nucleosome

Solenoid

Uncoiled chromatinDNA strand Chromosome

Estructurade un gen

Comet AssayComet Assay

Control TPA

UVA TPA + UVA

CCéélulaslulas en en suspensisuspensióónn

+ F+ Fáármacormaco

+ Agarosa+ Agarosa

UVAUVA

++ -- TinciTincióónn

TTéécnicascnicas de de valoracivaloracióónn in vitroin vitro de la de la FototoxicidadFototoxicidad a a nivelnivel celularcelular

UVAUVA

OO2211OO22

··

DaDaññoocelularcelular

FFáármacormaco

NeutralRed

MTT

LDH

Mediadores de la inflamaciónIL - 1β, IL - 6, PEG2

FototoxicidadFototoxicidad CelularCelular

FFáármacormaco

células

UVA

Test de viabilidad

FototoxicidadFototoxicidad CelularCelular

X

FFáármacormacoX

Cultivo de cCultivo de céélulas epiteliales humanaslulas epiteliales humanas

KeratinocitosKeratinocitosFibroblastosFibroblastosModelos de piel Modelos de piel ((EpiskinEpiskin, , EpidermEpiderm..)..)

30.000 30.000 ccéélulaslulas / / pocillopocillo

FotoFoto--reactor / Simulador Solarreactor / Simulador Solar

U.V.A.

2.4

0

mw/cm2

TTÉÉCNICAS DE VALORACICNICAS DE VALORACIÓÓN DE N DE VIABILIDAD CELULARVIABILIDAD CELULAR

•• LDH LDH •• RojoRojo NeutroNeutro (NRU)(NRU)•• MTTMTT

LDHLDH

• J. Pharm. Sci. 76, 374-378, (1987).• Photochem. Photobiol. 46, 991-996 (1987).

COOH COOCH3

+++

+ +

CH2OH

hνCH3OH

7 h.I (1%) II (5%) III (21%)

VI (5%)

OH

V (8%)

O

IV (8%)0

50

100

150

200

250

300

350

400

Control I II IV V Ibup

Xenobiotic

LDH

act

ivity

in c

ultu

re m

ediu

m

(mU

per

pla

te)

FFáármacormacoControlControl

Ibuprofeno

TestTest del Rojo Neutro (RNU)del Rojo Neutro (RNU)

Solo las cSolo las céélulas que no estlulas que no estáán dan daññadas con capaces de tomar el adas con capaces de tomar el rojo neutro en sus lisosomasrojo neutro en sus lisosomas

FFáármacormaco

+ + RojoRojo NeutroNeutro

MMéétodotodo colorimcoloriméétricotrico, , basadobasado en la en la capacidadcapacidad queque presentanpresentan laslas ccéélulaslulas viablesviables de de reducirreducir el MTT (el MTT (salsal de de tetrazoliotetrazolio) en un ) en un compuestocompuesto insoluble en insoluble en aguaagua queque quedaquedaretenidoretenido en en laslas ccéélulaslulas ((azulazul de de formazformazáánn). ). EstaEsta actividadactividad estestáá presentepresente en en laslasmitocondrias y el mitocondrias y el enzimaenzima responsableresponsable eses la la succinatosuccinato deshidrogenasa. deshidrogenasa. TranscurridoTranscurrido el el periodoperiodo de de incubaciincubacióónn con con laslas ccéélulaslulas, el , el colorantecolorante formadoformado se se extraeextrae de de laslas ccéélulaslulas, , se se disuelvedisuelve y se lee y se lee susu absorbanciaabsorbancia a 550 nm.a 550 nm.

MTTMTT

No absorbe a 550 No absorbe a 550 nmnm MMááximo de ximo de absabs a 550 a 550 nmnm

0102030405060708090

100

Oscuro LUZ 15minutos

LUZ 60minutos

ControlIBUTPA

Via

bilid

adV

iabi

lidad

(% d

el c

ontro

l)(%

del

con

trol)

Test de viabilidad MTTTest de viabilidad MTTFármacos a 0.3 mM.UVA = 0.9 mw/cm2

Medida de Prostaglandina en fibroblastos humanos Medida de Prostaglandina en fibroblastos humanos irradiados en presencia de irradiados en presencia de áácido cido fenoffenofííbricobrico

FFA ( µM)

0.1 1 10 1000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000dark controlirradiated

B

C

FFA ( µM)

0.1 1 10 100 1000

MTT

(% o

f con

trol)

0

20

40

60

80

100

120

dark controlirradiated

A

PGE 2(

pg/m

l)C

IntroducciIntroduccióónn

Fototoxicidad Fototoxicidad (mecanismos y t(mecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón)n)PeroxidacionPeroxidacion LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotoFoto--uniunióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (FotoFoto--genotoxicidadgenotoxicidad))

FotogenotoxicidadFotogenotoxicidadSSBSSBComet AssayComet AssaySecuenciaciSecuenciacióónn

FotoalFotoaléérgiargiaDiferenciaciDiferenciacióónn ((reccionesrecciones fotoalfotoaléérgicas/rgicas/fotoirritantesfotoirritantes))SensibilizaciSensibilizacióón y proliferacin y proliferacióón linfocitosn linfocitos

Fototoxicidad SistFototoxicidad Sistéémicamica

FOTOTOTOXICIDADFOTOTOTOXICIDAD* Generalizada* Generalizada* Manifestaciones en todos los individuos a * Manifestaciones en todos los individuos a

la dosis adecuadala dosis adecuada* Puede aparecer en la primera exposici* Puede aparecer en la primera exposicióónn* Los efectos son dependientes de la dosis* Los efectos son dependientes de la dosis

del agente y la radiacidel agente y la radiacióónn* Erupci* Erupcióón n monomorfamonomorfa con edemacon edema* Per* Perííodo prodrodo prodróómicomico* Citotoxicidad debida a productos * Citotoxicidad debida a productos intermediosintermedios

* Lesi* Lesióón exclusivamente en el n exclusivamente en el áárea expuestarea expuesta* No hay reacci* No hay reaccióón cruzadan cruzada* El individuo no queda sensibilizado* El individuo no queda sensibilizado

FOTOALFOTOALÉÉRGIARGIA* Idiosincr* Idiosincráásicasica* Baja incidencia* Baja incidencia* Requiere una segunda exposici* Requiere una segunda exposicióónn* No dependiente de la dosis de agente y * No dependiente de la dosis de agente y radiaciradiacióónn* Eczema, * Eczema, papulaspapulas, urticaria, urticaria* Las primeras manifestaciones no * Las primeras manifestaciones no aparecen hasta los 7aparecen hasta los 7--21 d21 dííasas* Participaci* Participacióón del Sistema n del Sistema InmunolInmunolóógicgic* Lesiones diseminadas, brotes* Lesiones diseminadas, brotes* Reacciones cruzadas* Reacciones cruzadas* El individuo queda sensibilizado, incluso * El individuo queda sensibilizado, incluso durante adurante aññosos

REACCIONES FOTOALREACCIONES FOTOALÉÉRGICASRGICAS

00.5

11.5

22.5

33.5

Aci

doTi

apro

feni

co

Fent

iclo

r

Car

prof

eno

Prom

etac

ina

Clo

rpro

mac

inaR

eacc

ione

s R

eacc

ione

s fot

oal

foto

aléé r

ficas

rfic

as(%

)(%

)

FOTOALFOTOALÉÉRGIARGIA

TTH 1H 1

DaDaññoo celularcelular mediadomediadoporpor el el sistemasistema inmuneinmune

Activación del sistema inmune

hhνν

FFáármacormacoTcTc/K/K

TH0

APCAPC

IgG IgM

TTH 1H 1

TTH 2H 2

BB

MacrMacróófagosfagos

FotoFoto--uniunióón a proten a proteíínas (uninas (unióón covalente)n covalente)EspectrofotometrEspectrofotometríía / a / FluorimetrFluorimetrííaa (previa purificaci(previa purificacióón o extraccin o extraccióón)n)DotDot blotblot / / westernwestern blotblot **ELISA ELISA **Radioactividad (compuestos marcados)Radioactividad (compuestos marcados)

FotoFoto--uniunióón a cn a céélulaslulasVisualizaciVisualizacióón directa al microscopio n directa al microscopio (solo compuestos fluorescentes)(solo compuestos fluorescentes)InmunotiniInmunotinióónn **DotDot blotblot / / westernwestern blotblot **CitometrCitometríía de flujo a de flujo **

* Son necesarios anticuerpos especSon necesarios anticuerpos especííficosficos

FFáármacormaco

células

Inmunotinción

FotoFoto--uniunióónn a a ccéélulaslulas

Citometría de flujoXX

UVAUVA

OSCURIDAD

Control TPA (0.3 mM)

Texas Red

Peroxidase

(Anti TPA + labelled 2nd antibody)

InmunotinciInmunotincióónn de de ccéélulaslulas 3T3 3T3 irradiadasirradiadas con TPAcon TPA

+ + enzimaenzima

CitometrCitometríía de a de flujoflujo de de ccéélulaslulas de de ratratóónn irradiadosirradiados en en presenciapresencia de TPA y DTPAde TPA y DTPA

KineticKinetic UVA UVA irradiationirradiation

IrrdiationIrrdiation ((JulsJuls))

Fluo

resc

ence

Fluo

resc

ence

(( Geo

met

ricG

eom

etric

mea

n)m

ean)

11

22

33

44

55

66

77

88

99

0.00.0 0.50.5 1.01.0 1.51.5 2.02.0

TPA 50 TPA 50 µµg/mlg/mlDTPA 50 DTPA 50 µµg/mlg/ml

Control Control withoutwithout drugdrug

(Anti TPA labelled with texas red)

ConcentrationConcentration ((µµg/ml)g/ml)

00 1010 2020 3030 4040 5050

55

DTPADTPA

Control Control DarkDark

2 J. 2 J. IrradiationIrradiation

TPATPA

Fluo

resc

ence

Fluo

resc

ence

(( Geo

met

ricG

eom

etric

mea

n)m

ean)

11

22

33

44

55

66

77

88

99

* * FotoantFotoantíígenogeno (SUP)(SUP)* * MitogenoMitogeno (Con A)(Con A)* * Control negativoControl negativo

InmunizaciInmunizacióón n de Ratonesde Ratones

ExtracciExtraccióón del Bazo, n del Bazo, obtenciobtencióón de linfocitosn de linfocitos(gradiente de centrifugaci(gradiente de centrifugacióón)n)

ProliferaciProliferacióónnde linfocitosde linfocitos

Siembra en PlacaSiembra en Placa

Fibroblastos de ratFibroblastos de ratóón n irradiados con SUPirradiados con SUP

DetecciDeteccióón de Linfocitos sensibilizados contra fn de Linfocitos sensibilizados contra fáármacosrmacos

33H TimidinaH Timidina + +

Ratón Control Ratón SUP400400

600600

800800

10001000

12001200

14001400

16001600

18001800

20002000

Control -SUPCon A

Tim

idin

a Ti

mid

ina

33 H (

H ( c

pmcpm

// min

min

))ProliferaciProliferacióón de Linfocitosn de Linfocitos

UVAUVA

Medida inflamaciMedida inflamacióón de la orejan de la oreja(mediante un micr(mediante un micróómetro)metro)

ExtracciExtraccióón y ann y anáálisis de nlisis de nóódulos linfdulos linfááticos prticos próóximos a la zonaximos a la zona(contaje total de c(contaje total de céélulas y subpoblaciones)lulas y subpoblaciones)

FFáármacormaco

Modelo integrado para la diferenciaciModelo integrado para la diferenciacióón entre fn entre fáármacos que rmacos que inducen a reacciones fotoalinducen a reacciones fotoaléérgicas y/o rgicas y/o fotoirritantesfotoirritantes

0,19

0,2

0,3

1,8

14,5

0,1

5,8

0,8

16,6

0,010,01 0,10,1 11 1010 100100

oral + UVoral + UV

SPA SPA

31183118

88--MOP MOP

CHLCHL

OLA OLA

dermal +UVdermal +UV

88-- MOP 0,3% MOP 0,3% epicu.+UVAepicu.+UVA

TCSA 1% TCSA 1% epicuepicu. +UVA. +UVA

dermal dermal -- UVUV

CROT.1% CROT.1% epicuepicu..

OXA 1% OXA 1% epicuepicu..

Irritant Potential Irritant Potential Irritant Potential

Allergic Potential Allergic Potential

IndiceIndice de de DiferenciaciDiferenciacióónn::% del n% del nºº mmááximo de cximo de céélulas del NL lulas del NL

incremento en % del la inflamaciincremento en % del la inflamacióónn

Fototoxicidad epitelial mediada por metabolitos Fototoxicidad epitelial mediada por metabolitos producidos en otros producidos en otros óórganos ( Hrganos ( Híígado) gado)

Fototoxicidad sistFototoxicidad sistéémica mediada por mica mediada por fotoproductosfotoproductosproducidos en la pielproducidos en la piel

Fototoxicidad de metabolitosFototoxicidad de metabolitos

FototoxicidadFototoxicidadmediadamediada porpormetabolitosmetabolitos

CYPCYP--VirusVirus

24 24 horashoras

FFáármacormaco

FormaciFormacióónn dedemetabolitosmetabolitos

CCéélulaslulas epitelialesepiteliales Test de Test de viabilidadviabilidadCCéélulaslulas modificadasmodificadas((expresanexpresan CYPs)CYPs)

UsoUso de de ccéélulaslulas modificadasmodificadas geneticamentegeneticamente parapara producirproducir metabolitosmetabolitos

EnsayoEnsayo in vitroin vitro parapara investigarinvestigar el el riesgoriesgofototfototóóxicoxico de de loslos metabolitos de un metabolitos de un ffáármacormaco

hν

FototoxicidadFototoxicidadsistsistéémica mica mediadamediadaporpor fotoproductosfotoproductosproducidosproducidos en la en la pielpiel

EfectosEfectos en DNAen DNA• SSB plasmid DNA• Daño Oxidativo Efectos

Efectos en en LLíípidos

pidos

•Oxidación del ácido

Linoleico (UV; HPLC)Efec

tos

Efec

tos e

n en P

rote

Prot

eííansan

s

•Cr

ossli

nkin

g(P

AGE)

•Fo

to-u

nió

(ELI

SA)

PrePre--screeningscreening

Análisis de fármacos potencialmente fotosensibilizantes

22ºº ScreeningScreening

Efectos fototóxicosdependientes de

metabolitos• Fotoxicidad de Fotoproductos

• Fototoxicidad de Metabolitos

EfectosEfectos fototfototóóxicosxicosdependientesdependientes de de

metabolitosmetabolitos• Fotoxicidad de Fotoproductos

• Fototoxicidad de Metabolitos

Genotoxicidad• Comet assay

• Daño oxidativo a ADN celular

• Reparación def. Sacharomyces

GenotoxicidadGenotoxicidad• Comet assay

• Daño oxidativo a ADN celular

• Reparación def. Sacharomyces

FFáármacormaco FotosensibilizanteFotosensibilizante((--)) ((++))

Test de Test de viabilidadviabilidad 3T3/fibroblastos 3T3/fibroblastos humanoshumanos11erer ScreeningScreening

Inmunotoxicidad & Fotoalérgia

• Discriminación entre potencial(foto) irritante/alérgico

InmunotoxicidadInmunotoxicidad & & FotoalFotoaléérgiargia

• Discriminación entre potencial(foto) irritante/alérgico