Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Estudio de los productos deEstudio de los productos defermentación de algunos fermentosfermentación de algunos fermentos

butírico-butílicosbutírico-butílicos

Hahn, Vera

1950

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Químicade la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Hahn, Vera. (1950). Estudio de los productos de fermentación de algunos fermentos butírico-butílicos. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0643_Hahn.pdf

Cita tipo Chicago:Hahn, Vera. "Estudio de los productos de fermentación de algunos fermentos butírico-butílicos".Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1950.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0643_Hahn.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FISICAS Y NATURALES

ESCUELA DE QUIMICA

ESTUDIO DE LOS PRODUCTOS DE FERMENTACIQN

DE ALGUNOS FERMENTOS BUTIRICO-BUTILICOS

T E S I S

presentada para optar al título deDOCTORA EN QUIMICA

por

V E R A H A H N

Igíáég/U É)É.É

- 1950 ­Año del Libertador General San Martín

A mis padres y al Doctor Alfredo A. Sordelli,

cuyo apoyo moral y consejos técnicos hicieron

posible la realización de este trabajo, dedi­co mi tesis.

Agradezco a1 Ing. Agr. Santos Soriano el haber dirigi­do en un comienzo mi trabajo y el haberme facilitado lamayor parte de las cepas a estudiar.

Asimisno quiero expresar mi reconocimiento a las nume­rosas personas que me han sido de ayuda, ya sea con conse­jos y datos, ya sea con material y drogas, a lo largo deeste trabajo. En especial agradezco la colaboración delpersonal del Taller de Vidrio de esta Facultad, donde hansido construidos los diversos aparatos y objetos que henecesitado.

D i: fihiCión del grupo de organismos en estudio

Entre las muynumerosas esDecies del género Clostridiumdescritas en la literatura se encuentren varias que, duran­te la fermentación de ciertos hidratos de carbono, producenácido butírico y alcohol butílico, al mismotiempo que dan

'J.‘ácido aCQbICO, alcohol etílico, acetona, alcohol isopropí­lico, anhídrido carbónico e hidrógeno.

No nos ocuparemos aquí de los clostridios patógenos quetambién a veces pueden producir algo de ácido butírico ybutanol, sino de clostridios no patógenos, con frecuenciapresentes en los suelos,capa0es de dar esos productos encantidades apreciables.

Todos los microrganismos que nos interesan tienen unapropiedad común: antes de esporular almacenan almidón, porlo cual lossu interiorreacción de la granulosa.

Existensonmostra

al ser teñidos con iodo,clostridios presentan granulaciones azules en

o sea dan la llamada

también plectridios granulosa positivos, peropoco fermentadores y muyproteolíticos. No los incluí­por eso en el grupo que estudiamos, del que son por o­parte perfectamente diferenciables por su morfologíaz

er efecto tales plectridios presentan bastones muydelgadoscon una esoora muy gruesa en un extremo, mientras que,los gérmenes que nos ocupan,esporas terminales o subterminales,

enaún cuando se observan a veces

éstas se hallan siempredentro de un bastón de tipo clostridio.

En resumen se trata de estudiar bastones anaerobios,opporulados, con formas clostridiales, no patógenos, queproducen ácido butírico y butanol al fermentar hidratos decarbono y que dan la reacción de 1a granulosa.

Antecedentes bibliográficos

Desde que Íasteur /1/ en 1Q52 encuentra butanol comoproducto directo de la fermentación, comienzan a apareceren la literatura artículos en que se describen, bajo losnombres más heterogéneos, cepas que producen fermentaciónbutírico-butílica. Así encontramosel Bacillus butylicus deFitz /2/, el bacillus amylobacter de Van Tieghem/5/, elClostridium butyrigug de Prazmowski/4/, los Bacillus am!­lobacter I, II y III de Gruber /5/, el Dacille amylozimedePerdr’x /6/, el Bacillus butïricus de Botkin /7/, el ga;cillus orthobutylicus de Grimbert /ó/, el Granulobacter bu­tylicum de Beijerinck /9/, el Amylobacter butvlicus de Du­claux /lC/, el ñranulobacillus saccharobutvricus mobilisnon-liguefaciens de Grassberger y Schattenfroh /ll/, elClostridiuc pasteurianuï de Winogradsky/l?/, el Bacillusmultifermentans tenalbus de Stoddard /15/, el Bacillus ven­turelli de Tomasi/14/, el Clostridium beiierinckii deDonker/l)/, el Clostridium viscifaciens de Shermany Erb/lS/, el Clostridiuu carbonei de Arnaudi/l7/, y otros.algunas de estas cepas no están bien descritas y varias sehan perdido.

En los años que precedieron a la primera guerra mundialsurgió la necesidad de obtener caucho sintético por polime­rización del butadieno: este último se prepara por clora­ción y deshalogenación posterior del n-butanol, de dondevino la importancia de conseguir una buena fermentación bu­tílica en le industria. Se realizaron muchosestudios alrespecto y en 1912 Úeizmann aisló un microrganismo que da­ba, en la fermentación de diversos almidones, buenos ren­dimientos en butanol y acetona. El organismo recibió porSnoakmen/lb/ el nombrede Bacillus granulobacterppectino­

3

voruu, que luego fué cambiado a Clostridium ccetobutylicumpor McCoy,Fred, Peterson y Hastings /l9/.

Con la guerra de 1914 surgió una gran demanda de aceto­na para explosivos y otros usos militares y después de laguerra se COLenzóa usar el butanol en forma de acetato debutilo comodisolvente para lucas de automóviles. La aceto­na es materia priha de varias importantes sintesis orgáni­

interviene en la fabricación de la seda artificial yO (JS

Cu

e

e materias plásticas. Estos y otros Luchos usos de talessolVentes explican el gran interés que adquirió la obten­ción de los mismospor fermentación en la industria y losLuchos artículos que se hallan publicados sobre este tema,aparte de a gran cantidad de patentes para la aplicaciónde las más variadas materias primas y de diversos procesos.

En nuestro estudio nos ocuparenos aderás de un grupo deuicrorgcnisros, tambiénbutirico-butílicos, cuyo apariciónvenln literatura está relacionada sin erbargo con otra ac­tividad industrial: el enriado del lino. COLOtales encon­traros el organisuo aislado por Fribes y descrito por Wino­gradsky en 1895 /20/, cl Plectridiun pectinovorun de Stor­mer /2l/, el Granulobactcr pectinovorun de Beijerinck y vanDelden /22/, el Pectinobacter ailvlophilun de Ivíakrinov/23/,el Bacillus felsineus de Ccrboney Toybolato /24/, el 3:;cillusgpgctinovorun de Henneberg/25/, el Clostridium pec­tinovoruh de Donker /15/, el Bacillugfinaunani de Soriano/26/. El ClostridiuL felsineun (Carbone y Tombolato) fuéestudiado y descrito correctamente por Sordelli y Soriano/35/; tanbien lo estudiaron Vander Lek /28/, Bergey et.al./29/ y McCoyy McClung/30/. Estos últimos autores descri­ben también el Clostridium roseun, relacionado con los mi­crorgcniSLos anteriores, pero no indican si es enriador ono /31/.

4

Dada la aplicación práctica de varios organismos del¿rupo en estudio, la mayor parte de lo que se ha escritosobre los mismosse refiere a las condiciones óptimas enque ha de Tnealizarse la fermentación, e los diversos sus­tratos que se pueden emplear, e los requerimientos nutriti­vos de las bacterias en cuestión, a la manera de fortalecerlos cultivos por "heat shocking", etc. Hay además una seriede estudios que tratan de aclarar el mecanismoenzimáticode la fermentación en el caso más interesante del organismacetobutílico. Pero existen relativamente pocos trabrjosque se ocupen de la sistemática del grupo. Al principio noestaban aún muyperfeccionados los métodos de cultivo y deestudic.de las proniedades bioquímicas de los anaerobios,de todo que no podemos hoy día estar seguros de cue todoslos cultivos antes citados fueran realmente anaerobios. Es­te hecho trae consigo ciertas complicaciones para la clasi­ficación de los microrganisu r descritos en la literatura.ncCo¿ ct al. /l9/, en su trabeïo sobre el organismo secto­butílicn, fueron los que aprovecharon los adelantos en losLétodïn para enaerobios y probaron varios propios, haciendoun verdadero estudio sistenático de once cepas de distintooriJen productoras de solventes, llegando a la conclusiónde que todas elles pertenecían e una misma especie, elCl stridium acetobutyliggfi (Weiznannï.

en 195€ los mismos autores /32/ publicaron un análogoestudio sobre 55 microrganismos butiricos, que dan en lefermentación acido butírico y acético pero no solventes:ellos dividen al grupo de los que llaman butíricos verdade­ros en j subgrupos: l. clostridios que no fermentan el al»uidón9 del tipo del Cl. pasteurianum, 2. clostridios quenIsrhentsn el alpidón, del tipo del Cl. saccharobutyricum y

5

5, plectridios que fermentwn el almidón, pero tienen msyoractividad proteolfticn y menor poder de fermentación quelos anteriores,

En 1554 aparece un articulo dc'Ianglkae, Peterson yMcCoy/jj/, continuación de los estudios citados, llevadose cabo en la Universidad de Wisconsin; el mismo se refiereal analisis cuantitativo de los productos de fermentaciónobtenidos con un ¿runo de 51 cultivos, que incluye, a másde Éos jj butíïicos del trabajo anterior, nuevns cepas bu­tíricas, algunas acctobutílicas, un Cl. felsineum, un El;roseum y un Cl. multifermentans. Dado que lts fermentecio­-cs no se hacen cn un sustrato de harina de maíz, que cs el

wedio más co únmente usado prra estos gérmenes en el lnbo­ratorio y en la industria, sino en agua de levadura conglucosa, y? no resulta evidente por los productos de fer­mentzción, según los datos de los autores citados, le diviwsión de los nicrorganismos en productores dc ácidos solos yen productores de ácidos más solventes: al contrario, lasccpcs de verdaderos butíricos dan a nenudo mejores rcndi»nicntos en solventes que las acetobutílicns y éstas, e suveu, figuren entre los mayores productores dc acidez.

Cono demostración completa de que el Cl. acetobutylicummerece ser reconocido como especie apart: (cosa ou; aún noSe hujía hecho en ln edición dc 1951 dcl “anual de bergcyï,ncCoy y ncClung /54/ publican en 1935 su estudio sobre lasprucbcs suerológicrs reclizadas con 22 cepas de Cl. accto­butylicum. Resulta evidente que todas ellas constituyen un:solr entidyd suerológica y que por otra parte están total­mente separados de una serie de cepas butíricas elegidas ulazar entre las mencionadasen la literatura.

En el mismo año mcCoyy ¿cClung publican dos artículosmLs: LLel primero /5l/ describen el Clostridium roseug

"—ñ_4_*4717

cn

aislado por Sir F. AnerWSy estudiado por ellos comparati­vamente con ¿l C1. ncctobutylicqg y el Cl. felsineum; 84 elsegundo/)O/ completan la diferenciación entre estes tres¿species con pruebas dc aglutinación.

Comoresultado de la vasta bibliografía existente, cnla edición dc 1918 del Lanual de Bergey figuran entre las61 cspccics dcl género Clostridium 10 especies grcnulosapositivas, cuyos datos útiles para la clasificación sacadosdel nonupl hemos rcsumido cn la tabla 1. Se puede observarque tales datos no son completos y que la clasificación en¿ac a los mismos no cs fácil dc hacer.

CD

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“O"-4oCU.pC1

Ferme

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91M epUOIOBWIOJ

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Productosde fermentacion

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Especie¿SporaPigmento

oo ewïi

UQDIWIVIOUIQIÜO

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TOPUI

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BInanedueL

asouranVBUITUUI

C:BULIG 01:101

9901097BSOOHID

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30M<- 90M

69

Ioseumoiuoo eqoeq

SISIIQWGHautistas

uo 1209110T'I

1211210

TtAoI

asoInuain

Í

locentralácidosorgánicos,

Clostridiumosub-butanol,etanol, butyricumterminalturbul,acetona,isopropq

la.central

Clostridium+osub-+ beijerinckiiterminalturbul.

IB.central«

Clostridium+osub-+i -——ACR37——+——+_-—+pasteurianumterminalturbul.

lc.central

Clostridium+osub-+i --+ACR57-++—++-++multifermentansterminalturbul.

5.centralbutanol,

Clostridium+osub-+---m36aa.de+-++++isopropanol,viscifaciensterminalñeptonascetona II.central-L 7—___butanoIÍ-EÏEHEIT-_"Clrstridium+osub-+-+-CR37-nde++--+++-+++acetona,butirico,acetobutylicumterminalNo;acético,H3,COg 49.centralbutanol,isobutano, Clostridium+osub-+rosado-C20-+-++----propanol,acetona,venturelliterminalamilicolacético

O.centralrojo—e>

Clostridium+osub-+púrpura+-CH37--de roseumterminalenelaireturbul.N05yNO'++ -++ -—++­

.centralDUUGHOL,EtanOL,

Clostridiumosub-+anaranjado+-ACR57--de _+++-++--++acetona,butírico,felsineumterminalN03y392acético,H2,CQ3_331etanol,

Clostridiumterminal-+rojo-AC57--ÍL-iÍbutirico,oarboneiH2,002,CH4

_.TABLA1

PrlnCIpalesdatosparalaclasificacióndelosclostridiosgranuÏosapOSitivos(extraídosdeBergey,p.763-827,ed.l948)

I

+++

l

t

+

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L\FJ

{fiC.)4

I

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l

+l

+

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+l +| .H +1

+ +

7

Objeto del presente trabajo

los ChaliSiS dc los productos dc fermentación d; losan CIObiOSbutirico-butílicos rcñliZQdos cn Üisconsin y ci­tados rntcriorMcntc /5)/ no sólo no indican una busnn cl:­sificcción ¿o los microrganismos ¿cl grupo en cuestión, si­no gus invalidnn hïstd cicrto punto la distinción ya exismtonto antro los productorcs dc solventes y los productorcsdc ¿oidos° En cfccto los primeros dan, on cl medio de cul­tivo usado por Iñnglykkc y sus colaboradores, Cintidadcs¿randos dc ácidos y pocos solventes; por otra parto hay cc­pos butíricns quc dan muchossolvcntcs; en particular, hsyccprs tanto del tipo dcl Cl. pastcuricnum comodel 9;;s*cchfrobutyricum que producen alcohol isopropílico, midn­tros que otras dc ambos tipos no lo dan. Además, un cl cguadc lav1durs con agregado dc glucosa quc uSñn esos autores,muchos dc los ¿érmcncs formcntcn menos del 50 fi del ÓZÚCÜTprascntc, con lo cucl lp producción de solventes cs nuessn­ri*mc;tc pcqucña y los análisis cuantitativos so vuelvenwenos c;nctosr cs muyposible que, por cjcrp10,no sc lle­¿nun ‘ aprcciar muy pequeñas cantidades dc isopronanol cnsl mosto poco fcrmentndo.

A pcs r dc todos estos inconvenientes, pnrccc rhzonablopcns r quo, nnálog non c a como sc hrn podido reunir cn un:sola cntidad las varias CcDCSdc organismos ncctobutilicos,dcbiczcn podcrsc aorupnr cn unas pocas especies los muchoscc TS dc cnccrobios butiricos que Sc conocen.

Dc chi que un un comienzo nucstro trabcjo tratara dc l?posibilidpd dc clcsificnr 2 los c "crobios butírico-butíli—cos, fundhdc cn cl cnálisis cusntitctivo dc sus productosdc'fcr cntáción cn diversos wcdios dc cultivo y cn al uncs

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propicd ¿es bioquímicos importantes ps‘rP este grupo de 34r­

Se dccidió estudiar las siguientes propiedades que, de;cucrdo 9 los CiÉTSbibliográficas, porccícn permitir P1"¿un? diferenciación entre los divorson gérmenes del grupo:k.)

In. morfologinb. reccción de lr ¿ranulosnc. licuación de ln gelatinad, formïción de rcctilmetilcarbinolp. erriadof. ataque del :lmidón.¿s se debían deterninrr cuantitativaeente:1. PZúCÉrresidualJ. alcohol butïlico5. clcohol etílico4. ncetonnb. rlcohol is0propílico6. pIí7. acidez total

. ácido butírico

. ácido bcético.losteriormcntc se pudo aprecirr que lá cher37dÜ'7 de

este trabajo sobrepasaba nuestras posibilidades experimen­trlcs. Ïor lo tánto nos limitrmos o estudinr los métodosquímicos y aicrobiológicos necesarios y a aplicarlos a unospocos cultivos representativos entre los onrerobios butíri­co-butílicos, cono un primer intento pcrr 10grnr un mejorconocimierto de l; asociación de las propiedades fermenta­tivcs con otras ¡:0rfológicas, bioquímicas, 3to.), por: no­derlrs empleflr lue¿o comobase de un? mejor diferenciaciónde lvs CSDecies del ¿rupo.

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Descripción de las cepas estudiadas yrsu origen

"87H

Cepa "181"

Cepa "179"

Cepn "180"

Cep: "1-1"

Copa n4_2n

Capa n4_1n

procedente de la National Collection of TypeCulturcs (Lister Inst., London); está rotula­da comoClostridium granulobacter pectinovo­¿ug Wciznan.

posiblemente procedente de Delft (?); estárotulada comoClostridium beiigrinckii.

procedente del Laboratorio de Pribram, Viena;está rotulado comoClostridium butïlicum.

posiblemente originaria de Delft (?); estárotuloda comoClostridium ncetobutylicum.

es el Clostridium felsineum aislado de un pre­parado de "Felsinozima" obtenido de Italia yestudiado en 1928 por Sordelli y Soriano /55/.

es un Clostridium felsineum aislado por Soria­no de una nuestra de lino enriado en el labo­ratorio, que de colonias anaranjadas en agar/'56/.

es otro Clostridium felsineum aislado por So­riano conjuntamente con cl anterior, pero quea colonias blancas en agar /36/.

Las siete cepas anteriores fueron recibidas de la Colec­. I . .Clon n10rob1 na de a Cátedra de nicrobiología Agrícola de

le Facultad de Agronomíay Veterinaria de Buenos Aires, porintertedio del Ing, Agr. Santos Soriano.

lO

Ademásse estudiaron las cepas siguientes:

Cepo "D" recibida del Dr. A.F. Langlykke; está rotula­da como Clostridium acetobutylicum. McCoyyncC1ung/34/ indican que es el Clostridiumacetonigenuu (Speaknan) Donker, presentado en1926 por Kluyver a la American Type CultureCollection, en la cual figura bajo el N° 862.

Copa "B-8-3" recibida del Instituto de Microbiologia Agrí­cola del Linisterio de Agricultura de la Na­cion; está rotulado comoClostridium acetobu­txlicun, cepa W de Wisconsin; McCoyy McClung/34/ indican que se trata del nal llamadoClostridium butyricun Prazuowski, presentadopor Ueyer en 1926 y existente en la n.T.C.C.bajo el N° 824.

Sin pretender establecer un sistema dc clasificación delas becterias butírico-butílicas y tan sólo para simplifi­car la coupilación de los datos obtenidos en el curso deltrabajo y para utilizar de algún nodo dichos datos, hemosdesignado con el nombre de tipos a n abres ya usados cn laliteratura por otros autores. Así designaüos o las cepas 87y 181 cono del tipo del Clostridium pesteurianum y a lascepas 179 y 180 cono del tipo dcl Clostridium saccharobutx:ricua, por ser cepas que no atacan el alridón las primerasy cepas que lo atacan las segundas.

Nos en guiado en la elección de esos nombres ciertaspropiedades encontradas por nosotros que corresponden a al­gunas ya utilizados por otros autores para fundamentar lacreacion del nonbre con alcance taxonónico. En nuestro casoesa designación no tiene por el contrario sentido ni inten­cion taxonónicos algunos.

llMétodosbacteriológicos

a. Estudio de la morfología.

De los extendidos de los cultivos se hicieron colora­ciones de Gramsegún la modificación de Kopeloff y Beerman,usando para decolorar una mezcla de acetona y alcohol etí­lico por partes iguales (Manual of Methods for Pure CultureStudy, IV46:8-10; III43214).

Los resultados de las observaciones, que fueron hechassobre cultivos en medio de levadura, se dan a continuación.

Durante las primeras 48 horas hay en todas las cepasbastones Grampositivos más o menos abundantes, los quesiempre aparecen más gruesos y derechos que los Gramnega­tivos presentes en el mismopreparado. A veces forman cade­nas o filamentos.

Los bastones Gramnegativos jóvenes se tiñen con uni­formidad por la fucsina, mientras que los viejos son gra­nulosos.

Se observa que las cepas 87, 181, 179 y 180 dan basto­nes Gramnegativos gruesos; en las mismas los clostridiosno son en general abultados, sino que sólo se notan por latinción marcadamentebipolar de los bastones, quedando sinteñir la parte central con la espora. Las cepas l-l, 4-2,4-1, D y Bu8-3 dan por el contrario bastones Gramnegativosdelgados, de largo variable; en las cepas 1-1 y 4-2 se hanobservado clostridios Gramnegativos con espora subterminalGrampositiva; en las cepas 4-1, D y B-8-3 no se han vistoclostridios en las coloraciones de Gramobtenidas de culti­vos en medio de levadura.

Simultáneamente a las coloraciones de Gram, se hicieronsiempre preparados coloreados por la técnica de Wirtz modi­

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ficada por Schaeffer y Fulton dada en el Manual (IV46:13),con objeto de obsgrvar la presencia de esporas sueltas. Fuénecesario usar esta coloración, porque varias cepas esporu­laban pOCOen el medio de levadura y por la coloración deGramera difícil hallar las esporas en esos casos.

Se observó que la esporulación ya comenzaba el primerdía en las cepas 87, 181, 179 y 180 (aún siendo más escasaen la 87); en las cepas l-l y 4-2 se hallaron esporas suel­tas al segundo día; en las cepas 4-1, D y B-8-3 no se en­contraron tampoco en cultivos de un mes. Estos resultadosconcuerdan con la observación de formas Clostridiales.

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b. Reacción de la granulosa.

Ios primeros ensayos se hicieron agregando a un prepa­rado sin secar una gota de Lugol, según indica el Manual

(11145216). Sin embargo resultó incómodo este método yaque, si se observaba el preparado debajo de un cubreobjeto,el aumentoresultaba insuficiente para observar bien losgránulos azules en los bastones y por otra parte, si se loquería mirar con el lente de inmersión, había que dejarlosecar sin poderlo calentar para que no se volatilizara eliodo° El proceso era muy lento.

Muchomejores resultados se obtuvieron por la técnicasiguiente: el preparado se extiende y seca calentando sua­vemente y enseguida se coloca en una caja de Petri dondehaya unos cristales de iodo. A los pocos minutos ya los va­pores de iodo se han depositado abundantemente sobre elpreparado. Entonces se lo observa con el objetivo de inmer­sión.

Todas las cepas estudiadas en este trabajo han resulta­do ser granulosa positivas. Sin embargohubo que repetir aveces la observación, porque no en todos los preparados sepodía ver claramente la tinción azul dada por el iodo: estono pareció deberse a defecto de técnica, sino a la gran es­casez de bastones granulosa positivos en algunos de loscultivos.

Se vió que el tipo de reacción difiere según la cepa:en la 87 y 181 los bastones se tiñen de un color azul uni­forme, en su tótalidad o parcialmente; en la 179 y 180 sehallan gránulos azules en general en los extremos de losbastones; en la 1-1, 4-2 y 4-1 se tiñe sólo un extremo delbastón abultado, quedandola espora subterminal sin teñir

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(el bastón parece un cigarro a medio fumar) o bien los bas­tones algo abultados aparecen llenos de gránulos azules;estos últimos predominan en D y B-8-3.

En general se observa bien la reacción de la granulosadentro de las primeras 48 horas de desarrollo, aunque a me­nudo subsiste después, siendo perfectamente visible en lascepas 87 y 181 al cabo de un mes. Estos dos cultivos pre­sentan todavía otra particularidad con respecto a la reac­ción de la granulosa: el preparado sometido a los vaporesde iodo sc tiñe todo de azul violeta. Los demás cultivos enlas mismas condiciones adquieren un color amarillo parduz­co° Volveremosa mencionar esta particularidad al estudiarcl ataque del almidón.

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c° Licugción de la gelatina.En base a las indicaciones de McCoyet al. /l9/, se usó

comomedio de cultivo para estas observaciones gelatinaglucosada preparada de la siguiente manera:

peptona 5,0 g.extracto de carne 5,0 g.glucosa 2,5 g.gelatina 150 g.agua destilada lOOO ml.

Se disuelven todos los ingredientes en el agua caliente yse ajusta el medio a pH 7,0; se clarifica con una clara dehuevo batida a nieve, a vapor fluyente en el autoclave du­rante 30 minutos. Luego se filtra en caliente por algodón,se reparte en tubos de 8 x 80 mm. (3 ml. por tubo) y se es­teriliza a llO°C durante 30 minutos.

El inoculum consistió en 0,15 ml. de un cultivo de 24horas en medio de papa-levadura. La incubación se hizo a37°C, observándose el desarrollo por el desprendimiento degases. Los tubos se colocaron cada día en la heladera du­rante unos 30 minutos para poder ver la licuación o no dela gelatina, repitiéndose el ensayo durante un mes en loscasos negativos.

los cultivos que licuaron la gelatina lo hicieron enmenos de 3 días. Todos los ensayos se hicieron por duplica­'do. Están resumidos cn la tabla 2.

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T A B L A 2

C e p aLicuación de la gelatina

tipo N°

87 ­Cl. pasteurianum

181 ­

179 ­C1. saccharobutyricum

180 ­

l-l +C1. felsineum 4-2 +

4-1 +

D +Cl. acetobutylicum

3-8-3 +

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d. Formaciónde acetilmetilcarbinol.

La presencia de acetilmetilcarbinol en los mostos fer­mentados se investigó cualitativamente por el método deBarrit /37/, ensayado en comparación con otros métodos porla Sta. .arn E. Goldenberg en este mismolaboratorio. Lareacción de Barrit fué incluída comoensayo de rutina a ha­cerse sobre todos los tubos de cultivos que luego se usaranpara el análisis cuantitativo de los productos de fermenta­ción; como se empleaban 20 tubos de Hall con medio de leva­dura para cada cepa, se pudo observar que entre un tubo yotro de una mismacepa había a veces cierta diferencia deintensidad en la coloración rosada que da el acetilmetil­carbinol, pero nunca hubo duda sobre si una reacción erapositiva o ne ativa. Es posible que esas diferencias de in­tensidad fueran debidas a la influencia de la anerobiosisen e sistema de óxido-reducción que forma el acetilmetil­carbinol con el 2-5-butanediol; en efecto, si se utiliza elliquido fermentado que queda por encima de la bolita en eltubo de Hall y se agitan repetidamente los tubos al hacerla eacción de Barrit, las diferencias de coloración se a­tenúan notablemente.

Al aplicar la reacción de Barrit en la fermentación demasa de maíz los resultados fueron más nítidos por ser elmedio dc cultivo incoloro, pero no hubo diferencias sustan­ciales con los resultados obtenidos en medio de levadura(ver tabla 5). Esto indica que la producción de acetilme­tilcarbinol no depende, en las cepas en estudio, de la uti­lización de glucosa o almidón comosustrato.

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T A B L A 3

C e q Formación dep ° acetilmetilcarbinol

tipo No en levadura en' + glucosa de maíz

87 - _Cl. pasteurianum

181 — _

179 - _Cl. saccharobutyricum

180 — _

1-1 + +

C1. felsineum 4-2 + +

4-1 + +

D + +Cl. acetobutylicum

B-8-3 + +

19

e. Enriado.

Para observar la capacidad enriadora de los cultivos seprocedió dc la siguiente manera: se cortan trozos de linoen rama dc unos 5 cm. de largo y se distribuyen 3 o 4 tro­zos por tubo; sc agrega a cada tubo, agitando continuamen­te, medio de levadura con 0,3 % de creta, hasta que el linoquede totalmente sumergido; se esteriliza a llO°C media ho­ra. le inoculan los tubos con 0,5 ml. de cultivo de 24 ho­ras en medio de papa-levadura, se asegura lasnaerobiosiscon l ml. de parafina estéril fundida en cada tubo y se in­cuba a 37°C. A las 48 horas, con ayuda de un ansa se sacanlos palitos del líquido y se observa si, raspando suavemen­te con el ansa, se liberan o no las fibras del lino.

El ensayo, aparentemente burdo, resulta muybueno en lapráctica, ya que la diferencia entre los gérmenesenriado­res y los que no lo son es muynotable (Ver tabla 4).

T A B L A 4

Cepa .. ._ Enriamiento del lan

tipo N°u _

Cl. pasteurianum l181 ­

ln_-_._,___ _n__ 1 ­Cl. seccharobutyricum 79180 ­

l-l +++Cl. felsineum 4-2 +++

4-1 +++

j '- _ D +.Cl. acetobutylicum ­? B-8-3 i

20

f. Ataque del almidón.

Según ya lo mencionamos (pág. 4), se acostumbra dividir"a los clostridios butíricos en los de tipo "pasteurianum"incapaces de atacar el almidón y en los de tipo "saccharo­butyricum" que lo fermentan.

Sin embargo, de los datos que figuran en el trabajo deMcCoyet al. /32/ resulta que, al desarrollar diversas ce­pas butírieas y una butílica en medio sintético + l % dehidrato de carbono, no hay diferencia neta y constante enel ensayo con almidón entre los fermentadores del mismo ylos que no lo son, por dar una cierta acidez y levantar lostapones de parafina tanto los unos comolos otros. Luego lafermentación de almidón soluble o almidón de maiz agregadosa un medio de cultivo no es un buen índice para observar elataque de este polisacárido. Los autores citados hacen paratal fin otro ensayo, o sea desarrollan los gérmenesbutíri­co-butilicos en masa de maíz: los del tipo "pasteurianum"no modifican el medio, los del tipo "saccharobutyricum"fermentan el almidón y dejan en el fondo del tubo un restode maiz sin digerir y el organismo acetobutílieo deja elresiduo de maíz flotando en la parte superior, dando el ca­racterístico "sombrero".

Hemos preparado masa de maiz al 5 % en tubos de 25 x300 mm., según se verá en el capítulo correspondiente a losmedios de cultivo; en el medio de cultivo terminado se ob­servan en la parte inferior los gránulos de maíz molido y,por encima, un gel blanco. Después de 3 días de desarrolloel aspecto de los cultivos es el siguiente:

21

cepa 87 y 181: todo el maíz en el fondo; parte del gel hasido digerido, quedandoun líquido turbio;

cepa 179 y 180: la mayor parte del maíz en el fondo; el gelha sido totalmente digerido y queda un lí­quido límpido;

cepa l-l: queda la mitad del maíz, es parduzco yforma "sombrero"; el gel ha sido totalmentedigerido y queda un líquido límpido;

cepa 4-2 y 4-1: casi todo el maíz en el fondo; el gel hasido digerido y queda un líquido turbio;

cepa D y 3-8-3: queda menos de la mitad del maíz formando"sombrero"; el gel ha sido digerido y quedaun líquido apenas turbio.

Aunquees posible así diferenciar varios tipos de cul­tivos por el aspecto de su desarrollo en la masa de maíz,no es muy claro el ataque o no del almidón, ya que todoslos cultivos digieren por lo menosla mayor parte del gel.Luego hemos ensayado lo siguiente: hemos usado como mediode cultivo sólo el gel de la masa de maíz, repartido en tu­bos de ensayo, bajo tapones de parafina. A los 3 días dedesarrollo se ensayó la presencia de almidón tanto en laparte líquida como en lo que quedaba del gel, agregando al ml. de cada uno una gota de iodo 0,07 N; en el medio sinsembrar se obtuvo un color azul intenso. Los resultados fi­guran en la tabla 5.

En base a nuestra observación al hacer la reacción dela granulosa (ver pág. 14) de que los preparados de las ce­pas 87 y 181 se tiñen de violeta y los demás de amarillocon el iodo, tratamos de ver a qué se debía esa particula­ridad y si podía servir para aclarar la fermentación delalmidón. Por de pronto se vió que en el medio dc levaduraautDÍizada, usado comosustrato para luego hacer los prepa­

22

rados, hay almidón soluble que da un intenso color azul conel iodo. Los resultados obtenidos con las distintas cepasal agregar una gota de iodo a 1 nl. de cultivo están en latabla 5. Quisinos ver luego si el color azul que daban lascepas 87 y 181 era debido al no ser utilizado el almidón obien a la gran cantidad de bastones granulosa positivos quese observan en estas cepas y no en las demás. Para eso cen­trifugauos bien los cultivos 87 y 181 y sobre el líquidolímpido y prácticamente libre de bacterias volvimos a hacerla reacción con el iodo: se obtuvo un intenso color azulcomo en el medio sin sembrar.

De todo lo cual resulta que las cepas 87 y 181 (tipoCl. pasteurianum) son incapaces de fermentar almidón, mien­tras que la D y B-8-3 (Cl. acetobutïlicum) lo consumento­talmente; entre ambosextremos hay cepas intermedias, la179 y 180 (tipo Cl. saccharobutxricun] y la l-l, 4-2 y 4-1(Cl. felsineun), que, según el medio, utilizan el almidón olo atacan de nodo que da una reacción distinta con cl iodo.

23

T A B L A 5

Almidón'residualC e p C por reaccion con iodo

h- tipo ¡ No gel de maíz medio dei Ïïañïasï-EEÏ——-levadura

J87 azul i azul azul

Cl. pasteurisnuu181 azul azul azul

_ 179 — violeta —Cl. sacchnrobutyricum l

180 - violeta ­l-l - violeta ­

Cl. fclsincum 4-2 - violeta —

4-1 - violeta ­D - _ _

Cl. noctobutylicum .A IB-8-3 _ - _

24

Métodos Químicos

l. Detcrninnción de azúqgr residual.En nuestro coso se trataba de determinaciones de gluco­

2, ya que el medio prinitivamente elegido para las fermen­aciones era el de levadura con 2,5 % de glucosa.

Los métodos basados en la reducción de las sales de++ + . . .a Cu son más adecuados para el análisis de medios deCu

cultivo por ser más específicos que los que usan ferricia­nuro (Hagedorn y Jensen /38/).

El reactivo cúprico de Shaffer y Hartmann/39/ fué mo­dificndo por Stiles, Peterson y Fred /40/ y aplicado porellos en su nicrométodo. Lo hemosutilizado en nuestro tra­bajo, a pesar de los varios otros aparecidos posteriormente(Shaffer y Somogyi/4l/, Underkofler et al. /42/, Somogyi/A3/), por estar ya en uso en nuestro laboratorio y dar da­tos satisfactorios. Los resultados que hemosobtenido conuna solución de glucosa en agua y con el medio de levaduramás glucosa figuran en la tabla.6. En ambos casos el conte­nido real en azúcar fué establecido por pesada de la gluco­sa a agregar.

Se observa que, siempre que se haya defecado el líquidoen examen, el método tiene un error de t 0,05 ng. de gluco­su. También se ve que conviene tomar el máximo de nuestracompatible con los límites del método, para así disminuirel error porcentual.

T A B L A 6

Detcrminaciones de glucosa en soluciones conocidas

l_——25_——

Solución usada Líquido Nagszo Glucosc Glucosa'0, E ¿3 en laï Error

tipo volumen defecado gastado muestra hallada

ml. m1. ml. m1. mg. mg. g/l %

10,03 1,01 18,2 3,6 0,639 0,558 2,75 -13glucosaen agua 10,03 2,02 13,2 8,6 1,272 1,224 3,02 - 43,14 g/l

1,01 1,01 18,8 3,0 0,510 0,477 23,6 - 6

1,01 2,02 14,9 6,9 1,020 0,997 24,4 —2

1,01 3,04 10,6 11,2 1,533 1,547 25,2 + lglucosa

en Líquidomedio diluido

dc sinlevadura defccar125,0 g/l

1,01 1,01 19,0 2,8 0,510 0,446 21,8 -13

1,01 2,02 15,3 6,5 1,020 0,940 23,0 - 8

i 1,01 3,04 11,5 10,3 1,533 1,446 23,5 - 6Testigo

21,8

26

2-3. Determinaciónde alcohol butílico y etílico.

Varios son los métodos cuantitativos que han sido pro­puestos.

Bogin /44/ y más tarde Bakonyi /45/ separan los solven­tes totales anhidros y luego determinan la cantidad de aguanecesaria para provocar un enturbianiento: éste es debidoal butanol, no Liscible con el agua en todas proporciones;el etanol y la acetona retardan el proceso y la cantidad deagua que produce la turbidez resulta proporcional a la can­tidad de etanol más acetona presente en los solventes tota­les. Por lo tanto, conociendo el contenido en aectona, fá­cil de determinar, y la cantidad de solventes totales, esposible estableCer así el contenido en alcohol etílico yluego, por diferencia, el butanol. Existen tablas compila­das con mezclas conocidas de solventes, que facilitan elcálculo; pero el métodoresulta largo, debiendo partirse decantidades muy grandes de mosto fermentado (2500 nl.),'

Hsi Ch'ou Fang /46/ separa los solventes totales, de­termina la acctona por iodometría y por otra parte halla elpeso específico y el índice de refracción de la mezcla.Luego tiene 2 ecuaciones con 2 incógnitas para calcular eletanol y el butanol. Los resultados no parecen'ser excelen­tes.

Stahly, Osburn y Werknan/47/ oxidan los productos vo­

látiles neutros con K2Cr207y H3PO4;luego aplican el méto­do de partición entre el agua y el éter dielilico a los á­oidos butírico y acético formados. El método presenta elinconveniente de la inflaLabilidad del éter.

Christensen y Fulmer /48/ tratan con K2Cr207 y HZSO4ydeterminan el poder oxidante de la mezcla, antes y despuésde la oxidación, agregando KI y valorando el iodo liberadocon Nazszoj. Aún conociendo el contenido de acetona, hay

27

así una sola ecuación para dos incógnitas etanol y butanol.Entonces los autores obtienen la segunda ecuación, ya seaoxidando en otras condiciones la mezcla, o bien extrayendopreviamente el butanol con clóroformo. El método no prevéla presencia posible de alcohol isopropílico.

Mouratoff /49/ determina el alcohol butílico por el me­tano que se desprende al tratarlo con reactivo de Grignard,pero el método es engorroso y sólo da uno de los dos alco­holes que se trata de determinar.

Nosotros hemos adaptado el método de Johnson /50/, quepresenta la ventaja de su sencillez y la de necesitar sólopequeñas cantidades de mosto fermentado. El método consisteen lo siguiente: los solventes neutros se destilan, luegose oxidan los alcoholes butílico y etílico a ácidos y fi­nalmente se destilan dos fracciones sucesivas y en ambas sedetermina la acidez.

Este método se basa en los estudios de Duclaux /51/,según los cuales los ácidos butírico y acético formadosdestilan cada uno siempre en la mismaproporción en la pri­mera y segunda fracción, sea cual fuere la cantidad absolu­ta y sin que el uno interfiera en la destilación del otro.Por lo tanto se pueden hallar dos ecuaciones para calcularlas cantidades de butanol y etanol contenidas en una solu­ción, una vez que se han encontrado los respectivos coefi­cientes por oxidación y destilación de soluciones conocidasde cada alcohol.

Reactivos:

l. Solución oxidante: se mezclan volúmenes iguales de

K20r207 3 N (149,1 g/Dy H2SO4 10 N (719 ml. H20 + 281 m1. sto4 96%)

preparados con agua libre de CO2.

28

2. Solución alcalina: 13a(0H)2 0,05 NSe disuelven aprox. lO g. Ba(OH)2.8H20en un litro de a­gua-destilada hervida, se agita bien y se deja sedimen­tar dos días el BaCOB;luego con sifón se pasa el líqui­do límpido sobrenadante a un frasco donde se ha hecho

pasar aire u oxígeno libres de CO2durante una hora.3. Indicador: rojo de fenol al 0,02 %

Se disuelven 100 mg. fenolsulfonftaleina con 2,85 ml.NaOH0,1 N y se lleva a 500 ml. con agua destilada.

4. Solución ácida patrón: ftalato ácido de potasio 0,01 N(2,041 g/l). Se conserva en vidrio Pyrex durante algúntiempo. Con esta solución (10 ml. por vez) se estandar­diza el Ba(OH)2 0,05 N.

¿apar_aio.s_=

l. Para la destilación de los solventes neutros:

El tubo de vidrio Pyrex de 38 x 200 mm. está conectadocon el refrigerante de Liebig de 15 cm. de largo por uncierre esmerilado. El matracito en que se recibe el des­tilado está calibrado para contener 10 m1.

Microbureta:

29

Para la destilación de 10s ácidos:El aparato es análogo al anterior, pero el refrigerantetiene el extremo cortado en bisel y éste apoya sobre elborde del matracito de 10 m1. de capacidad.En el articulo de Johnson se describe un dispositivo pa­ra conseguir una calefacción constante del tubo de des­tilación: está constituido por un micromecheroy por unsistema de regulación del gas que llega al mismo. Hemosobservado sin embargo que se destila muchomejor calen­tando simplemente con un mechero de Bunsen con llama nomuy grande ni muy fuerte. En efecto el micromechero ca­lienta sólo una pequeña zona del tubo de destilación, 1acual se sobrecalienta con respecto al resto y provocafrecuentes sobresaltos en 1a destilación; si envés seusa la llama de un mechero común, se calienta todo elfondo del tubo y la destilación es muchomás regular.

graduada a1 0,02 m1., contiene en total2 m1. y ha sido calibrada, obteniéndose los siguientesdatos:

Intervalo leído 0,00 - 1,00 ml. 0,00 —2,00 ml.Volumen real a 20°C 1,005 ml. 2,011 m1.

Corrección + 0,005 ml. + 0,011 m1.Error + 0,5 % + 0,5 %

Para evitar que el Ba(0H)2 absorba CO2del aire, se hahecho la instalación representada en la página siguien­te. Para cargar la microbureta, se quitan los capuchonesde goma y se conecta A con B, se mantiene baja la micro­bureta y se abre la llave C.

30

“w Ifi:_:71"\‘/1 ÏCal sodada EL.

Cal ¿Ochoa/Ba(0H]—> ¿/flB0,05 wn'­

4 uu

a H

IA.._.í:

uamH-—fi

329251322222En el aparato para destilar los solventes neutros se

coloca la muestra con 5 - 15 mg. de alcoholes(en generales necesario hacer un ensayo previo de orientación). Se a­ñade una pizca de piedra pómezmolida, se alcaliniza y di­luye a unos 20 - 21 m1. con agua sin 002.

En el matracito se pone 1 m1. de agua sin CO2para queel tubo de desprendimiento esté sumergido y se destila has­ta la marca del matraz, bajándolo de modoque, a1 destilarla última porción, el extremo del tubo no esté más sumergi­do en el líquido.

Por otra parte se prepara el tubo del aparato de oxida­ción y de destilación de los ácidos con 10 m1. de mezclaovidante y piedra pómez. Se añaden los lO m1. de destilado

31

y se enjuaga el matracito con 5 m1. de agua sin CO2en dosporciones. Se cierra bien con un tapón de gomaque se ajus­ta con alambre y se procede a la oxidación de los alcoholescolocando el tubo a baño maría hirviendo durante 5 minutosexactos. Se lo enfría luego bajo canilla, se abre y conectaal refrigerante. Se destilan dos fracciones sucesivas delO m1. en dos matracitos. Cada una se pasa a un erlenmeyerde 25 m1. enjuagando el respectivo matraz con 5 m1. de agua

sin CO2en dos porciones, y se titulan ambas fracciones conel Ba(OH)20,05 N en presencia de 5 gotas del indicador,que vira a un rosado permanente en el punto final. Se haceun testigo: en nuestras experiencias el mismosiempre gastóuna cantidad despreciable de álcali (menos de 0,03 m1.).

Comoen las fermentaciones siempre hay que determinarno sólo butanol y etanol, sino también acetona e isopropa­nol, los cuales deben separarse análogamente de los ácidosexistentes en el mosto fermentado, conviene entonces hacerla primera destilación con una cantidad mayor del mismo. Ennuestras experiencias destilamos siempre 20 m1. de mosto,recibiendo el destilado en un matraz aforado de 50 m1. con

unos m1. de agua sin CO2 en el fmndo.A1 principio tuvimos dificultades por 1a enorme espuma

que da el mosto fermentado cuando se lo calienta en medioalcalino. Se ensayó 1a defecación previa del método deStiles, Peterson y Fred /40/ para azúcares y la defecacióncon ZnSO4+ Ba(CH)2, pero los resultados no fueron concor­dantes. Muchomejor encontramos finalmente que era centri­

fugar el mosto, añadirle unos cristales de ZnSO4y MgSO4,piedra pómez, NaOHhasta viraje del rojo de fenol y desti­lar calentando suavemente el tubo de destilación en casitoda su extensión, con lo cual se consigue romper la espu­ma. Al destilado se añade el agua de lavado del refrigeran­te y se lo lleva a volumen, De allí se toman porciones ade­

32

cuadas para ser oxidadas en la determinación de butanol yetanol por una parte, en la de isopropanol por otra, y fi­nalmente para la determinación directa de acetona.

Cálculos para Estandardizar el método:

Al hacer las determinaciones con cada uno de los dosalcoholes por separado se observa que, dentro de ciertoslímites de concentración en la muestra, el gasto de Ba(OH)2por cada milígramo de cada uno de los dos alcoholes essiempre el mismo en cada una de las dos fracciones.

Ya que en general en la fermentación acetobutílica de­biera obtenerse más butanol que etanol, se preparó por pe­sadaa. una solución con 245,1 mg. de butanol en 100 ml.b. una solución con 52,8 mg. de etanol en 100 ml.

Se trabajó primero con cada solución por separado y nose hizo la destilación previa, sino que directamente seprocedió a oxidar al alcohol. Se agregaron a la mezclaoxidante cantidades adecuadas de cada solución con pipetasde doble enrase calibradas, diluyendo luego, si era necesa­rio, con la correspondiente cantidad de agua sin CO2paratener un volumen total de 25 ml.

El gasto de Ba(OH)2en la primera y segunda fraccióndestiladas se corrigió por el factor del Ba(OHÏ20,05 N ypor el error de la microbureta,

Las experiencias realizadas con butanol están resumidasen la tabla 7, las con etanol en la tabla 8.

En el caso del butanol se observa que el gasto deBa(OH)2 0,05 N, o sea la acidez formada por cada miligramode alcohol, es bastante constante, menos con cantidades pe­queñas de alcohol, donde el error es relativamente grande.Si se toman en cuenta por lo tanto sólo los valores corres­

TABLA7 IJ

Experienciasrealizadasconsolucionbutllica

(245,1mg.butanol/lOOml.)

PrimerafracciónSegundafracción

boluciónButanolFactorGastodeGastode ButílicaenladelBa(OH)2Ba(0H)2B0(OH)3005NBa(OH)2Ba(0H)2Ba(OH)3005N

usadamuestraBa(OH)2gastado0,05Npormgdebu-gastado0,05Npormg.debu­

0,05NtanolpresemBtanolpresemfi

ml.mg.ml.ml.ml/mg..ml.ml.ml/mg. 1,012,480,9550,540,5070,2040,250,2160,087 1,012,480,9240,560,5200,2090,250,2140,086 1,012,480,9240,560,5200,2090,250,2140,086 2,024,960,9241,060,9840,1980,450,5990,080 2,024,960,9241,060,9840,1980,410,5810,077

33

5,047,440,9241,621,5050,2020,580,5590,072 5,047,440,9241,661,5420,2070,620,5760,077 5,047,440,9241,651,5140,2050,620,5760,077 4,059,920,9122,181,9980,2010,850,7610,076.4,059,920,9122,151,9700,1980,850,7610,076

5,0712,450,9242,672,4800,199L,000,9290,075 5,0712,450,9242,612,4240,1951,070,9940,080

TABLA8

Experienciasrealizadasconsoluciónetílica

(47,6mg.etanol/100ml,enlasllprimerasexperiencias,

52,8mg.etanol/100ml.enlasúltimascuatro)

ooluciónEtanolFactorGastodeGastode etílicaenladelBa(OH)3Ba(OH)380(0H)2Q95NBu(OH)¿Ba(OH)2Ba(OH)2QOSN

usadamuestraBa(OH)2gastado0,05Npormg.dee-gastado0,05Npormg.deen

0,05Ntanolpresumetanolpresea

Primerafr8001ónSegundafracciónI

l

ml.mg.ml.ml.ml/mg.ml.ml.ml/mga 1,010,480,9240,120,1110,2320,150,1390,290 1,010,480,9240,120,1110,2320,140,1300,270 2,020,960,9240,220,2040,2120,250,2320,242 2,020,960,9240,210,1950,2030,250,2320,242 3,041,450,9240,290,2690,1850,370,3440,237 3,041,450,9240,280,2600,1790,380,3530,243 4,051,930,9240,390,3620,1880,480,446_0,231 4,051,930,9240,400,3710,1920,500,4640,241 4,051,930,9240,390,3620,1880,490,4550,236 5,072,410,9240,470,4360,1810,570,5290,220 5,072,410,9240,450,4180,1740,570,5290,220

10,03-5,300,9240,970,9010,1701,221,1330,214 10,035,300,9240,990,9190,1741,221,1330,214

0,9240,940,8730,1651,191,1050,209 0,9240,920,9010,1201,241,1520,217

34

35

pondientes a 5 - 12,5 mg. de butanol en 1a muestra, resultaun promedio de

0,200 ml/mg. en la primera fraccióny 0,077 ml/mg. en la segunda fracción.

En total por cada milígramo de butanol se gastan 0,277 m1.de Ba(OH)2 0,05 N, que son equivalentes a

0,277 m1. x 88 g. x 0,05 = 1,22 mg. ácido butírico1000 ml.

ya que el peso molecular del mismo es 88.Ahora bien, si se produce cuantitativamente la reacción

de oxidación

(¡ma ÏHs(¡me + o? ——> ¡H2 + H20(¡3H2 CH

CHZOH ¿00H

y todo el ácido butírico pasa al destilado, debe ocurrirque 74 g. de butanol den 88 g. de ácido butírico.

Luego de l mg. de butanol se deben obtener

1,19 mg. ácido butírico.

E1 error por exceso del 2,5 % puede ser debido a que unapequeña fracción del butanol llega a oxidarse hasta ácidoacético y 002.

Al trabajar con la solución etílica no se observa yatanta constancia en la acidez de las 2 fracciones destila­das. Hay una disminución no muy regular de la acidez pormilígramo de etanol al aumentar la cantidad de etanol en lamuestra. Comose ha trabajado aquí con cantidades 5 vecesmenores que las usadas de butanol, es posible que por esoel error relativo sea mayor. Por lo tanto se han tomado enconsideración sólo los datos obtenidos al destilar 5 mg. deetanol. Entonces resulta un promedio de

36

0,170 ml/mg. en la primera fraccióny 0,213 ml/mg. en la segunda fracción.

En total son 0,383 ml. Ba(0H)2 0,05 N por milígramo de eta­nol, lo que equivale a

0,383 ml. x 60 g. x 0,05 = ¿,15 mg. ácido acético.lOOO m1.

Si es cuantitativa la reacción

+ H 0H CH:3 +026] 23

HZOH COOH

y todo el acético destila, se tiene que 46 g. de etanol dan60 g. de ácido acético.

Luego de l mg. de etanol se deben obtener

l430 mg. ácido acético.En este caso el error es por defecto y es del 11,5 %; esprobable que sea debido a que en los 5 ml. que quedan sindestilar hay todavía algo del ácido acético formado.

Si tenemos ahora una mezcla de butanol, etanol y aguacon B mg. de butanol y E mg. de etanol y la sometemos a laoxidación y destilación, debe haber en la primera fracciónuna acidez total, expresada en ml. Ba(0H)2 0,05 N,

I = 0,200 ¡nl/mg. x B ng. + 0,170 ml/Ing. x E mg.

y en la segunda fracción:

II : 0,077 nl/mg. x B mg. + 0,213 ml/mg. x E mg.

Tenemosasí un sistema de dos ecuaciones para calcular lasdos incógnitas B y E. Resulta:

37

B = 7,22 x I - 5,77 x II6,78 x II - 2,61 x Ig’PJ ll

Para ver cuál es la exactitud del método, se hicieronalgunas experiencias con soluciones de butanol y etanol.Los datos obtenidos figuran en la tabla 9.

Se observa que no se puede trabajar con exactitud cuan­do hay menos de 5 mg. de butanol y l mg. de etanol en lamuestra, porque con cantidades menores el error es enorme.

Si en la muestra hay entre 6 y 15 ug. de alcoholes to­tales, el método de Johnson es perfectamente utilizable enel análisis de productos de fermentación, ya que, si bienel error relativo en la determinación de alcohol etílico esgrande todavia, hay que recordar que se trata de cantidadesmuypequeñas de etanol y que por otra parte el análisis delos solventes totales no será por eso afectado, ya que lasuma de alcohol butílico y etílico se determina con una a­proximación bastante grande.

Puesto que, al realizar las fermentaciones, es necesa­rio separar los productos volátiles neutros para el análi­sis por medio de una destilación, hemos tratado de determi­nar si de esta manera hay alguna pérdida apreciable de eta­nol y butanol. Para eso se ha trabajado con cada uno de losdos alcoholes por separado y se ha seguido todo el procedi­miento del método, incluyendo ahora la destilación previa ala oxidación del alcohol. Los datos figuran en la tabla 7-Ay 8-A. Se observa que los errores no son mayores que losobtenidos sin la destilación previa, siempre que se trabajecon 6 a 15 mg. de alcoholes en la muestra.

p

TABLA9

Experienciasrealizadasconmezclasconocidasde

butanol,etanolyagua

I

AlCOhO-Factonla.fraccion28.fracciónButunolEtanolalcoholes

ButanolEtanoulesdeltotales

enla enlatotalosBa(Od)zBa(OH)2U0(OH)BBa(OH)258(0H)¿hallg‘rrorhallgrroxhallgerror

muestramucstraenla0,05Ngustadob,05Ngastad00,05Ndododo

nuestra

mg.mg,mg,ml.ml.Al.ml.mg.%mg.%mg.%2,480,533,010,9240,630,585o,"70,“422,24—9,70,80+515,02+1,0

00

,5252,55-5,20,68+283,03+0,7

2,480,533,010,9240,630,585

1

4,960,965,920,924

hH

,1420,510,5674,97+

L0

HI

2‘”)

CD

1')

Or-I

I

KOd)

OCJ

O

i

4,960,965,920,924

CJ

H

1,1420,610,5672,97+

LD

r-I

I

f)CO

LO

Or-l

LO

O :—l

CJA

O

7,461,458,890,912

O0‘

H

1,741

G;+OQ

C\

r-d'OmwO

quC)

.—-l

r-i (DA

CJ

+

LO' <0

D

0110CO

7,&41,158,890,912

O05

f4

0

1,7410,930,

1

9,921,9311,850,9122,

CJIO

2,309

12,082,6814,760,9313,0

C)

2,8911,571,669,40+2,62,41-1014,81+

12,082,68lé,7b0,9313,092,8911,691,534,02-0,52,85+615,87+0,7

38

TABLA

7A

Experienciasconsoluciónbutíllca(513,0mg.butanol/lUOml.)

incluyendoladestilaciónprevia

Solución

J.

butillca

usada

Butanol

onlamuestra

Factor

del

BU(OH)2 0,05N

Primerafracción

Segundafracción

Ba(0H)2 gastado

0,05NBa(0H)g

Butanol hallado

Error

Bu(OH)2 gastado

B0(OH)2 0,05N

ButanolError hallado

mg.

ml.

ml.

mg.

fiml.

ml.mg.%

6,55 6,55

0,855 0,855

1,48 1,47

1,245 1,254

6,22­ 6,17­

1,70,56

0,57

0,4706,11— 0,479

12,66

0,855

5,00

2,519

12,60­

2,5 0,5

1,16

5

6,22-1,7

o

0,97412,65i­

Experiencias

consoluciónetílico

TABLA

8A(47,6

incluyendoladestilación

mg.etanol/100ml.) previa

Solución

utilica

usada

Etanolenla

muestra

Factor

del

Ba(OH)20,05N

Primerafracción

Segundafracción

Ba(0¿í)2 gastado

Ba(01í)2 0,05N

Etanol

hallado

Error

Ba(OH)3 gustado

BU(OH)2 0,05N

Etanol

hallado r

Error

1g.

ml.

Lll.

me.

%ml.

ml.mg;%

0,96

0,855

0,20

0,168

0,99+

0,27

0,2271,07+11

4,77 4,77

0,855 0,855

0,95 0,95

0,781 0,781

1,20 1,19

1,0084,75—0,8 0,9994,69-1,7

39

40

4-5. Determinación de acetong e isopropanol.

Una revisión de los métodos más comunes para determinaracetona se halla en el artículo de Green /52/. De ahí re­sulta comoel mejor el método de Messinger /53/ modificadoluego por Goodwin/54/, que consiste en tratar la soluciónacctónica con iodo en medio alcalino, dejar en reposo paraque sea completa la formación del iodoformo, liberar elexceso de iodo con ácido y valorarlo luego con tiosulfatode sodio en presencia de aluidón: hay que hacer un testigopara conocer el iodo total. De la diferencia, o sea del io­do gastado para la formación de iodofor:o se calcula elcontenido en acetona ya que, según la reacción

"H H3

CO + 3 12 + 4 NaOH —+>- CHI3 + ÏOONa + 3 NaI + 3 H20,

h}l mol de acetona (58,08 g.) gasta 6 átomos de iodo y por lotanto l ml. de iodo 0,1 N corresponde a

58.080 ng. x 0,1 = 0,968 ug. acetona.6 x 1000

Para determinar el alcohol isopropílico existe el méto­do dc Allgeier y Tatuu, mencionado en el trabajo deLanglykke et al. /33/: según el mismose oxida el isopropa­nol e acetona con la mezcla oxidante de Johnson y luego és­ta se valora por el método de messinger, pero en uicroesca­la. En detalle, se procede de la siguiente manera: en untubo de vidrio Pyrex de 38 x 200 un. se coloca la nuestracon lO L1. de Lezcla oxidante y agua destilada hasta tenerexactamente 25 m1. de volumen total, se añaden unos trozosde vidrio para regularizar la ebullición. Se tapa bien yfija el tapón con alambre, se coloca a baño maría hirviendo

41

durante 3 minutos, se enfría bajo canilla y se conecta a unrefrigerante cuyo extremo está sumergido en 15 ml. deNaOHN colocados en un erlenmeyer de 125 ml. de tapón esme­rilado. Se destila la mitad del líquido. A1destilado se a­gregan 5 nl. de iodo 0,2 N con una pipeta, se cierra y deja5 - lO minutos para que se complete la reacción. Luego se

acidifica con 20 nl. de stO4 N y se titula el exceso deiodo con Na25203 0,1 N de una microbureta.

Por otra parte se hace un ensayo en blanco; según losautores, del isopropanol original se determina asi el 85 %,de la aceton? el 96 %.

Nosotros hemos tratado de usar este método que trabajacon pequeñas cantidades de muestra tanto para la determina­ción del isopropanol comopara la de la acetona. Al princi­pio los errores de las determinaciones eran inadmisiblesdebido a las siguientes causas:a. la nicrobureta, cuya graduación se suponía suficiente­mente exacta, resultó tener graves errores de calibración ytuvo que ser nuevamente calibrado; otro tanto ocurrió conlas pipctas de doble aforo;b. 15 nl. de NaOHN constituyen un exceso de álcali absolu­tanente innecesario;c. al agregarse luego 20 ul. de H2804N, queda en la solu­ción un exceso de 5 nl. de H2SO4: según Goodwin /54/, ya enel macronétodo no debe haber un exceso mayor que l m1.; deotra uanera se gasta más tiosulfato y por lo tanto se ob­tiene un error por defecto en las determinaciones;d. al conectar el tubo de destilación al refrigerante ne­diante un tapón de goma, queda luego de la destilación mu­cho liquido de condensación entre la pared del tubo y eltapón y sobre la base del tapón mismo: se comprobó, al en­juagar con agua destilada esta parte del aparato, que eselíquido contenía abundante acetona y daba buena precipita­

42

ción de iodoformo; es necesario trabajar con un aparato devidrio con cierre esmerilado, desalojar el líquido conden­sado en la parte superior del tubo de destilación con llamadirecta y enjuagar finalmente todo el condensador para reu­nir en su totalidad la acetona destilada.

Resumiendo el método,tal como fué usado por nosotrospara determinar acetona y alcohol isopropilico en pequeñascantidades, es cl siguiente?

Reactivosa

l. solución oxidante de JohnsonNaOH OZS N

3-52a“¿egggaqiuse disuelven 25 g. Na28203.5H20en agua destilada hervi­da y enfriada y se lleva a un litro. Se añade 0,1 g. de

NaZCO3como conservante. La solución debe dejarse esta­bilizar unas dos semanas.

4:. D

5. indicador de almidón2 g. de almidón soluble se deslien en un mortero con unpoco de agua y se mezclan con lO mg. Hg12 (conservador).Luego se vierte esta suspensión poco a poco sobre un li­tro de agua destilada hirviendo. Se sigue la ebulliciónhasta tener un líquido limpido y luego se deja enfriar¡Se usan 5 ml. por cada 100 m1. de solución a titular.

6. iodo 0,07 H8,9 g. de iodo se pesan rápidamente y pasan a un erlen­neyer de 250 ul. con 28 g. KI libre de iodato y 25 mlcde agua destilada. Se agita hasta disolución total yluego se lleva a un litro en un matraz aforado. Se guar­da en un frasco de tapón esmerilado al abrigo de la luz.Para saber si el KI tiene o no iodato, se disaelve l g.

7.

43

de KI en 25 ul. de agua, se le añaden 6 ul. de HZSO4N y2 D1. de indicador: en nusencia de iodnto 1a solución nose colorea de azul enseguida.

KIO3 0,1 Nse pesan exactamente 3,5669 g. KIO3y se lleva a un li­tro con agua destilada. Esta solución se use comosolu­

ción patrón para estandardizar el 110282030,1 N, lo cualse hace de la siguiente manera: 5 m1. KIO3 0,1 N se di­luyen con lO ml. de agua destilada, se añaden 0,2 g. KI

El. H SO N. Se valora con el2 4

añadiendo hacia el final l ELlibre de iodnto y l

Na2SZO3 de lade almidón.

microbureta,

Aparatos:

1.

2. Microbureta:

Aparato de destilación: comoel aparato l del método deJohnson. El destilado es recibido en erlenmeyer de125 ml. de tapón esmerilado.

graduada al 0,01 31.,5 m1.; su calibración dió los datos siguientes:

contiene en total

Intervalo Volumenreal Corrección Errorleido a 20°Cm1. ml. ml. %

0,00 - 1,00 1,040 + 0,040 + 4,00,00 - 2,00 2,107 + 0,107 + 5,30,00 - 3,00 3,155 + 0,155 + 5,10,00 —4,00 4,122 + 0,122 + 3,10,00 —5,00 5,226 + 0,226 + 4,5

44

Procedimiento:

A. Valoración de acetona:Si se trata de determinar solamente acetona, se destila

en medio alcalino en el aparato 1 del método de Johnson unvolumen de mosto que contenga no más de 5 mg. de acetona y

agua Sidel mosto fermenta­del destilado de

se usa comomuestra el destilado más el de lavado.envés se deter1inan todos los solventesdo, se utiliza comomuestra una porción

nu.solventes llevado volumen.La muestra se coloca en un erlenneyer de 125 nl. de ta­

de NaOH0,5 N. Con pipetade

pón esmerilado, junto con lO nl.decontinuamente.

doble enrase se añaden lO ml.Se deja en reposo 15 minutos, luego se libe­

de HZSO

con el Na28203 0,1 N de la microbureta.

ra el exceso de iodo con 5,5 ul. Ñ y se lo valora4

Se hace un testigo. La diferencia entre el gasto deltestigo y el de la muestra, expresada en ml. de iodo o de

113.252030,1 N, da el contenido en acetona de la muestra, yaque

l ml. Igggil N equivale a 0,968 mg, acetong.

B. Valoración de isopropanol + acetona:La nuestra se prepara por destilación comoen el caso de

la acctona . Se la coloca en el tubo de destilación del a­parato l, con 10 al. de solución oxidante y agua destiladahasta tener un volumen de 25 ml. Se añade piedra pónez, setapa y fija el tapón con alambre, se oxida 3 minutos a bañomaría hirviendo, se enfría bajo canilla y se destila, reci­biendo el destilado bajo 10 ul. de NaOH0,5 N. Se destilaalgo más que la mitad del líquido, desalojando con llamasuave directa lo que se condensa en la parte superior deltubo. Se enjuaga el refrigerante con unos 5 - lO m1. de a­

iodo 0{O7N agitando! "

45

gua destilada, añadiendo este líquido de lavado al destila­do, que se,ha recibido en un erlenmeyer de 125 ml. LuegO'sesigue comoen la valoración de acetona.

Del gasto total de tiosulfato se resta el correspondien­te a la acetona, que ya se conoce. El resto da el contenidoen isopropanol, ya que

l ml. 12 0,1 N reacciona con 1,0015 mg; isopropanol.

El método se ha ensayado con soluciones de acetonh y al­cohol isopropílico y los datos obtenidos figuran en las ta­blas lO y ll. Se observa una exactitud del 2 %, que es a­ceptable al trabajar con cantidades tan pequeñas.

6. Determinación de pH.

Se hizo por mediciones potenciouétricas con electrodo devidrio, el que se controlaba antes de la medición conbuffer de pH 4,0.

11229512333iÉïlJlLlíLáQide..z¿-13l.

Según las indicaciones del Manual (V14227), 5 ml. demosto fermentado se colocan en un erlenmeyer de 25 ul., sellevan hasta ebullición para eliminar el CO2y se enfrían.Se agregan unas gotas de fcnolftaleína y se titula conNaOHN/20 exacto colocado en una uicrobureta, de lO nl. decapacidad. El NaOHN/2O exacto se prepara por dilución con­veniente del NaOH0,5 N cuyo factor se conoce.

Experiencias

.LI41

10

I

realizadasconsolucióndeacctona

(43,39mg.acetona/lOOml.solución)

Solución

acetó­

nica

usada

ACOtOHQ

en10muestra

Factor

delNu25205

0,1N

N023203gustado poreltestigo

(T)

N525205gastado

solución

porla

(S)

lodogastado

enlareacción

luído

corrqgido

leído

corregido

E-S0,1N

Acetonn hallada

Error

ml.

mg.

ml.

ral.

m1.

m1.

ml.ml.

%

1,01 1,01 1,01

0,44 0,44 0,4%

1,006 1,006 1,006

6 l.0,750 ,750 ,750

7,07o 7,070 7,070

6,620 6,620 5,635

0,455 0,455 0,440

10,05 10,05 10,05 10,05 10,05 10,05 10,05 10,05 10,05 10,05 10,05

4,35 \«,55

1,006 1,006 1,000 1,006 1,000 1,006 1,006 1,006 1,000 1,012 1,012

ü

7,070 7,070 7,070 7,070 7,070

¡x":ru,%d

2,525 2,500 2,560 2,660

4,570

0,5755,000 2,5554,580 47,526’2: 4,&OO&,&65 4,5150,550 4,5152,520

Au JHJ)

n.yq

<3D‘H

as

¿C

\í

U)J\l

46

TABLA

ll

Experienciasrealizadasconsoluciónisopropílica

(43,99mg.isopropanol/loonl.solución)

Solución

ieorro­

i.p1llca usada

Isopro­

panol enlamuestra

Factor

delN028203

0,1N

N028203gastado porultestigo

(T)

N028205gastado porla

solu01ón (o)

Iodogastado

enla

leído

correg1do

leído

corregido

T—d

reacción

(

0,1N

Isopro­

panel

hallado

Error

ml.

mg.

ml.

511.

ml.

ml.

ml.

ml.

mg.

10,03 10,03 10,03 10,03 10,03 10,03

4,41 ¿1,41 4,41 4,41 4,41 5,41

1,005 1,005 1,012 1,012 1,012

1,0l2

5,755 5,755 5,715 6,610 5,510 6,310

7,075 7,075 7,030 5,920 5,920 5,920

2,500 2,490 2,555 2,500 2,550 2,530

2,030 2,520 2,700 2,530 2,590 2,550

4,445 4,455 5,330 ¿1,290 4,330í:

4,570 4,480 4,580 ¿1,340 4,310

5,48

47

48

8-9. Determinación de ácido butírico y acético.

En la bibliografía se encuentran para este tipo de aná­lisis varias clases de métodos. Algunos se basan en la des­tilación por arrastre de los ácidos grasos volátiles y suvaloración en el destilado (Duclaux/51/, Virtanen y Pulkki/55/), otros aprovechansu diferente constante de particiónen diversos étcres comoel isopropílico, etílico; isoamíli­co (Werkman, Osburn y Wood/56/). También hay un método co­lorimétrico de Allgeicr, Peterson y Fred /57/, según elcual los ácidos se destilan y tratan con cloroformo paraextraer el butírico: éste, en presencia de CuCl2+ HCl, daun color azul debido al butirato de cobre, que se comparacon el color dc una serie de tubos standard. El ácido acé­tico se determina por diferencia.

Este método colorimétrico es bastante largo y necesitabuena cantidad de mosto para la destilación. Los métodos deextracción con éteres son inconvenientes por la inflamabi­lidad de los mismos y porque hay que manejar cantidadesgrandes de mosto fermentado y de líquido destilado.

En cuanto a los métodos de destilación originales, tam­bién usan volúmenes grandes, pero nosotros hemos observadd,al estudiar el método de Johnson /50/, que en el mismo elbutanol y etanol son oxidados a ácidos butírico y acético yque éstos son determinados simplemente por destilación dedos fracciones sucesivas, cuya acidez se titula. Nos pare­ció que debía ser posible analizar de la mismamanera unasolución de tales ácidos, por supuesto sin oxidación previa.

Hemospreparado, con ácido butírico normal Merck, unasolución acuosa con unos 200 mg. en 100 m1.; el contenidoexacto en ácido se ha determinado por valoración conBa(OH)2 0,05 N. Otro tanto se ha hecho con ácido acéticoMerck. Los datos de la valoración son los que se detallanen la tabla 12.

TABLA__¿gSoluciónbutírlca

SoluciónacétiCa

prlmerasegunda

experienciacxppriencin

prlmcrasegunda

oxpcriun01ncprriencia

Cantidaddesoluciónusada4,93m1.4,95H1.

5,07m1.5,07m1.

Ba(OH)2gastado2,10ml.2,16m1.

3,92ml.5,93ml.

Promudioduambas

experiencias2,16m1.

5,925m1.

FactordolBa(OH)30,05N0,957

0,957

Bu(0H)20,05N2,054ml.

3,096nl.

Pesomoleculardelácido88,10

60,05

Acidounlamuestra2,034x88,10x0,05=

:8,96mg.

3,096x60,00x0,05=

=11,10mg.

Acidocontenidocn 100ml.dcsolución182m5.%

49

Luego se ha destiládc cada solución ácidá por separadopara hallar el gasto de Ba(0H)2 0,05 N por uiligramo de ca­da ácido en 1a prinera y en la segunda fracción. Los datosobtenidos están en la tabla 13.

En pronedio resulta que se gasta, en Ba(OH)20,05 N,para el ácido butírico

0,146 ml/mg. en la primera fraccióny 0,069 ml/ug. en la segunda fracción,

y para el ácido acético0,095 ml/mg. en la primera fracción

y 0,127 ml/ug. en la segunda fracción.Para el análisis de mezclas de ambosácidos se tienen en­tonces las dos ecuaciones siguientes:

I 0,146 nl/mg. x b ng. + 0,095 ml/mg. x a mg.II g 0,069 ml/mg. x b ng. + 0,127 ml/mg. x a mg.

en que I y II son 10s ml. de Ba(0H)2 0,05 N gastados en laneutralización de la priïera y segundafracción respectiva­mente; "a" y "b" son los miligramos de ácido acético y bu­tírico en 1a uuestra.

De las dos ecuaciones resulta:

b = 10,67 x I - 7,98 x IIa = 12,26 x II - 5,80 x I

Los datos obtenidos con soluciones de ambos ácidos enconjunto están expuestos en la tabla 14.

TABLA15I

Expuriuncinsrealizadasconsoucionbatirica

I-I.

(182m5.001dobut1r100/100ml.)

Primerafrucci6hsegundafracción

boluciónA.butí-FactorGastoduGasto00 butíricaricodelBa(0fi)rBa(OH)250(OH)30,05NBG(OH)B&(OH)3B0(OH)20,05N

usadaenlaB0(OH)2gastad0,05Npormg.dogastadoo,05Nporug.dc

muestra0,05Ná.butirico2.butirico

ml.mg.ml.ml.ml/mg.ml.ml.ml/mg.5,079,230,9371,4"1,3470,1460,680,b&00,069 5,079,230,9371,421,3"70,1%50,680,b&0U,069

1

5,079,230,937,421,3370,1450,680,6%00,06910,0318,250,9372,822,6560,1461,331,2520,069

1

10,0318,250,9372,842,6740,147,331,2520,069

Experienciasrealizadasconsoluciónacético

Í..

(219mg.001doacético/100ml.)

PrimerafracciónSegundafracción

51

Scluciónacido'actorBa(OH)2Ba(OH)2Ba(OH)20,05NB0(0H72B0(0H)2BG(OH)20,05N acéticaacéticodelgastado0,05NQormg.dcgastadoO,CSNyormg.deusaacnlaBa(CH)2a.acuticoa.acético

mucstrapresuntopresento

ml.mg.ml.m1.ml/mg.ml.ml.ml/-*.5,c711,100,9831,081,0670,0961,63,4220,128

1

5,C711,100,9831,071,0570,0951,411,60“0,126 5,0711,100,9831,091,0770,0971,231210,0321,960,9372,202,0720,0962,062,787C 10,0321,960,9372,192,0620,0922,962,7870127

TABLA14

Experienciasrealizadasconmezclasconocidasdo

..I.

fieldobutírlco,acct1coyagua

AcidonCidOAcidosFactorla.fracción2a.fracciónAcidoacidoacidos

..l.I.

butírlcoacótlcototulusdelbutlrlcoacotlcototales

enla cnla cnlaBu(OH)3B0(OH)¿Bu(On)2Bu(OH)BBa(0H)210llgprrorhallgcrrorhallgcrror

mucstraucstrauostr00,05Nrast0d00,05NastadoD,05Ndo’dodo

EL,EIii fi,,"r

m7.mg.mg.ml.ml.ul.ml.mg.mmg.nmg.m8,9611,1020,060,9572,512,5642,152,0069,21+2,811o,oa—e,(:g,r9+

N

8,9611,1020,060,9572,512,564

01

,121,9969,29+5,710,76-5,120,05-0,0

1,8422,214,050,9570,520,4900,450,405l,99+82,15-,64,12417 1,842,214,050,9570,510,4800,450,4051,89+2,72,19-,94,08+0,7 9,651,2210,850,8551,811,5200,950,7989,84+2,20,97-210,81—0,4

5 0

9,651,2210,850,8551,801,5110,960,8069,69+0,61,12-8,2ü0,81—0,4

0 6

9,572,4511,820,8601,891,654'1,110,9609,77+4,52,29-,512,06+2,0 9,572,4511,820,8601,881,6261,110,9609,68+5,52,54-4,512,02+1,7

19,066,1525,190,8515,945,5712,422,07019,45+2,05,85-4,925,28+0,4

1,926,158,050,8600,980,8471,060,9171,72466,52+5,18,04+0,1 1,926,158,050,8600,990,8561,0”0,8912,02+55,96-2,87,98-0,9 5,8412,2616,120,8511,971,6902,051,7544,05+4,911,70;,615,75-2,4

lw

l

52

53

hedios de cultivo empleados en las fermentaciones

Eïtracto de levadura de doble concentración.

Para que nuestros datos pudieran ser comparados con losde los autores de Wisconsin /33/, se eligió comoprimer me­dio de cultivo para realizar las fermentaciones el extractode levadura de doble concentración con 2,5 % de glucosa.

Ya Orla-Jensen /59/ menciona la necesidad de la autóli­sis en la preparación de un buen extracto de levadura; elmismo indica que 24 horas a 50°C alcanzan para que se cum­pla el proceso. Según las indicaciones del Ing. Agr. SantosSoriano, conviene más autolizar 48 horas (aunque se obtengaasi una mayor acidez y rotura de las proteínas) y luego ca­lentar el medio con clara de huevo, porque se consigue deesta manerauna mejor clarificación y filtración. La prepa­ración del extracto de levadura se detalla a continuación.

500 g. de levadura fresca de panadería se disgregan y,en un matraz de dos litros, se dejan 48 horas a 45-50°C pa­ra que se efectúe laintólisis, agitando la masavarias ve­ces en ese intervalo, Unavez autolizada, la levadura sedeslíe en agua a razón de 200 g/l. Se agrega una clara dehuevobatida a nieve por litro, repartiendo los 6 litros demedio en 4 matraccs de dos litros. Se lleva 20 minutos a120°C, con lo cual se consigue la primera clarificación. Sedecanta y pasa por una gasa el líquido y una vez tibio sele vuelve a agregar una clara batida por litro, esterili­ando de nuevo 20 minutos a 120°C en matraces grandes no

del todo llenos. Se obtiene así una buena coagulación y laseparación de un líquido perfectamente límpido. Se lo de­canta y pasa por papel de filtro, se arregla el pHa 7,0,se agregan 25 g/l. de glucosa, se reparte y esteriliza 30minutos a 110°C.

54

Del volumen inicial de 6 litros se consiguen de 3 a 4litros de medio de cultivo terminado.

Las fermentaciones con extracto de levadura como sus­trato se hicieron en tubos de Hall /60/, con unos 60 ml. demedio por tubo.

El mismo extracto de levadura de doble concentración seusó además en otros momentos de este trabajo, según ya sevió en la parte bacteriológica.

Medio de papa-levadura.

Comomedio de cultivo en que hacer desarrollar los gér­menes esporulados sobre tierra, o sea para obtener los lla­:ados "starters" con que inocular luego los tubos de medi”de levadura, se ha utilizado el medio de papa-levadura, porno convenir para tal objeto un medio totalmente líquido°

200 g. de papa cortada en cubitos se hiervcn lO minutoscon 500 m1. de extracto de levadura más 500 ml. de agua. Sesepara el líquido y los cubitos se reparten en tubos de en­sayo (5-6 cubitos por tubo). Al liquido se añade 0,3 % decrota; luego, agitando bien, se lo reparte en los tubos.Se esteriliza 30 minutos a 110°C.

Masa_demgaiz.

Las fermentaciones se realizaron también en masa demaíz, para lo cual se muele el maíz, sin llegar a tener unpolvo fino; se coloca al 5 % en agua y se hierve 15 minutosen un vaso de precipitación, agitando a menudo. Se reponeel agua evaporada, se separa el engrudo de almidón formado,se reparte c1 maiz en los tubos y luego sc añade el líquidoseparado. Finalmente se esteriliza 20 minutos a 120°C.

Las fermentaciones con masa de maíz se realizaron entubos grandes de 25 x 300 mm. con 50 ml. de medio de culti­

—55

TOpor tubo. Para los "starters" se repartió masa de maízen tubos de ensayo, que se sembraron con los cultivos espo­rulados sobre tierra.

Para asegurar 1a anaerobiosis, todos los medios de cul­tivoy a1 momentode ser usados, se ponían a baño maría hir­viendo durante lO a 30 minutos, según el tamaño de los tu­bos, y luejo se enfriaban para poder ser inoculados. Además1 los tubos de ensayo comunes, una vez sembrados, se agre­

LIgaba 1 m1. de parafina eSprÏÏ tünflida.

56

gécnica de las fermentaciones

Cgmolos gérmenes en estudio pierden fácilmente su vi­¿ur por sucesivos transplantes, fué necesario esporularlossoore tierra antes de comenzar las fermentaciones. Para esoe reparó tierra molida, se repartieron 2 g. por tubo y se-:orilizó una hora a 120°C. Los cultivos recibidos, des­

pués de controlar la ausencia de contaminantes aerobios,fueron sembrados en medio de papa-levadura. A las 48 horasde desarrollados, se pasó de cada uno l ml. del líquidoturbio a un tubo con tierra, que luego se dejó secar variosdías a 37°C:

Se vic luego que algunos gérmenes no daban así buenoscultivos esporulados en tierra: ¿e ellos fué necesario ino­(uler unos lO ml. de medio de levadura: a las 48 horas dedenzïrollados los tubos, se centrifugó estérilmente su contenido, se separó el líquido límpido y sólo el sedimentoh“ñcdo se mezcló con la tierra estéril.

Al principio hubo que determinar el_momento adecuado.para hacer los análisis en el mosto fermentado. Para eso seinocularon, a partir de un mismotubo en pleno desarrollo,uñas 7 tubos con lO ml. de medio ue levadura por tubo. Estor? tiro con cada uno de los gérmenes. Cada día se abría untubo de cada germen y se detorminaba el azúcar residual.los datos que se obtuvieron fueron aproximados, por lasinevitables diferencias entre un tubo y otro, pero se pudover que a partir del cuarto día el contenido en glucosa co­menzabaa mantenerse prácticamente constante para cada ger­;e:. Luego, en todas las fermentaciones hechas con objetode analizar los productos formados, se adoptó el tiempo de

días comoperíodo de incubación.Al comenzar nuestro trabajo, dejábamos fermentar un so­

Íñ tubo de Hall con extracto de levadura por vez, ya que

57

todas las determinaciones analíticas que debíamos hacer conel mosto fermentado en el mismo día no nos permitían hacermás tubos al mismo tiempo. Los resultados que obtuvimos dedistintos tubos Íermentados por un mismogermen en distin­tas oportunidades fueron tan discordantes, que no pudimossacar más que una conclusión: había que eliminar esas enor­mes diferencias entre tubo y tubo. Se trató de conseguirlosembrando el cultivo esporulado en tierra a un tubo de pa­pa-levadura, a las 48 horas de desarrollado pastenrizarln5 minutos a 83°C, luego inocular con este material un tubocon lO ml. de medio de levadura y recién con este cultivobien desarrollado inocular el tubo de Hall. Los resultadosno llegaron a ser muy buenos, pero demostraron que, si secomparabansólo aquellos datos que correspondían a los tu­bos en que había menos glucosa residual, las cantidades delos varios productos de fermentación en los distintos tuboseran bastante análogas.

Entonces se vió la necesidad de obtener datos promediosdirectamente y por lo tanto se decidió fermentar por vezdiez tubos de Hall, analizar luego en cada uno la glucosaresidual y la acidez producida y, en base a tales datos,mezclar los contenidos de los tubos análogos, analizandoluego, en csanio a los productos de fermentación, las dos otres mezclas resultantes. Cada serie de diez tubos debíarepetirse por lo menos dos veces, para ver si de esta mane­ra los resultados eran concordantes.

En detalle, la técnica seguida se da a continuación.

.¿¿_Eermentaciones en medio_de_levadura +__glu_co__s_aL

ÏÏÁEÉÉ_1ÉÏ?ÉÏPEïzDel cultivo esporulado en tierra se pasa, con un ansa

enroscada ei for a de cestillo, un poco de tierra a dos tu­bos con medio de papaulevadura; se los incuba a 37°C y de­

58

De: comenzar a fermentar dentro de las 36 horas. Si esto noocurre, hay que preparar un cultivo esporulado de mayor ac­tividad.

.61:812-1130._"._s13811321;

Unavez que los dos tubos del primer starter están fer­mentando 24 horas, se elige uno de ellos, se lo pasteuriza5 minutos y se enfría rápidamente. Dos tubos de Hall se i­noculan cada uno con 2,5 m1. del cultivo pasteurizado'y seincuban.egzzaeniesicñ».

A las 48 horas los tubos del segundo starter deben es­tar bien fermentados. Se elige uno de ellos: se le saca ellíquido por encima de la bolita de vidrio y se le quita és­ta mediante una cucharita de vidrio estéril. Se homogeinizabien el cultivo (esto es importante para el 1-1 y 4-2 quedan un desarrollo mucoso) y se inoculan 5 tubos de Hall ca­Cl uro con 3 ml. del segundo "starter". El resto se pasteu­riza 5 minutos, se enfría bajo canilla y se usa para inocu­lar otros 5 tubos de Hall. Los lO tubos se incuban 4 días a37° .

La temperatura de pasteurización fué en general de 70­7500, pero tuvo que ser disminuida a 50-55°C para los cul­tivos 4«1, D y B-8-3, cuya resistencia a las temperaturasele:adas es muyescasa, debido a su difícil esporulación.«_

Al terminar el cuarto día, se saca de cada tubo el lí­quido de cierre y se usa l ml. del mismo para la reaccióndel acetilmetilcarbinol. Del mosto fermentado en anaerobio­sis se extrae de cada tubo, con sendas pipetas estériles,la cantidad necesaria para el análisis de glucosa residualy acidez.

Los tubos, con el resto del mosto fermentado, se guar­¿un en la heladera y, una vez conocido el resultado del

59

análisis previo, se mezclan volúmenes iguales de los mostosanálogos, siempre manteniendo separados los que provienendel “starter” pasteurizado o no.

En cada mezcla se determina el pH, luego se la centri­fuga: una porción dc la misma (de 2 a 5 m1.} sirve para de­terminar ácido butírico y acético; otra porción (20 m1.) sedestila en medio alcalino y el destilado se usa para deter­minar solventes de acuerdo a los métodos dados anteriormen­te.

_?¿_“grmentaciongs en masa de maíz al 5 %¿

Cod el cultivo esporulado en tierra se inocula un tubode ensayo con masa dc maíz ("starter"I. A las 48 horas, conuna pipeta de lO ml. de punta bien abierta, se inoculan 3tubos grandes de masa de maiz, cada uno con 3 ml. de 1“ "o­c: fcrmentada del "starter". Después de 4 dias de incuba­ción a 37°C, se saca de cada tubo el liquido sobrenadante;se analiza en cada uno la acidez y se hace la reacción de¿arritn Si la acidez es aproximadamente la misma en los 3tubos, se mezclan partes iguales de los respectivos liqui­dos y se hacen las determinaciones de ácidos y solventescomoen el caso de las fermentaciones en extracto de leva­dura, En este caso no es necesario centrifugar, porque seforma poca espuma.

60

'Resultados de las fermentaciones

A, En medio de levadura + glucosa.

En la tabla 15 figuran los resultados de las fermenta­ciones llevades a cabo en el medio de levadura, ya sea conel segundo "starter" pasteurizado o no.

Existe una mayor concordancia entre los datos obtenidossin la pasteurización: ello puede ser debido a que el mediode levadura, totalmente líquido, no es muyfavorable a laesporulación; luego, al morir por el calentamiento las for­mes vegetativas, quedarían muy pocos núcleos para comenzarenseguida una buena fermentación,

Consideremos entonces los promedios de los resultadosobtenidos sin pasteurizar el segundo "starter", los que es­tán en la tabla 16.

Con respecto a la capacidad de consumir glucosa, se ob­serva que todos los microrganismos fermentan por lo menosel 45 %; es interesante ver que un Cl. acetobutylicum, elBPS 3, es capaz de consumir la mayor parte de la glucosapresente (promedio 82 %), mientras que, según el trabajo deLanglykkey colaboradores /33/, los acetobutílicos fermen­tan alrededor del 50 fi de la glucosa. Dichos autores no es­pecifican la preparación del medio de levadura que utili­zan, pero, a juzgar por los resultados, parecería que elmedio de cultivo fuera distinto al nuestro y es posible ¿ueellos no autolizaran la levadura.

En cuanto al pH, después de 4 días de incubación, nodifiere grandemente de un germen a otro: varía entre 4,2 y6,0 en todo el grupo estudiado, pero en un mismo organismohay fácilmente variaciones de hasta 0,5 unidades entre unaexperiencia y otra. En forma de curvas de pH hechas a lolargo de una fermentación en gran escala los datos de pH

Fcrmontucioncs

TABLA

15

enmodio

du

levadura

ulaqlelsuIGP

03

UQIOGZIInaisua

Glucosa

Bpaiuamaa;

IÉanSSJ

pH

ACidO

S

olvcnt0s

00:1;inqOAIQIÚO °In g

:ZGDIOV

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Tipo

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10d oa/N HOÉN E

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5/1­

5/1.

O

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.I-Í\:0

Clostridium pastourinnum

Clostridium aoetobutylicum

87

1e,0

15,02,09,515,7

15,0 11,57,6

12,5 11,9

56 ‘1E3 63 52 46 30 58 48

1,00 1,20 1,92 1,5 C',‘.:8 0,28 1,17 LLl6

50,19

0,17 0,05 0,00

o-m yme? A

u

0,020,05 0,00 030€:

x1 n-i 1') Jl ¡lL¡nan-¡An"J

181

8,5¡17,7¡71í'

15":10,859

lb,AUI1JÍL),"I¡"I'LJ9,9!15,1!6

1,m_1_".1. 15,511,747; 12,512,5¡50=12,712,5109;13,LLL?¿9153¡

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2,09 2,090,2 'L{quÉ'b¡”i/y,m.,‘Ja,¡1,19'0,26!1,27I

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0,55 0,55 0,54 ,9,22 0,75 1,85 5,98 2,97

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ui ‘:aJ:HBC‘Jan-ic

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0,04!1,1o0,1ó¡1,500,U5¡0,96

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0,5011,25 O,89l0,90 0,87¡0,81O,96:l,00 0,50!1,010,25j0,991,06‘0,85 1,211,07

l0,98

OOOOOOOOOOOOO._

l

61

TABLA16

Fcrmuntnoionusenmediodcluvaduru

(promudiosdulosunsayosufoctudossinpastuuriZurul

sugundo"St:_'.rt;(,r")

Tu.

Gluco-.ACidOS

L3

uclvcntc

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pH

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Tipo

4'.)

i.H

r—|\w'

.4

Clostrid1um pastcuriunum

15,950ï,oó5,021,850,86

1,082,29

0,09 0,2

Clostridium succharobutyricma

IO

0,931,1“

0,100,21 0,17

a)‘)

Clostridiumn fvl;in;um

1,211,56o

Clostridium’ acutobutyl1cuu

63

dcbcn resultar sumamenteútiles en la industria, pero medi­das aisladas, aunque sea siempre después de un mismo perío­do de incubación, no pueden servir en la diferenciación delas cepas.

La determinación de acidez total adolece del mismodefec­to, aunque ya difiere más que el pH entre un germen y otro.Se observa que en el medio de levadura son productores máxi­mosde acidez los acetobutílicos; les siguen los felsineosy los del tipo "pasteurianum", mientras que los sacarobuti­ricos dan muy poca acidez.

Muchomás interesante resulta la determinación de losácidos butirico y acético por separado. Hay más butírico queacético en los del tipo "pasteurianum" y en los acetobutili­cos; hay menos en los sacarobutiricos y en los grandes en­riadcres. La relación entre la concentración de ambosácidosestá calculada en la tabla 17 y parece ser un buen indice enla diferenciación de las cepas.

T A B L A 17

C e p a Relación = ácido butíricoácido acético

tipo N° en medio de levadura87 6

Cl. pasteurianum 5’181 3,8

, 179 0,62C1, saccharobutyricum

180 0,41l-l 0,14

Cl. fclsincum 4-2 0,914-1 0,50

. D 1,45Cl. acctobutylicum

64

Si se consideren los solventes obtenidos, por dc prontose diferencia el tipo "saccharobutyricum" por la presenciadel isopropanol; si luego se observa la relación entre lasconcentraciones de los solventes, la que figura en la tatla18, se nota que la diferencia entre los felsíncos y aceto­butílicos es poco nítida y que depende más bien en ambostipos de gérmenes del porcentaje de glucosa consumida.

Es notable que en medio de levadura con glucosa siemprese obtenga más e anol que acetona, mientras que luego severá que en masa dc maiz, cuando el rendimiento en solven­tes es apreciable, siempre hay más acctona que etanol.

T A B L A 18

C Relacióne p aa butanolzacetonazetanol:(isopropanol)

tipo N° en medio de levadura + glucosaClostridium 67 6,4 = 0,36 = 1pristeuriïznurz 181 5 , o g 0,61 g 11 3134,sncchorobutyricum 180 12,6 : 0,43 z l : 3,

1-1 3,7 : 0,91 : 1Clostridium o .felsineum 4-2 0’90 ° 0'12 ' 1

4-1 2,6 : 0,80 2 lClostridium D 0,37 = 0,08 = 1

¡acetobutylicum b_8_3 2,2 3 0,71 , 1

65

B. En masa de maíz al 5 %.

Consideremos ahora las fermentaciones en masa de maiz,cuyos resultados están expuestos en la tabla 19.

La acidez es aquí máximaen los felsíneos, les siguenlos acctobutílicos y finalmente los del tipo "saccharobu­tyricum" y "pasteurianum" que dan muy poca acidez.

Ia relación entre ácido butírico y acético no presentavariaciones tan nítidas comoen el medio de levadura: sólose puede decir que hay más butírico que acético en los deltipo "pasteurianum" y "sacoharobutyricum", hay menos en losacetobutilicos y la relación es.variable, aunquebastantecercana a l en los fclsíneos.

En cuanto a los solventes, en ningún caso se ha obteni­do isopropanol, pero en muchos casos las concentraciones desolventes son tan exiguas que ya no se tiene mucha seguri­dad en los análisis. Por la mismarazón no se puede hablarde relación de solventes más que en el caso de los acetobu­tílicos y dc algunos felsíneos, donde se tiene:

Clostridium {1-1 butanolzacetonazetanol = 5,3 : 2,3 2 1fclsineum 4-1 n " " = 3,7 : 1,5 : 1

Clostridium { D " " " 6,1 z 2,7 2 1acetobutylicun 3-8-3 n " " = 5,7 : 3,4 z l.Las relaciones calculadas en base a los datos de McCoy

y McClung/3l/ son las siguientes:Cl. felsincum butanolzacetonazetanol = 6,7 : 3,4 :Cl. roscum " " " = 4,8 : 2,2 zC1.acetobutylicum " " " z 6,4 2 3,1 : l.

abría que ver si repetidos "heat shocks" en un mediofavorable a la esporulación modifican o no tales relacionesen forma apreciable o si se consigue una mejora en el ron­dimiento.

TABLALg

FUI'm‘JntíECiCHpSon[15282;dumaíz

v0nt0sr-Í

.Acidez:AcidosSo

NaOHH/BO

Ccpapor5ml.L 'iso­

dccultivobutic“cuticobutanolacctoneatunolpropanol

ír

TlpoN°ml.g/l.5/1.g/l.g/l.5/1.5/1.

Clostridium

87(,50C,ZS0,1900,020,08C

pastcurianuml

181O,bó0,50,10o0,010,00o

Clostridium1790’95Ú’ïa0,18“,010,020,0vO seccnarooutyrlcuu180l,ü80’790,250,06C’Uó0,07C

1-17,081,7L2,02¿,081,500,600

ClQSEridiumrlsinbumü-B5,68¿,521,270,000.000,12o

0-15,221,731,000,000,500,200

¿5 A

Clostidiumucptobutylicum

8-8-55,2¿,951,000,260,100,0:u

nudio51n

swmbrar

0,30

66

Resumen

la investigación, que fué realizada con finalidad taxo­nónica a la par que con el propósito de poner a punto y do­minar las técnicas analíticas necesarias para el estudio delos balances de fermentación, no alcanzó integramente elpropósito inicial. Sin embargo, la experiencia alcanzadanos coloca en una posición tal, que nos será mucho más fá­cil obtener resultados que signifiquen alguna contribuciónal conocimiento del tema.

Los métodos analíticos para determinar azúcares reduc­tores, butanol, etanol, acetona, alcohol isopropilico, áci­dos butírico y acético fueron examinadospor pruebas testi­gos hasta conocer sus limitaciones y errores y luego apli­cados a los líquidos fcrmcntados. Los métodos utilizadosson del tipo seni-microquímico y han dado resultados compa­tibles con la exactitud requerida para los balances de fer­mentación. Prácticamente se han introducido pocas variantessobre las técnicas descritas originalmente.

Las cepas que hemos estudiado son muy pocas (9) parapoder intentar un examensistemático crítico útil y ademássu origen y autenticidad no nos han sido garantizados, demodoque los nombres de cuatro de ellas (87: Clostridiumgranulobactcr pectinovorum, 181: Clostridium beijerinckii,179: Clostridium butylicun y 180: Clostridium acetobutyli­23g) pueden no corresponder a las especies de esa designa­ción. Tres cepas de Clostridium felsineuu dadas por elIng.Agr. Santos Soriano corresponden sin duda a la especie.Dos de Clostridium acetobutylicun son casi con certeza tam­bién auténticas y así lo consideraremos.

La fermentación fué estudiada en un medio de levadurafautolizado de levadura) con glucosa y en mosto de maízcompleto. Los resultados difieren de manera tan marcada,

67

que el hecho uerece la mayor atención y deberá ser estudia­do, pues ofrece perspectivas interesantes. En efecto, en elmedio de levadura la cantidad de solventes neutros formadoscontradice la idea corriente de que los "butíricos" apenaslos producen, en comparación con los verdaderos formadoresde solventes. En cambio dicha idea es correcta para el casodel medio de maíz, cuando la fuente hidrocarbonada estáconstituida casi exclusivamente por el almidón. De igualmanera a proporción relativa de los distintos solventes noes la nisna en el medio de levadura que en el medio de maíz.

He os confirmado el significado práctico y quizás devalor taxonóuico de a licuación de a gelatina, del enria­do del lino, de la formación de isopropanol, de la del ace­tilaetilcarbinol.

Lapropcrción de ácidos acético y butírico en el Lediode leVñdura se ha mostrado comouna propiedad relativamenteconstante y distintiva de por lo monosdos de los cuatrogrupos de bacterias que hemos creado por razones prácticasy no taxonónicas. Dicha propiedad está asociada con otras,cono la de forrar isopropanol. De su valor práctico nadapuede edelantqrso y menos aún de su significado taxonómico.

En el cuadro 20 de la página siguiente figuran en resu­pen las propiedades que Layor significado tienen para in­tentar una diferenciación de las bacterias estudia as.

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Clostridium saccharobutyrioun+-—-.(+)+0,2-0,6lClostridium fulainuum+++++++—C

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Conclusiones

l. Le aplicación de métodos semi-mieroquímicos conocidospara le determinación de azúcares reductores, butanol,etanol, isopropenol y ncetone, y ácidos butírico y acé­tico es reletivenente simple y da resultados suficiente­mente exuctos por? el estudio de balances de fermentu­ción. I

2. Por el estudio de cuatro cepas de clostridios del tipobutírico, de tres de Cl. felsineum y de dos de Cl. ace­tobutllicun fué posible establecer una diferenciación encuatro grupos (o tipos) por lo menos:tipo I: no producen prácticamente ácidos ni solventes a

partir de elhidón y no parecen atacar a este po­lisaeárido (correspondería a le especie Cl. pes­jeurienuu según le edición de 1948 de Bergey);

tipo II: no producen prácticamente ácidos ni solventesdel almidón, pero lo transforman en un polisaeá­ride de reacción distinta con el iodo y producenisopropanol a partir de le glucosa;

tipo III: especie gl. felsingug (enriador);tipo IV: especie gl¿_ggetobutxlicu¿ (licúa gelatina y no

enríu prácticamente).las propiedades neneionedns están asociadas e algunas o­d­ res, que dan una base un poco más sólida a tal divisiónprovisoria.

3. La fermentación de a glucosa en un medio de levadura ylá del almidón en un medio de maíz muestren diferenciasten importantes, que merecen ser investigadas sistemáti­cemento.

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A. Fermentaciones en medio de.1evadura + glucosaPrimer'btarter"Segundo"starter"FermentaciónAnálisis

B. Fermentaciones en masa de maíz al 5 %Resultados de las fermentaciones

A. En medio de levadura + glucosaB. En masa de maíz al 5 %

ResumenConclusionesBibliografía

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