estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el virus de la ... · 2018-07-13 ·...
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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
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Tesis Doctoral
Estudio de la evasión de la respuestaEstudio de la evasión de la respuestainmune citotóxica por el Virus de lainmune citotóxica por el Virus de la
Inmunodeficiencia Humana Tipo-1 (HIV-1)Inmunodeficiencia Humana Tipo-1 (HIV-1)y su relación con el tratamientoy su relación con el tratamiento
antirretroviralantirretroviral
Dilernia, Darío A.
2010
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Cita tipo APA:
Dilernia, Darío A.. (2010). Estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el Virus dela Inmunodeficiencia Humana Tipo-1 (HIV-1) y su relación con el tratamiento antirretroviral.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Dilernia, Darío A.. "Estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el Virus de laInmunodeficiencia Humana Tipo-1 (HIV-1) y su relación con el tratamiento antirretroviral".Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2010.
Universidad de Buenos Aires Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipo‐1 (HIV‐1) y su relación con el
tratamiento antirretroviral
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área
CIENCIAS BIOLÓGICAS
Lic. Darío A. Dilernia
Director de tesis: Dr. Horacio Salomón Consejero de estudios: Dr. Eduardo Arzt Lugar de trabajo: Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 2010
Estudio de la evasión de la respuesta inmune citotóxica por el Virus de la Inmunodeficiencia
Humana Tipo 1 (HIV 1) y su relación con el tratamiento antirretroviral
Introducción. El HIV es el agente causal del SIDA. Entender las formas en las que evade la respuesta inmune del
hospedador es crítico para el desarrollo racional de una vacuna efectiva. Aunque la amplia extensión del
tratamiento antirretroviral es capaz de impactar significativamente en los procesos naturales de selección y
escape, pocos trabajos han estudiado esta temática. El objetivo de esta tesis fue identificar aquellas regiones
virales sometidas a presión de selección inmune y evaluar el impacto del tratamiento antirretroviral en su
selección y persistencia.
Metodología y resultados. Mediante análisis estadístico se identificaron 12 mutaciones virales asociadas a
escape inmune, 6 de ellas en regiones no caracterizadas previamente como epítopes. El análisis de secuencias
obtenidas en los últimos 20 años de epidemia sugirió que varias de ellas han incrementado su frecuencia hasta
estar presentes en la mayoría de las cepas virales actuales. La evaluación de la respuesta inmune péptido
específica mostró reconocimiento principalmente de dos péptidos con restricción para el alelo HLA A02
(A02P65 y A02P84), uno para el alelo HLA A03 (A03P28) y uno para el alelo HLA B07 (B07P357). Para los dos
últimos y para A02P65 se demostró que la variante de escape disminuía el reconocimiento por la respuesta
inmune mientras que, para todos los casos, se evidenció la capacidad de inducir una respuesta polifuncional
secretora tanto de IFN como de IL 2 y MIP 1 . Se evaluó también el nivel de agotamiento inmune y, aunque
la técnica de tetrámeros presentó varios inconvenientes, se detectó una mayoría de respuesta no exhausta en
los casos exitosos. La secuenciación del gen viral gag mostró la presencia de escape viral en la mayoría de los
epítopes analizados y sugirió que la positividad de la respuesta inmunológica estaba asociada a una mayor
afinidad del epítope por el alelo HLA que lo presenta. Al mismo tiempo, el análisis de secuencia de dicho gen
viral en muestras repetidas de 50 pacientes separadas por un promedio de 3 años, demostró la presencia de
recambio activo de variantes virales hacia el estado de escape durante el período de muestreo. Se encontró
también que la selección activa resulta menos frecuente en los pacientes bajo tratamiento y el análisis del virus
en dichos pacientes sugirió que esto sería debido a una reducción significativa de la capacidad evolutiva del
virus en el contexto del tratamiento altamente efectivo. Finalmente, un análisis filogenético más profundo de
las secuencias estudiadas permitió datar el inicio de la epidemia del HIV 1 en Argentina en la primera mitad de
la década de 1970.
Conclusiones. El presente trabajo de tesis permitió caracterizar regiones de la proteína viral Gag de frecuente
reconocimiento inmune sobre las cepas del HIV 1 circulantes en nuestra región y caracterizar su dinámica a
nivel poblacional a lo largo de veinte años de epidemia. El conjunto de datos obtenido de los ensayos
inmunológicos confirma la aproximación estadística para identificar sitios de reconocimiento inmune
demostrando respuestas citotóxicas polifuncionales mientras que el estudio de muestras seriadas en pacientes,
la mayoría de ellos en estados clínicos avanzados, sugiere que la selección del escape viral se extiende más allá
de los primeros momentos de la infección. En este sentido, el inicio del tratamiento puede tener un beneficio
adicional al prevenir dicho escape por reducción significativa de la evolución viral.
Palabras clave: HIV, escape inmune, gag, tratamiento, respuesta citotóxica.
Study of the evasion from the cytotoxic immune response by the Human Immunodeficiency Virus
Type 1 (HIV 1) and its relationship with the antiretroviral therapy
Introduction. HIV is the etiological agent of AIDS. To understand the way the virus evade the immune response
of the host is critical for the rational development of an effective vaccine. Although the expansion of treatment
access is able to shape the natural process of selection and escape, few studies have analyzed this
phenomenon. The objective of the present thesis was to identify viral genomic regions where the virus
undergoes selective immune pressure and to evaluate the impact that the antiretroviral therapy may have in
their selection and persistence.
Methodology and results. A total of 12 viral mutations associated to immune escape were identified, six of
them in regions not previously characterized as epítopes. The analysis of a set of viral sequences obtained from
samples collected in the last twenty years suggested that many of them have increased their prevalence in time
until become the most prevalent state of circulating viral strains. The evaluation of peptide specific immune
response showed that the main targets of immune recognition were located in two HLA A02 restricted
epítopes (A02P65 and A02P84), in a HLA A03 restricted one (A03P28) and in a HLA B07 restricted one
(B07P357). For the last two and also for A02P65 we found that the escape mutations significantly impair
recognition by the immune response. For all of them, the capacity of stimulating a polyfunctional response able
to release IFN , IL 2 and MIP 1 was shown. Also, the evaluation of immune exhaustion through tetramer
technique showed, in spite of many technical inconveniences, a low level of exhaustion in the majority of
successfully analyzed samples. The sequencing of viral gene gag showed the presence of escape in the majority
of the epítopes analyzed and suggested that detection of immune response was associated to a greater affinity
of the epítope for the HLA allele. At the same time, the analysis of the same region in repeated samples
collected from 50 patients within a time period of 3 years showed the presence of active replacement of viral
sequences toward the escape state. That active replacement seems to be associated to the lack of
antiretroviral therapy and the analysis of the virus quasispecies in under therapy patients suggested that the
significant reduction of evolutive capacity of the virus in the context of the effective therapy is likely the reason
for that observation. Finally, a deeper phylogenetic analysis of the sequences under study allowed us to locate
the initiation of the HIV epidemic in Argentina at the first half of the 1970s decade.
Conclusions. The present thesis allowed us to characterize the regions of the viral protein Gag under frequent
immune recognition at the population level and to characterize their dynamics in the last twenty years of
epidemic. The set of data obtained from the immunologic assays confirms the statistical approach of the
identification of sites under immune recognition showing polyfunctional cytotoxic responses while the study of
repeated samples from patients that were in their majority in advanced stages of infection show that selection
of escape not only occurs in the first stages of infection. In this sense, the initiation of treatment could have an
additional benefit in preventing the immune escape by significantly reducing the evolutive capacity of the virus.
Key words: HIV, immune escape, gag, treatment, cytotoxic response
A mi amor Dani,
a mis viejos, mi hermana
y mis abuelos,
y a todos mis amigos
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer a las siguientes personas que hicieron posible la realización de la presente tesis
de doctorado:
Al Dr. Horacio Salomón por confiar en mí al darme la posibilidad de desarrollar mi tesis de doctorado
bajo su dirección y por estar siempre dispuesto a apoyarme en todas las iniciativas que surgieron
tanto como parte del presente trabajo como en paralelo.
Al Dr. Leandro Jones por su invaluable aporte al análisis filogenético, y por estar siempre dispuesto a
compartir conmigo sus amplios conocimientos y ayudarme con la mejor predisposición.
A la Dra. Sabrina Rodríguez por el tiempo dedicado a los análisis de corrección filogenética.
Al Dr. Christian Bautista quien siempre aportó significativamente al análisis estadístico, tanto a la
presente tesis como a mi conocimiento general respondiendo mis dudas.
A los Dres. Marcelo Losso, Leonardo Lourtau, Guillermo Vila y a sus colaboradores en el Hospital
Ramos Mejía que fueron parte del presente trabajo, colectando las muestras y los datos
epidemiológicos que permitieron un análisis más completo de los resultados.
A los Dres. John Altman y Eric Hunter, y a sus colaboradores en el Emory Vaccine Center que me
recibieron en su instituto y de los cuales aprendí mucho en solamente un mes gracias a su gran
predisposición y amplio conocimiento.
También al Dr. Pablo Romagnoli, integrante del equipo del Dr. Altman, a quien debo el haber podido
terminar la parte preliminar de los estudios de tetrámeros para lo cual dedicó varios días de trabajo
con el objetivo único de poder ayudarme a finalizar aquello que los tiempos no habían permitido.
A los Dres. Pedro Cahn, Alejandro Krolewiecki, Carina Cesar, Omar Sued y a sus colaboradores en
Fundación Huésped con quienes discutimos todos los aspectos del desarrollo del modelo de Markov
presentado brevemente en esta tesis de doctorado pero que significó varias reuniones en las cuales
siempre mostraron la mejor predisposición a discutir resultados y compartir sus conocimientos.
Finalmente agradezco también a mi familia por estar siempre, a Dani por toda su ayuda en todos los
aspectos posibles, por elegirme y por ser mi apoyo, a mis amigos, Nacho, Marie, Mari, Ceci, Nico,
León (!) que siempre son parte de los mejores momentos de mi vida, y a mis compañeros de trabajo
por la compañía y los mates.
COMUNICACIÓN DE RESULTADOS
Parte de los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis fueron presentados en
congresos nacionales e internacionales y publicados en revistas científicas:
Publicaciones aceptadas
HLA driven Convergence of HIV 1 Viral Subtypes B and F toward the Adaptation to ImmuneResponses in Human Populations. Dario Dilernia, Leandro Jones, S. Rodriguez, G. Turk, A. Rubio, S.Pampuro, M. Gomez Carrillo, C. Bautista, G. Deluchi, J. Benetucci, M. Lasala, L. Lourtau, M. Losso, H.Perez, P. Cahn, H. Salomón. PLoS ONE 2008;3(10):e3429.
Manuscritos en preparación
Founder effect in the origin of HIV 1 epidemics in America. Dario A. Dilernia, Leandro R. Jones, MariaPando, Roberto D. Rabinovich, Gabriel D. Damilano, Gabriela Turk, Andrea E. Rubio, SandraPampurro, Manuel Gomez Carrillo y Horacio Salomon.
Presentaciones en Congresos
Origen de la epidemia del HIV en Argentina. Dilernia, Dario A., Jones, Leandro R., Damilano, GabrielD.; Gomez Carrillo, Manuel, Salomon, Horacio. II Congreso Nacional de SIDA. Salta, Argentina. 26 29agosto de 2009.
Estimation of the year of introduction of subtype F HIV in America that lead to the origin of the BFrecombinant epidemic and the first cases of AIDS. Dario A Dilernia, Leandro Jones, Manuel GomezCarrillo and Horacio Salomón. 5th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention.Cape Town, South Africa. 19 22 de Julio de 2009.
Evidence of HLA mediated immune response driving the maintenance of CTL escape variants inpatients with undetectable viral load. D. A. Dilernia, L. Lourtau, L. Jones, S. Rodriguez, C. Bautista, M.Gomez Carrillo, M. Losso, H. Salomon. AIDS Vaccine 2008, Cape Town, South Africa. Octubre 2008.
Timely diagnosis of HIV infection reduces mortality in patients on HAART in Argentina. A Markovmodel approach. D. A. Dilernia, C. César, A. Krolewiecki, O. Sued, R. Marone, N. Laufer, M. GomezCarrillo, P. Cahn, H. Salomón. XVII International AIDS Conference, México City, México. 3 8 August2008.
Accumulation of CTL Escape Variants and HLA driven Convergence of Viral Subtypes D. A. Dilernia, LLourtau, L Jones, G Turk, M Gomez Carrillo, C Bautista, J Benetucci, M Losso, P Cahn, and H Salomon.15th Conference in Retroviruses and Opportunistics Infections. Boston, MA, USA. February 2008.
Selección poblacional de variantes de escape del HIV 1 a la respuesta CTL en la Ciudad de BuenosAires Dilernia, D; Lourtau, L; Parlante, Á; Losso, M; Salomón, H. Presentación oral el día jueves 6 deSeptiembre de 2007. CONGRESO NACIONAL DE SIDA. Paraná, 5 al 8 de septiembre de 2007.
Differential HLA dependent HIV evolution among subtypes. Dilernia D.A., Lourtau L., Losso M. andSalmon H. 2006 International Meeting of the Institute of Human Virology. Hyatt Regency, Baltimore,USA. November 2006.
ÍNDICE
Contenido
I. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................................. 17
I.1. El Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (HIV 1) ................................................................ 18
I.2. El inicio de la epidemia en Argentina .............................................................................................. 19
I.3. Características estructurales del HIV 1 ........................................................................................... 20
I.4. El ciclo de replicación ...................................................................................................................... 21
I.5. El curso natural de la infección ....................................................................................................... 23
I.6. El escape a la respuesta inmune ..................................................................................................... 24
I.7. Metodología para la identificación de mutaciones de escape ....................................................... 26
I.8. Dinámica de la selección y transmisión de mutaciones de escape................................................. 27
I.9. Evidencia reciente acerca de la adaptación del HIV a la respuesta inmune poblacional ............... 29
I.10. Breve reseña acerca del tratamiento antirretroviral y el desarrollo de resistencia ..................... 30
I.11. Impacto del fenómeno de resistencia en la terapéutica .............................................................. 31
I.12. Objetivos del proyecto y construcción de la hipótesis de trabajo ................................................ 31
I.12.1. La importancia de estudiar la relación entre el tratamiento antirretroviral y la respuesta
inmune, base de los objetivos de la presente tesis de doctorado. .............................................. 31
I.12.2. El objetivo general ............................................................................................................. 32
I.12.3. La hipótesis de trabajo ...................................................................................................... 32
I.12.4. Los objetivos específicos ................................................................................................... 33
II. MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................................................................. 34
II.1. Población bajo estudio ................................................................................................................... 35
II.2. Procesamiento de las muestras ..................................................................................................... 35
II.3. Congelado de células...................................................................................................................... 36
II.4. Descongelado de células ................................................................................................................ 36
II.5. Medición de los valores de Carga Viral .......................................................................................... 36
II.6. Medición de los valores de CD4 ..................................................................................................... 37
II.7. Medición de los niveles de activación del sistema inmune ........................................................... 37
II.8. Generación de líneas autólogas de linfocitos B ............................................................................. 37
II.9. Extracción de ácidos nucleicos....................................................................................................... 38
II.9.1. Extracción de ADN .............................................................................................................. 38
II.9.2. Extracción de ARN a partir de muestras con carga viral detectable .................................. 39
II.9.3. Extracción de ARN a partir de muestras con carga viral indetectable ............................... 39
II.10. Caracterización de los genes HLA................................................................................................. 39
II.11. Amplificación de Ácidos Nucleicos............................................................................................... 40
II.11.1. Primers utilizados ............................................................................................................. 40
II.11.2. Amplificación a partir de ARN viral – Nested RT PCR....................................................... 40
II.11.3. Amplificación utilizando enzima polimerasa de alta fidelidad de copia .......................... 41
II.12. Clonado de secuencias virales...................................................................................................... 41
II.13. Secuenciación............................................................................................................................... 41
II.14. Análisis Filogenético ..................................................................................................................... 42
II.14.1. Secuencias de referencia.................................................................................................. 42
II.14.2. Alineamiento de secuencias ............................................................................................. 42
II.14.3. Análisis de similitud .......................................................................................................... 43
II.14.4. BootScanning.................................................................................................................... 44
II.14.5. Árboles Filogenéticos ....................................................................................................... 44
II.14.6 Estimación del tiempo al ancestro común más cercano (TACMC).................................... 45
II.15. Análisis estadístico ....................................................................................................................... 46
II.15.1. Análisis para la identificación de potenciales mutaciones de escape CTL ....................... 46
II.15.2. Corrección filogenética..................................................................................................... 47
II.15.3. Análisis de tendencias en el tiempo ................................................................................. 47
II.16. Medición de los niveles de respuesta inmune HIV especifica ..................................................... 48
II.16.1. ELISPOT para IFN . .......................................................................................................... 48
II.16.2. Estimulación in vitro / análisis por citometría de flujo..................................................... 49
II.16.3. Marcación de CTLs péptido específicos mediante la técnica de tetrámeros................... 50
II.17. Desarrollo del modelo de Markov de la epidemia del HIV 1 ....................................................... 53
III.RESULTADOS ..................................................................................................................................... 55
III.1. Características de la población bajo estudio................................................................................. 56
III.2. Identificación de mutaciones de escape CTL ................................................................................ 58
III.2.1. Los primeros análisis de asociación estadística................................................................. 58
III.2.2. Comparación de las mutaciones identificadas con los epítopes conocidos del HIV ......... 60
III.2.3. Corrección filogenética de las asociaciones encontradas ................................................. 60
III.2.4. Análisis de la prevalencia de las mutaciones identificadas a lo largo de la epidemia del
HIV en Argentina .......................................................................................................................... 60
III.2.5. Análisis de substituciones sinónimas y no sinónimas ....................................................... 63
III.2.6. Identificación de otras mutaciones cuya prevalencia cambió significativamente en el
tiempo .......................................................................................................................................... 63
III.2.7. Análisis estadístico global de las tendencias en el tiempo de las mutaciones asociadas a
escape........................................................................................................................................... 64
III.3. Estudio de la respuesta inmune HIV específica en la población bajo estudio.............................. 70
III.3.1. Evaluación del estado de activación inmune general ....................................................... 71
III.3.2. Estrategia para el análisis de respuesta inmune epítope específica................................. 73
III.3.3. Evaluación de la frecuencia de reconocimiento de los epítopes bajo estudio ................. 73
III.3.4. Comparación de la respuesta a los péptidos salvajes y mutados ..................................... 78
III.3.5. Confirmación de la respuesta citotóxica específica frente a los epítopes estudiados...... 81
III.3.6. Caracterización del nivel de agotamiento de la respuesta epítope específica ................. 87
III.4. Evaluación del impacto del tratamiento antirretroviral ............................................................... 92
III.5. Análisis filogenético de las secuencias estudiadas y el inicio de la epidemia en Argentina ......... 98
IV. DISCUSIÓN...................................................................................................................................... 105
IV.1. Las mutaciones de escape en las variantes del HIV en Argentina .............................................. 106
IV.2. El HIV 1 Subtipo B de Argentina acumuló mutaciones que favorecen la evasión a la respuesta
inmune luego de su introducción desde Norteamérica...................................................................... 106
IV.3. La acumulación de las mutaciones observadas no estaría relacionada con el desarrollo del
tratamiento antirretroviral de las últimas décadas ni con el estadío clínico de la infección.............. 108
IV.4. Las mutaciones de escape han presentado tres comportamientos distintos en el tiempo....... 109
IV.5. La acumulación de escape ocurre en sitios capaces de evolucionar adaptativamente ............. 110
IV.6. La acumulación de estas mutaciones podría conducir a una convergencia de subtipos virales
mediada por la selección inmune ....................................................................................................... 110
IV.7. La evidencia inmunológica apoya las predicciones del análisis estadístico................................ 111
IV.8. Las mutaciones de escape impactarían en el reconocimiento de maneras dependiente de su
posición relativa al sitio de anclaje del epítope .................................................................................. 112
IV.9. Las mutaciones de escape se seleccionan también en estadíos tardíos de la infección y el inicio
del tratamiento podría prevenir este fenómeno................................................................................ 114
IV.10. Breve discusión acerca del origen de la epidemia del HIV 1 en Argentina .............................. 115
IV.11. Conclusiones finales.................................................................................................................. 117
V. REFERENCIAS................................................................................................................................... 119
VI. ANEXOS .......................................................................................................................................... 129
VI.1. ANEXO I – Detalle de los pacientes incluidos en el análisis de asociación genética y
polimorfismos virales enrolados en la primera etapa. ....................................................................... 130
VI.2. ANEXO II Detalle de las características de las segundas y terceras muestras tomadas en la
segunda etapa. .................................................................................................................................... 133
VI.3. ANEXO III –OUTPUT del análisis de corrección filogenética ....................................................... 135
VI.4. ANEXO IV – INPUT y OUTPUT del análisis de medidas repetidas ............................................... 136
VI.5. ANEXO V – OUTPUT del análisis estadístico de la respuesta basal de linfocitos CD3+/CD8+ frente
a líneas B no sensibilizadas ................................................................................................................. 142
VI.6. ANEXO VI – Detalle de las secuencias peptídicas encontradas en las distintas muestras junto con
el análisis de predicción y afinidad de epítopes.................................................................................. 144
VI.7. Anexo VII – Validación del modelo de Markov de la epidemia del HIV...................................... 148
LISTA DE TABLAS Y FIGURAS
FIGURAS
Figura I.1. Historia evolutiva de los lentivirus de primates.
Figura I.2. Mapa de HXB2, secuencia referencia del HIV 1 subtipo B.
Figura I.3. Esquema del virión maduro del HIV 1 rodeado por las proteínas virales estructuralmentecaracterizadas presentes en dicho virión
Figura I.4. Pasos claves del ciclo de replicación del HIV 1.
Figura I.5. Variación de los valores de CD4 y Carga Viral (CV) (marcadores del curso de la infección porHIV 1) con el progreso de la infección hacia SIDA.
Figura I.6. Los reservorios virales del HIV 1 y su contribución a los niveles de viremia.
Figura I.7. Dinámica de la replicación viral del HIV 1 in vivo.
Figura I.8. Esquematización del principio de asociación entre polimorfismos virales y alelos de losgenes HLA cuando el polimorfismo es una mutación de escape a la respuesta inmune mediada porestos genes.
Figura I.9. Prevalencia de la mutante de escape I135X al alelo B51 en un estudio de 9 cohortes conmás de 2800 individuos.
Figura II.1. Análisis de similitud realizado mediante el programa Simplot 2.5.
Figura II.2. Análisis de BootScanning realizado mediante el programa Simplot 2.5
Figura III.1. Histograma de la frecuencia de muestreo en los 3 años que duró la recolección demuestras de la primera etapa. En rojo se detallan aquellos pacientes donde se realizó lacaracterización de los genes HLA A y HLA B.
Figura III.2. Histograma de edad de los 395 pacientes incluidos en el estudio al momento de toma demuestra
Figura III.3. Resultados de caracterización de los alelos de los genes HLA A y HLA B comparados con laprevalencia en la población general.
Figura III.4. Árbol filogenético construido mediante el método de distancia de Neighbor Joining parael gen viral gag sobre el conjunto de muestras analizadas
Figura III.5. Tendencias en el tiempo de los polimorfismos identificados como potenciales mutacionesde escape CTL por análisis estadístico.
Figura III.6. Resultados del análisis de identificación de sitios bajo presión de selección positiva.
Figura III.7. Tendencias en el tiempo de los polimorfismos identificados como potenciales mutacionesde escape CTL por el análisis de tendencia.
Figura III.8. Frecuencia media de las mutaciones de escape a lo largo del tiempo.
Figura III.9. Tendencia en el tiempo de las mutaciones de escape identificadas mediante asociacionesnegativas en los subtipos virales B y F.
Figura III.10. Frecuencia de recolección de primeras, segundas y terceras muestras a lo largo deltiempo.
Figura III.11. Valores medidos de Carga Viral y conteo de células CD4 en el conjunto de primeras ysegundas muestras recolectadas.
Figura III.12. Estrategia de análisis de los niveles generales de activación de la respuesta inmune.
Figura III.13. Valores medidos de activación general de respuesta inmune CD4 y CD8.
Figura III.14. Distribución de los valores medidos en los ensayos de ELISPOT para todas las muestrasanalizadas.
Figura III.15. Proporción de respuesta frente a los péptidos evaluados en ensayos de ELISPOT.
Figura III.16. Respuesta al epítope A02P65 en las muestras F197 y F048.
Figura III.17. Respuesta al epítope A02P84 en las muestras F037, F174 y F048.
Figura III.18. Respuesta al epítope A03P28 en las muestras F197 y F289.
Figura III.19. Respuesta al epítope B07P357 en las muestras F030 y F060.
Figura III.20. Respuesta al epítope B40P218 en la muestra F026.
Figura III.21. Estrategia de análisis mediante tinción con Ioduro de Propidio.
Figura III.22. Estrategia de análisis de polifuncionalidad de la respuesta péptido específica de CMSPsobre líneas B sensibilizadas.
Figura III.23. Resultados obtenidos en los ensayos de polifuncionalidad para péptidos específicos enpacientes previamente caracterizados en la sección 3.3.
Figura III.24. Resultados obtenidos en los ensayos adicionales de polifuncionalidad.
Figura III.25. Control de síntesis de tetrámeros en Gel SDS PAGE luego del tratamiento conEstreptavidina (SAV).
Figura III.26. Perfil FSC vs SSC para las muestras seleccionadas para el análisis de tetrámeros.
Figura III.27. Estrategia de análisis utilizada para distinguir células individuales de agregadas.
Figura III.28. Resultados obtenidos del análisis de tetrámeros.
Figura III.29. Resultados del análisis in sílico de afinidad frente a la magnitud de respuesta en ensayosde ELISPOT.
Figura III.30. Comparación de las variantes salvajes y mutadas encontradas en las primeras ysegundas muestras.
Figura III.31. Perfil de respuesta medido en los ensayos de ELISPOT según el estado (salvaje omutado) de los distintos epítopes bajo estudio
Figura III.32. Reconstrucción filogenética de las quasiespecies virales en cuatro pacientes.
Figura III.33. Esquema de las regiones genómicas virales bajo análisis.
Figura III.34. Reconstrucción filogenética del subtipo F.
Figura III.35. Reconstrucción filogenética del subtipo B.
Figura III.36. Reconstrucción filogenética de la región de subtipo B en la CRF12_BF.
Figura III.37. Estimación del tiempo al ancestro común más cercano (TACMC).
TABLAS
Tabla II.1. Lista de primers utilizados.
Tabla II.2. Secuencias de referencia de subtipos virales utilizadas para realizar los análisisfilogenéticos de caracterización de subtipo viral.
Tabla III.1. Resumen de las 22 mutaciones potenciales de escape CTL identificadas por análisisestadístico
Tabla III.2. Resumen de los 12 polimorfismos que han cambiado significativamente su prevalencia enel tiempo durante los últimos 20 años de epidemia
Tabla III.3. Resumen del análisis estadístico de medidas repetidas y de efectos simples.
Tabla III.4. Detalle del análisis de contrastes para la comparación de a pares de prevalencia demutaciones de escape entre los distintos tiempos.
Tabla III.5. Detalle de los péptidos sintetizados
Tabla III.6. Resumen de los resultados obtenidos en los ensayos de ELISPOT de respuesta péptidoespecífica.
Tabla III.7. Resumen de los epítopes sugeridos en la tabla III.2. y confirmados en los ensayos deELISPOT
Tabla III.8. Diseño experimental para la detección de citoquinas intracelulares en linfocitosCD3+/CD8+ péptido específicos.
Tabla III.9. Magnitud de respuesta a los controles con líneas B no sensibilizadas.
Tabla III.10. Detalle de las muestras seleccionadas para analizar con la técnica de tetrámeros
Tabla III.11. Resumen de los resultados obtenidos del análisis de tetrámeros.
Tabla III.12. Detalle de los estadísticos obtenidos en los análisis filogenético por el método bayesiano
I. INTRODUCCIÓN
I.1. E
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la Inmuno
munodeficie
ia Adquirida
el SIDA fue d
te un tiemp
a se encont
tica resultad
a generación
se ve refleja
úmero siemp
urgen de ev
la población
ución cosmop
dicho grupo f
as responsab
odeficienci
encia Human
(SIDA) y la c
descubierto
o de circula
traba circula
do de la eleva
de genoma
ada en la exi
pre creciente
ventos de r
n. En la figura
polita se enc
fue estimado
bles de las in
18
ia Humana
na Tipo 1 (H
causa de mue
en 1981 [2,3
ación críptica
ando en la p
ada tasa de e
s progenie c
istencia de 9
e de Formas
recombinació
a I.1 se mues
cuentra en el
o alrededor d
nfecciones q
a tipo 1 (HI
HIV 1) es el
erte de alred
3] y el HIV re
a (no detect
población hu
error de su e
con secuenci
9 subtipos di
Recombinan
ón entre su
stra la divers
Figura I.1. H
primates. S
filogenéticos
los grupos N
virales de est
l llamado gru
de 1930 [6] y
que conduje
IV 1)
agente etio
dedor de 2 m
econocido co
tada) de var
umana. El H
enzima Trans
ia distinta a
istintos ident
ntes Circulan
ubtipos disti
sidad del HIV
Historia evolu
Se detallan
s relacionados
N, O y M de
te último grup
upoMain, o
y la llegada d
ron al descu
ológico del S
millones de p
omo el agent
ias décadas
IV 1 presen
scirptasa Rev
la del genom
tificables po
ntes (CRFs) id
intos y la s
V y su relació
utiva de los
en rojo
s con el HIV: E
el HIV 1 con
po.
grupo M. El
de cepas del
ubrimiento d
Síndrome de
personas por
te etiológico
durante las
ta una gran
versa (RT)[5]
ma parental.
or análisis de
dentificadas.
subsiguiente
ón con otros
lentivirus de
los grupos
El HIV 1 y 2, y
los subtipos
surgimiento
l subtipo B a
del virus) se
e
r
o
s
n
]
.
e
.
e
s
e
s
y
s
o
a
e
estim
casos
que h
y en p
I.2. E
En A
ident
detec
ocurr
nunc
aque
epide
han d
varia
casos
que
desco
La ci
Suda
Mien
recom
preva
regio
mayo
genó
Con r
de m
de la
fuera
1980
come
ma que ha oc
s de SIDA fu
haber ocurrid
particular ba
El inicio de
rgentina los
tificado por p
ctados en n
rido en los E
a fue analiz
llos primero
emiológicos.
demostrado
ntes de subt
s importados
la introducc
onocido.
rculación de
mérica aunq
tras que en
mbinantes B
alencia de va
nes genómi
oría de las
micas de sub
respecto al i
etodologías
década de 1
a el caso tam
no podria
enzaron a se
currido hacia
eran detect
do ya que ce
ajo la forma d
e la epidem
s primeros c
primera vez
uestro país
Estados Unid
ado profund
os casos ocu
En este pun
que la epide
tipo B y un 5
s de los Esta
ción del sub
e recombina
que la prev
n Argentina
F como se m
ariantes del s
cas de subt
recombinan
btipo F.
nicio de las
filogenética
1960, el prim
mbién para A
ser explica
er detectado
a finales de la
ados. Una s
epas del subt
de recombin
mia en Arge
casos de SID
en los Estad
eran “impo
dos. Sin emb
damente y e
urrieron en l
nto, resulta i
emia del HIV
0% de recom
dos Unidos
btipo F así c
antes BF es
valencia de
circulan e
mencionó an
subtipo B y l
tipo B [14 1
tes BF de A
epidemias, d
s el origen d
mero, y en e
Argentina, la
ada. Estas o
os al mismo
19
a década de
egunda intro
tipo F tambi
nantes con el
entina
DA fueron d
dos Unidos. S
ortados”, es
bargo, el or
el único con
los comienzo
importante
V en Argenti
mbinantes en
solamente e
como el sur
s una caract
los distintos
n igual prev
nteriormente
as recombin
17]. Esta últi
Argentina es
dos estudios
de las epidem
l comienzo d
a elevada pr
observacion
tiempo en
1960 [7], va
oducción de
én circulan e
l subtipo B [8
detectados b
Siempre se s
decir, el re
igen de la e
nocimiento h
os de la déc
recordar que
na está cons
ntre los subt
explicarían el
gimiento de
terística com
s subtipos p
valencia tan
e, en Brasil e
antes BF est
ima observa
stán constit
s previos rea
mias de subt
de la década
revalencia de
es sugieren
ambos país
arios años an
l HIV al con
en alta preva
8 10].
brevemente
supuso que
esultado de
epidemia de
hasta el mo
cada de 198
e varios estu
stituida por a
ipos B y F [9
l 50% de nue
e las recomb
mún de las
parece difer
nto variante
en cambio, p
tán conforma
ación resulta
tuidas princi
alizados en B
ipo B y F en
de 1980 el
e recombina
que, aunq
es, deben e
ntes de que l
tinente Ame
alencia en el
después de
aquellos prim
infecciones
l HIV en nu
omento cons
80 basados
udios de dive
alrededor de
,11 13]. Por
estra epidem
binantes BF
epidemias
rir entre reg
es del subti
parece haber
adas princip
a interesant
ipalmente p
Brasil estima
ese país en
segundo [18
antes BF a m
que los cas
existir difere
los primeros
ericano tuvo
continente,
e que fuera
meros casos
que habían
estra región
siste en que
en registros
ersidad viral
e un 50% de
lo tanto, los
mia mientras
permanece
del HIV en
giones [12].
po B como
r una mayor
almente por
e porque la
por regiones
ron a través
el comienzo
8,19]. Si este
mediados de
os de SIDA
ncias en los
s
o
,
a
s
n
n
e
s
l
e
s
s
e
n
.
o
r
r
a
s
s
o
e
e
A
s
prime
difere
I.3. C
Como
El de
y el d
acces
geno
Fig
Las c
bicap
trans
env).
de la
eros evento
entes.
Característ
o todos los r
las proteína
de las prote
sorias compl
ma viral con
gura I.2. Map
fin del ma
aracterística
pa lipídica d
smembrana (
En su interi
cápside (CA,
os de la co
ticas estruc
etrovirus, el
as estructura
eínas de env
letan el conj
los marcos a
pa de HXB2, se
arco abierto de
posiciones en
as generales
erivada de
(TM (gp41),
or contiene
, gen gag).
lonización q
cturales de
HIV 1 posee
les interiore
voltura (Env
junto de 9 g
abiertos de l
ecuencia refe
e lectura de c
n el genoma d
del virión d
la membran
gen env) y u
una cápside
20
que conduje
el HIV 1
e un genoma
es (Gag), el c
). Otros 6 g
genes que lo
lectura de lo
rencia del HIV
ada gen. El HX
el HIV 1, por e
el HIV pued
na de la cél
unida a ella
e cónica prot
Figura I.3.
las proteín
presentes
eron luego
a de ARN cod
odificante pa
genes codific
constituyen
os genes viral
V 1 subtipo B
XB2 es utilizad
ejemplo, punt
en observas
lula hospeda
la glicoprote
teica constit
Esquema del
nas virales est
en dicho virió
a epidemio
dificante par
ara las prote
cantes para
n. En la figur
les.
. Se detalla la
do como refer
tos de recomb
se en la figu
adora, pose
eína de supe
uida por 200
l virión madu
tructuralmen
ón.
ologías mole
ra tres genes
eínas de repl
proteínas d
ra I.2. se esq
posición de c
rencia para in
binación.
ra I.3. Envue
e en ella a
erficie (SU (g
00 copias de
ro del HIV 1 r
te caracteriza
eculares tan
s principales:
icación (Pol)
enominadas
quematiza el
comienzo y
dicar
elto por una
la proteína
gp 120), gen
e la proteína
rodeado por
adas
n
:
)
s
l
a
a
n
a
Entre
por 2
posit
nucle
rever
empa
infect
I.4. E
El cic
Inicia
de s
inmu
tropis
blanc
e la bicapa li
2000 unidade
iva estabiliza
eocápside (N
rsa (RT, gen
aquetan en e
tada.
El ciclo de r
lo de replica
almente se p
u proteína
noglobulina
smo por los
co principale
pídica y la cá
es. Dentro d
adas como c
NC, gen gag)
pol) y la inte
el virión mie
replicación
ción del HIV
Figur
produce la ad
de superfic
N terminal
linfocitos “T
es, entre otro
ápside se en
e la cápside
complejo rib
) y tres enzi
egrasa (IN, g
entras que la
n
V sigue los pa
ra I.4. Pasos c
dsorción de
cie (gp120)
de la molécu
T helper” (CD
os grupos ce
21
ncuentra la p
se encuentr
bonucleoprot
imas esencia
gen pol). Las
as proteínas
asos clásicos
laves del ciclo
la partícula v
con el rec
ula de CD4. C
D4+), por los
elulares. Per
proteína de l
ran dos copi
teico con un
ales: la prot
proteínas a
Vpu, Tat y
de un retrov
o de replicació
viral a la célu
ceptor celul
Como conse
s macrófagos
ro a diferenc
la matriz (M
as del genom
nas 2000 cop
teasa (PR, ge
ccesorias, N
Rev solo se
virus, detalla
ón del HIV 1.
ula blanco a
lar, en este
cuencia de e
s y por las cé
cia de otros
A, gen gag),
ma de ARN d
pias de la pr
en pol), la t
ef, Vif y Vpr
encuentran
do en la figu
través de la
e caso, el
este hecho, e
élulas dendr
retrovirus, l
, constituida
de polaridad
oteína de la
transcriptasa
r también se
en la célula
ura I.4.
a interacción
dominio de
el HIV posee
ríticas, como
os lentivirus
a
d
a
a
e
a
n
e
e
o
s
de p
prom
Luego
que c
conte
geno
las pr
Una v
comp
asoci
activi
La fas
proce
Rev.
proce
por la
RT e
Las p
mens
prote
tamb
la de
virale
funci
Para
intera
Aprox
encap
las pr
rimates req
mover la fusió
o de la fusió
consiste en
eniendo el g
ma de ARN
roteínas NC.
vez retrotran
plejo de pre
ación con p
idad catalític
se tardía del
esados por s
Tat actúa
esados llegu
a enzima vir
IN.
proteínas de
sajero viral
easas celular
bién son sinte
gradación d
es de envoltu
onal gp41 gp
producir la
actúa direct
ximadament
psida dos co
roteínas MA,
uieren prote
ón. Para el H
n de membr
el desensam
genoma al in
a ADN lleva
nscripto el ge
eintegración
proteínas cel
ca de la enzim
ciclo de rep
splicing. Los
como facto
en al citopla
al PR para d
e envoltura
procesado q
res para gen
etizadas en e
e las misma
ura inhibiend
p120[23].
partícula v
tamente con
te 1200 a 2
opias de geno
, CA y NC res
eínas de su
IV estas prot
ranas y la pe
mblado de l
nterior celu
do a cabo p
enoma a ADN
compuesto
lulares. Lueg
ma viral IN.
plicación com
primeros so
r de transc
asma para po
ar, por un la
son sintetiz
que codifica
nerar las pro
el RE es impo
s, que de ot
do su translo
viral, el extr
n la membr
2000 copias
oma viral. Su
sultando así
22
perficie adic
teínas son lo
netración de
la cápside y
lar. Al mism
principalment
N, es llevado
por el geno
go, el genom
mienza con la
on los codific
cripción pot
oder sintetiz
ado, la polipr
zadas en el
a para una p
oteínas viral
ortante el ro
tra forma int
ocación a la
emo miristo
rana celular
de Gag bro
ubsecuentem
una partícula
cionales de
os quimiorrec
e la nucleocá
y la liberació
mo tiempo se
te por la en
o al núcleo ce
oma viral (a
ma viral es
a síntesis de
cantes para
enciándola.
zar el precur
roteína viral
Retículo En
poliproteína
les gp41 y g
ol de las prot
teractuarían
membrana
olado del do
r y con la c
otan para fo
mente la pro
a viral madu
e la membra
ceptores CXC
ápside se pro
ón del comp
e produce l
zima viral RT
elular por tra
ahora ADN),
integrado al
transcriptos
las proteínas
Rev permit
rsor proteico
Gag y por o
ndoplasmáti
(gp160) qu
gp120. Como
eínas virales
prematuram
celular o la
ominio MA
cola citoplas
ormar una p
teína viral P
ra e infectiva
ana viral y
CR4 y CCR5 [
oduce el des
plejo ribonuc
a retrotrans
T pero acom
ansporte act
, la RT, MA
l genoma ce
s mARN proc
s regulatoria
te que tran
o Gag pol qu
otro lado las
co (RE) a p
ue luego es
o las molécu
s Nef y Vpu e
mente con la
formación d
de la polip
smática de
partícula inm
R cliva a Gag
a.
celular para
20 22].
nudamiento
cleoproteico
scripción del
mpañado por
ivo como un
y la IN, en
elular por la
cesados y no
as Nef, Tat y
nscriptos no
ue es clivado
enzimas PR,
partir de un
clivada por
ulas de CD4
en promover
as proteínas
del complejo
roteína Gag
gp41 (TM).
madura que
g generando
a
o
o
l
r
n
n
a
o
y
o
o
,
n
r
4
r
s
o
g
.
e
o
I.5. E
Al mo
aume
aume
un pe
mom
dismi
lo lar
Los m
concl
deple
efect
que e
de un
Como
prote
linfoc
dend
del v
tipo d
La re
célula
El curso na
omento de l
enta bruscam
ento de CV y
eríodo de va
mento el valo
inuirán abru
go del curso
mecanismos
luyente. Exis
eción de linf
o más impo
es el deterio
na respuesta
o se mencion
eínas celular
citos T help
ríticas. Todo
irus en el o
de régimen a
plicación vir
as susceptib
atural de la
a infección p
mente y es a
y la reduce a
rios años du
or de CV aum
ptamente. E
de la infecc
por los cu
sten dos teo
focitos CD4
ortante causa
oro de las fun
inmune abe
nó anteriorm
res que le pe
per (CD4+)
os los tipos c
rganismo en
antirretrovira
ral en las cél
les, pero dic
a infección
por el HIV la
compañado
un nivel rela
rante el curs
mentará rápi
En la figura I.
ión por el HI
uales el HIV
orías acerca d
resultante d
al de la enfe
nciones celu
errante.
mente, el tro
ermiten ingr
si no tamb
celulares afe
nfrentando t
al.
ulas T CD4 e
chas células i
23
cantidad de
por una fue
ativamente e
so natural de
damente al
.5. se esquem
V 1.
V causa la e
de los mism
de la infecci
ermedad no
ulares inducid
opismo del H
resar a la cé
bién macrófa
ectados jueg
toda respues
es más eficie
infectadas n
e virus en pla
erte respuest
estable alred
e la infección
mismo tiem
matiza la evo
enfermedad
os. Una afir
ón por el v
es la misma
das indirecta
HIV 1 está de
élula. Así, el
agos, célula
gan un papel
sta inmune
ente y rápida
o sobreviven
asma (medid
ta inmune cit
dedor del cu
n hasta la pr
po que los n
olución de lo
no se han
ma que la c
irus. La otra
a muerte de
amente por
eterminado p
HIV 1 no só
as dendrítica
l muy impor
montada po
Figura
valores
(marcad
infecció
progres
SIDA.
a que en cua
n más de un
do como car
totóxica que
al permanec
ogresión a S
niveles de lin
os valores de
identificado
ausa es dire
a teoría sost
e los linfocito
el virus, tal
por la distrib
ólo es capaz
as y células
rtante en la
or el hosped
I.5. Variaci
de CD4 y Car
dores del c
ón por HIV
o de la inf
alquiera del
o o dos días
rga viral, CV)
e contiene el
cerá durante
SIDA. En este
nfocitos CD4
e CD4 y CV a
o de forma
ectamente la
tiene que el
os CD4 si no
vez a través
bución de las
z de infectar
s foliculares
persistencia
ador y todo
ión de los
rga Viral (CV)
curso de la
V 1) con el
ección hacia
resto de las
s funcionales
)
l
e
e
4
a
a
a
l
o
s
s
r
s
a
o
s
)
a
l
a
s
s
para
podrí
que
infect
mues
nivele
Estud
mant
fase G
activo
pero
cualq
respu
de va
grand
I.6. E
Los e
virem
mantener u
ía erradicar
se hubiera
tadas. Es en
stran los dist
es de carga v
dios realizado
teniendo una
G1 son foco
os. Por otro
no permisiv
quier evento
uesta inmun
arios años a
des responsa
El escape a
estudios de d
mia observad
una replicac
el virus del
producido
este aspecto
tintos tipos c
viral.
os indicarían
a producción
s de una baj
lado, los lin
vos a la rep
que los activ
e) se convie
l igual que l
ables de la im
a la respue
dinámica de
dos frente a
ción viral. Es
organismo s
el recambio
o que el rest
celulares que
n que los ma
n viral perma
ja producció
nfocitos T C
licación vira
ve (por ejem
rten en foco
la de las cél
mposibilidad
esta inmun
replicación
la reducida
24
sto implicar
si se adminis
o completo
to de los tipo
e son suscept
crófagos son
anente cuan
ón viral pero
D4 quiescen
l y por lo ta
mplo vacunac
os de produc
ulas folicula
de erradicar
ne
del HIV 1 in
vida media
ía que un t
strara durant
de células
os celulares
tibles a la inf
n menos susc
do la poblac
su vida med
ntes (no acti
anto constit
ción o infecci
cción viral. L
res dendrític
r el virus del
n vivo indica
de las célula
tratamiento
te, por ejem
infectadas
resulta relev
fección por e
ceptibles a la
ción T decae
dia es much
vos) son sus
uyen reserv
ión de cualq
La vida media
cas y por es
organismo q
Figura I.6
virales d
contribució
viremia. B
realizados
aplicación
antirretrov
(HAART).
n que para m
as blanco de
antirretrovi
mplo, una se
por nuevas
vante. En la f
el HIV 1 y su
a citopatoge
. Los linfocit
o mayor que
sceptibles a
vorios latente
uier tipo que
a de este tip
so estos dos
que lo porta.
6. Los res
del HIV 1
ón a los niv
Basado en
mediant
de trata
virales de alta
mantener lo
el virus, debe
ral eficiente
mana, hasta
s células no
figura I.6. se
aporte a los
enicidad viral
tos T CD4 en
e la de los T
la infección
es que ante
e estimule la
po celular es
s grupos son
.
servorios
y su
veles de
estudios
te la
amientos
a eficacia
os niveles de
e existir una
e
a
o
e
s
l
n
T
n
e
a
s
n
e
a
alta t
Esta c
asegu
quasi
resum
venta
En lo
pued
humo
analiz
que r
adela
recon
curso
tiemp
HIV c
varia
“polim
[34].
tasa de infec
característic
ura que los
iespecies vir
men los resu
aja selectiva
os últimos añ
e modelar l
oral[30] y ce
zado la selec
reconoce ep
ante “alelos
nocen motiv
o de la infec
po es espera
con las mism
ción de un
morfismo”) y
En ese trab
cción de célu
a, combinad
individuos
ales[26], cad
ltados de es
al virus que
Figura
ños se ha de
a evolución
elular[31 45
cción de esca
pítopes virale
HLA”). Debid
vos aminoac
cción son di
able que ind
mas mutacio
aminoácido
y el alelo HL
bajo se dem
ulas nuevas y
da con la alta
infectados
da una difirie
stos estudios
la porta, la m
I.7. Dinámica
emostrado q
del virus al
] a través d
ape a la resp
es a través
do a que las
cídicos partic
stintas entre
dividuos port
nes de esca
o en un siti
LA del pacien
mostró que e
25
y por lo tant
a tasa de mu
con el viru
endo de la ot
s. Por eso es
misma emerg
a de la replica
que la respu
l seleccionar
del proceso
puesta celula
de las molé
s diferentes
culares, las
e individuos
tadores de lo
pe en su sec
o particular
nte infectad
existe una a
to una eleva
utación que o
us posean u
tra en una o
entendible q
gerá por sob
ación viral del
esta inmune
r variantes q
de mutació
r de linfocito
éculas de los
proteínas ex
variantes d
s portadores
os mismos a
cuencia ami
r del proteo
o ha sido de
sociación es
ada tasa de p
ocurre duran
una complej
o más mutaci
que si alguna
bre el resto [2
l HIV 1 in vivo
e de un pac
que escapan
ón. La mayo
os citotóxico
s genes HLA
xpresadas po
e escape se
s de distinto
alelos HLA se
noacídica. D
oma del HIV
emostrada e
stadística en
producción v
nte la retrot
a y diversa
iones. En la f
a mutación q
27 29].
o.
iente infecta
n a la respue
ría de los t
os (CTL), es d
A de clase I
or diferente
eleccionadas
os alelos HLA
eleccionen v
Dicha asociac
V (de aquí e
en 2002 por
ntre los alelo
viral [24,25].
ranscripción
a mezcla de
figura I.7. se
que confiere
ado con HIV
esta inmune
rabajos han
ecir, aquella
(de aquí en
s alelos HLA
s durante el
A. Al mismo
variantes del
ción entre la
en adelante
Moore et al
os de HLA y
.
n
e
e
e
V
e
n
a
n
A
l
o
l
a
e
l
y
distin
esque
Fig
e
po
I.7. M
El an
herra
princ
mane
la pro
requi
filoge
comp
en ca
deriv
mism
ntos polimor
ematiza en la
gura I.8. Esqu
HLA cuando
genes. En la
escape, de ma
con un dete
surgimiento d
alelo lo m
oblacional la p
infectad
Metodolog
nálisis de as
amienta útil
ipal de este
ejar grandes
obabilidad d
isito, una crít
enéticas entr
partían el m
ada una de l
ado de un m
mo ancestro c
rfismos de la
a figura I.8.
uematización
el polimorfis
figura, las par
anera que una
erminado alelo
de una varian
más probable e
presencia de l
do. Esta asoci
significa
gía para la
ociación ent
para la ident
e tipo de es
conjuntos d
de falsos pos
tica que se r
re las secuen
ismo polimo
as secuencia
mismo ancest
común y ade
a secuencia v
del principio
mo es una m
rtículas virales
a variante salv
o (en este cas
te de escape
es que esa mu
a mutación de
iación se pued
ativamente ma
a identifica
tre alelos H
tificación de
studios cons
de datos e in
sitivos. Si bie
ealizó a su tr
ncias virales
orfismo asum
as analizadas
tro común. D
emás los ind
26
viral a nivel
de asociación
utación de es
s en rojo repr
vaje (hacia la i
o A02) sufre u
a dicho alelo,
utación no apa
e escape resu
de identificar
ayor a 1, sugie
ación de mu
LA y polimo
epítopes de
siste en pod
cluya correc
en el trabajo
rabajo poste
que analizab
mía que dich
s y no consid
De esta man
dividuos infe
poblacional
n entre polimo
scape a la resp
esentan varia
zquierda de la
una presión d
mientras que
arezca. De est
lta asociada a
mediante el c
ere la asociac
utaciones
orfismos vira
e reconocimi
der realizar u
cciones de co
o de Moore
eriormente fu
ba; es decir, s
ha variación
deraba la po
nera, si un co
ctados con e
. El principio
orfismos vira
puesta inmun
ntes portador
a figura) cuan
e selección qu
e en los individ
ta manera, en
a la presencia
cálculo del OR
ión menciona
de escape
ales puede
iento CTL en
un análisis e
omparacione
[34] cumplía
ue que no co
si un conjunt
había surgid
osibilidad de
onjunto de s
ellas compar
o de dicha a
les y alelos de
ne mediada po
ras de la muta
do infecta un
ue puede cond
duos que no p
n un análisis a
del alelo en e
R que, cuando
ada.
ser utilizado
n el HIV. La c
estadístico q
es múltiples
a ampliamen
onsideraba la
to de secuen
do independ
que fueran
ecuencias co
rtían uno o v
sociación se
e los genes
or estos
ación de
individuo
ducir al
portan el
nivel
el individuo
es
o como una
aracterística
que permita
para reducir
nte con este
as relaciones
ncias del HIV
dientemente
un carácter
ompartían el
varios alelos
e
a
a
a
r
e
s
V
e
r
l
s
HLA
comp
de lo
impro
simila
para
demo
por d
una r
para
I.8. D
Mien
estud
longit
demo
molé
la cél
replic
[36,5
de p
selec
la cap
impli
indivi
capac
el HI
circul
indivi
mayo
HLA
selec
de la
recie
entonces po
partidos por
os individuos
obable ya q
ares. Sin em
los resultad
ostraron que
dicho fenóme
reconstrucció
evitar falsos
Dinámica d
tras que la
dios poblacio
tudinales la
ostrado la rá
cula del HLA
lula citotóxic
cativa del vir
1 53], y la ca
ersistir en a
ciona) siend
pacidad repl
cancia en el
iduo para qu
cidad replica
V podría es
la adquirien
iduos de dic
oría de las m
que posee
cionadas en
a secuencia
ntes de Brum
odía surgir u
dichas secu
s portadores
que implica
mbargo, Bhat
dos de asoci
e la mayoría
eno. Es por e
ón de la histo
positivos en
de la selecc
corrección f
onales, a nive
dinámica
ápida selecc
A en la célula
ca[41], el im
rus[50], la id
apacidad de
ausencia de
o esto últim
licativa del v
diseño de u
ue reconocie
ativa significa
star adaptán
do mutacio
cha població
utaciones qu
y a la muta
el individuo
del virus qu
mme et al [3
una asociaci
encias relaci
del mismo
que cepas
ttacharya et
iación estad
de las asoci
ello que actu
oria evolutiv
n los estudio
ción y tran
filogenética
el de individu
de selección
ión de muta
a presentado
pacto negati
dentificación
variantes de
e la presión
o muy frecu
virus[36,51 5
na vacuna y
era regiones
ativamente d
ndose progre
nes que red
ón. De hech
ue serian con
ación particu
o infectado [
ue porta el
31] que suge
27
ón estadísti
ionadas hab
alelo de HLA
del HIV re
al en 2007[
dística para
iaciones iden
ualmente se
va mediante
s de asociaci
nsmisión d
desarrollada
uo trabajos p
n de las va
aciones que
ora[47 49] o
ivo que algu
de mutacio
e escape de s
selectiva (e
ente para m
53,55]. Todo
a que sería i
s del virus fr
disminuida[5
esivamente
ducen la cap
ho, reciente
nsideradas “
ular del viru
57]. Estas co
individuo tr
erían que la
ca ficticia a
ían emergid
A. En un prin
elacionadas
[46] desarro
la identificac
ntificadas po
considera qu
análisis filog
ión estadístic
e mutacion
a por Battac
posteriores a
ariantes de
disminuyen
por el Recep
nas de estas
nes que com
ser transmiti
en individuo
mutaciones q
o este conjun
nteresante e
rente a las c
56]. Otra imp
a la respue
pacidad de r
mente se h
“escape” en u
us) habrían
onclusiones s
ransmisor y
mayoría de
l considerar
o independi
ncipio este “
infecten ind
llaron una “
ción de mut
or Moore en
ue este tipo
genético de la
ca.
nes de esc
charya [46] r
al de Moore
escape [34
la afinidad
ptor de Célu
s mutaciones
mpensan dic
idas a otros
os que no p
ue no tienen
nto de descu
estimular la
cuales, en ca
plicancia de
sta inmune
reconocimie
ha encontrad
un individuo
sido en rea
se apoyan e
contradice
las mutacio
r que los po
entemente e
“error” pare
dividuos gen
“corrección f
tantes de es
n 2002 podía
de estudios
as secuencia
cape
resulta impo
demostraro
4]. Dichos tr
del péptido
las T (TCR) e
s tienen en l
ha capacidad
individuos [5
poseen el H
n efecto dele
ubrimientos
respuesta in
aso de escap
estos result
de la pobla
ento por los
do evidencia
(de acuerdo
lidad transm
n la ventaja
observacion
ones asociad
olimorfismos
en cada uno
cía bastante
néticamente
filogenética”
scape CTL y
an explicarse
debe incluir
as analizadas
ortante para
n en análisis
rabajos han
o viral por la
especifico en
la capacidad
d replicativa
54] e incluso
HLA que las
etéreo sobre
tienen gran
mune de un
par, viera su
tados es que
ación donde
HLA de los
a de que la
o a los alelos
mitidas y no
de disponer
nes también
as al escape
s
o
e
e
”
y
e
r
s
a
s
n
a
n
d
a
o
s
e
n
n
u
e
e
s
a
s
o
r
n
e
viral
a la
muta
prese
partic
previ
impro
escap
virus
parej
recep
Estos
persis
gene
podrí
recon
profu
partic
del H
varia
poten
El pr
trans
secue
conju
indivi
porta
secue
obten
(codif
prese
vitro
trans
emergían se
que llegaron
aciones de es
entes en el
culares del p
a de la varia
obable que
pa” solamen
tanto del in
as de trans
ptor o fue tra
s resultados
sten con mu
ral de que la
ía estar ada
nocido en lo
undamente e
cularmente
HIV en el mo
bilidad y se
nciales vacun
imer trabajo
smisión fue
encias del g
unto de 8 pa
iduo recepto
aba el indiv
encias de ge
nidos por D
ficante para
entes en el e
los diferent
smitidas del g
eleccionadas
n Brumme y
scape en estu
virus que
paciente hab
antes “salvaj
un individuo
te por azar.
ndividuo que
smisión) per
ansmitida; y
sustentan la
ucha más fac
a respuesta
ptándose pr
os nuevos in
el evento de
importante
omento de la
e constituye
nas y drogas
o en demos
el desarrolla
gen env del
arejas de tra
or podría at
iduo transm
noma comp
Derdeyn et
la proteína
estadío cróni
tes grados d
gen env[62,6
por la respu
y colaborado
udios longitu
disminuyera
bían emergid
je” del epíto
o tuviera al m
Sin embargo
e lo transmi
rmitieron co
de hecho, o
a inquietante
ilidad y con
inmune pob
rogresivame
ndividuos in
e transmisió
porque se h
a transmisió
e además c
(como micro
strar la dram
ado por Der
virus HIV q
ansmisión es
ribuirse sola
misor. Estos
pleto del viru
al sugerían
de envoltur
co de la infe
de sensibilid
63]. Aún mas
28
uesta citotóx
ores resultó
udinales pero
an la afinid
do en ese pa
ope. Esta sup
mismo tiem
o, los nuevos
itió como de
onocer si la
bservan que
e teoría de q
mayor frecu
blacional pue
ente a dicha
fectados. Se
n para ente
ha demostrad
ón, lo que se
como un es
obicidas) qu
mática dismi
rdreyn et al
ue portaban
stimaron qu
amente a un
resultados
us también e
n también q
ra) poseían c
ección. De he
dad a la neu
s, un estudio
xica del indiv
de ver el s
o además, de
dad del epít
aciente aun
posición se s
po “la muta
s estudios do
el individuo
a supuesta m
la mayoría f
que las muta
encia de lo q
ede moldear
respuesta h
e muestra t
ender el futu
do que exist
e traduce en
scenario ide
e prevengan
inución de l
l [59] donde
n tanto el t
e en la may
na variante v
fueron con
en parejas de
que las sec
característica
echo, posteri
utralización
o reciente de
viduo. Concr
surgimiento
e suponer qu
tope viral p
sin tener ev
sustentaba e
ación de esca
onde se disp
que fue infe
mutación em
fueron trans
ciones de es
que se creía,
r la evolució
hasta ser sig
ambién la i
uro de la ep
te una fuerte
n una signific
eal para est
n la transmisi
la diversidad
e, analizand
ransmisor c
yoría de los
viral del con
firmados m
e transmisió
cuencias tra
as particular
iormente se
por anticue
emostró que
retamente, la
en el tiemp
ue aquellos a
por alguno
videncia de l
en considera
ape” y “el al
ponía de la se
ectado (en l
mergió en
mitidas.
scape son tra
, apoyando la
ón del HIV y
gnificativam
mportancia
pidemia del
e selección d
cativa dismin
tudiar el de
ión[58].
d viral en e
o filogenétic
omo el rece
casos la infe
njunto de va
ás adelante
n[60,61]. Lo
nsmitidas d
es, distintas
demostró e
rpos de est
e pacientes c
a conclusión
po de varias
aminoácidos
de los HLA
la existencia
ar altamente
lelo del cual
ecuencia del
las llamadas
el individuo
ansmitidas y
a teoría más
que el virus
ente menos
de estudiar
HIV. Esto es
de variantes
nución de la
esarrollo de
l evento de
camente las
eptor en un
ección en el
ariantes que
e analizando
s resultados
del gen env
de aquellas
n ensayos in
as variantes
con mayores
n
s
s
A
a
e
l
l
s
o
y
s
s
s
r
s
s
a
e
e
s
n
l
e
o
s
v
s
n
s
s
nivele
tiend
célula
El es
anális
publi
un e
trans
relev
ser tr
natur
luego
persis
comp
El est
trans
bien
nivele
anális
gene
asoci
porta
indep
pronó
los al
muta
comp
en pa
confi
I.9.
pobl
Un t
pobla
es de activa
en a infecta
as blanco de
tudio de es
sis de la din
cado en 200
pítope part
smisión a un
ancia limitad
ransmitida a
raleza altam
o del evento
stencia es
pensatorias[3
tudio de la s
smisión ha po
trabajos pre
es de virus
sis[32,67 69]
rada por el
adas a las
adores de es
pendienteme
óstico es aso
elos de HLA
aciones de es
pensatorias[3
arejas serod
rmado por e
Evidencia
lacional
rabajo recie
acional, rean
ación inmu
arse con un
l HIV en muc
ste tipo de
námica de s
05 por Leslie
icular de la
individuo q
da a nivel de
un individuo
ente polimó
o de transm
posible gra
36,53,66].
selección y t
osibilitado ta
evios analiza
en sangre, l
]. Al estudia
mismo viru
mutaciones
ste tipo de m
ente de los a
ociado a la in
que posee e
scape apare
33]. Incluso d
discordantes
estudios post
reciente
ente ha est
nalizando gra
ne (debido
mayor núme
cosas facilita
pacientes re
selección y t
et al [54,65
a proteína G
ue no poseí
el individuo p
o con diferen
órfica del gen
misión, otras
cias a la a
transmisión
ambién evalu
ron la posib
a variabilida
ar el virus e
us en dos p
de escape.
mutaciones t
alelos del gen
nfección con
el individuo i
ntemente pu
dos trabajo h
que compa
teriores[71,7
acerca de
udiado la h
andes conjun
29
por ejemplo
ero de varia
aría la infecci
elacionados
transmisión
5] que demo
Gag (con re
ía el alelo HL
para las muta
ntes alelos H
n HLA). Sin e
s mutacione
parición de
de mutacion
uar su impac
ilidad de un
ad de este p
n parejas de
pacientes dif
. Estos estu
ienden a ge
n HLA que p
variantes de
nfectado. Di
ueden ser in
han llegado a
rten alelos d
72].
e la adapt
hipótesis de
ntos de dato
o a infeccio
ntes. Es dec
ón[64].
amplió sign
de variante
stró la rever
estricción pa
LA B57. Esto
aciones de e
HLA (evento a
embargo, tra
s de escape
e las anterio
nes de escap
cto en parám
a relación e
parámetro e
e transmisió
ferentes y f
udios recient
nerar una in
osea el indiv
el HIV portad
chas cargas
ncrementada
a sugerir un
del gen HLA
tación del
adaptación
os provenient
nes agudas
cir, que una
nificativamen
s de escape
rsión de una
ara HLA B57
os primeros
scape ya que
altamente p
bajos poster
e son capac
ormente me
pe en el con
metros clínico
ntre las mut
n la infecció
ón puede co
facilitar la d
tes han dem
nfección con
viduo infecta
doras de mu
virales reduc
as por el surg
incrementad
A aunque est
l HIV a la
n del virus
tes de 9 cen
de transmi
mayor activ
nte las posib
e. El primer
mutación d
7) luego del
resultados s
e se suponía
robable con
riores demos
ces de persi
encionadas
ntexto de un
os como la c
taciones de
ón natural d
ompararse la
etección de
mostrado qu
cargas viral
ado [70] aun
taciones de
cidas por la p
gimiento de
do riesgo de
te resultado
a respuest
a la respue
tros en un m
sión sexual)
vación de las
bilidades de
trabajo fue
de escape en
l evento de
sugerían una
a revertían al
siderando la
straron que,
istir y dicha
mutaciones
na pareja de
arga viral. Si
escape y los
dificultaba el
a carga viral
e diferencias
ue los virus
es menores,
que un peor
escape para
presencia de
mutaciones
transmisión
o deberá ser
ta inmune
esta inmune
meta análisis
)
s
e
e
n
e
a
l
a
,
a
s
e
i
s
l
l
s
s
,
r
a
e
s
n
r
e
e
s
con a
y enc
muta
Por o
prime
que p
que s
válida
alelos
impo
encue
nuev
a nive
y ent
interv
I.10.
resis
Medi
indet
los in
infecc
terap
alrededor de
cuentran un
ación de esca
otro lado, ta
eros momen
poseen alelo
si la hipótesis
a, es probab
s “raros” au
rtantes para
entran limita
a. Actualmen
el poblacion
re poblacion
venciones ef
. Breve r
stencia
iante el trat
tectables y co
ndividuos no
ción y la efic
péutica.
2800 pacien
na asociació
ape I135X en
ambién se s
ntos de la div
os HLA de b
s de que el H
ble que lo ha
un se vería f
a entender
ados por la in
nte se consid
al. Por eso, e
nes es esenc
ficientes com
reseña ace
amiento ant
onsecuentem
o infectados
ciencia del tr
ntes. En el m
n positiva e
n las distintas
sugirió la inf
versificación
aja prevalen
HIV se ha ada
aya hecho p
forzado a es
la interacci
ncapacidad d
dera casi un
estudios má
ial para ente
mo una vacun
erca del
tirretroviral
mente increm
[76]. Así, los
ratamiento a
30
mismo confirm
entre la pre
s poblacione
Figu
alel
indi
fluencia de
n del HIV[73]
ncia[74]. Este
aptado en ci
para los alelo
scapar y por
ión del HIV
de seguir al v
hecho que l
s profundos
ender la pato
na [75].
tratamien
los niveles d
mentar los n
s parámetro
antirretrovir
man las asoc
evalencia de
s estudiadas
ura I.9. Preval
o B51 en un e
ividuos[38].
la respuesta
] y una mayo
e último dat
erto grado a
os mas preva
r lo tanto a
V con la po
virus a medi
as respuesta
acerca del o
ogénesis del
nto antirre
de CV pued
iveles de CD
os de CV y C
al, guiando e
ciaciones pre
el alelo B51
s (Figura I.9.)
lencia de la m
estudio de 9 c
a inmune m
or diversifica
to debe inte
a la respuest
alentes y en
diversificars
blación en
da que se pr
as CTL mode
origen del H
virus e impe
etroviral y
en reducirse
4, incluso a n
D4 sirven pa
en la toma d
eviamente de
y la preval
).
mutante de es
cohortes con
mediada por
ación viral e
erpretarse co
a inmune po
n aquellos pa
se. Estos res
la que circu
ropaga en un
lan la divers
IV y su evolu
erativo para
y el desa
e, idealment
niveles simila
ara seguir el
de decisione
escriptas[38]
lencia de la
cape I135X al
más de 2800
HLA en los
n individuos
onsiderando
oblacional es
acientes con
sultados son
ula pero se
na población
idad del HIV
ución dentro
el diseño de
arrollo de
te, a niveles
ares a los de
curso de la
es durante la
]
a
l
0
s
s
o
s
n
n
e
n
V
o
e
e
s
e
a
a
Los a
prime
blanc
Trans
Inhib
produ
nuev
Fusió
I.11.
La d
proba
emer
frecu
resist
resist
replic
Sin em
de m
medi
varia
lado
trata
Y por
trans
infect
I.12.
I.12.1
inmu
Tanto
contr
pode
antivirales ut
eros utilizad
co es el sitio
scriptasa (NN
idores de la
uctos virales
os blancos v
ón.
. Impacto d
disminución
ablemente s
rge y preva
entemente
tencia cruzad
tentes result
cación viral.
mbargo, si b
utaciones as
o libre de e
ntes salvaje
implica que
miento, las v
r otro lado, q
smisión de re
tado.
. Objetivos
1. La importa
une, base de
o la respue
rarrestar la r
mos llamar
tilizados en e
os fueron lo
activo de la
NRTI) cuyo b
Proteasa (P
s. En los últ
virales entre
del fenóme
de la efe
e deba a la s
alece por s
presentan r
da entre dro
ta ser un pro
bien en un m
sociadas a re
esta presión
s (wild type
cuando a u
variantes res
que cuando
esistencia), l
s del proye
ancia de estu
los objetivo
esta inmune
replicación v
artificial. La
el tratamien
os llamados
enzima RT.
blanco es tam
PI), enzima v
timos años
los que se c
eno de resi
ctividad de
selección de
sobre el res
resistencia a
gas de una m
oblema grav
edio donde
esistencia tie
de selecció
e, no resiste
n individuo
sistentes (pr
un individuo
as mismas n
ecto y cons
udiar la rela
os de la prese
HIV especí
viral, siendo
respuesta i
31
to se puede
Inhibidores
El segundo g
mbién la RT
viral involucr
se han des
uentan los In
istencia en
el tratamien
una variante
sto. Y debi
a varias clas
misma clase
ve que siemp
existe presió
enen una cap
ón dicho fitn
ntes)[81 83]
que se encu
edominante
o se infecte c
no deberían
trucción de
ción entre e
ente tesis de
ífica como
la primera u
nmune, al ig
en clasificar d
Nucleosídic
grupo son lo
pero no su
rada en proc
arrollados n
nhibidores d
n la terapé
nto para co
e resistente a
ido a que
ses de drog
es frecuente
pre complica
ón de selecci
pacidad repl
ness viral es
. Esto tiene
uentra bajo f
s) deben ser
con variante
persistir muc
e la hipóte
l tratamient
e doctorado.
el tratamien
una forma n
gual que el
de acuerdo
cos de la Tra
os Inhibidore
sitio activo.
cesamientos
nuevos antir
e la Integras
éutica
ontener la
al/los antivir
las variante
gas antirretr
e [78 80], la e
a nuevos esf
ión antiviral
icativa (fitne
s, en genera
e consecuenc
falla terapéu
r reemplazad
s resistentes
cho tiempo
esis de trab
to antirretro
.
nto antirret
natural y la s
tratamiento
al blanco de
anscriptasa (
es no Nucleo
. El tercer gr
s post traduc
rretrovirales
sa y los Inhib
replicación
ral/es admin
es del HIV
ovirales[77]
emergencia
fuerzos para
las variantes
ess viral) sup
al, menor qu
cias inmedia
utica se le in
das por la fo
s (es decir, u
en este nuev
bajo
oviral y la res
troviral son
segunda una
o antirretrov
e acción. Los
(NRTI), cuyo
sídicos de la
rupo son los
ccionales de
que atacan
bidores de la
viral muy
istrados que
resistentes
y a que la
de variantes
controlar la
s portadoras
perior; en un
ue el de las
atas: por un
terrumpe el
orma salvaje.
n evento de
vo individuo
spuesta
formas de
a forma que
iral, poseen
s
o
a
s
e
n
a
y
e
s
a
s
a
s
n
s
n
l
.
e
o
espec
indivi
indivi
indivi
Inclus
acces
la ev
antirr
capaz
teste
más t
cerca
que r
nivel
infect
muta
Sólo
antirr
perm
Prote
[85,8
trata
I.12.2
Carac
de ev
antirr
I.12.3
Nues
es co
antirr
varia
cificidad po
iduos. La dif
iduos infect
iduos diagno
so, del conju
so al tratami
volución de
retrovirales
z de modela
o y el acceso
temprano d
ano la mayor
resulta de gr
poblacional
tados que se
aciones de es
unos poco
retroviral [84
mitir extrapo
easa que no
86]. Por lo
miento en la
2. El objetivo
cterizar los e
vadir la resp
retroviral en
3. La hipótes
tra hipótesis
onsecuencia
retroviral fa
ntes salvajes
r el virus y
ferencia ent
tados mient
osticados y
unto que cu
ento. Esto su
el virus a
ha sido am
ar la evolució
o al tratamie
ebido a la re
ría de la pob
ran importan
puede afect
e encuentran
scape CTL.
os estudios
4 86] aunque
lación a niv
o son consid
tanto, exist
a persistencia
o general
epítopes vira
puesta selecc
la persisten
sis de trabajo
s de trabajo
de la signific
avorece la r
s, mejor adap
y seleccionan
tre ambas re
tras que la
en particula
umple con e
ugiere que la
nivel pobla
pliamente d
ón de las va
nto antirretr
educción de
blación infect
ncia estudiar
tar y/o inter
n bajo tratam
han analiza
e fallan en a
el poblacion
deradas ent
e un gran
a de las muta
les que está
cionando mu
cia dichas m
o
fue que “la
cativa reduc
eversión de
ptadas a la r
32
n variantes
espuestas es
respuesta
ar aquellos q
l criterio, de
a respuesta
acional. Sin
descripta y e
ariantes del
roviral, suma
la toxicidad
tada se enco
r cómo esta
actuar con la
miento; y en
ado la rela
lcanzar un n
nal [84] y la
re los blanc
vacío de in
aciones de e
n sometidos
utaciones de
mutantes.
desestimula
cción de la c
e las variant
eplicación vi
de escape
s que la res
por antirre
que cumplen
ebe aclararse
inmune sería
embargo,
estudios rec
HIV a nivel
ado a la tend
d de los med
ontrara bajo
fuerte pres
a respuesta
particular c
ción entre
úmero impo
mayoría de
cos más imp
nformación
escape CTL.
s a presión in
e escape, y
ación de la re
arga viral de
tes de esca
iral.”
que puede
puesta inmu
etrovirales s
n criterio de
e que nunca
a mucho má
la transmi
ientes sugie
poblacional
dencia a inici
dicamentos
tratamiento
ión de selec
inmune mon
on la selecci
el escape
ortante de m
e ellos estud
portantes de
necesaria a
nmune citotó
evaluar el im
espuesta inm
ebido a la ef
pe a la res
en transmitir
une actúa e
solamente e
e inicio de t
a el total de
s potente pa
sión de re
eren que ser
. Con la am
ar tratamien
utilizados, e
o. Por eso co
cción artificia
ntada por lo
ión y persist
CTL y el t
muestras ana
dian las pro
e la respue
cerca del im
óxica y que s
mpacto del t
mune HIV es
ficiencia del
spuesta citot
rse a otros
n todos los
en aquellos
ratamiento.
e ellos tiene
ara modelar
esistencia a
ría también
pliación del
nto cada vez
n un futuro
onsideramos
al ejercida a
s individuos
encia de las
tratamiento
lizadas para
teínas RT y
sta inmune
mpacto del
son capaces
tratamiento
specifica que
tratamiento
tóxica hacia
e
o
a
I.12.4
1. C
2. Id
3. C
4. C
5. E
6. D
e
in
4. Los objetiv
Caracterizar l
dentificar me
Confirmar las
Caracterizar l
Evaluar la din
Determinar e
estas mutaci
niciar el trata
vos específic
a población
ediante anál
s mutaciones
a respuesta
námica de es
el posible im
ones analiza
amiento
cos
bajo estudio
isis estadísti
s identificada
inmune espe
tas mutacion
mpacto del
ando los gen
33
o
co las poten
as mediante
ecífica frente
nes en el cur
tratamiento
nomas virale
ciales mutac
ensayos inm
e a estas var
rso de la epid
antirretrov
es presentes
ciones de esc
munológicos
riantes
demia del HI
iral en la se
s en pacient
cape CTL
in vitro
V en Argent
elección/per
tes antes y
ina
rsistencia de
después de
e
e
II. MATERIALES Y MÉTODOS
II.1.
El cr
diagn
de In
Centr
térm
prese
terce
hecho
preva
heter
25%.
mayo
proye
Unive
II.2.
Las m
estud
homo
mues
fracc
y el r
célula
el di
corre
con P
suspe
se re
y de
de 2
millo
Población
riterio de i
nosticado po
munocompr
ro de Testeo
inos de prev
entes en los
er mundo, se
o, en unos
alencia de in
rosexual aun
Los estudio
oritariamente
ecto ha sido
ersidad de B
Procesam
muestras de s
dio se recib
ogeneizar, se
stra se cent
iones de 1 m
resto se alma
as mononuc
luido sobre
espondiente
PBS. Se tom
ensión de CM
suspendió e
2 millones d
millones se
nes se conge
bajo estud
nclusión pa
rtador del H
rometidos de
o Voluntario
valencia de re
pacientes [9
e encuentra
de los trab
fecciones re
nque la pob
os de caracte
e recombina
presentado
uenos Aires
iento de la
sangre perifé
bieron en tu
e separó un
rifugó a 250
ml en criotub
acenó a 70º
leares de sa
3 ml de s
a las CMSPs
mó una alícu
MSPs se lavó
n el volumen
de CMSPs. Se
secaron par
elaron de acu
dio
ara el pres
HIV. El muest
el Hospital R
o. Esta pobla
esistencia pr
9]. En genera
en estados
bajos antes
ecientes era a
blación HSH
erización mo
ante BF mien
y aprobado
(OHRP ref nu
as muestra
érica obtenid
ubos conten
a alícuota d
00 rpm dura
os. Una de la
ºC. El centrif
angre perifér
solución de
s se separó a
ota de 0,5
ó por centrif
n adecuado
e centrifugó
a obtener la
uerdo a la m
35
ente trabaj
treo se realiz
Ramos Mejía
ación fue pr
rimaria a ant
al es una pob
avanzados d
citados se e
alrededor de
(hombres q
olecular del
ntras que var
o por el Com
um: IORG000
as
das por pun
niendo EDTA
de 1 ml para
ante 10 min
as fracciones
fugado se di
rica (CMSPs)
Ficoll a 25
a un tubo fa
ml y se con
fugación a 17
para alicuot
nuevamente
s CMSPs com
metodología d
jo consistió
zó sobre los p
de Capital F
reviamente c
tirretrovirale
blación que,
de la infecci
estimó med
el 10%. La po
que tienen se
virus han d
riantes del s
ité de Bioéti
04063).
ción venosa
A como ant
a realizar las
nutos. El sob
s fue utilizad
luyó al medi
por gradien
00 rpm por
lcon de 15 m
ntaron las C
700 rpm dur
ar en criotub
e a 1700 rpm
mo pellet se
descripta a c
en ser in
pacientes qu
Federal, la cu
caracterizada
es [87] y subt
como suele
ón al mome
iante la téc
oblación sue
exo con hom
demostrado
ubtipo B ron
ica de la Fac
de los indiv
ticoagulante
s mediciones
brenadante
da para realiz
io con buffe
nte de Ficoll
r 15 minuto
ml y se llevó
MSPs en cá
rante 5 minu
bos de 2 ml
m durante 5
co, mientras
ontinuación
ndividuo rec
ue asistieron
ual opera tam
a por nuest
tipos virales
ser el caso e
ento del diag
cnica de De
le ser mayor
mbres) pued
que el mism
ndan el 30%.
cultad de Me
iduos involu
. Previa agi
s de CD4. El
(plasma) se
zar las medic
r PBS y se se
Hypaque: S
os sin freno
a un volum
ámara de Ne
utos y el pell
fracciones d
minutos y la
s que las frac
.
cientemente
a la sección
mbién como
ro grupo en
de las cepas
en países del
gnóstico. De
tune que la
ritariamente
de rondar el
mo suele ser
. El presente
edicina de la
crados en el
itación para
resto de la
alicuotó en
ciones de CV
epararon las
e centrifugó
o. La banda
en de 15 ml
eubawer. La
let obtenido
e 6 millones
as fracciones
cciones de 6
e
n
o
n
s
l
e
a
e
l
r
e
a
l
a
a
n
V
s
ó
a
l
a
o
s
s
6
II.3.
Las c
millo
de 50
soluc
inten
rápid
"Mr.
las tr
mese
II.4.
Los c
acele
goteo
goteo
progr
veces
II.5.
Las m
DNA
340 b
hibrid
prime
genó
captu
viral y
indivi
distin
forma
alcali
con u
Congelado
células que s
nes por mili
00 a 700 µl
ción de Sue
samente la s
amente tod
Frosty") que
ransfiere a u
es es también
Descongel
criotubos de
erar el desco
o sobre 1 ml
o, se agrega
resivamente
s con medio
Medición
mediciones d
(bDNA) con
bDNA Analyz
dación de ác
er lugar, el
mico se liber
ura de oligon
y a las sonda
iduales, y la
ntas partes d
ando un co
na se hibrid
un sustrato q
o de célula
se desean co
litro. Luego
(5 a 7 millo
ro Fetal Bo
suspensión c
o el conteni
e permite ret
un sistema d
n posible.
lado de cé
e las células
ongelamiento
l de medio R
n otros 10 m
y agitando
RPMI 10%SF
de los valo
e carga viral
el kit VERSA
zer. El ensay
cido nucleico
HIV 1 se co
ró de los viri
nucleótidos s
as del amplif
as sondas d
del gen pol d
omplejo de A
daron a este
quimiolumini
as
ongelar se l
se distribuye
ones de célu
ovino (SFB)
celular. Una
do y se colo
tardar el tiem
de nitrógeno
lulas
a desconge
o. Una vez d
RPMI al mism
ml de medio
al mismo ti
FB.
ores de Car
l se realizaro
ANT® HIV 1
yo VERSANT
o para la cua
oncentró a p
ones, se cap
sintéticos es
ficador. Las s
iana, que co
del ARN vira
ADN ramific
complejo in
iscente. La e
36
as resuspen
en en criotu
ulas por tubo
20% DMSO
vez finalizad
ca en sistem
mpo de cong
o líquido en
elar son llev
descongelada
mo tiempo q
o RPMI 10%
iempo. Una
rga Viral
on a partir de
RNA 3.0 Ass
T® HIV 1 RNA
antificación d
partir del pl
pturó en un m
pecíficos. Un
sondas de ca
onstan de 8
al y la sonda
cado. Varias
nmovilizado.
emisión de lu
de en medi
bos de 2ml
o). Finalmen
en forma
do el goteo d
ma Mr Frosty
gelación y se
los días sigu
vados rápida
as, se dispen
que se agita
% SFB tambié
vez finalizad
e 1 ml de pla
say (bDNA) d
A 3.0 (bDNA
directa de AR
asma por ce
micropocillo
n conjunto d
aptura, que c
81 extensore
a del amplifi
s copias de
La detecció
uz es directam
o RPMI a un
(Greiner bio
nte se agrega
de goteo su
de la solución
y (5100 Cryo
e lo almacena
uientes aunq
amente a un
nsa el conte
intensament
én en forma
do el goteo
asma media
de Bayer y e
) es un proc
RN del HIV 1
entrifugació
mediante un
e sondas dia
constan de 1
es diana ind
icador se hib
una sonda
ón se realizó
mente propo
na concentr
o one 126) e
a igual volum
uave mientr
n mencionad
1°C Freezin
a a 70ºC. Id
que una dem
n baño a 37
enido en form
te. Una vez
a de goteo a
se centrifug
nte la técnic
el equipo BA
cedimiento s
1 en plasma
n. Una vez
n conjunto d
ana se hibrid
17 extensore
dividuales, se
brida al prea
marcada co
ó incubando
orcional a la
ación de 10
n fracciones
men de una
ras se agita
da se mezcla
g Container,
ealmente se
mora de 4 5
7ºC a fin de
ma de lento
finalizado el
acelerándolo
ga y lavan 2
ca de Branch
AYER®System
sandwich de
humano. En
que el ARN
de sondas de
daron al ARN
s de captura
e acoplan a
amplificador
on fosfatasa
el complejo
cantidad de
0
s
a
a
a
,
e
5
e
o
l
o
2
h
m
e
n
N
e
N
a
a
r
a
o
e
ARN
relati
conce
ARN
II.6.
Las m
flujo
T890
CD8 P
ambi
rojos
desti
desti
lavad
flujo
CD3/
II.7.
Este
mues
realiz
técni
linfoc
nivel
cantid
antic
Biosc
cada
II.8.
Estas
de la
se de
del HIV 1 p
ivas de luz.
entraciones
del HIV 1 en
Medición
mediciones d
con el TriTE
EPICS XL. Se
PE/CD3 PerC
ente por un
mediante a
lada), la solu
lada) y la sol
dos (fundam
BD FACSCa
/CD4/D8.
Medición
ensayo se r
stras evaluad
zarse la marc
ca de citom
citos citotóx
de activació
dad apropia
uerpo no p
ciences). Co
muestra dos
Generació
s líneas se ge
línea celula
ejan crecer h
presente en
Se definió u
conocidas d
las muestra
de los valo
de CD4 se rea
EST CD4 FITC
e mezclaron
CP con 100
período de
agregado se
ución B (Bic
lución C (For
ental para r
anto Flow
de los nive
realizó siem
das será men
cación, la mi
metría de flu
icos de linfo
ón celular. M
da de cada
pegado y an
omo controle
s marcacione
ón de línea
eneran por in
r B95.8 crec
hasta que el
cada muest
una curva p
de virus HIV
as se determ
ores de CD
alizaron a pa
C/CD8 PE/CD
5 µl. del ant
l de muestr
1 hora (rang
ecuencial de
arbonato de
rmaldehido a
recuento ab
Cytometer
eles de act
pre sobre la
nor al total d
sma no sería
ujo. Los ma
ocitos “helpe
Metodológica
anticuerpo a
nalizan en e
es para pod
es adicionale
as autóloga
nfección con
ida en medi
medio este
37
tra y el ana
patrón por la
1 tratado c
inaron a part
D4
artir de 1 ml
D3 PerCP (Be
icuerpo mon
ra. Se incubó
go de 45 min
tres solucio
e potasio, ca
al 0,2% en Is
soluto). Las
(BD Bioscie
tivación de
a muestra r
e muestras b
a realizada m
rcadores ut
er” y los ma
amente se i
a 4ºC duran
el citómetro
er determin
es, cada una
as de linfoc
un stock vir
o RPMI supl
ligeramente
alizador regi
a emisión d
con beta pro
tir de esta cu
de sangre m
ecton Dickin
noclonal (TriT
ó en oscurida
n. a 2 horas)
ones: La so
arbonato de
sotón). La mu
muestras se
ences) con
el sistema i
recién extraí
bajo estudio
más adelante
ilizados fue
arcadores CD
ncuban alre
te 30 minut
de flujo B
nar los límite
en ausencia
citos B
al de Epstein
ementado c
e ácido y ent
istra los res
e luz de est
opiolactona.
urva estánda
mediante la t
son) y el cit
Test de Bect
ad en el flujo
. Luego se re
lución A (Ác
calcio, hidró
uestra una v
e corrieron
el protoco
inmune
ída. Es por
ya que, si po
e. La medició
ron CD3/CD
D38 y HLA D
ededor de 1
tos. Luego se
D FACSCant
es de positiv
de CD38 o H
n Bar. Dicho
on antibiótic
onces se cen
ultados com
tándares qu
Las concent
ar.
técnica de ci
ómetro de f
ton Dickinson
o laminar a t
ealizó la lisis
cido fórmico
óxido de cal
vez lisada no
utilizando c
lo denomin
ello que el
or alguna raz
ón se realiza
D4/CD8 para
DR como ind
millón de P
e lavan para
to Flow Cyt
vidad se rea
HLA DR.
stock se obt
co y 10%SFB
ntrifuga y lu
mo unidades
e contienen
traciones de
itometría de
flujo Coulter
n) CD4 FITC/
temperatura
de glóbulos
o en agua
lcio en agua
requiere de
itómetro de
nado Rutina
número de
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mediante la
a diferenciar
dicadores de
PBMC con la
a remover el
ometer (BD
lizaron para
iene a partir
B. Las células
ego filtra en
s
n
e
e
r
/
a
s
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e
e
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o
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e
a
l
D
a
r
s
n
poros
conce
de 5
stock
de Cy
baño
5%CO
duran
de fo
Una
enriq
de 5
II.9.
La ex
QIAa
plasm
partir
II.9.1
Dos
eppe
Luego
200
Se ce
adhe
nuev
(QIAG
filtrad
de bu
colum
20ºC
s 0,45µM a
entrado en v
millones de
k de Epstein
yclosporina A
a 37ºC dura
O2 37ºC dura
nte ese perío
ocos de prol
muestra de
quecimiento
millones y co
Extracción
xtracción de
mp viral extr
ma y el QIAa
r de CMSPs a
1. Extracción
millones de
ndorff de 1,
o se agregar
l de etanol
entrifugó a 6
rido a la col
amente a 60
GEN) a la col
do y se coloc
uffer de eluc
mna y el ADN
.
fin de rem
virus Epstein
CMSP y se r
Bar (de acue
A a fin de in
ante 1 hora.
ante alreded
odo. Finaliza
iferación (in
e la suspens
en linfocitos
ongeladas sig
n de ácidos
ácidos nucl
raction Kit (Q
amp DNA mi
almacenadas
de ADN
CMSPs se
,5 ml al cua
ron 200 l d
absoluto par
6000 x g por
lumna. Se ag
000 x g por
lumna. Se ce
có la column
ción (Buffer A
N resuspendi
mover la fra
n Bar. Para re
resuspenden
erdo a la infe
hibir la resp
. Luego se ag
dor de 1 me
das las 4 sem
cluso visible
sión positiva
s B y luego es
guiendo el p
s nucleicos
eicos se rea
QIAGEN, Gm
ini Kit (QIAG
s como pelle
resuspendie
al se agregar
e Buffer AL
ra precipitar
r 1 minuto y
gregaron 50
1 minuto. S
entrifugó a m
na sobre un t
AE, QIAGEN)
ido en 200
38
cción celula
ealizar la tra
n en 1 ml de
ectividad / c
uesta citotó
gregan 5 ml
es sin realiza
manas se ob
es sin micros
a es marcad
s contada en
rotocolo des
s
alizó mediant
mgH, Hilden,
GEN, GmgH,
t seco.
eron en 200
ron 20 l de
(QIAGEN) y
el ADN y se
y se descartó
0 l de buff
e descartó e
máxima velo
tubo eppend
y se centrif
l buffer AE e
ar. Este sobr
nsformación
e medio RPM
capacidad tra
xica específi
de medio R
r ningún tip
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scopio) es in
da con CD3
n cámara de
scripto anter
te los kits co
Alemania) p
Hilden, Alem
0 l de buffe
e solución d
se incubó a
cargó la solu
ó el filtrado.
fer AW1 (QIA
el filtrado y
cidad (20.00
dorff de 1,5 m
ugó a 6000 x
en el tubo ep
renadante s
n de linfocito
MI solo. Lueg
ansformante
ica para Epst
RPMI 10% SF
po de cambio
pensión al m
ndicativo de
3/CD4/CD8/C
Newbawer,
riormente.
omerciales d
para la extrac
mania) para
fer PBS y se
de Proteasa
56ºC por 10
ución total e
Luego se re
AGEN) a la c
se agregaron
00 x g) por 3
ml. Se agrega
x g durante
ppendorff se
se encuentra
os B se toma
go se agrega
e del stock) e
tein Bar y se
FB y se incub
o de medio
microscopio. L
transformac
CD19 para c
fraccionada
de QIAGEN:
cción de ARN
la extracció
e colocaron
QIAGEN (Pr
0 minutos. S
n una colum
ealizó el lava
columna y s
n 500 l de
minutos. Se
aron a la colu
1 minuto. Se
almacenó e
a altamente
an alrededor
n 1 2 ml del
en presencia
e incuban en
ba en estufa
ni agregado
La presencia
ción celular.
confirmar el
en alícuotas
se utilizó el
N a partir de
ón de ADN a
en un tubo
roteinasa K).
Se agregaron
mna QIAamp.
ado del ADN
e centrifugó
buffer AW2
e descartó el
umna 200 l
e descartó la
n freezer a
e
r
l
a
n
a
o
a
.
l
s
l
e
a
o
.
n
.
N
ó
2
l
l
a
II.9.2
En u
(QIAG
etano
6000
volvie
colum
6000
colum
coloc
elució
el AR
II.9.3
Se tra
trasv
centr
sigma
420µ
bajar
un tu
centr
415µ
ambi
en 55
II.10
La ca
secció
carac
sobre
2. Extracción
n tubo eppe
GEN). Se inc
ol absoluto.
x g por 1 m
eron a centr
mna. Se agre
x g por 1 m
mna. Se cent
có la column
ón (Buffer A
N resuspend
3. Extracción
asvasaron en
asó el plasm
rifugó a 170
a y 10µl de
µl de 5M Gua
r liquido en l
ubo de 1,5m
rifugó a 21.0
µl de etanol 7
ente. Finalm
5µl de solució
0. Caracteri
racterización
ón de Inmun
cterización a
e ADN celula
de ARN a pa
endorff de 1,
ubó a temp
Se cargaron
minuto y se
rifugar a 600
egaron 500
minuto. Se d
trifugó a má
a sobre un t
VE, QIAGEN
dido en 60
de ARN a pa
ntre 8 y 15m
ma clarificad
.000g por 1
proteinasa K
anidinium th
las paredes.
l. Luego se a
00g por 30m
70% y se vo
mente, se elim
ón de elució
rización de
n de los gen
nogenética d
dos dígitos
r extraído se
artir de mue
5 ml se colo
eratura amb
n 630 l de
descartó el
00 x g por 1
l de buffer
escartó el fi
áxima velocid
tubo eppend
) y se centrif
l buffer AVE
artir de mue
l de plasma
o a un tubo
hora a 4ºC.
K. Se incubó
hiocyanate y
Se incubó 1
agregaronn 4
min a temper
rtexeó 10 se
minó todo e
n Qiagen.
los genes
es HLA fue r
del Hospital
y se realizó s
egún el proto
39
estras con ca
caron 140
biente duran
la solución
filtrado. Se
1 minuto. Lu
AW1 (QIAG
iltrado y se
dad (20.000
dorff de 1,5 m
fugó a 6000
en el tubo ep
estras con ca
a un tubo fa
o de ultrace
. Se removió
ó 30min a 55
10µl de Gly
15min a tem
495µl de alc
ratura ambie
egundos. Se
l etanol y se
HLA
realizada po
de Clínicas d
sobre los loc
ocolo descrip
arga viral det
l de plasma
nte 10 minu
total en una
cargaron los
uego se reali
EN) a la colu
agregaron 5
x g) por 3 m
ml. Se agrega
x g durante
ppendorff se
arga viral ind
lcon de 15m
ntrífuga y se
ó el sobrena
5ºC vortexea
ycogen. Se vo
peratura am
cohol isoprop
ente, se desc
centrifugó a
secó al aire
r el laborato
de la Ciudad
ci A y B medi
pto en la ant
tectable
y se agregar
tos y luego
a columna Q
s 630 l rest
izó el lavado
umna y se ce
500 l de buf
minutos. Se
aron a la colu
1 minuto. S
e almacenó e
detectable
ml y centrifug
e llenó con
adante y se a
ando periód
ortexeó suav
mbiente y se
pílico y se vo
artó el sobre
a 21.000g po
e por 10min.
orio del Dr. L
de Buenos A
iante la técn
erior sección
ron 560 l de
se agregaro
QIAamp. Se
tante a la co
o del ARN ad
entrifugó nu
uffer AW2 (Q
descartó el
umna 60 l
Se descartó l
en freezer a
ó 15min a 3.
solución de
agregaron 9
icamente. S
ve y se dio u
trasvasó el
ortexeó 10 s
enadante y s
or 15 min a t
El pellet se
Leonardo Fai
Aires. La mis
nica de sonda
n.
e buffer AVL
on 560 l de
centrifugó a
olumna y se
dherido a la
uevamente a
QIAGEN) a la
filtrado y se
de buffer de
a columna y
20ºC.
.600 rpm. Se
llenado. Se
0µl de agua
e agregaron
un spin para
contenido a
egundos. Se
se agregaron
temperatura
resuspendió
imboin en la
sma fue una
as PCR SSOP
L
e
a
e
a
a
a
e
e
y
e
e
a
n
a
a
e
n
a
ó
a
a
P
II.11
Se ut
neste
termo
II.11.
Los p
forma
Tabla
Nom
1ga
2ga
1ga
2ga
II.11.
El me
dNTP
trans
sustr
mezc
corre
se le
de en
minu
Para
1,5m
25µM
agreg
según
minu
segun
Para
MgCl
1. Amplifica
tilizó la técni
ed PCR, para
ociclador PE
1. Primers u
primers utiliz
a casi compl
II.1. Lista de
mbre
agFw CTAG
agFw TCTC
agRev CAG
agRev TTTC
2. Amplifica
edio de reac
Ps, 10mM D
scripción rev
ato ARN ex
clar (por rea
espondiente
agregaron 6
nzima RT Sup
tos a 72ºC.
el primer ro
M y 0,2mM
M y 0,2µl de
garon a los
n los siguient
to 40 segun
ndos a 72ºC]
el segundo
2 2,5mM y 0
ación de Á
ica de Reacc
a amplificar
RKIN ELMER
utilizados
zados se det
eta (hasta u
primers utiliz
Sec
GCAGTGGCGC
CTCGACGCAG
TCTTTCATTTG
CCACATTTCCA
ación a partir
cción de la re
DTT, 1,6 U/µ
versa. La rea
xtraído segú
acción) 3,45
y 10µl del su
6,16µl una so
perscript II (I
und de amp
M dNTPs. Se
e enzima pol
20µl de pro
tes ciclos: 3
ndos a 72ºC]
], 10 minutos
round de a
0,2mM dNT
cidos Nucl
ción en Cade
la región g
R GeneAmp P
tallan en la
nos 100nt an
zados.
cuencia
CCCGAACAGG
GACTCG
GGTGTCCTTC
AACAGCCC
r de ARN vira
etrotranscrip
µl de la enz
cción se llev
n la técnica
µl de una s
ustrato de AR
olución comp
Invitrogen).
lificación se
tomaron 19
limerasa (Am
ducto de tra
minutos a 95
, 30 ciclos d
s a 72ºC.
mplificación
Ps. Se toma
40
leicos
ena de la Pol
genómica ba
PCR System 9
tabla II.1. E
ntes del extr
P
G
al – Nested R
pción contie
ima RT Sup
vó a cabo en
a descripta
solución 35%
RN extraído.
puesta por 4
La mezcla co
preparó una
9,4µl de esta
mpliTaq DNA
anscripción
5ºC, 5 ciclos
de [15 segun
se preparó
ron 19,7µl d
imerasa (PC
ajo estudio,
9600 (Roche
Estos primer
emo 3´).
osición (gen
629 6
682 7
2044 2
2022 2
RT PCR
ne “Strand"
erscript II (
n un volume
anteriormen
% glicerol 1,
Esta mezcla
µl de 5X Stra
ompleta se in
a mezcla de T
a solución y
A polymeras
reversa y se
de [15 segu
ndos a 90ºC,
una mezcla
de esta soluc
R) en sus va
con los kits
diagnostic S
s permiten
noma HXB2)
650
700
2066
2042
RT Buffer a
Invitrogen) y
en total de 2
nte. El proc
2 mM dNTP
a se incubó 5
and Buffer, 2
ncubó 45 mi
Tris pH 8,3 5
se agregaro
e, Invitrogen
e inició la re
ndos a 95ºC,
15 segundo
a de Tris pH
ción y se agr
riantes nest
s correspond
System).
amplicar el
Aplic
1º round –
2º round –
1º round
2º round
1X, 6% Glice
y 0,5µM de
20µl incluyen
cedimiento c
P, con 0,4µl
5 minutos a 6
2µl de DTT 0,
inutos a 42º
0mM, KCl 25
on 0,4µl de
n). Estos 20
eacción de a
, 15 segundo
os a 56ºC y 1
8,3 50mM,
regaron 0,10
ed RT PCR o
dientes y el
gen gag en
ación
– Forward
– Forward
– Reverse
– Reverse
erol, 0,2mM
el primer de
ndo 10µl de
consistió en
l del primer
65ºC y luego
,1M y 0,16µl
C y luego 15
5mM, MgCl2
cada primer
µl finales se
mplificación
os a 56ºC y 1
1 minuto 40
KCl 25mM,
04µl de cada
o
l
n
M
e
e
n
r
o
l
5
2
r
e
n
1
0
,
a
prime
se ut
prime
II.11.
En lo
enzim
siguió
de elo
0,2m
Polym
de pr
segun
II.12
Para
realiz
se pr
de pr
volum
4ºC O
Luego
de es
4ºC,
incub
mayo
conce
dejó
según
II.13
La re
Warr
Biosy
er 25µM y 0,
ilizó 1µl de p
er round.
3. Amplifica
s casos en q
ma Platinum
ó el mismo p
ongación a 6
M dNTP, 2m
merase. La re
roducto del p
ndo round d
2. Clonado
realizar el c
za la reacción
eparó la me
roducto de P
men final de
O.N.
o se realizó l
stas bacteria
luego 45 seg
bó en agitad
or parte del
entrada de b
O.N. a 37ºC
n protocolo d
3. Secuenci
eacción de s
rington, UK)
ystems).
,104µl de en
producto de
ación utilizan
ue fuera nec
High Fidelity
protocolo de
68ºC. Con res
mMMgSO4, 0
eacción se ll
primer round
e amplificaci
de secuen
clonado de
n de ligación
ezcla de ligac
PCR y al final
10µl. Todo e
la transform
s y se le agr
gundos a 42º
or 1 hora a
sobrenadan
bacterias se
C y se toma
descripto en
iación
secuenciació
y el equip
zima polime
reacción de
ndo enzima p
cesario realiz
y Taq Polym
etallado en e
specto al seg
0,25µM de c
evó a cabo
d. El ciclado t
ión excepto
cias virale
secuencias
n. Para ello se
ción con 5µl
1µl de enzim
el procedimi
ación de bac
egaron 3µl d
ºC y 2 minut
37ºC. Luego
nte y el pelle
plaqueó en
ron las colo
las seccione
ón se llevo a
o de secue
41
erasa (AmpliT
l 1º round. E
polimerasa d
zar una neste
erase. En est
l inciso ante
gundo round
ada primer y
en un volum
térmico fue
la temperatu
es
se utilizo el
e cuantificó
de “2X Rapi
ma “T4 DNA
iento se real
cterias comp
de producto
os a 4ºC nue
o se centrifu
et se resusp
LB agar con
nias blancas
es anteriores
a cabo con
nciación aut
Taq DNA poly
El ciclado tér
de alta fideli
ed RT PCR co
te caso para
rior pero cam
d se preparó
y 0,16 U/µl d
men final de
idéntico al d
ura de elong
vector pGE
en gel del pr
id Ligation B
Ligase” y ag
lizó en hielo
petentes. Pa
de reacción
evamente. Se
ugaron breve
pendió en el
n ampicilina,
s para realiz
s.
el kit Big D
tomática AB
ymerase, Inv
mico es idén
idad de copi
on alta fidelid
el primer ro
mbiando la e
una mezcla
de enzima Pla
25µl utilizan
detallado en
gación que se
EM T [Prome
roducto de P
Buffer”, 1µl d
gua para biol
y la reacción
ra ello se tom
de ligación.
e agregaron
emente las b
l volumen m
y en presen
ar una colon
Dye teminato
BI Prism 310
vitrogen). Co
ntico al deta
a
dad de copia
ound de amp
enzima y la t
con buffer d
atinum High
ndo como su
el inciso ant
e realizó a 68
ega A1360].
PCR a ser clo
del vector pG
logía molecu
n de ligación
mó una alícu
Se incubó 3
80µl de med
bacterias, se
muerto. Esta
ncia de IPTG
ny PCR de 1
or (Applied
00/3100 Ava
omo sustrato
llado para el
a se utilizó la
plificación se
temperatura
de la enzima,
Fidelity Taq
ustrato 2,5µl
erior para el
8ºC.
Primero se
nado. Luego
GEM T, 65ng
ular hasta un
n se incuba a
uota de 20µl
30 minutos a
dio SOC y se
e descartó la
suspensión
G y X Gal. Se
1 solo round
Biosystems,
ant (Applied
o
l
a
e
a
,
q
l
l
e
o
g
n
a
l
a
e
a
n
e
d
,
d
Se m
Big D
3,5
secue
de: 1
fenól
minu
Se ce
se ce
se co
se en
Arbo
II.14
Se ut
del a
Joinin
Máxi
confi
II.14.
Las se
págin
secue
la cer
tabla
II.14.
El ali
BioEd
Clust
el pro
ezclaron 9
Dye Terminat
l Agua esté
enciación se
10 segundos
ica agregand
tos a 2500 x
entrifugó 10
ntrifugó bre
onservó a 4°C
nsamblaron y
r, MI).
4. Análisis F
tilizó una var
análisis parti
ng. Para la
ma Parsimo
rmación de l
1. Secuencia
ecuencias de
na web de
encias corres
rteza de que
II.2
2. Alineamie
neamiento d
dit Sequence
alW. Posteri
ograma Gene
l de la “Mez
tor® v3.1 5x S
ril apirógena
realizó en e
a 96°C, 5 s
do 40 l de e
xg. Se descar
minutos a 2
vemente pa
C para luego
y analizaron
Filogenétic
riada gama d
cular. Para
reconstrucc
onia y de A
los resultado
as de referen
e referencia
Los Álamos
sponden a ge
e son subtipo
ento de secu
de las secue
e Alignment
ormente se
eCutter dispo
cla de Reacc
Sequencing
a) con 1 l d
el termocicla
segundos a 5
etanol 75%, s
rtó el sobren
2000 xg y al p
ra asegurars
o analizar me
mediante e
co
de técnicas d
la caracteriz
ión de relac
Análisis Baye
os mediante
ncia
de cada sub
s National L
enomas vira
os puros y no
uencias
encias con la
t Editor ver
realizó un pa
onible on lin
42
ción de Secue
Buffer, 1 l P
de producto
ador DNA th
55°C y 4 mi
se incubó 15
nadante y se
pellet se le a
se que las m
ediante el AB
el software S
de análisis fil
zación del s
ciones de a
esiano; en g
técnicas ind
tipo viral uti
Laboratory
les completa
o recombina
as referencia
rsión 5.0.9
aso de optim
e en la págin
enciación” (2
Primer corre
o de amplific
hermal cycler
nutos a 60°
minutos al r
e resuspendi
agregaron 10
uestras esté
BI Prism® 31
Sequencher v
ogenético cu
subtipo viral
ncestralidad
general, am
ependientes
ilizadas son a
de la Unive
amente secu
ntes intersu
as de subtipo
(North Caro
mización por
na web de Lo
2 l Big Dye
espondiente
cación a secu
r Perkin Elm
C. Luego se
resguardo de
ó el pellet e
0 l de Hi Di
n en la parte
100 Genetic A
versión 4.0.5
uya aplicació
l se utilizó e
se utilizaro
bas en par
s.
aquellas pub
ersidad de
uenciados y q
btipo. Sus no
o se realizó
olina State
codones del
os Alamos Na
Terminator®
de secuencia
uenciar y la
mer TC 9600
realizó la p
e la luz, se c
n 150 l de
Formamide.
e inferior de
Analyzer. Las
5 (Gene Cod
ón dependía
el método d
on las meto
alelo a fin
blicadas com
California, U
que por lo ta
ombres se d
mediante e
University)
l alineamien
ational Labo
® v3.1, 2.5 l
ación 4µM y
reacción de
en 25 ciclos
precipitación
entrifugó 30
etanol 70%.
. Finalmente
cada tubo y
s secuencias
des Co., Ann
del objetivo
de Neighbor
odologías de
de obtener
o tales en la
USA. Dichas
anto se tiene
etallan en la
el programa
Algoritmo
to mediante
ratory.
l
y
e
s
n
0
.
e
y
s
n
o
r
e
r
a
s
e
a
a
o
e
Ta
II.14.
Se re
comp
que
conse
tama
herra
obten
abla II.2. Secu
SubtipoViral
A1
A2
B
C
D
3. Análisis d
ealizó el an
parar el porc
se encuentr
enso por su
ño ajustable
amienta es ú
nido para un
uencias de ref
Secue
A1.KE.94.Q23
A1.SE.94.SE72
A1.UG.85.U45
A1.UG.92.92U
A2.CD.97.97CD
A2.CD.97.97CD
A2.CY.94.94CY
B.FR.83.HXB2_
B.US.83.RF_AC
B.US.86.JRFL_A
B.US.90.WEAU
C.BR.92.92BR0
C.BW.96.96BW
C.ET.86.ETH22
C.IN.95.95IN21
D.CD.83.ELI_A
D.CD.83.NDK_
D.CD.84.84ZR0
D.UG.94.94UG
de similitud
álisis media
centaje de si
ra alineada.
btipo y ana
e) que se m
útil para iden
na secuencia
ferencia de su
de cara
encia Referencia
17_ACC_AF0048
53_ACC_AF0696
55_ACC_M62320
G037_ACC_U511
DKS10_ACC_AF28
DKTB48_ACC_AF
Y017 41_ACC_AF
_ACC_K03455
CC_M17451
ACC_U63632
U160_ACC_U2113
025_ACC_U52953
W0502_ACC_AF1
220_ACC_U46016
1068_ACC_AF067
ACC_K03454
_ACC_M27323
085_ACC_U8882
G114_ACC_U8882
ante el prog
imilitud de u
Si existen
liza la simili
ueve por pa
ntificar posib
no recombin
43
ubtipos virale
acterización d
885
670
190
86241
286238
286237
35
3
10967
6
7155
2
24
grama Simpl
una secuenc
más de una
itud a lo lar
asos (tambié
bles recombi
nante y el ob
es utilizadas p
de subtipo vira
SubtipoViral
F
G
H
J
K
lot 2.5 (199
ia incógnita
a secuencia
rgo de la se
én ajustable
nantes. En l
btenido para
ara realizar lo
al.
Secuen
F1.BE.93.VI850_
F1.BR.93.93BR0
F1.FI.93.FIN9363
F1.FR.96.MP411
F2.CM.95.MP25
F2.CM.95.MP25
G.BE.96.DRCBL_
G.FI.93.HH8793
G.NG.92.92NG0
G.SE.93.SE6165_
H.BE.93.VI991_A
H.BE.93.VI997_A
H.CF.90.90CF056
J.SE.93.SE7887_
J.SE.94.SE7022_
K.CD.97.EQTB11
K.CM.96.MP535
97 1999 Stu
con las disti
referencia
cuencia med
s) a lo largo
a figura II.1.
una recomb
Figura II.
realizado
Simplot
observa e
de subtip
análisis
recombina
os análisis filo
cia Referencia
_ACC_AF077336
20.1_ACC_AF005
3_ACC_AF075703
1_ACC_AJ249238
5_ACC_AJ249236
7_ACC_AJ249237
_ACC_AF084936
12.1_ACC_AF06
83_ACC_U88826
_ACC_AF061642
ACC_AF190127
ACC_AF190128
6_ACC_AF005496
_ACC_AF082394
_ACC_AF082395
1C_ACC_AJ24923
5_ACC_AJ249239
art C. Ray,
intas referen
por subtipo
diante una v
o del alineam
se observa
binante.
1. Análisis
mediante e
2.5. A la
l análisis de u
po B y a la
de una
ante BF
ogenéticos
5494
3
6
7
1641
6
6
5
M.D.) para
ncias con las
o, realiza un
ventana (de
miento. Esta
el resultado
de similitud
el programa
izquierda se
una secuencia
a derecha el
secuencia
a
s
n
e
a
o
d
a
e
a
l
a
En am
claram
inters
II.14.
La téc
los re
que s
un á
incóg
y una
secue
un ej
Para
con la
de Bo
una v
Fi
se
II.14.
II.14.
El an
Evolu
mbos casos
mente mayo
subtipo) que
4. BootScan
cnica de Boo
esultados ob
se desplazan
rbol filogen
gnita, las dos
a cuarta qu
encia incógn
e x que repr
asegurar qu
a muestra in
ootScanning
ventana de 1
gura II.2. Aná
ecuencias ana
5. Árboles F
5.1. Método
nálisis filoge
utionary Gen
se observa
or (similitud
e aparecen ag
nning
otScanning fu
tenidos por
escaneando
ético por N
s involucrada
ue actúa co
ita y cualqui
esenta las po
ue una mues
ncógnita, con
de una mue
140pb y paso
álisis de BootS
alizadas en la f
a la
ilogenéticos
o de Neighbo
nético basa
netics Analy
que la simi
intrasubtipo
grupadas a n
ue realizada
el análisis de
o el alineami
Neighbor Join
as en la reco
mo outgrou
iera de las se
osiciones de
stra es recom
n un valor ig
estra de sub
os de 20pb.
Scanning real
figura 2.2. A la
derecha el an
s
or Joining.
do en este
ysis versión
44
ilitud con la
o) que la sim
niveles inferi
con el progr
e similitud co
ento pero en
ning bajo e
ombinación (
up. El valor
ecuencias re
la secuencia
mbinante de
gual o superi
btipo B y de
izado median
a izquierda se
nálisis de la se
método se
2.1, de Kum
a referencia
militud con e
ores.
rama Simplo
on el mismo
n vez de hac
el modelo d
determinada
de bootstra
eferencia es
a.
ebe haber un
or a 75. En l
una recomb
nte el program
observa el an
cuencia recom
e realizó co
mar, Tamura
del subtipo
el resto de l
t 2.5 y confie
programa. U
er un análisi
e K2P entre
as por el aná
ap de los c
registrado y
n cambio de
la figura II.2.
binante BF. P
ma Simplot 2.
nálisis de la se
mbinante BF
n el progra
a, Jakobser
a la que p
as referenci
ere soporte e
Utiliza tambi
s de similitu
e cuatro se
álisis de simi
lados conte
graficados a
e la referenc
. se muestra
Para el análi
5 sobre las m
ecuencia de su
ama MEGA3
y Nei) bajo
pertenece es
as (similitud
estadístico a
én ventanas
d, construye
cuencias: la
litud previo)
niendo a la
a lo largo de
cia agrupada
un ejemplo
sis se utilizó
ismas dos
ubtipo B y
3 (Molecular
o el modelo
s
d
a
s
e
a
)
a
e
a
o
ó
r
o
evolu
réplic
II.14.
El an
http:/
analiz
“Tree
de 10
Los c
fuero
fusio
15 ho
largo
II.14.
El an
cabo
por c
se res
descr
II.14.
La es
(Univ
http:/
simul
mode
Swoff
árbol
reloj
gene
con 1
caden
in” de
utivo K2P, T/
cas de remue
5.2. Método
nálisis filoge
//www.zmuc
zar grandes
e Drift” y “Se
00 secuencia
iclos de T R
on almacena
nados con lo
oras y los a
era posible,
5.3. Método
álisis filogen
2 corridas in
corrida con u
sumieron en
ripto en la sig
6 Estimación
stimación de
versity of A
//beast.bio.e
laciones de
elo de subst
ford (Smiths
l inicial cons
molecular re
raciones par
10 millones
nas indepen
e 2 o 3 millo
/t: 2.0. Com
estreo.
o de Máxima
nético basa
c.dk/public/
conjuntos d
ectorial Searc
as de adició
Df SS fueron
ados para
os árboles ob
rboles resul
, al menos ba
o de Análisis
nético basad
ndependient
un periodo “b
n un árbol co
guiente secc
n del tiempo
e este parám
Auckland, A
ed.ac.uk]. E
Monte Carlo
titución nuc
sonian Instit
truido a par
elajado no c
ra optimizar
de generac
dientes de M
ones de gene
mo prueba e
a Parsimonia
do en este
phylogeny/T
de datos [21
ch” (T R Df S
n aleatoria (
n aplicados t
alimentar la
btenidos en
tantes fuero
ajo nuestras
s Bayesiano.
o en este m
tes con 4 u 8
burn in” de
onsenso de m
ción.
o al ancestro
metro se real
Auckland, N
El programa
o. Para este
cleotídica fue
tution, Wash
rtir del méto
correlacionad
los diferent
iones para
Markov, cada
eraciones se
45
estadística s
a.
método se
TNT). Este p
]. Utilizamos
SS) aplicado
(RAS) seguid
res veces a c
as rondas
cada RAS+TB
on fusionado
condiciones
método se re
8 cadenas de
2 millones. E
mayoría. Tam
o común más
izó con el p
ew Zealand
a utiliza un
análisis se a
e obtenido
hington DC,
odo bayesian
do Log Norm
tes operado
mejorar las
a una de 10
gún el caso.
e utilizó el
e realizo con
programa im
s una combi
sucesivame
do por “Tree
cada RAS+TB
subsiguiente
BR. Este esqu
os para veri
s experiment
ealizó con el
e acuerdo al
El conjunto d
mbién se utili
s cercano (TA
rograma BEA
d) y A. Ra
n análisis d
asignó el año
mediante e
USA); http
no de coales
mal. Se realiz
res. Entonce
optimizacio
millones de
La muestra
método de
n el progra
mplementa n
nación de “T
nte a los me
e Bisection R
BR. Los mejor
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uema fue re
ficar que ni
tales.
programa M
caso, y 10 m
de árboles d
zó el program
ACMC).
AUti/BEAST
mbaut (Un
de cadenas
o de muestr
l ModelTest
://paup.csit.
cencia “Skyl
zó una corrid
es nuevos an
nes. La corr
generacione
posterior fu
Bootstrappi
ma TNT (di
nuevas tecno
Tree Fusing”
ejores árbole
Reconection”
res árboles d
Df SS, es de
petido 10 ve
ngún mejor
Mr. Bayes. S
millones de g
e la muestra
ma BEAUti/B
v1.4.8 [A. J.
iversity of
de Markov
reo a cada s
t[88] y PAUP
.fsu.edu/]. S
line” bajo un
da inicial de
nálisis fuero
rida final co
es con un pe
ue analizada
ing con 500
sponible en
ologías para
”, “Ratchet”,
es obtenidos
” (RAS+TBR).
de cada ciclo
ecir, fueron
eces durante
amiento del
Se llevaron a
generaciones
a “posterior”
BEAST v1.4.8
Drummond
Edinburgh);
v mediante
secuencia. El
P4.0b1 [D.L.
Se utilizó un
n modelo de
1 millón de
n realizados
nsistió de 8
riodo “burn
mediante el
0
n
a
,
s
.
o
n
e
l
a
s
”
8
d
;
e
l
.
n
e
e
s
8
l
progr
Auck
con e
trans
los la
"):0;"
por "
una d
corrid
De e
arbol
mayo
II.15
II.15.
Este
cabo
prese
consi
conse
dond
esper
utiliza
Al mi
con u
con “
asoci
inflad
posit
proba
falsam
sea m
de ti
consi
rama Tracer
land, Auckla
el programa
sforman las s
rgos de ram
" por ");"; es
" nombrema
de las 8 sal
das con el co
sta manera
les (que cor
oría 50.
5. Análisis e
1. Análisis p
análisis fue
un análisis u
encia o ause
derando “po
enso del con
e al menos
rado menor
amos el valo
smo tiempo
una potencia
“backward e
aciones que
da con análi
ivos desarro
abilidad aju
mente la hip
mayor del 20
ipo Bonferro
deramos po
r v1.4.1 [A. R
and, New Ze
a Mr.Bayes s
salidas del B
a) y después
decir, sacar
triz.nex.runx
idas del BEA
omando MrB
MrBayes le
responden a
estadístico
para la identi
desarrollado
univariado de
encia de po
olimorfismo”
njunto de da
una de las
r a 4,5. Ento
or p obtenido
estimamos
a menor al 30
elimination”
e tuvieran u
isis de signif
ollado por
ustados. La
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0%) y tiene a
oni que con
otenciales m
Rambaut (U
ealand); http
siguiendo e
BEAST a form
s se edito co
rle el “:0”. En
x.t " donde “
AST. Entonce
Bayes> mcmc
ee las 8 salid
a las primer
o
ificación de
o basándono
e asociación
limorfismos
” a aquellos
atos. Previam
cuatro celd
onces llevam
o como filtro
la potencia d
0%. Luego d
considerand
n valor p m
ficancia múl
Benjamini
aproximació
(esto es, la t
algunas vent
ntrolan el ll
utaciones de
46
niversity of
p://beast.bio
l procedimie
mato Nexus (
nWord de m
ntonces se c
“runx” pued
es se ejecut
cp nruns=8,
das transfor
as 2 millone
potenciales
os en el desc
entre la pre
en cada un
residuos am
mente al aná
as de una t
mos a cabo
, eliminando
del análisis p
esarrollamo
do los alelo
menor a 0,05
tiple, el pro
y Hochberg
ón lineal c
asa de ident
tajas (incluye
amado “fam
e escape CTL
Edinburgh)
o.ed.ac.uk]; y
ento descrip
(esto se hace
manera de re
ambia el nom
de ser run1 o
ta la matriz
luego se eje
madas del B
es de genera
mutaciones
cripto por M
esencia o aus
na de las po
inoacídicos d
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abla de dos
un análisis
o aquellas as
para cada pa
s un análisis
os HLA como
5. Luego, pa
ocedimiento
g fue aplica
ontrola la
tificación de
endo mayor
mily wise er
L a aquellos
and A. J. Dr
y el consens
pto a contin
e con el pro
eemplazar al
mbre a cada
o run2 o run
en el MrBa
cuta el coma
BEAST, remu
aciones) y d
de escape C
Moore et al[1
sencia de los
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distintos al p
minaron aque
por dos tu
por la pru
ociaciones c
r bajo anális
multivariad
o regresores
ra controlar
de tasa de
ado para c
proporción
falsos positi
potencia) so
rror rate”. E
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rummond (U
so de mayor
nuación: Inic
grama PAUP
final de cad
a una de las
n3 hasta run
ayes, y se de
ando sumt b
ueve los pri
evuelve el c
CTL
17]. Primero
s distintos ale
alizadas en
presente en
ellos pares H
viera un nú
eba exacta
on un valor
is y eliminam
o por regres
s mantenien
r la tasa de
identificació
calcular los
esperada d
vos es esper
obre los pro
En el presen
mos que tuvi
University of
ría obtenido
cialmente se
P guardando
a árbol cada
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n8 para cada
eterminan 8
burnin=2000.
meros 2000
consenso de
, llevamos a
elos HLA y la
el gen gag,
la secuencia
HLA posición
mero real o
de Fisher y
mayor a 0,1.
mos aquellos
sión logística
ndo aquellas
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ón de falsos
valores de
de rechazar
rable que no
cedimientos
nte estudio,
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o
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8
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0
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,
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.
s
a
s
I
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r
o
s
,
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estad
la DM
II.16
Estas
evalu
fuero
estim
IFN
II.16.
Para
anális
según
a una
ml re
Millip
lavan
ello s
segun
PBS.
tanto
Newb
pépti
PMA/
luego
RPMI
dispe
react
de PM
se lav
diluci
previ
calculado el
dístico para l
MS (es decir,
6.Medición
s mediciones
uó en ensayo
on marcadas
mulación in vi
.
1. ELISPOT p
esta metod
sis. Todo el
n procedimie
a concentrac
ecostado 5 g
pore IP agre
ndo 3 veces
se diluye el a
ndo día se co
Luego se ag
o se prepara
bawer y se
idos se prep
/Ionomicina
o se la diluye
I completo 1
ensan 50µl d
tivos corresp
MA/Ionomic
van las placa
ión 1/250 d
amente filtr
estadístico
os mismos g
ahora la incó
n de los niv
s se realizar
os in vitro de
s con tetrám
itro con el p
para IFN .
dología se u
ensayo tien
ento detallad
ción final de 4
rados sobre
egando 50µl
con buffer P
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omienza con
regan 150µl
an las célula
las resuspe
paran en un
que se prep
e 1/100 hac
1% DMSO. Fi
e las corresp
pondientes, t
ina y control
as 3 veces co
de anticuerp
ado en poro
de Fisher,
grados de lib
ógnita es el “
veles de re
on mediante
e ELISPOT p
meros sintét
éptido espec
utilizaron pé
ne una dura
do anteriorm
4 millones p
la horizonta
l de etanol
PBS. Luego s
1/200 en PBS
n el “bloqueo
de medio R
s, lo péptid
nde en una
na concentra
para partiend
cia una soluc
nalizada la i
pondientes s
tanto péptid
l negativo. La
on una soluc
po de detec
o 0,22µM a f
48
se determi
bertad con lo
“1 ” del est
espuesta in
e tres meto
ara la libera
ticos para l
cífico seguid
éptidos sinté
ción de tres
mente. Se lav
ormililitro. S
al. En paralel
puro a cad
se realiza el
S y se dispe
o de la placa
RPMI comple
os y los con
concentrac
ación de 200
do de una so
ción final 2X
ncubación d
suspensione
os a evaluar
a placa así co
ción PBS 0,0
cción biotin
fin de remov
na el valor
os que fue o
tadístico).
nmune HIV
dologías dis
ción de IFN
os epítopes
a de una ma
éticos para
s días. El pri
van dos vece
Se incuban O
lo se realiza
a pocillo a
recubrimien
nsan 60µl po
a” removiend
eto 10%SFB y
ntroles: las c
ción de 4 m
0mM. Como
lución 200X
X. El control
e la placa, se
s celulares a
r (al menos e
onstituida se
05%Tween20
ilado (BD, c
ver impureza
p como la
btenido el v
V especifica
stintas: inicia
. Por otro
s reconocido
arcación por
los distinto
imer día se
s y resuspen
O.N. a 37ºC e
la activación
utilizar, vol
nto con antic
or pocillo y
do el anticue
y se incuba
células se la
illones de c
o controles
(PMA 1/100
negativo es
e descarta e
a las cuales s
en duplicado
e incuba O.N
0 y luego se
cat 51 1690
as presentes
probabilida
alor crítico p
a
almente la r
lado muestr
os y tambié
citometría d
os epítopes
descongelan
nden en med
en tubo tipo f
n de la placa
cándolo ráp
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se incuba O
erpo y lavand
1 hora a 37º
as cuenta en
células por m
se usa una
00, Ionomicin
una solució
l medio bloq
se les agrega
o) como con
. a 37ºC. En
dispensan 1
0KZ) en me
en el SFB. L
ad de dicho
para calcular
respuesta se
ras positivas
én mediante
de flujo para
virales bajo
n las células
dio completo
falcon de 15
a de ELISPOT
pidamente y
aptura. Para
.N. a 4ºC. El
do 1 vez con
ºC. Mientras
n cámara de
mililitro. Los
solución de
na 1/10) que
ón de medio
queante y se
a 50µl de los
trol positivo
el tercer día
00µl de una
dio 10%SFB
Las placas se
o
r
e
s
e
a
o
s
o
5
T
y
a
l
n
s
e
s
e
e
o
e
s
o
a
a
B
e
incub
0,05%
hora
veces
indica
revel
posit
lecto
aque
CMSP
II.16.
Para
estuv
expre
célula
comp
falcon
1,5m
pépti
medi
de an
15 m
a una
siguie
rema
antic
en os
muer
suave
vorte
prepa
aprop
volum
ban 2 horas
%Tween20. L
a temperatu
s con una s
aciones del
ado se deti
ivos. Las me
r de placas d
llas muestra
P luego de s
2. Estimulac
esta metod
vieran dispon
esan el HLA p
as según pro
pleto a una c
n de 15 ml r
ml se incuban
ido durante
o de cultivo
nticuerpo an
l recostado 5
a concentrac
ente se lava
anente del ú
uerpos apro
scuridad y lu
rto remanen
emente. Se
exeando entr
ara una sol
piada de an
men de soluc
s a temper
Luego se disp
ura ambiente
olución de
proveedor y
ene con ag
embranas se
de ELISpot Im
con un valo
er sustraído
ción in vitro /
dología se u
nibles. Cuan
para el cual
ocedimiento
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recostado 5 g
n 100.000 cé
1 hora a 37º
conteniend
ti CD49d. Est
5 grados sob
ción final de
an las célula
último lavado
piados y det
uego se lava
nte del últim
incuba 20 m
re cada lava
ución de m
nticuerpo es
ción posible.
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pensan 100µ
e. Luego se
PBS solo. Se
y utiliza com
ua corriente
e dejan seca
mmunospot S
or promedio
el promedio
/ análisis po
utilizaron lín
do no estuv
el péptido a
detallado a
ón final de 4
grados sobre
lulas B autól
ºC. Luego se
o 10% de su
ta suspensió
bre la horizo
10ug/ml y se
s 2 veces co
o. En un tot
tallados en la
an 2 veces co
mo lavado, se
minutos a 4
ado el volum
marcado con
specífico pa
. Se agrega l
49
iente y lue
µl de una dilu
lava 3 veces
e prepara el
mo revelado
e cuando se
ar a tempera
Series 3A An
de sus réplic
o de los nega
or citometría
neas de linf
vieran dispon
estudiar po
anteriorment
4 millones po
e la horizont
ogas en un m
lavan las lín
uero fetal bo
ón se incuba
ntal. Pasado
e incuba ent
on medio R
tal de 50µl
a sección “R
on medio RP
e agregan 10
ºC en oscur
men muerto
el buffer P
ara las citoq
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go se lavan
ución 1/800
s con una so
l sustrato A
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e observa p
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a de flujo.
ocitos B au
nibles, se uti
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te. Se lavan
or mililitro. S
tal. En el seg
medio conte
eas B y se le
ovino, 1ug/m
a 37ºC dura
o el tiempo d
re 5 y 6 hora
PMI, y se re
se marcan
Resultados”. S
PMI. Las cél
00µl del rea
ridad y se la
remante pa
Perm/Wash
quinas intra
e marcado a
n 3 veces
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lución PBS 0
EC (BD cat
do 75µl por
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nte O.N. y l
Analyzers). S
ltara mayor a
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ilizaron linfo
ión. El prime
dos veces y
Se incuban O
gundo día, en
niendo una c
e agregan 50
ml de anticue
nte 1 hora e
de incubación
as. Luego se
esuspenden
las molécula
Se incuba du
ulas se resu
ctivo Cytofix
ava 2 veces
ra asegurar
como solve
acelulares n
a cada tubo y
con una so
vidina HRP y
0,05%Tween2
t 551951) de
pocillo. La
ntensa de lo
uego se ana
e considerar
a 5 puntos c
aquellos ca
ocitos B hete
er día se desc
y resuspende
O.N. a 37ºC e
n un tubo ep
concentració
0.000 CMSP
erpo anti CD
en un tubo ti
n se agrega
incuba O.N.
en el volum
as de superf
urante 30 m
uspenden en
x/Cytoperm
son buffer
la homogen
ente y con
ecesarias en
y se incuban
olución PBS
y se incuba 1
20 y luego 2
e acuerdo a
reacción de
os controles
alizan en un
ron positivas
ada 100.000
asos en que
erólogos que
congelan las
en en medio
en tubo tipo
ppendorff de
ón 20µM del
s en 1 ml de
28 y 1ug/ml
po falcon de
Brefeldina A
a 4ºC. Al día
men muerto
ficie con los
inutos a 4ºC
el volumen
y se mezcla
Perm/Wash
neización. Se
la cantidad
n el menor
n 30 minutos
S
1
2
a
e
s
n
s
0
e
e
s
o
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e
l
e
l
e
A
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o
s
C
n
a
h
e
d
r
s
a 4ºC
medi
en 20
de flu
tubos
linfoc
estim
II.16.
II.16.
Día 1
antib
Día 2
agita
incub
400m
Día 3
medi
la mu
900µ
fuert
final
homo
como
almac
La su
pellet
homo
alred
La su
caso
react
C en oscurid
ante una su
00µl finales p
ujo BD FACS
s de 1,5 ml y
citos B y es
mulando las C
3. Marcació
3.1. Prepara
1: Se plaquea
biótico aprop
2: Se transfie
dor durante
bación se tra
ml de medio
3: Se enfría la
o ZYP 5052
uestra para u
µl de la sus
emente. Lue
de 500µl a
ogéneament
o último recu
cena a 20C
spensión ba
t bacteriano
ogeneización
edor de 60m
spensión se
de que el
tivos por sep
dad. Durante
ave agitació
para ser ana
SCanto Flow
y los lavado
stimulando c
CMSP con lín
n de CTLs pé
ación de los c
an bacterias
piado y se inc
ere 1 coloni
e 6 a 8 hora
ansfieren 150
ZYP 5052 y s
a suspensión
de la suspen
un subsecue
pensión bac
ego se agreg
la cual se le
te disuelto; e
urso sonicarl
para posteri
cteriana se c
se resuspen
n, proceso q
ml.
transfiere a
volumen fu
parado: 1,2m
e los 30 min
ón. Finalmen
alizadas en e
w Cytometer
s se realizar
con una sol
neas B no sen
éptido espec
cuerpos de i
BL21 transf
cuban O.N. a
ia de la plac
s o hasta ve
0µl de la sus
se incuba O.
n bacteriana
nsión utilizan
ente análisis
cteriana y e
an 200µl de
e agrega 1µl
en caso de ve
lo 2 a 3 minu
or análisis.
centrifuga 30
nde en 10 m
que puede d
un agitador
era menor.
ml de lysozim
50
nutos de inc
te se lavan
l equipo de
(BD Bioscie
ron con volú
lución de P
nsibilizadas.
cíficosmedia
inclusión
formadas y a
37ºC.
ca de agar a
er el medio
spensión bac
N. en agitad
a y se mide l
ndo como bl
de proteínas
el pellet se
agua y 250µ
de DTT. Fin
er ADN no h
utos con las
0 minutos a
l de Buffer d
emorar hast
magnético c
Mientras se
ma 50mg/ml,
cubación se
2 veces con
citometría. E
ences). Toda
menes de 1
MA/Ionomic
ante la técni
almacenadas
a 1ml de m
turbio pero
cteriana a un
or a 37ºC.
a absorvanc
lanco una m
s totales por
resuspende
µl de solució
nalmente se
omogeneiza
muestras en
4000xg y a 4
de resuspens
ta 30 minut
con barra de
e lo agita s
600µl de M
mezclan en
buffer Perm
El análisis se
as las marca
ml. El contro
cina. El cont
ica de tetrám
s en glicerol
edio P 0,5G
o no saturad
n erlenmeye
cia a 600nm
muestra del m
r SDS PAGE.
e en 50µl d
n 2x SDS SB
confirma qu
do se debe v
nfriadas en h
4ºC. Se deca
sión (con DT
os. El volum
e plástico y s
se agregan e
gCl2 1M, 3m
períodos de
m/Wash resu
e realiza en u
aciones se re
ol positivo s
trol negativo
meros
en placa LB
y se incuba
o. Pasado e
r de 1 litro c
de una diluc
medio. Luego
Para ello se
de agua y
para tener u
ue el ADN s
vortexear fu
hielo. El ADN
nta el sobre
TT fresco). Se
men final deb
e lleva a 60m
en goteo lo
ml de Dnasa
e 5 minutos
uspendiendo
un citómetro
ealizaron en
e realizó sin
o se realizó
B agar con el
a a 37ºC en
el tiempo de
conteniendo
ción 1:10 en
o se prepara
centrifugan
se vortexea
una solución
e encuentre
ertemente y
N disuelto se
nadante y el
e agita hasta
bería ser de
ml finales en
s siguientes
I 2mg/ml en
s
o
o
n
n
ó
l
n
e
o
n
a
n
a
n
e
y
e
l
a
e
n
s
n
glicer
mant
Esta
minu
a 2 m
buffe
visibl
resus
sobre
una s
mas
2720
se tra
calcu
Finalm
en ni
se co
1:150
II.16.
Día 1
agreg
pépti
(En g
utiliza
inclus
alícuo
se re
los co
remo
agita
y bajo
rol 50% con
tiene por uno
suspensión
tos a 27200x
ml de buffer
er de lavado.
emente lim
spende en b
enadante y e
solución de
volumen. De
0xg por 15 m
ansfiere a un
la la concent
mente se ali
trógeno líqu
orre un gel 1
0 o 1:200 en
3.2. Prepara
1: Se colocan
gan 400µl de
ido para el c
general se ut
arse tambié
sión cargand
otas de 250n
pite el mism
ontenidos d
olino formad
ción. La solu
o agitación c
teniendo 75
os 15 a 20m
se sonica po
xg por 10 mi
de lavado y
Se repiten l
pio, realizan
buffer de la
el pellet se re
Urea 8M pr
e esta mane
minutos a 4º
n tubo de 50
tración de pr
cuotan 250n
uido. Para co
10% o 12% S
SDS SB con
ación de los
n 200ml de
e PMSF 100
cual el tetrám
tilizan unos
n) y se agre
do una jerin
nmoles de cu
mo procedimi
e ambas jer
do en el buf
ción así prep
continua a 80
5mM NaCl, 1
minutos.
or 1,5 minut
inutos. Luego
se disocia c
os pasos de
ndo todo el
avado sin T
esuspende e
eparada en
era los cuerp
ºC y el sobre
0ml. A parti
roteínas mid
nMol (500nM
onfirmar la ef
SDS PAGE de
DTT de la so
monómeros
buffer de p
mM, 307,3m
mero se dese
12mg de pé
ega al buffe
ga con 2 a
uerpos de in
iento para 5
ringas (el de
ffer de pleg
parada se de
0 rpm.
51
1,2ml de Tri
tos con inter
o se descart
con una barr
sonicado, ce
procedimie
Triton X y s
en 500µl de a
el momento
pos de inclu
enadante con
r de una dil
diendo absor
Mol para B2m
ficiencia del
e la muestra
lución final d
s biotinilados
plegado en u
mg de glutat
ea sintetizar
éptido aunqu
er de plegad
3 ml de buf
nclusión prep
00nmoles de
e la cadena
gado que co
eja agitando
ton X 100 y
rvalos de 0,5
a el sobrena
ra de plástic
entrifugado y
ento a 4ºC.
se centrifug
agua bidesti
o, típicamen
usión se solu
nteniendo lo
ución 1:100
rvancia entre
m) en tubos d
proceso de
a inicial y de
de cuerpos d
s
una botella
ión reducido
r se disuelve
ue cantidade
do bajo agit
ffer de inyec
parados segú
e la cadena
pesada y el
ontiene el p
unos minuto
y 600µl de D
5 segundos.
dante y el p
o para luego
y lavado has
Cuando el
a igual que
lada. A esta
te 3 a 5 ml
ubilizan. La s
os cuerpos d
(2µl en 200
e 240nm y 32
de 1,5ml y se
purificación
e una dilució
de inclusión.
bajo agitació
o y 61,3mg
en la cantid
es tan bajas
tación. Se p
cción y luego
ún el protoco
liviana 2m.
de la caden
péptido acel
os mas y lueg
DTT 1M. La
Luego se ce
ellet se resu
o agregar ot
ta que se log
pellet se ve
e antes. Se
suspensión
aunque pue
solución se
e inclusión s
0µl final de U
20nm.
e congelan r
de cuerpos
ón de aproxi
ón magnétic
de glutatión
dad apropiad
como 1 a 2
reparan los
o agregando
olo anterior.
Finalmente,
na liviana) a
erando la v
go se incuba
agitación se
entrifuga 10
spende en 1
ros 30ml de
gre un pellet
e blanco, se
decanta el
se le agrega
ede requerir
centrifuga a
solubilizados
Urea 8M) se
rápidamente
de inclusión
madamente
ca. Luego se
n oxidado. El
da de DMSO
2mg pueden
cuerpos de
o una de las
. En paralelo
, se inyectan
al centro del
velocidad de
O.N. a 10ºC
e
0
1
e
t
e
l
a
r
a
s
e
e
n
e
e
l
O
n
e
s
o
n
l
e
C
Día 2
250n
anter
Pasad
y se i
Día 3
preci
hasta
Seph
luego
recup
100m
enzim
Día 4
tama
utiliza
Día 5
tubo
de H
1ml n
hace
320n
se co
Día 6
Se di
solam
se co
el tra
indica
corre
II.16.
: Como prim
moles de la
rior. Nuevam
das las horas
ncuba O.N. a
3: La reacció
pitado agreg
a tener men
adex PD 10
o 2,5ml de m
peran de la c
mM, 10µl de
ma BirA 2mg/
4: La reacción
ño en colum
ando un tub
: La solución
a menos de
PLC para rea
nuevamente
una dilución
m para calcu
ngelan rápid
6: Se realiza l
ivide en dos
mente buffer
rren en un g
atado con e
ador de qu
espondiente
3.3. Armado
mer paso se c
cadena pesa
mente se inc
s de agitació
a 10C con ag
ón de plegad
gado. Luego
os de 5ml d
G 25M (inic
muestra con
columna y lu
e leupeptina
/ml. Se mezc
n de biotinila
mnas S300. L
o falcon con
n concentrad
1ml, se extr
alizar la crom
en los mism
n 1:50 o 1:10
ular la conce
damente con
la prueba de
s tubos: a u
r a fin de util
gel SDS PAGE
streptavidin
ue el proce
al monómer
o de los tetrá
coloca la solu
ada se agreg
cuba a 10ºC
n se repite p
gitación.
do se centri
se coloca en
de solución.
cialmente se
ncentrada y
ego se llevan
1mg/ml, 10
cla suavemen
ación se filtr
Las fraccione
filtro incluid
da se resuspe
rae del tubo,
matografía d
mos tubos y s
00 de 1 o 2 µ
entración de
n nitrógeno l
e biotinilació
uno de ellos
izar como co
E (sin calenta
a correspon
dimiento fu
ro (31 a 36 kD
ámeros
52
ución de ple
ga a la solució
C y bajo agit
por tercera v
ifuga a 15 m
n un concent
Luego se re
pasan 25 m
finalmente 3
n a 10ml y se
0µl de pepst
nte por inve
a con jeringa
es de interés
do.
ende en Tris
, se lleva a 1
de intercamb
se lava 2 vece
µls de la solu
monómeros
íquido.
n diluyendo
s se le agre
ontrol. Se inc
ar ni agregar
ndientes a m
ue eficiente.
Da).
gado bajo ag
ón siguiendo
tación conti
vez el agrega
minutos a 2
trador por fil
ealiza el inte
ml de buffer
3,5ml de buf
e agregan: 10
tatina 1000x
rsión y se inc
a y se realiza
s se recolecta
20mM pH8,
0ml con Tris
bio aniónico.
es con buffer
ución final y
s. Se alicuota
una fracción
egan 10µl d
cuban por 30
r DTT al prep
monómeros,
. El control
gitador magn
o el mismo p
nua de 70º
ado de 250nm
5000xg a fin
tración y pre
ercambio de
de biotinilac
uffer de bioti
00µl de ATP
x, 20µl de P
cuba O.N. a t
a una croma
an y se conc
, se vuelve a
s 20mM pH 8
. El eluido se
r de almacen
se mide abs
a en fraccion
n de 3 a 5 µ
e estreptav
0 minutos a t
parado). La p
dímeros, tr
debe tene
nético y otra
procedimient
rpm entre 6
moles de cad
n de remov
esión de nitr
buffer en u
ción para eq
inilación). U
100mM, 40µ
PMSF 100mM
temperatura
tografía de e
centran a me
concentrar
8 y se carga e
e concentra
namiento. Fi
sorvancia ent
nes de 200ug
ls y se diluye
idina 1mg/m
temperatura
resencia de
ímeros y tet
er solament
a alícuota de
to que el día
6 y 8 horas.
dena pesada
er cualquier
rógeno a 4ºC
una columna
quilibrarlas y
nos 7 ml se
µl de biotina
M y 10µl de
a ambiente.
exclusión de
enos de 1ml
en el mismo
en el equipo
a menos de
nalmente se
tre 240nm y
g cada una y
e a 0,4ug/µl.
ml y al otro
a ambiente y
4 bandas en
trámeros es
te la banda
e
a
.
a
r
C
a
y
e
a
e
e
l
o
o
e
e
y
y
.
o
y
n
s
a
Finalm
y se
(16,5
otros
II.17
El mo
prese
detec
infecc
Dicho
trans
utiliza
la ep
prese
El mi
softw
micro
En es
negat
indivi
mues
proba
repite
pued
diagn
que r
la sim
los in
de ca
viral
SIDA
indivi
mente para
agrega por
µl cada 10m
s colores Alex
7. Desarroll
odelo de Ma
ente trabajo
cción de los
ción realizad
o modelo de
smisibilidad a
ación a pred
idemia de S
entan en el A
ismo consist
ware TreeAg
osimulacione
ste modelo l
tivos que a l
iduos ingres
streado de d
abilidades d
en en interv
e estar o no
nosticada. La
representan
mulación y en
ndividuos y a
arga viral. El
y determina
y muerte d
iduos puede
armar los te
goteo, lenta
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xa, Fluoresce
lo delmod
arkov para es
de tesis do
primeros ca
dos mediant
e Markov in
aunque en lo
dicciones en
SIDA. El mism
Anexo VII. A c
te en un mo
ePro Suite
es de Monte
a población
o largo de c
san al mode
distribucione
ependientes
valos que re
o infectado, y
a historia nat
los tres esta
n cada ciclo e
demás el est
conteo de
a las probabi
dependen d
n diagnostic
etrámeros se
amente y co
SAV APC, 31
ein, Pacific o
delo deMa
studiar la ep
ctoral y utili
asos de SIDA
e análisis fil
ncluye predi
o que respec
ausencia de
mo fue prev
continuación
odelo basad
2007 (TreeA
Carlo.
bajo estudio
ada corrida
elo con una
es obtenida
s del sexo, g
epresentan e
y si está infe
tural de la in
adíos clínico
el programa
tadío en el q
CD4 empiez
lidades de t
el conteo d
carse en el m
53
e utiliza estre
on agitación
1µl cada 10m
f Pacific Ora
arkov de la
pidemia del H
izado en est
A a fin de va
ogenético d
icciones que
ta a los obje
tratamiento
iamente vali
n se provee u
do en matric
Age Softwar
o es una coh
del modelo
a edad, sex
s de datos
grupo de rie
el tiempo en
ectado pued
nfección se m
os característ
registra los
que se encue
za a descend
ransición en
de CD4, carg
modelo a trav
eptavidina m
a fin de fav
minutos para
nge).
a epidemia
HIV en Argen
te trabajo pa
alidar las est
e las secuen
e involucran
etivos específ
o antirretrovi
idado con d
una descripc
ces de Mark
re, Inc) y lo
horte de ind
y en algún m
o, grupo de
epidemiológ
sgo y edad.
n meses. En
e estar diag
modeló como
ticos (asinto
valores de to
entran. Cuan
der según un
ntre estados.
ga viral, eda
vés de dos vía
marcada con
vorecer la fo
a SAV PE y 7
a del HIV 1
ntina fue des
ara estimar e
imaciones d
ncias obtenid
el tratamie
ficos de la pr
iral como era
atos reales y
ión breve de
kov tiempo d
os análisis so
ividuos hipo
momento de
e riesgo y c
gicos publica
El modelo o
n cada ciclo
nosticado o
o estadíos m
mático, sinto
odas las vari
ndo se infect
na función d
Las probab
ad actual y
as: mediante
el fluorocro
ormación de
7µl cada 10m
sarrollado en
el año mas
e los primer
das en la pre
ento antirre
resente tesis
a el caso al c
y dichas vali
e dicho mode
dependiente
on realizado
otéticos inicia
e su vida se i
conteo de C
ados y se i
opera con c
(o mes) cad
portar una
mutuamente
omático, SID
ables que ca
an se les asig
dependiente
ilidades de p
edad de in
e testeo volu
mo deseado
e tetrámeros
minutos para
n paralelo al
probable de
ros casos de
esente tesis.
troviral y la
s se limitó su
comienzo de
idaciones se
elo:
es. Utiliza el
os mediante
almente HIV
nfectan. Los
CD4 que es
nfectan con
ciclos que se
da individuo
infección no
excluyentes
DA). Durante
aracterizan a
gna un valor
de la carga
progresión a
fección. Los
untario o por
o
s
a
l
e
e
.
a
u
e
e
l
e
V
s
s
n
e
o
o
s
e
a
r
a
a
s
r
ident
de rie
Aires
Cuan
sentid
pacie
estad
supre
indivi
mode
frecu
mode
Las p
tificación por
esgo para el
) y conteo de
do se diagno
do, algoritm
entes y “dec
dos que rep
esora. Cuatro
iduo posee o
eló de man
encia de me
elo.
rincipales pr
r sintomatol
primero (se
e CD4 para e
ostican, los i
mos clínicos
cida” si inici
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o formas dist
o no respues
era que pu
edición de la
redicciones q
ogía con pro
egún curvas r
el segundo.
ndividuos pu
fueron inc
ar tratamien
l primer añ
tintas de res
stas discorda
uede ocurrir
carga viral y
que constituy
54
obabilidades
reales obten
ueden iniciar
luidos para
nto o no. La
ño de tratam
spuestas al tr
antes virológ
debido a t
y conteo de
yen en parte
que depend
nidas de cent
r tratamiento
que el mo
a historia d
miento, la t
ratamiento f
gica y/o inm
toxicidad o
CD4 fueron
e su validació
den de su ed
tros de teste
o o permane
odelo “lea”
e tratamien
terapia supr
fueron mode
unológica. L
ineficacia d
incluidas tam
ón se muestr
dad actual, s
eo voluntario
ecer no trata
los paráme
to fue mod
resora y la
eladas de acu
La falla al tra
de los trata
mbién como
ran en el Ane
sexo y grupo
o de Buenos
dos. En este
etros de los
elada como
terapia no
uerdo a si, el
atamiento se
mientos. La
o entradas al
exo VII.
o
s
e
s
o
l
e
a
l
III.RESULTADOS
III.1.
Para
etapa
almac
nitróg
recol
últim
El 63
años;
. Caracterís
el presente
as distintas.
cenar plasm
geno líquido
ectadas. La p
ma en octubre
Figura III.1. H
muestras
,5% de los p
; la distribuc
ísticas de la
estudio se to
En la prime
ma y células
o. En la Figur
primera mue
e de 2005.
Histograma de
s de la primer
c
pacientes er
ión de esta v
a població
omaron mue
era se toma
mononucle
a III.1. se mu
estra para la
e la frecuenci
a etapa. En ro
caracterizació
an hombres
variable se m
56
ón bajo est
estras de san
aron muestr
ares de san
uestra un his
primera eta
a de muestre
ojo se detallan
ón de los gene
y el restant
muestra en la
udio
ngre periféric
ras de 395 p
ngre periféri
stograma con
apa fue toma
o en los 3 año
n aquellos pac
es HLA A y HLA
te 36,5% mu
a figura III.2.
Figura III
pacientes
toma de m
ca de pacien
pacientes y
ca (CMSP) v
n el número
ada en el me
os que duró la
cientes donde
A B.
ujeres. La ed
.2. Histogram
s incluidos en
muestra
ntes HIV posi
se procesar
viables alma
de muestra
es de marzo
a recolección
e se realizó la
dad promedi
ma de edad
el estudio al
itivos en dos
ron a fin de
acenadas en
s mensuales
de 2003 y la
de
io fue de 35
de los 395
momento de
s
e
n
s
a
5
5
e
La se
pacie
Sobre
103 d
sobre
mues
de po
carga
El det
Anex
egunda etapa
entes enrolad
e el conjunto
de ellas. El h
e el histogra
stras adicion
oder extend
as virales, co
talle de las c
o II.
a consistió e
dos en la prim
o de primera
histograma d
ama de mu
ales tomada
er el período
nteos de CD
característica
en tomar un
mer etapa.
as muestras,
de muestras
estras total
as en el año 2
o de tiempo
D4 y alelos id
as de los pac
57
a segunda (y
, se realizó la
seleccionad
es. Dicha ca
2001 para las
o bajo anális
entificados e
cientes en la
y en algunos
a caracteriza
as se muest
aracterizació
s cuales se d
is. El detalle
en los genes
s segundas y
s casos una
ación de los
ra en rojo e
ón fue realiz
disponía de c
e de las edad
HLA A y B se
y terceras m
tercera) mu
loci A y B de
n la figura II
zada tambié
élulas almac
des, fecha d
e muestra e
muestras se r
uestra de los
el gen HLA a
II.1. anterior
én sobre 10
cenadas a fin
e muestreo,
n el Anexo I.
esume en el
s
a
r
0
n
,
.
l
III.2.
Como
meto
objet
de lo
preva
aunq
Figur
En el
mism
III.2.1
A par
ARN,
edició
dicha
figura
las se
obser
recom
. Identifica
o primer pa
odología des
tivo de busca
os genes HL
alencia de c
ue algunos
a III.3.).
Figura III.3. R
conjunto de
mo conjunto d
1. Los prime
rtir de una m
amplificació
ón de secue
as secuencia
a III.4. se mu
ecuencias ba
rva en la figu
mbinante AD
ación dem
aso para el
scripta en la
ar evidencia
LA I A y HLA
ada alelo en
alelos se en
Resultados de
e datos de H
de alelos.
ros análisis d
muestra de 1
ón por RT PC
ncias, un tot
s se realizó
uestran los re
ajo estudio c
ura, 35 de el
D.
utaciones
estudio de
a sección 14
de selección
A I B en las
n ambos gen
ncuentran so
caracterizació
la preval
LA para los g
de asociació
140µl de plas
CR del gen vi
tal de 1210 p
el análisis f
esultados de
con otras se
las fueron su
58
de escape
e la respue
4.1 de “mate
n mediada p
s 103 muest
nes que en
obrerreprese
ón de los alel
encia en la po
genes A y B n
ón estadística
sma de las m
iral gag y se
pares de bas
filogenético
el análisis de
cuencias ref
ubtipo B, 56
CTL
sta inmune
eriales y mé
or HLA sobre
tras seleccio
general es s
entados (A2
os de los gen
oblación gene
no se detecta
a
mismas 103 m
cuenciación.
ses del geno
para caracte
e similitud po
ferencia de d
fueron reco
a nivel po
étodos” de l
e el genoma
onadas arro
similar a la
4, A68, B39
es HLA A y HL
eral.
aron individu
muestras se
. Luego de re
ma viral fue
erizar genét
or el método
distintos sub
ombinantes B
oblacional, s
a presente
viral. La car
jó como re
de la poblac
9, B07, B40,
LA B compara
uos que com
realizó la ex
ealizar el alin
ron secuenc
icamente al
o de Neighbo
btipos del H
BF, una fue s
se utilizó la
tesis con el
racterización
sultado una
ción general
A31 y B62;
ados con
mpartieran el
xtracción del
neamiento y
iadas. Sobre
virus. En la
or Joining de
IV. Como se
subtipo C y 1
a
l
n
a
l
;
l
l
y
e
a
e
e
1
Luego
carac
polim
que p
linfoc
la efi
CD8)
infect
enco
en n
múlti
p cor
Figura III.4.
para el gen vi
de subtipo
muestras an
o, el alinea
cterización d
morfismos vir
previenen el
citos T citotó
ciencia de p
se espera
tados que p
ntramos un
uestra pobl
iples, 22 de l
regido meno
. Arbol filogen
iral gag sobre
B y las ramas
alizadas y los
amiento nuc
de los genes
rales. Brevem
l reconocimi
óxicos especí
procesamien
que estén
portan el ale
total de 75 p
ación (p<0,0
las 75 asocia
or a 0,0140)
nético constru
e el conjunto
verdes el clad
puntos en co
cleotídico fu
s HLA, fuero
mente, este a
iento de pép
íficos (ya sea
to por el inm
presentes
elo para el c
polimorfismo
05, regresió
aciones tenía
de acuerdo a
59
uido mediant
de muestras
do de recomb
lor rojo y verd
respectivam
ue traducido
on realizados
análisis se ba
ptidos virale
a reduciendo
munoproteo
en frecuenc
cual el pépti
os significativ
ón logística).
an un valor q
al método de
te el método d
analizadas. La
binantes BF. Lo
de representa
mente.
o a aminoá
s los análisi
asa en el hec
s en el cont
o la afinidad
osoma o el r
cias significa
do posee re
vamente aso
. Luego de
q menor a 0,2
e Benjamini
de distancia d
as ramas rojas
os puntos neg
an referencias
ácidos y, ju
s de asociac
cho de que l
exto de la m
del péptido
reconocimien
ativamente
estricción. A
ociados con
la correcció
2 (que se cor
y Hochberg
de Neighbor J
s representan
gros represent
s de los subtip
unto con lo
ción entre a
os polimorfi
molécula de
por la moléc
nto por el TC
mayores en
través de e
diferentes a
ón para com
rresponden c
(Tabla III.1.).
oining
n el clado
tan las
os B y F
os datos de
alelos HLA y
smos virales
HLA por los
cula de HLA,
CR en el LT
n individuos
este análisis,
lelos de HLA
mparaciones
con un valor
.
e
y
s
s
,
s
,
A
s
r
III.2.2
La po
HLA f
CTL m
descr
epíto
Predi
Epipr
III.2.3
Como
ser e
podrí
pued
filoge
HLA
polim
remo
confu
Mark
filoge
mues
corre
sopo
previ
enco
fuero
III.2.4
en Ar
Con
analiz
obten
fuero
de aq
2. Comparac
osición de las
fueron comp
mejor definid
riptos para e
opes no car
iction Server
red (Microso
3. Corrección
o se explicó
estadísticame
ían violar est
e ser resue
enéticas ayu
y polimorfi
morfismos [2
ovieron toda
undidores en
kov y análi
enéticas[19].
stra en la ta
ección filoge
rtadas por
amente def
ntradas tam
on considera
4. Análisis d
rgentina
el objetivo
zaron un co
nidas de ind
on clasificada
quellos polim
ción de lasm
s mutacione
paradas con
dos” [22] y s
el alelo bajo
racterizados
r, Center for
oft Research
n filogenétic
anteriormen
ente indepe
te supuesto
elto incorpor
dan a ident
smos virale
6]. Por lo ta
as las secue
n la inferenc
isis de Mo
. Los detalle
abla III.1., se
nética y sei
la correcció
finidos o pre
mbién dentro
das probable
e la prevale
de analizar
onjunto adic
dividuos rec
as de acuerd
morfismos id
mutaciones id
es que se enc
los datos de
e encontró q
o análisis. Po
previament
Biological Se
[24]).
ca de las asoc
nte en la int
ndientes de
básico de la
rando inform
tificar resulta
s debido a
nto, se aplic
encias recom
cia filogenét
onte Carlo a
es del resulta
e encontraro
s moderada
ón filogenéti
edichos. Ent
o de epítop
es falsos pos
encia de las m
la dinámic
cional de se
cientemente
do al subtipo
entificados c
60
dentificadas
contraron si
e epítopes co
que 6 de ello
or otro lado,
te pero pre
equence Ana
ciaciones en
troducción, l
bido a una
a mayoría de
mación filog
ados falsos
relaciones
caron estos p
mbinantes d
ica. Luego, a
a las 22 a
ado de este
on cuatro aso
amente sopo
ca se encon
re las 12 as
pes conocido
sitivos.
mutaciones
a de estas
ecuencias de
diagnostica
viral y al añ
como mutac
con los epít
gnificativam
onocidos de a
os se ubicab
, otras 3 mu
edichos por
alysis, Techn
ncontradas
os datos bio
historia filog
e los procedi
genética en
positivos en
evolutivas
procedimien
del análisis
aplicamos e
asociaciones
análisis se
ociaciones f
ortadas. La
ntraron al m
sociaciones n
os o predich
identificada
mutaciones
el gen viral
ados entre l
o de toma d
ciones de esc
topes conoci
ente asociad
acuerdo al “
ban dentro d
utaciones se
los program
nical Univers
ológicos de c
genética com
mientos esta
el análisis [
n análisis de
entre indivi
tos al prese
con el obje
l método ba
para corr
muestran e
uertemente
mayoría de
mismo tiem
no soportad
hos. Las res
as a lo largo
de escape
gag de 12
os años 198
de muestra y
cape CTL en
idos del HIV
das a los dis
“resumen de
de epítopes p
encontraro
mas NetMH
ity of Denma
comparación
mpartida y p
adísticos. Est
[25]. Estas c
asociación
iduos que p
nte estudio.
etivo de ev
ayesiano de
egir por c
n el Anexo
soportadas
las asociaci
po dentro d
das, dos de
stantes 10 a
de la epide
a nivel po
29 muestras
87 y 2006.
y se analizó l
tres interva
tintos alelos
los epítopes
previamente
n dentro de
HC 3.0 (CBS
ark [23]) y/o
n podrían no
por lo tanto
te problema
correcciones
entre alelos
portan esos
Primero, se
vitar efectos
Cadenas de
orrelaciones
III. Como se
luego de la
iones (7/10)
de epítopes
ellas fueron
asociaciones
emia del HIV
blacional se
s de plasma
Las mismas
a frecuencia
los distintos
s
s
e
e
S
o
o
o
a
s
s
s
e
s
e
s
e
a
)
s
n
s
V
e
a
s
a
s
de tie
B, 55
hecho
Tabla
HL
Corre
A0
B5
A1
A0
Corre
B0
A2
A1
A0
B4A2
Corre
A0
A0
Correfiloge
B4B4A0A0A3A3B0B4A0A2
E
H
p
a
c
e
e
e
N
U
e
empo. El aná
5 (21,8%) er
o de que en
III.1. Resume
Estado
LA Consenso
elaciones fuerte
03 K
57 T
11 A
03 E
elaciones mode
07 G
24 R
11 G
02 Q
40 T24 V
elaciones dentro
02 A
01 GAP/N
elaciones que noenética (probab49 K40 Q02 A01 L31 T31 N08 T49 E01 P24 T
En la tabla se
HLA asociado
polimorfismo
a 0,2 (en nu
clasificadas de
epítopes cono
en negrita el
epítopes con
NetMHC 3.0
University of
es posible calc
álisis filogené
an subtipo F
Sudamérica
en de las 22 m
o en la posición
o Polimorfis
emente soporta
Q R
N
K M T V
D G
radamente sop
S
K
S
H
AL I
o de epítopes c
V
S
o se encuentrables falsos posit
E Q A DK R NP S TI V MS
S T GV AD
T S Q IS
detallan las p
o, el residuo a
correspondie
estro conjun
e acuerdo al n
ocidos o predi
/los residuo/
ocidos según
(”NetMHC”, C
Denmark) y E
cular el valor
ético mostro
F y 103 (40,
las variante
mutaciones po
nPosicióen HXBsmo
adas como esca
P028
P242
P118
P055
portadas como
P357
P030
P357
P065
P081P046
conocidos o pre
P083
P125
an en epítopes ptives)D P012
P090P146P215P342P372P303P312P339P342
posiciones de
aminoacídico
ente. Todas la
to de datos
nivel de sopor
ichos. En rojo
/s de anclaje
n Los Álamos
CBS Predictio
pipred softwa
61
o que 93 (36
,9%) eran re
s del subtipo
otenciales de
ónB2 OR v
ape por la corre
21,0 <
54,7 0
10,5 0
4,8 0
escape por la
7 13,8 0
0 0,21 0
7 13,2 0
5 4,8 0
1 5,8 06 3,4 0
edichos pero no
3 0,13 0
5 NPC 0
predichos ni co
2 0,00 00 0,00 06 0,27 05 0,00 02 0,12 02 NPC 03 4,0 02 15,6 09 4,9 02 5,9 0
las mutacione
mas frecuent
s asociacione
equivalente
rte de la corre
se destacan
a la molecu
Best defined
on Server, Cen
ares (”Epipred
,9%) de las 2
ecombinante
o B co circula
escape CTL id
vacorrvalor p
ección filogené
< 10 7 0,0
0,0002 0,0
0,0018 0,0
0,0123 0,0
corrección filog
0,0050 0,0
0,0076 0,0
0,0070 0,0
0,0031 0,0
0,0084 0,00,0090 0,0
o soportados po
0,0043 0,0
0,0105 0,0
onocidos y tamp
0,0116 0,00,0104 0,00,0099 0,00,0105 0,00,0063 0,00,0099 0,00,0047 0,00,0119 0,00,0042 0,00,0110 0,0
es en la proteí
te encontrado
es mostradas e
a un valor p
ección filogen
las posiciones
ular HLA corre
d CTL/CD8+ E
nter for Biolo
d”,Microsoft
252 muestra
es BF, lo cua
an con varian
dentificadas p
alor pregido Se
ética
0006 RLR0013 TSTL0019 KTQ
0139
genética
0051 GP0070 KY0063 GVG
0025 IL
00760082
or la corrección
0038 SL
0114 NSS
poco soportada
0127010200950108005700890044013300320121
ína Gag refere
o en cada po
en la tabla tie
p de 0,0140).
ética y si se e
s donde el esc
espondiente.
Epitope Summ
ogical Sequen
Research) par
s pertenecía
al es consist
ntes recomb
por análisis es
Análisis de e
ecuencia
RPGGKKKKLQEQIGWFQQAAADK
PGHKARVLYKLKHIVWGGPGHKAR
GQLQPSL
n filogenética
LYNTVATL
SQVSQNY
as por la correc
encia de HXB2
sición (conse
enen un valor
. Las mutacio
ncontraban d
cape fue ident
Se utilizó la
mary y los pr
ce Analysis, T
ra predicción.
an al subtipo
tente con el
inantes BF
stadístico
epítopes
Antecedente
Conocido
Conocido
NetMHC
Conocido
Conocido
Conocido
Epipred/NetMHC
Conocido
Epipred/NetMHC
cción
2, el alelo
nso) y el
q menor
ones son
dentro de
tificado y
lista de
rogramas
Technical
NPC: No
o
l
en pr
forma
recom
103 r
un co
efect
analiz
consi
segm
la fig
tenid
Muta
en e
respe
el ca
revalencia si
as recombin
mbinación, lo
recombinant
orto segment
os confundi
zables, elimi
deramos a
mento B 5’ y c
gura III.5., en
o un rango v
Figura II
mutaciones d
subtipo viral (
identificadas
posición P30
el tiempo. E
aciones como
el tiempo (
ectivamente,
aso de la m
milar. Una m
nantes entre
o cual nos pe
tes, 68 (66%)
to de subtip
idores por
inamos aque
las restante
como F para
ncontramos
variable de c
I.5. Tendencia
de escape CTL
(Subtipo F en
s por asociacio
para el subtip
En particular, a
negativos, lín
o aquellas u
p<0,05; Chi
, mientras qu
mayoría o do
muestra corr
los subtipos
ermitió clasi
) de ellas co
o B de 200 p
recombinaci
ellas secuen
s recombina
aquellas mu
que los pol
comportamie
as en el tiemp
L por análisis
el panel izqui
ones negativa
po F, las tende
aquellos que a
neas negras)m
bicadas en l
i cuadrado
ue otras mut
ominando u
62
respondía a
s B y F, la m
ficarlas de a
mpartían el
pares de bas
ión y preve
cias que no
antes BF com
utaciones ub
imorfismos
entos.
po de los poli
estadístico. L
erdo, subtipo
s (negro) o po
encias fueron
actualmente s
muestran los m
las posicione
para tende
taciones se h
no de los d
subtipo C. A
mayoría de e
cuerdo a la
mismo patró
es en el 5’ d
nir al mism
poseían un
mo B para a
icadas en el
identificado
morfismos id
Las mutacione
o B en el pane
ositivas (en az
hacia un incr
son el estado
mayores incre
es 30 y 83 h
ncias) en e
han manteni
dos subtipos
A pesar de la
llas compart
estructura d
ón de recom
e la región. C
mo tiempo l
n estructura
aquellas mut
segmento F
os como mut
dentificados co
es fueron clasi
l derecho), y d
ul). Excepto p
remento o per
más común (
ementos en el
an incremen
el subtipo
ido a una ba
s virales B
a elevada pre
tían el mism
e recombina
mbinación co
Con el objeti
a perdida d
recombinan
taciones ubi
3’. Como se
taciones de
omo potencia
ificadas de ac
de acuerdo a s
para la mutaci
rmanencia est
identificados
tiempo.
ntado signific
B y en el
aja prevalenc
o F. Interes
evalencia de
o patrón de
ación. De las
nsistente en
ivo de evitar
de muestras
nte común y
icadas en el
e muestra en
escape han
ales
uerdo al
si fueron
ón en la
table en
por OR
cativamente
subtipo F,
cia como fue
santemente,
e
e
s
n
r
s
y
l
n
n
e
,
e
,
muta
para
preva
domi
nuest
a trav
para
III.2.5
Luego
utiliza
de lo
presi
(p=0,
mues
alelo
III.2.6
Luego
sufici
virale
aciones en la
el subtipo
alencia en e
nando el su
tro conjunto
vés de asocia
esa posición
5. Análisis de
o, analizamo
ando un mé
s 399 sitios
ón selectiva
027) y 125 (
stra en la Fig
A02 parece
Figura III.6. R
detalla el p
6. Identificac
o nos plant
ientemente f
es, entonces
s posiciones
B y F resp
l subtipo op
btipo F y au
o de datos (p
aciones nega
n.
e substitucio
os las tasas
todo de Max
analizados e
positiva (val
(p=0,007) pr
gura III.6. la
ser una regi
Resultados de
pico correspon
ción de otras
teamos la
fuerte para i
la propagac
s 30 y 83 par
pectivament
puesto. Lo m
mentando e
=0,211). De
ativas (OR<1
ones sinónim
de substitu
ximum Likel
estaban sujet
lor p <0,05).
eviamente id
a región corr
ón “caliente
el análisis de i
ndiente a la po
res
smutacione
hipótesis de
inducir un ca
ción y acumu
63
recen haber
te mientras
mismo se ha
en el subtipo
hecho, estas
) debido a q
mas y no sinó
ución sitio e
ihood [89,90
tos a presión
Dentro del
dentificadas
respondiente
” de selecció
identificación
osición P125 y
tricción para
es cuya preva
e que si la
ambio en el
ulación de m
alcanzado u
que se ha
encontrado
o B, aunque
s tres mutac
ue el escape
ónimas
specíficas si
0]: Mediante
n selectiva si
último grupo
por asociac
e al epítope
ón positiva.
n de sitios bajo
y la región cor
el alelo A02
alencia camb
a selección
estado de di
utaciones qu
na elevada p
an mantenid
o para el esc
no estadístic
iones de esc
e es actualm
inónimas (dS
e este anális
ignificativam
o estaban inc
iones negati
e SLYNTVATL
o presión de s
rrespondiente
bió significat
mediada p
iferentes pos
ue no afecta
prevalencia e
do siempre
cape en la p
camente sig
cape fueron e
ente el estad
S) y no sinó
is encontram
mente negati
cluidas las p
ivas. De hec
L con restric
selección pos
e al epítope SL
tivamente e
or HLA es
siciones de l
n el fitness v
en el tiempo
en elevada
osición 125,
nificativo en
encontradas
do consenso
ónimas (dN)
mos que 194
va y 24 bajo
osiciones 84
ho, como se
ción para el
itiva. Se
L9 con
n el tiempo
una fuerza
as proteínas
viral tienden
o
a
,
n
s
o
)
4
o
4
e
l
a
s
n
a red
preva
a una
basad
acum
regió
tiemp
llevam
de 39
B o F
Nuev
epíto
que
nuest
alelos
posic
0,071
obser
III.2.7
escap
Clasif
para
a tra
realiz
El fac
mues
conti
un su
negat
El tam
P28,
ducir la fue
alencia de m
a pérdida de
das en asoc
mulado en ot
n viral bajo
po. Primero,
mos a cabo u
99 posiciones
(p<0,05; tab
ve de ellas s
opes predich
alteren la a
tros datos p
s HLA: dos d
ciones 30 y 8
16 para aso
rvados para
7. Análisis e
pe
ficando las m
aquellas mu
vés de asoc
zó un análisis
ctor dentro
stras: 1987
nuación: (1)
ubtipo viral
tivas que no
maño muest
P46, P55, P6
rza de la as
utaciones de
potencia est
ciaciones est
ras posicione
estudio bus
clasificamos
un análisis b
s han increm
bla III.2.).
se encontrab
os. De acuer
afinidad por
poseen sufic
e ellas había
83, Tabla III.1
ciaciones co
aquellas mu
estadístico g
mutaciones p
taciones que
ciaciones po
s con el Mod
de sujetos f
1997, 1998
Asociacione
(aquellas co
dominan un
tral para cad
65, P81, P118
sociación; e
e escape en
tadística [29
tadísticas. C
es podrían h
scando otros
s las muestr
asado en Ch
mentado sign
ban dentro
rdo a progra
la molécul
ciente poten
an sido ident
1.) y la muta
on HLA A02.
taciones ide
global de las
por OR es po
e alcanzan as
sitivas. Para
delo Lineal G
fue el año d
2002 y 20
es positivas (
on OR<1 y el
n subtipo vir
a nivel fue 1
8, P242 y P37
64
es decir que
individuos q
]. Por lo tant
Con el objet
aber sido de
s polimorfism
as de acuerd
hi Cuadrado p
nificativamen
de epítopes
amas de pred
a de HLA. P
ncia estadíst
tificadas com
ación en la p
Nuevamen
ntificadas po
s tendencias
osible observ
sociaciones n
a evaluar es
eneral de M
de muestreo
003 2006. El
aquellas con
l subtipo en
al (aquellas
18, 4 y 4, res
75; nivel 2: e
e la transmi
ue no portan
to, no podrá
ivo de dete
eterminados
mos que han
do al año de
para tenden
nte en el tiem
s CTL conoci
dicción de e
Particularme
tica, encontr
mo potenciale
osición 84 te
te, los may
or asociacion
s en el tiem
var los difere
negativas co
tadísticamen
edidas Repe
con 3 nive
factor ent
n OR>1), (2) a
el cual siem
con OR<1 y
spectivamen
escape en las
sión sin rev
n el alelo HL
n ser identif
erminar si lo
por selecció
n cambiado
muestreo y
cia. Encontra
mpo en al me
idos y las re
pítopes, nue
ente, en las
ramos evide
es mutacion
enían un OR
ores cambio
nes negativa
mpo de las m
entes compo
omparadas co
nte las tend
tidas.
les según el
tre sujetos f
asociaciones
mpre domina
en el subtipo
te (nivel 1: e
s posiciones
versión incre
A selectivo c
icadas porm
os cambios
ón inmune, a
significativam
y al subtipo v
amos que 12
enos uno de
estantes tre
eve de ellos
tres posici
encia de aso
es de escape
R de 0,34 y u
os en el tie
s (Figura III.7
mutaciones
rtamientos e
on aquellas i
dencias en e
l año de rec
fue como s
s negativas q
aron) y (3) a
o viral que n
escape en la
P030, P084 y
ementará la
conduciendo
metodologías
que se han
nalizamos la
mente en el
viral, y luego
2 de un total
los subtipos
s dentro de
es probable
ones donde
ociación con
e CTL (en las
n valor p de
mpo fueron
7.)
asociadas a
en el tiempo
dentificadas
el tiempo se
colección de
se detalla a
que dominan
asociaciones
o dominan).
s posiciones
y P125 en
a
o
s
n
a
l
o
l
s
e
e
e
n
s
e
n
a
o
s
e
e
a
n
s
.
s
Tabla
tiemp
Pos
H
Dentro
P
P
P
P
P
P
P
P
P
Dentro
P
P
P
S
r
p
c
III.2. Resum
po durante los
siciónen
HXB2
Valo
Subtip
o de epítopes c
P030 0,03
P076 0,02
P083 0,90
P084 0,01
P095 0,08
P215 0,03
P218 0,04
P223 0,12
P280 0,60
o de epítopes p
P090 0,61
P054 0,55
P138 0,62
Se muestran
resaltado en r
de anclaje a
posiciones. (1)
casos se obse
men de los 12
s últimos 20 a
or p de tendenc
po B Subtip
conocidos
38 0,106
29 0,030
04 0,031
12 0,730
88 0,040
31 0,930
47 0,770
23 0,009
01 0,020
predichos
14 0,028
55 0,009
28 0,040
las secuencias
ojo el residuo
la molécula H
) En estos cas
rvó un increm
conse
2 polimorfism
años de epide
cia Es
o F Cons
6
0
1 A
0
0
0
0
9
0
8
9
0
s aminoacídic
o que cambia.
HLA. También
os no se dispo
mento significa
enso como gru
65
mos que han
emia
stados de la po
senso Polim
R
R
A
V
K
L
V
I
V
Q K
S A P
LA F H
as de los epíto
Aumentado d
se muestran
onía de inform
ativo en el tiem
upo. NPC: no
cambiado si
sición Selocmorfismo
K
K
KYG
GG
K
R
RSL
E
VSLR
RS
SL
TR
RS
T
RIE
VEE
A
A
AEH
HP
VH
HP
TRMV
VRM
R (2)
A
AV
CV
P T (2)ETA
I M P V(2) N
opes conocido
de tamaño se
los resultado
mación acerca
mpo de todos
es posible cal
ignificativame
ecuencia deos epítopesconocidos
KW9 A24:
YKLKHIVWGK9 B08:
GKKKYKLKRY11 A30:
LYNTVAVLYEV9 B08:
LRSLYNTVSL9 A02:
LYNTVATLRY11 A30:
LYNTVATLYSL9 A02:
LYNTVATLRY11 A30:
LYNTVATLYTI9 A11:
LYCVHQRIIL10 B40:
EIKDTKEALEL9 B40:
EAAEWDRLAV9 B40:
EWDRLHPVHA9 B07:
PVHAGPIAHA9 B07:
PVHAGPIARI8 B52:MYSPTSI (1)VI9 Cw18:MYSPVSI (1)
AK9 A11:
VLYCVHQKCK9 A03:
VHKKIEVKEI9 B68:AEGCRQI (1)NL8 A24:
NYPIVQNL
os alrededor d
muestra en c
s del análisis e
de residuos d
s los residuos
lcular el valor
ente su preva
Dentro de
OR Poten
0,23 0,8
NC 0,4
1,70 0,0
1,25 0,0
0,10 0,9
NC <0,0
0,34 0,7
1,79 0,1
2,83 0,3
0,82 0,1
0,42 0,1
2,84 0,2
NPC 0,0
1,55 0,1
2,61 0,1
NPC NP
de estas muta
cada epítope e
estadístico pa
de anclaje. (2)
alternativos a
.
alencia en el
el estudio
ncia Valor p
3 0,0055
2
8
5
4 0,0008
01
7 0,0716
3
0
5
5
9
3
3
1
C
aciones y
el residuo
ara esas
) En estos
al residuo
l
subti
P083
Box y
prueb
evalu
0,117
signif
ANOV
p= 0,
En el
secció
un m
utiliza
obser
tres g
Figura II
mutaciones
puntos en e
subtipo viral (
identific
posic
significativam
el tiempo (Ch
el subtipo
po B y P083
en subtipo B
y demostró c
ba de Mauch
uado con la
7; p= 0,890
ficativa (F4; 42
VA de 1 facto
264 para el n
Anexo IV se
ón “materia
mejor estimad
arlo en la es
rva una asoc
grupos, como
I.7. Tendencia
de escape CT
el tiempo de l
(Subtipo F en
adas por asoc
ciones P30 y P
mente asociad
hi cuadrado pa
o B, las tende
3 en subtipo
B). El supues
cumplirse (F1
hly y tambié
prueba de L
para T2/F2;
2 =13.892; p
or para los n
nivel 1, F2; 9 =
e detalla la s
les y método
dor de la va
stimación de
ciación signi
o se observa
as en el tiemp
TL por el análi
a prevalencia
el panel izqui
ciaciones nega
P83 se repiten
das a un alelo
ara tendencia
ncias fueron h
F y nivel 3:
sto de iguald
12; 285.5 = 1,48
én fue confir
Levene y tam
21 = 0,002;
<0,001), por
niveles entre
= 1,031 p = 0
salida del pr
os” el cuadra
arianza del e
e los estadíst
ficativa entr
a en la tabla I
66
po de los poli
isis de tenden
estimada. Las
erdo, subtipo
ativas (negro)
n como en la F
HLA (q<0,2) y
as, p<0,05). Ex
hacia un incre
escape en la
dad de matric
89; p =0,127)
rmado (p =0
mbién confi
p= 0,998 pa
r lo tanto se
sujetos. Los
0,395 para el
rograma par
ado medio d
error aún pa
ticos F resul
re la prevale
III.3.
morfismos id
ncia. Se muest
s mutaciones
o B en el pane
o positivas (e
Figura III.5. de
y también se e
xcepto para la
emento o perm
as posicione
ces de covar
), el supuest
0,112), el sup
rmado (F2; 2
ara T3). La
realizó un a
s resultados
nivel 2 and
ra el present
del error en
ra el análisis
ta más apro
encia del est
dentificados co
tran las líneas
fueron clasifi
l derecho), y d
en azul). Las m
bido a que se
encontró un ca
mutación en
manencia esta
es P030, P08
rianza fue ev
o de esferici
puesto de ig
1 = 1,024; p
interacción
análisis de ef
para cada gr
F2; 9= 4,193 p
te análisis. C
el Análisis d
s de efectos
opiado. Toma
ado de esca
omo potencia
s de tendencia
cadas de acue
de acuerdo a s
mutaciones en
encontraban
ambio signific
la posición P2
able en el tiem
84 y P125 en
valuado con l
idad fue eva
ualdad de v
= 0,376 par
entre factor
fectos simple
rupo fueron
p = 0,052 pa
Como se men
de Medidas R
s simples y p
ando en cue
ape y el tiem
ales
a para 3
erdo al
si fueron
n las
cativo en
215 para
mpo.
n subtipo F y
la prueba de
luado con la
arianzas fue
a T1/F2; 21 =
res fijos fue
es mediante
F2; 45 = 1,372
ra el nivel 3.
nciona en la
Repetidas es
por lo tanto,
enta esto, se
mpo para los
y
e
a
e
=
e
e
2
.
a
s
,
e
s
A
A
Si bie
contr
tende
Como
signif
signif
entre
ident
de 19
1990
signif
Los r
aume
frecu
los a
posic
preva
Cons
dos s
Tabla II
Fuente deVariación
ANÁLISIS DE M
Entre sujeto
A
B en A
Dentro suje
C
A x C
C x (B en
ANALISIS DE EF
Nivel 1: Aso
Entre
Error
Nivel 2: asosiempre dom
Entre
Error
Nivel 3: Asoque no dom
Entre
Error
en el análisis
rastes demu
encia en el t
o se observ
ficativament
ficativa. Las
e los tiemp
tificadas con
980s y comi
, y luego sos
ficativament
esultados de
entando sign
entes en la
lelos A02 (a
ción 125) y A
alentes en nu
iderando qu
subtipos vira
II.3. Resumen
Scu
EDIDAS REPETI
os
5
1
etos
1
n A) 1
FECTOS SIMPLE
ociaciones posi
1
ociaciones negaminaron)
1
ociaciones negaminan)
1
1
s estadístico
estra que so
tiempo, y ad
va en la tab
e del tiempo
mutaciones
os 1 y 2 y
ORs negativ
ienzos de lo
stuvieron su
e.
escriptos se
nificativamen
población. D
asociado con
A24 (asociado
uestra pobla
e varias mut
les mientras
n del análisis e
uma deuadrados
IDAS
54986,6
13930,5
720,2
1749,6
1301,5
S
tivas (aquellas
743,2
1301,5
ativas que dom
265,5
1301,5
ativas que no d
1758,4
1301,5
demuestra
olamente las
emás es el q
bla III.4., las
o 1 al 2 y lue
s que domin
y luego dis
vos y que se
os 1990s aum
tendencia ha
muestran re
nte en el ti
De acuerdo
n escape en
o con escape
ción.
taciones que
s que domina
67
estadístico de
Grados delibertad
2
21
2
4
42
con OR>1)
2
42
minan un subtip
2
42
dominan un sub
2
42
una asociaci
s mutacione
que posee la
s mutacione
ego aumenta
nan subtipos
sminuyen au
encontraba
mentaron si
acia comienz
esumidos en
empo se en
a datos inde
n las posicio
e en la posic
e han aumen
aban el otro
e medidas rep
CuadradoMedio
27493,3
663,4
360,1
437,4
31,0
371,6
31,0
po viral (aquella
132,8
31,0
btipo viral (aqu
879,2
31,0
ón significat
es pertenecie
as diferencia
es identifica
an entre los
s virales (niv
unque no s
n en baja pr
gnificativam
zos y mediad
n la figura III
ncuentran as
ependientes
nes 83 y 84
ión 30) se en
ntado en el t
subtipo vira
petidas y de e
oEstadíst
41,4
11,6
14,
11,9
as con OR<1 y e
4,3
uellas con OR<1
28,4
tiva en los tr
entes al terc
s con mayor
das por OR
tiempos 2 y
vel 2) aume
significativam
revalencia ha
ente hacia f
dos de la déc
.8. Las muta
sociadas con
(http://www
4), A01 (aso
ncuentran en
tiempo, lo h
al como se m
fectos simple
tico F V
4 <
6 <
1 0
9 <
el subtipo en el
3 0
1 y en el subtipo
4 <
res grupos, e
cer grupo m
r significanci
Rs positivos
y 3, aunque n
entan signific
mente. Las
acia finales d
finales de la
cada de 2000
aciones que
n alelos HLA
w.allelefrequ
ciado con e
ntre los cinco
han hecho en
mencionó ant
es.
Valor p
< 10 7
< 10 4
0,0026
< 10 4
l cual
0,0203
o viral
< 10 7
el análisis de
uestran una
a del grupo.
disminuyen
no en forma
cativamente
mutaciones
de la década
a década de
0 aunque no
se han visto
A altamente
uencies.net),
escape en la
o alelos mas
n uno de los
teriormente,
e
a
.
n
a
e
s
a
e
o
o
e
,
a
s
s
,
es po
hacia
de pr
la Fig
Tabla
escap
F
d
v
osible que lo
a variantes m
revalencia en
gura III.9.
III.4. Detalle
pe entre los di
Tiempcompara
Nivel 1
1
1
2
Nivel 2
1
1
2
Nivel 3
1
1
2
Figura III.8. Fr
secuencias qu
datos previos
de las mutaci
viral (línea ver
s subtipos v
mejor adapta
n ambos sub
del análisis d
istintos tiemp
osados
Difero
2
3
3
2
3
3
2
3
3
recuencia med
ue poseen mu
disponibles p
ones tuvo qué
rde) y las resta
irales B y F e
adas a la res
btipos para la
de contrastes
pos.
rencia mediaobservada
9,4
6,5
2,9
11,4
7,1
4,3
22,5
28,0
5,5
dia de lasmut
utaciones de e
para saber que
é hacerse a po
antes de acue
azu
68
estén conver
puesta inmu
as posicione
para la comp
Errorestándar
1,9681526
1,9681526
1,9681526
3,9363053
3,9363053
3,9363053
3,9363053
3,9363053
3,9363053
taciones de e
escape se rep
e mutaciones
osteriori: aque
erdo a si fuero
l) o positivas
rgiendo, al m
une poblacio
es P030, P08
paración de a
r DMS
69 5,0
69 5,0
69 5,0
37 10,0
37 10,0
37 10,0
37 10,0
37 10,0
37 10,0
escape a lo lar
resentan en e
podrían domi
ellas que se e
on identificada
(línea roja).
menos en su
onal como lo
3, P084 y P1
pares de prev
Estadíde FiS
11,
5,5
1,0
4,1
1,6
0,5
16,
25,
0,9
rgo del tiempo
el eje vertical.
inar el subtipo
ncontraron do
as por asociac
secuencia a
sugieren las
125 como se
valencia de m
ísticosher Va
42 < 0
50 0
07 0
19 0
65 0
58 0
34 <
25 <
97 0
o. El porcenta
Debido a que
o B o F, la clas
ominando un
ciones negativ
aminoacídica
s tendencias
muestra en
mutaciones de
alor p
0,001
,008
,352
,022
,204
,563
10 5
10 7
,388
aje de las
e no hay
sificación
subtipo
vas (línea
a
s
n
e
F
n
c
e
igura III.9. Te
negativas en lo
consenso, inde
en el tiempo m
virales B o F
subtipos v
ndencia en el
os subtipos vi
ependientem
muestra que e
F. Esto significa
irales hacia va
l tiempo de la
irales B y F. La
ente del subt
en años temp
a que se han a
ariantes proba
69
asmutaciones
as cuatro mut
ipo viral. Sin e
ranos de la ep
acumulado en
ablemente má
hospedad
s de escape id
taciones ident
embargo, el an
pidemia domi
n el tiempo y h
ás capaces de
dor.
dentificadasm
tificadas son a
nálisis de su p
naban solo un
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e evadir la resp
mediante asoc
actualmente e
prevalencia ha
no de los dos
una convergen
puesta inmun
ciaciones
el residuo
acia atrás
subtipos
ncia de
e del
III.3.
Los e
toma
mant
razón
nitróg
En to
mues
total
utiliza
secció
fue re
se les
Fig
En el
pacie
sangr
III.11
. Estudio d
estudios de r
adas de los p
tuvieron bue
n de esto fu
geno y todas
otal se reco
stra en la fig
de 49 segun
ada para rea
ón 2 de resu
ecolectada e
s realizó ade
gura III.10. Fr
conjunto de
entes que ini
re. El conteo
.).
de la respue
respuesta in
pacientes ba
enos niveles
ue principalm
s las primera
lectaron 49
gura III.10. el
ndas muestra
alizar el análi
ultados. Los
en el período
más la carac
ecuencia de r
e segundas m
ciaron trata
o de CD4 pe
esta inmun
mune se rea
ajo estudio.
de viabilida
mente que
as muestras s
segundas m
l tiempo pro
as, 29 de ella
sis de asocia
restante 20
o de tiempo
cterización de
recolección de
muestras, las
miento, el 4
ermaneció s
70
ne HIV esp
alizaron sobr
Esto se deb
d luego de u
en un mom
se desconge
muestras y 1
omedio entre
as correspon
ación entre p
muestras c
detallado en
e los alelos d
e primeras, se
s cargas vira
5% de ellos
similar al de
pecífica en
re el conjunt
bió a que el
un promedio
mento el tan
laron.
10 terceras
e primera y s
nden a otros
polimorfismo
orresponden
n la sección 1
de los genes
egundas y ter
les mostraro
no presenta
los medido
la poblaci
to de segun
conjunto de
o de 3 años
nque de alm
muestras (V
segunda mu
pacientes cu
os virales y a
n a paciente
1 de resultad
HLA A y HLA
rcerasmuestr
on una redu
aban niveles
os en las pri
ión bajo es
das y tercer
e primeras m
de almacen
macenamient
Ver Anexo I
estra fue de
uya primera
lelos HLA de
s cuya prim
dos y por lo t
A B.
ras a lo largo d
cción signific
detectables
meras mues
studio
ras muestras
muestras no
namiento. La
to perdió el
I). Como se
e 3 años. Del
muestra fue
scripto en la
era muestra
tanto a ellos
del tiempo
cativa en los
del virus en
stras (Figura
s
o
a
l
e
l
e
a
a
s
s
n
a
III.3.1
Sobre
flujo
CD3+
repet
estos
en la
de ca
de ac
ANOV
nivele
varia
trans
comp
facto
(F2,46=
celula
depe
para
con
Figura III.11.
1. Evaluación
e el conjunt
de los niv
+/CD8+ que
tido para la
s ensayos. El
figura III.13
arga viral me
ctivación y lo
VA consider
es). Los resu
nza (p=0,00
sformación d
probó el sup
res fijos pa
=0,437; p=0,
ar CD8 com
ndiente de
el factor de
cargas vira
. Valoresmed
n del estado
o de segund
veles genera
expresan lo
población CD
detalle de lo
se resumen
edidos en pla
os valores de
ando como
ultados prelim
7; Prueba d
del logaritm
uesto antes
ra la variab
649) y sí det
mparado co
los niveles d
carga viral d
les mayore
didos de Carga
segun
o de activació
das muestra
ales de act
os marcadore
D3+/CD4+. E
os valores m
los resultad
asma. Como
e carga viral.
factores fij
minares indi
de Levene).
o natural no
mencionado
ble transform
tectó una m
on el tipo
de carga vir
demostró qu
s a 1000
71
a Viral y conte
dasmuestras
ón inmune g
s se realizó
tivación cito
es CD38 y H
En la figura I
edidos de ac
os obtenido
o se observa
Esta observ
os el grupo
icaron que n
El análisis
ormalizaría
o (p=0,283; P
mada no ide
magnitud de a
celular CD4
al (F2,46=5,67
e la diferenc
copias ARN
eo de células
s recolectadas
general
también la
otóxica med
HLA DR en s
II.12 se esqu
ctivación se
s para cada t
, existe una
vación se pus
de carga v
no se cumplí
de los resid
los valores.
Prueba de Le
entificó una
activación si
4 (F1,46=14,7
77; p=0,006)
cia significati
N/ml, cuyos
CD4 en el con
s.
evaluación
didos como
su superficie
uematiza la e
muestra en e
tipo celular e
tendencia p
so a prueba
viral (3 nivel
ía el supuest
duos estand
Luego de d
evene). El an
interacción
gnificativam
766; p<0,001
). El análisis
iva emerge e
niveles de
njunto de prim
mediante ci
porcentaje
e. El mismo
estrategia de
el Anexo II m
en función d
positiva entre
mediante u
les) y el tip
to de homog
darizados sug
dicha transfo
nálisis de AN
n entre amb
mente mayor
1) y signific
post hoc de
en el grupo d
e activación
meras y
tometría de
de células
análisis fue
e análisis de
mientras que
e los niveles
e los niveles
n análisis de
o celular (2
geneidad de
girió que la
ormación se
NOVA de dos
bos factores
para el tipo
cativamente
e contrastes
de pacientes
n resultaron
e
s
e
e
e
s
s
e
2
e
a
e
s
s
o
e
s
s
n
signif
(p=0,
Fig
tr
f
ut
ficativament
006)
gura III.12. Es
res paneles su
(CD3+/CD8+
fluorocromo A
tilizado con el
CD3+/CD8+
Figura
e mayores q
strategia de a
uperiores se m
). En el panel
APC utilizado c
l anticuerpo a
+/CD38+/HLA
anteriores.
a III.13. Valore
que aquellos
nálisis de los
muestra la suc
inferior se mu
con el anticue
nti HLA DR y
DR+ según lo
El mismo aná
esmedidos de
72
s medidos en
niveles gener
esiva selecció
uestra de izqu
erpo anti CD38
iii. La muestra
os limites de p
álisis se realizó
e activación g
n los pacien
rales de activa
ón de subpobl
uierda a derec
8, ii. Un contr
a completame
positividad det
ó sobre la pob
general de res
tes con carg
ación de la re
aciones hasta
cha: i. Un cont
ol de isotipo p
ente marcada
terminados co
blación CD3+/
spuesta inmun
gas virales in
espuesta inmu
a la población
trol de isotipo
para el fluoroc
a y la població
on los dos con
/CD4+.
ne CD4 y CD8
ndetectables
une. En los
citotóxica
o para el
cromo PE
n activada
ntroles
8.
s
III.3.2
Una v
inmu
1 S
m
p
2 L
e
d
3 S
fi
4 S
e
5 S
te
La sín
miligr
resus
tabla
III.3.3
Con e
realm
la res
sintet
fue e
pépti
obten
dos c
negat
CMSP
adela
2. Estrategia
vez estimad
ne péptido e
Se sintetizaro
mutaciones d
polimorfismo
Los péptidos
ensayos in vi
del alelo HLA
Se caracteriza
in de detecta
Se confirmó
ensayos de es
Se evaluó el
etrámeros.
ntesis de los
ramo y una
spendieron e
III.5.
3. Evaluación
el objetivo d
mente son re
spuesta med
tizados en su
nsayado en
ido posee re
nidos en ens
controles ne
tivos, en am
P) pero men
ante. En nar
a para el aná
os los nivele
específica. P
on los pépt
de escape) i
os virales.
sintetizado
itro de ELISP
para el cual
aron las curv
ar diferencia
la naturaleza
stimulación
l fenotipo d
péptidos se
a pureza m
en dimetil su
n de la frecu
de determina
econocidos p
dida en ensa
u versión sal
todas las mu
estricción alé
sayos con 10
egativos). Lo
arillo aquello
nores al per
ranja se mue
lisis de respu
es generales
ara ello se ut
idos corresp
dentificados
os se utilizar
OT sobre m
los distintos
vas de respu
as en la magn
a citotóxica
in vitro y aná
de la poblac
solicitó sin m
ayor al 80%
ulfóxido (DM
uencia de rec
ar experime
por la respue
yos in vitro d
vaje. En la ta
uestras prove
élica. Los va
00,000 CMSP
s colores in
os que cump
centil 90 pa
estran aque
73
uesta inmun
s de activaci
tilizó la sigui
pondientes a
s en el anális
ron para det
uestras de C
s péptidos po
esta a péptid
nitud de resp
de la respue
álisis por cito
ción citotóx
modificacion
%. De acue
MSO) a una c
conocimient
ntalmente s
esta inmune
de ELISPOT p
abla III.6. se
enientes de
alores mostr
P (el promed
dican la ma
plen el criter
ara el conjun
llas respuest
ne epítope e
ón inmune,
ente estrate
a epítopes s
sis estadístic
tectar la pre
CMSPs de pa
oseen restric
dos salvajes
puesta frent
esta y se eva
ometría de fl
ica epítope
es adicionale
rdo a la ca
concentració
o de los epít
si los sitios id
específica e
para la liber
resumen los
pacientes qu
rados corres
dio de las do
gnitud de la
io de positiv
nto de valor
tas consider
específica
se prosiguió
egia:
salvajes y m
co de asocia
esencia de
acientes y co
cción.
y mutados e
te a ambas va
aluó su nivel
lujo.
específica m
es, a una can
antidad de
ón de 20mM
topes bajo e
dentificados
n los pacien
ación de IFN
s resultados o
ue posean el
sponden al n
s réplicas me
a respuesta:
vidad (más de
res obtenido
radas de ma
ó a evaluar
mutados (po
ación entre a
respuesta e
onsiderando
en ensayos d
ariantes vira
de polifunci
mediante la
ntidad de alr
péptido sint
M según se d
estudio
por análisis
tes infectado
N frente a
obtenidos. C
alelo HLA pa
número de p
enos el prom
en azul se
e 5 puntos c
os según se
agnitud med
la respuesta
ortadores de
alelos HLA y
specífica en
la presencia
de ELISPOT a
les.
ionalidad en
técnica de
rededor de 1
tetizado, se
detalla en la
s estadístico,
os se evaluó
los péptidos
Cada péptido
ara el cual el
puntos neto
medio de los
resaltan los
ada 100.000
detalla más
dia (medidas
a
e
y
n
a
a
n
e
1
e
a
,
ó
s
o
l
o
s
s
0
s
s
entre
perce
Según
de 5
estos
proba
e los percent
entil 95).
Nombre
A01-P125
A01-P125
A02-P65Q
A02-P65H
A02-P84T
A02-P83V
A02-P84V
A03-P28K
A03-P28Q
A11-P357
A11-P357
A24-P30K
A24-P30R
B07-P223
B07-P223
B07-P357
B07-P357
B08-P76R
B08-P76K
B40-P215
B40-P215
B40-P21
B40-P21
B40-P95R
B40-P95K
B57-P242
B57-P242
A03-P90Q
A11-P11
A11-P90Q
A24-P13
B68-P54S
n se detalla
puntos cada
s ensayos, u
ablemente a
tiles 90 y 95
S
5S N
5N -
Q I
H -
T S
V S
V S
K R
Q -
7G GV
7S --
K K
R -
3I H
3V -
7G G
7S -
R E
K -
5V E
5L -
8V A
8A -
R IE
K --
2T TS
2N --
Q C
8A K
Q A
8L N
S E
en la sección
a 100.000 CM
una magnitu
a considerar
) y en rojo a
Tabla III.5. De
Secuencia
SSQVSQNY
N-------
LGQLQPSL
----H---
LYNTVATL
LYNTVVTL
LYNTVAVL
LRPGGKKK
-------Q
VGGPGHKAR
----S----
YKLKHIVW
-R------
PVHAGPIA
------V-
PGHKARVL
-S------
LRSLYNTV
-K------
EAAEWDRV
-------L
EWDRLHPV
-------A
EIRDTKEAL
--K------
STLQEQIGW
-N-------
VHKKIEVK
TQQAAADK
VLYCVHQK
NYPIVQNL
TAEGCRQI
n 15.1. el pu
MSP. Si bien
ud de 5 pu
positivas mu
74
aquellas resp
etalle de los p
Salvaje/M
Salva
Muta
Salva
Muta
Salvaje/
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Muta
Salva
Salva
Salva
Salva
Salva
unto de corte
n este punto
untos cada
uestras realm
puestas de e
péptidos sinte
MutadoP
aje
do
aje
do
Mutado
aje
do
aje
do
aje
do
aje
do
aje
do
aje
do
aje
do
aje
do
aje
do
aje
do
aje
do
aje
aje
aje
aje
aje
e a partir se
de corte es
100.000 CM
mente negati
elevada mag
etizados
Peso molecula(gr/mol)
1171
1198
1113
1121
1124
1152
1122
1182
1183
1096
1126
1357
1385
1041
1027
1077
1107
1236
1208
1244
1258
1264
1236
1346
1318
1324
1337
1225
1105
1204
1086
1148
considera u
el que com
MSP resulta
vas.
gnitud (medi
ar Masasintetiza
1,6
1,4
1,8
1,6
1,4
1,1
1,3
1,9
1,3
1,4
1,3
1,3
1,1
1,2
1,1
1,4
1,3
1,7
1,6
1,5
1,1
1,5
1,8
1,2
1,8
1,2
1
1,3
1,9
1,4
1,2
1
na respuesta
múnmente se
muy baja
das sobre el
aada
a positiva es
e utiliza para
y conduce,
l
s
a
,
Tabla
IDMuestra
F001
F018
F021
F023
F024
F026
F027
F028
F030
F037
F040
F044
F046
F047
F048
F050
F060
F063
F070
F072
F080
F081
F085
F087
F090
F095
F100
F119
F133
F155
F174
F182
F189
F197
F235
F244
F284
F285
F288
F289
Esta
corte
sobre
estad
Debid
medi
III.6. Resume
A01
P125N
A02
P65Q
2
1
0,5
0
3
3,5
1,5
17,5
2,5
0,5 1,5
4,5
12
1
0,5
0
1
2,5
0
1,5
19
4,5
7,5
1,5
0,5
4 21
proporción d
e. Es por ello
e el conjunto
dístico los pe
do a que los
ana fue pr
en de los resu
A02
P84T
A03
P28K
A03
2,5
1
1
3,5
3
85
5,5
3
22,5 20
0
1,5
4 2,5
9,5 15,5
0,5
66,5
2
1
1
1,5
49,5
1,5
2,5
501 47,5
10
14
21 8
de falsos po
o, que a fin d
o de todos lo
ercentiles 90
s datos sugie
ácticamente
ultados obten
A03
P90Q
A11
P357G
A11
0
10
6
18,5
2
23
21
1
11,5
0,5
8 2
ositivos natur
de utilizar un
os valores m
y 95. En la f
eren que la m
e 0 (0,5 pu
75
idos en los en
P118A
A11
P90Q
A24
1
0,5 0,5
0
3 8 3,
4,
0
0
5
0
5
2
0,
0
2 2 1
ralmente de
n criterio obj
edidos en to
igura III.14. s
mayoría de
ntos cada
nsayos de ELIS
P30K
A24
P138L
B07
P223I
1
1
2
0,5
1
0
,5 7,5
2
,5 0
1,5
0 0
0
8,5
5
0,5 1,5
5,5
2,5
,5
0,5 0,5
1
15 4 6
ecrece a med
etivo para c
odos los ensa
se muestra l
los ensayos
100,000 CM
SPOT de resp
P223I
B07
P357G
B08
P76R
2
0,5
5 8
2
33,5
5 2
5 24,5
2,5
2,5
1,5
6 4
dida que se
lasificar la m
ayos se dete
a distribució
resultaron n
MSP), se pu
uesta péptido
B40
P215V
B40
P218V
0,5 2,5
2,5 12
0,5 2
2,5 1
0,5 1
0 7
1 1
7 7
incrementa
magnitud de
erminó media
ón de la varia
negativos, y
uede conside
o específica.
B40
P95R
B57
P242T
0
0,5
2,5
9
3,5
1,5
15,5
11
1,5
4
0,5
7 4
el punto de
la respuesta
ante análisis
able medida.
de hecho la
erar que la
e
a
s
.
a
a
distri
La pr
medi
demo
A02P
A11P
respu
pobla
cabe
evalu
bución de lo
roporción de
das se resum
ostraron ser
P65 y A03P9
P118, A24P30
uesta podría
ación bajo e
destacar qu
uado en 14 p
os valores m
e respuesta
me en la fig
r reconocido
90 alcanzaro
0, B07P223,
estar relaci
estudio que
ue resulta l
acientes.
medidos es u
ensayo
signifi
certer
con al
por so
aquell
29,45
positiv
del pe
5 pun
del 25
Figura
ELISPO
respue
azul las
positiva a lo
gura III.15. C
os con resp
on reconocim
B08P76 y B
onada con l
no permitió
lamativa la
76
una buena a
os realmen
cativamente
ramente pos
lta magnitud
obre el perc
las contenid
puntos). Aq
vidad antes m
ercentil 90 fu
tos correspo
5% de los ens
III.14. Distri
OT para toda
estas de eleva
s de magnitud
os distintos
Como se obs
puestas de e
mientos de
B40P215 no
a limitada p
analizar un
falta de res
aproximación
te negativo
e alejados d
sitivos. De es
d aquellos en
centil 95 (2
as entre los
quellas resp
mencionado
ueron consid
ondió al per
sayos puede
bución de lo
s las muestr
da magnitud,
d baja.
péptidos en
serva, los ep
elevada mag
media mag
se detectaro
prevalencia d
número gra
spuesta fren
n a la variab
os; y que
de la medi
sta manera c
nsayos dond
9,45 puntos
s percentiles
puestas que
(mayor a 5
deradas resp
rcentil 76,6;
considerars
os valores me
ras analizada
, en naranja la
nsayados, ju
pítopes A02P
gnitud, mie
gnitud. Para
on respuesta
de los alelos
ande de mu
nte al epíto
bilidad de los
por lo tan
iana son e
consideramo
de se obtuvie
s), y respue
90 y 95 (en
cumplen el
puntos) pero
uestas bajas
es decir, qu
e en principi
edidos en los
s. En rojo se
as de magnitu
nto con las
P84, A03P28
ntras que l
los epítope
as, aunque e
s correspond
uestras. En e
pe A24P30,
s valores en
to aquellos
nsayos casi
os respuesta
eron valores
stas medias
ntre 18,55 y
l criterio de
o por debajo
s. El valor de
ue alrededor
io, positivos.
s ensayos de
e resaltan las
ud media y en
magnitudes
8 y B07P357
os epítopes
es A01P125,
esta falta de
dientes en la
este sentido,
el cual fue
n
s
i
a
s
s
y
e
o
e
r
e
s
n
s
7
s
,
e
a
,
e
Del to
A02P
B40P
A24P
los in
B07P
frent
Basad
posic
tende
tabla
la evi
el ale
como
que f
confi
asoci
aque
Figura III.15
detall
otal de 13 p
P65Q, A02P8
218V, B40P9
P30K, B07P22
ndividuos ev
357G, B40P2
e a ambas va
dos en los re
ciones conte
encia para d
III.7. se deta
idencia dispo
elo HLA por
o para asegu
fueron analiz
rmados con
ación al ale
llos epítopes
5. Proporción
la la magnitud
péptidos para
84T, A03P28
95R, B57P24
23I, B08P76R
valuados. Lo
218V, B40P9
ariantes salv
esultados ob
enidas en u
eterminar si
allan nuevam
onible que lo
el cual pose
rar un buen
zados donde
evidencia in
lo correspon
s con eviden
de respuesta
d de la respue
a los cuales
8K, A11P357
42T], para 5
R, B40P215V
os restantes
95R, B57P24
vaje ymutada
btenidos, se
n total de
alguno de e
mente los ep
os confirma.
ían restricció
número de
e se observa
nmunológica
ndiente. De
cia estadístic
77
frente a los p
esta y el núme
se sintetizar
7G, A24P30
5 de ellos [c
V] no se enc
s 8 péptido
2T] pudieron
a. Los resulta
reanalizó la
20 epítope
ellos resultab
ítopes de la
Obsérvese q
ón no se enc
casos analiz
ron tendenc
y uno (el A2
aquí en ad
ca y/o inmun
péptidos eval
ero de muestr
ron potencia
K, B07P223
como se obs
contró ningú
s [A02 P65
n ser reevalu
ados se mue
a tabla III.2.
s potenciale
ba confirmad
tabla III.2. ju
que 8 de ello
contraba en
ados. Como
cias significat
24P030) disp
elante, sólo
nológica.
uados en ens
ras analizadas
les variantes
I, B07P357G
serva en la f
n nivel de re
Q, A02P84T
uados para d
estran en la s
donde se m
es identifica
do por los en
unto con la in
os no fueron
prevalencia
muestra la t
tivas en el ti
pone sólo de
serán cons
sayos de ELISP
en cada caso
s de escape
G, B08P76R,
figura III.15.
espuesta en
T, A03P28K,
diferencias e
siguiente sec
mostraba una
ados en los
nsayos de EL
nformación y
analizados d
a lo suficient
tabla, de los
empo, 5 de
evidencia es
iderados en
POT. Se
.
[A01P125N,
B40P215V,
A01P125N,
ninguno de
A11P357G,
en respuesta
cción.
a lista de 12
análisis de
LISPOT. En la
y se muestra
debido a que
emente alta
12 epítopes
ellos fueron
stadística de
n los análisis
,
,
,
e
,
a
2
e
a
a
e
a
s
n
e
s
Ta
Pos
P03
P07
P08
P08
P09
P21
P21
P22
P28
P09
P05
P13
III.3.4
A fin
realiz
ensay
200.0
llegó
utilizó
1 log
dispo
analiz
III.3.4
Este e
célula
la mu
bla III.7. Resu
siciónAleloHLA
30 A24
B08
76 A30
B08
83 A02
A30
84 A02
A30
A11
95 B40
15 B40
18 B40
B07
23 B07
80 B52
CW18
90 A11
A03
54 B68
38 A24
4. Comparac
de identifica
zaron nuevo
yos difieren
000 células p
a 300.000 s
ó una conce
garitmo e i
onibilidad de
zado.
4.1. A02P65
epítope se e
as por pocill
uestra F197 m
umen de los e
oA Secuenc
4 KYKLKHIVW
GGKKKYK
0 RSLYNTVAV
ELRSLYNT
SLYNTVAT
0 RSLYNTVAT
SLYNTVAT
0 RSLYNTVAT
TLYCVHQR
IEIKDTKEA
EEAAEWD
AEWDRLHP
HPVHAGP
HPVHAGP
RMYSPTS
8 VRMYSPV
AVLYCVHQ
CVHKKIEV
ETAEGCRQ
4 NYPIVQN
ción de la res
ar diferencia
s ensayos d
del anterio
por pocillo; e
según dispon
ntración de
intentando
e células. A
ensayó en do
o respectiva
mostró nivel
pítopes suger
ia E
W E
KLK N
VLY N
TV
TL Estadísti
TLY N
TL Estadísti
TLY N
RI N
AL In
RL
PV In
PIA N
PIA
SI N
VSI N
QK
VK In
QI
NL
spuesta a los
as en la resp
e ELISPOT, e
or en que e
esto es, el d
nibilidad de c
péptido de 1
comenzar c
continuació
os muestras
mente. Los
es de respue
78
ridos en la tab
Evidencia
Estadística
o analizado
o analizado
Ausente
ica e inmunoló
o analizado
ica e inmunoló
o analizado
o analizado
munológica
Ausente
munológica
o analizado
Ausente
o analizado
o analizado
Ausente
munológica
Ausente
Ausente
s péptidos sa
uesta espec
esta vez fren
l número d
doble que en
células. Ade
10 5 M, en es
con una co
ón se detalla
positivas, la
resultados s
esta mucho m
bla III.2. y con
Obser
p=0,00
Baja p
Baja p
Falta d
ógica p=0,00
Baja p
ógica p=0,07
Baja p
Baja p
ELISPO
no con
ELISPO
Baja p
no con
Baja p
HLA C
ELISPO
ELISPO
falta d
1 solo
alvajes ymu
ífica frente a
nte a ambas
e células fu
n el caso ant
más, a difere
ste caso se u
oncentración
an los result
F048 y la F1
e muestran
mayores fren
nfirmados en
rvaciones
055
revalencia de
revalencia de
de pacientes
008
revalencia de
716
revalencia de
revalencia de
OT
nfirmada
OT
revalencia de
nfirmada
revalencia de
no caracteriz
OT positivo ba
OT
e pacientes
paciente muy
utados
a los péptido
s variantes p
ue en gener
terior, aunq
encia del cas
utilizaron con
n de 10 4 M
tados obten
197. Se utiliz
en la figura
nte a la varia
los ensayos d
l alelo
l alelo
l alelo
l alelo
l alelo
l alelo
l alelo
zado en este e
ajo y en solo 1
y bajo
os salvajes y
peptídicas. E
al mayor: e
ue en algun
so anterior e
ncentracione
M, nuevame
idos para ca
zaron 163.00
III.16. Como
antes salvaje
de ELISPOT
estudio
paciente
mutados se
Estos nuevos
n promedio
as muestras
en el cual se
es seriadas a
ente, según
ada epítope
00 y 162.000
o se observa,
e comparado
e
s
o
s
e
a
n
e
0
,
o
con l
muy
III.3.4
Este
93.00
La mu
mues
detec
III.3.4
Este e
célula
o observado
similar a am
4.2. A02P84
epítope se e
00 y 162.000
uestra F037
stras fue prá
ctó ningún ti
Fig
4.3. A03P28
epítope se e
as por pocill
o frente a la
bas variante
Figura III.16.
ensayó en t
0 células por
no pudo ser
cticamente i
po de respu
gura III.17. Re
ensayó en do
o respectiva
variante m
es.
. Respuesta al
res muestra
r pocillo resp
ensayada co
idéntica fren
esta en ning
espuesta al ep
os muestras
mente. Los
79
utante. La m
l epítope A02
s positivas,
pectivamente
on el péptido
nte a los pép
una de las d
pítope A02P84
positivas, la
resultados s
muestra F048
2P65 en lasmu
la F037, F17
e. Los result
o P83V. Com
tidos P84T y
iluciones.
4 en lasmues
F197 y la F2
e muestran
8, en cambio
uestras F197
74 y la F048
ados se mue
mo se observa
y P84V. Frent
stras F037, F1
289. Se utiliz
en la figura
o, respondió
y F048.
8. Se utilizar
estran en la
a la respuest
te al péptido
74 y F048.
zaron 162.00
III.18. Como
ó de manera
on 130.000,
figura III.17.
ta en las tres
o P83V no se
00 y 230.000
o se observa,
a
,
.
s
e
0
,
en am
todas
III.3.4
Este e
fue n
III.3.4
Este
célula
la res
respu
Figura
mbas muest
s las dilucion
4.4. A11P357
epítope se e
egativo sugi
4.5. B07P357
epítope se e
as por pocill
spuesta en
uesta práctic
a III.19. Respu
tras se dete
nes ensayada
Figura III.18.
7
ensayó en un
riendo un re
7
ensayó en d
o respectiva
las dos mue
camente nula
uesta al epíto
ctó una resp
as.
. Respuesta al
na muestra,
esultado falso
os muestras
amente. Los
estras mostr
a frente a la
pe B07P357 e
80
puesta de m
l epítope A03
la F046. Se u
o positivo en
s positivas, l
resultados s
ró una respu
variante mu
en lasmuestr
mayor magn
3P28 en lasmu
utilizaron 86
n el primer a
a F030 y F0
se muestran
uesta mayor
tada.
as F030 y F06
itud frente
uestras F197
.000 células
nálisis de ELI
60. Se utiliza
en la figura
r frente a la
60.
a la variante
y F289.
por pocillo.
ISPOT.
aron 204.00
III.19. Como
a variante sa
e salvaje en
El resultado
00 y 206.000
o se observa
alvaje y una
n
o
0
a
a
III.3.4
Este e
célula
result
mues
III.3.4
Este e
fue n
III.3.5
Cons
carac
otras
marc
iodur
que s
muer
sobre
pépti
autól
dicho
4.6. B40P218
epítope se e
as por pocill
tó ser negat
stra F026, co
4.7. B57P242
epítope se e
egativo sugi
5. Confirmac
iderando qu
cterizar la res
s citoquinas,
ación intrac
ro de propidi
se esquemat
rtas sobre la
e las CD3+,
ido A03P28K
ogas, y en c
o porcentaje
8
ensayó en do
lo respectiva
tiva y es po
omo se obser
2
nsayó en un
riendo un re
ción de la res
ue la prueba
spuesta espe
se realizó l
celular de la
io para difer
tiza en la fig
selección d
para la mu
K (siguiendo e
cambio se re
fue 0,42% p
os muestras
amente. Los
or lo tanto o
rva en la figu
a muestra, l
esultado falso
spuesta cito
a de ELISPOT
ecífica previa
a prueba de
s citoquinas
enciar célula
gura III.21. C
e la població
estra F197
el procedimi
ealizó la esti
para la muest
81
positivas, la
resultados
otro caso fal
ura III.20. fue
Figura
B40P218
a F080. Se ut
o positivo en
tóxica espec
T detecta la
amente dete
e estimulació
s MIP 1 e
as vivas de cé
Como se ob
ón linfocitar
estimulada
iento detalla
imulación di
tra F197 y 0,
F026 y la F0
se muestran
lso positivo
e mayor frent
III.20. Respu
8 en la muest
tilizaron 256
n el primer a
cífica frente
liberación s
ectada por E
ón in vitro c
IL 2 aparte
élulas muert
bserva en dic
ia en el cuad
con una lín
ado en la sec
recta de las
33% para la
095. Se utiliz
n en la figur
del primer
te a la varian
uesta al ep
ra F026.
6.000 células
nálisis de ELI
a los epítop
solamente d
LISPOT en té
con péptidos
de IFN . In
tas siguiendo
cha figura, e
drante de FS
nea B autólo
cción ). Cuan
CMSP con
muestra F28
zaron 292.00
ra 4.8. La m
conjunto de
nte salvaje.
pítope
por pocillo.
ISPOT.
es estudiado
de IFN y c
érminos de s
s específicos
nicialmente
o la estrategi
el porcentaje
SC vs SSC res
oga sensibili
do no se usa
el péptido m
89.
00 y 198.000
uestra F095
e análisis. La
El resultado
os
on el fin de
secreción de
s y posterior
se utilizó el
a de análisis
e de células
sultó ser 1%
zada con el
aron líneas B
mencionado,
0
5
a
o
e
e
r
l
s
s
%
l
B
,
es
po
Un in
longit
PerCP
mort
remo
estra
Cons
líneas
B sen
casos
Figura III.21
estimulada
stimulada dire
F289 estimu
corresponde
oblación muer
nconveniente
tud de onda
P, y por lo t
andad medi
oviendo el Io
tegia de aná
iderando tam
s B sensibiliz
nsibilizadas e
s en que no s
A
B
C
1. Estrategia d
a con una líne
ectamente po
ulada también
e al FSC vs SSC
rta (IP positiva
e que surge
a correspon
tanto su uso
idos en el e
oduro de Pro
álisis se esqu
mbién que l
zadas compa
en todos los
se disponía d
de análisisme
a B autóloga s
r incubación c
n directament
C, en el segund
a), en el terce
(CD3+
de la utiliza
diente al flu
o limita el a
experimento
opidio e inclu
ematiza en l
os niveles d
arado con la
s experimen
de linfocitos
82
ediante tinció
sensibilizada c
con una conce
e con el pépti
do se seleccio
er cuadrante s
+/CD8+) secret
ción del Iod
uorocromo P
nálisis a 4 fl
mencionad
uyendo dos m
a figura III.22
de secreción
estimulación
ntos siguient
B autólogos
ón con Ioduro
con el péptido
entración 10 4
ido A02P28K.
ona la subpobl
e determina l
tores de IFN
uro de Prop
PE pero tam
luorocromos
o, se decidi
marcas adici
2.
de IFN fu
n directa con
tes, sean au
transformad
o de Propidio.
o A03P28K. B.4 M del mismo
En cada caso
lación CD3+ y
a proporción
.
pidio es que
mbién interfi
s. Confirman
ió cambiar l
onales: el M
ueron mayor
n el péptido,
utólogas o h
dos).
A. La muestra
. La misma mu
o péptido. C. L
el primer cua
se la diferenc
de linfocitos c
el mismo ab
ere con el f
ndo los bajo
la estrategia
MIP 1 y la IL
res cuando s
se decidió u
eterólogas (
a F197
uestra
La muestra
adrante
cia de la
citotóxicos
bsorbe en la
fluorocromo
s niveles de
a de análisis
2. La nueva
se utilizaron
utilizar líneas
(en aquellos
a
o
e
s
a
n
s
s
En la
ensay
tuvie
Tabla
péptid
CMSP
F030
F037
F048
F060
F080
F087
F197
F289
En
En
po
so
Como
obtuv
y los
consi
contr
result
Po
IFN
M
IL
IFN
IFN
IL
IFN
tabla III.8. se
yadas, se dis
ran el/los ale
III.8. Diseño
do específico
HLA CM
P A
0 1 2 37
7 2 2 48
8 2 3 39
0 1 24 7
0 2 3 57
7 3 31 7
7 2 3 27
9 1 3 57
n la tabla se re
n amarillo se
or ELISPOT en
obre otras mu
o se detallab
vo el porcen
resultados
derar una r
roles, es dec
tados se mu
Tab
orcentajes
N
IP 1
2
N + MIP 1
N + IL 2
2 + MIP 1
N + IL 2 + MI
En la tabla se
e detalla el d
sponía de líne
elos para los
o experiment
s.
MSP
B Línea
7 7 F030
8 35 F197
9 35 F048
44 F030
7 39 F289
45 F289
7 18 F197
7 7 F289
esalta en rojo
resaltan las e
n las curvas d
estras no utili
ba en la figur
taje de linfo
obtenidos s
espuesta po
cir, aquellos
estran en la
bla III.9. Magn
Lí
F030
0,189
0,784
0,252
0,036
0
0,023
P 1 0,014
resaltan en r
diseño exper
eas B autólo
s cuales los p
tal para la d
HLA Lín
B A
0 Autólo
7 2 3 27
8 Autólo
0 1 2 37
9 1 3 57
9 1 3 57
7 Autólo
9 Autólo
o los alelos pre
estimulacione
de respuesta,
izadas para re
ra III.22., a p
ocitos CD3+/C
e muestran
ositiva se co
s donde las
tabla III.9.
nitud de respu
Porcent
íneas B Heteról
F048 F19
0,06 0,11
1,11 1,64
0,237 0,62
0,315 0,08
0,042 0,01
0,057 0,02
0,163 0,01
ojo aquellos v
83
rimental. Com
ogas; en los o
péptidos a en
detección de
ea B
B A02P
oga
7 18
oga 1
7 7
7 7
7 7
oga 1
oga
esentes en las
es programada
mientras que
ealizar las curv
artir de los d
CD8+ respon
a continuac
menzó anali
CMSP se e
uesta a los con
aje de células C
logas
7 F289 F
11 0,071 0
45 0,63 0
2 0,436 0
88 0,035 0
1 0
27 0,047 0
1 0,024 0
valores identif
mo se observ
otros casos s
nsayar tuvier
citoquinas in
P65 A02P84
1
1
s líneas B per
as para confi
e en verde se
vas de respues
distintos cua
ndedores seg
ción. Para de
izando las re
enfrentaban
ntroles con lín
CD3+/CD8+ res
Líneas B
F037 F060
0,094 0,031
0,782 1,02
0,516 0,528
0,016 0
0 0
0,01 0,041
0,005 0
ficados como
va, para cuat
e utilizaron l
ran restricció
ntracelulares
A03P28 A
1
1
1
1
o ausentes en
rmar las resp
e resaltan est
sta.
drantes del
gún la o las c
eterminar el
espuestas ob
a líneas B
neas B no sen
spondedoras
Autólogas
F080 F08
0,109 0,3
0,893 0,2
0,345 0,1
0,082 0,04
0,014 0
0,018 0
0,009 0
extremos en
tro de las oc
líneas B hete
ón.
en linfocitos
A03P90 B07P3
1
1
1
1
1 1
n las CMSP es
puestas antes
imulaciones a
análisis de c
citoquinas qu
l límite a pa
btenidas en
no sensibiliz
nsibilizadas.
D87 Media
27 0,124
33 0,887
14 0,384
47 0,043
0 0,008
0 0,028
0 0,009
el análisis est
ho muestras
erólogas que
s CD3+/CD8+
357 B57P242
1
stimuladas.
evaluadas
adicionales
citometría se
ue liberaban
artir del cual
los ensayos
zadas. Estos
Desviaciónestándar
0,094
0,407
0,168
0,032
0,015
0,019
0,008
adístico
s
e
+
e
n
l
s
s
Figura III.22. Estrategia dee análisis de psob
84
olifuncionalidre líneas B se
dad de la respnsibilizadas.
Mono
secre
Mono
secret
Mono
secre
Trifun
Trifun
Trifun
Bifun
de IF
Bifun
de IL
Bifun
de IF
Bifun
de IL
Bifun
de IF
Bifun
de IF
puesta péptid
ofuncional
tora de IL-2
ofuncional
tora de IFN-
ofuncional
tora de MIP-1
ncional
ncional
ncional
ncional secretora
FN- y MIP-1
ncional secretora
L-2 y MIP-1
ncional secretora
FN- y MIP-1
ncional secretora
L-2 y MIP-1
ncional secretora
FN- y IL-2
ncional secretora
FN- y IL-2
o específica dde CMSP
Como
mien
el ob
Inicia
existí
estan
funci
la tra
valor
del a
homo
medi
facto
ya se
entre
(F6,30=
Cons
calcu
como
Cons
obten
cump
Como
signif
los e
B07P
tanto
de la
decir
lado,
de IL
ELISP
o se observa
tras que las
jetivo de po
almente se p
ían diferenc
ndarizados m
ón del logar
ansformació
es extremos
nálisis, los d
ogeneidad d
ante un ANO
res fijos “Cit
a frente a lín
e la magnitu
=43,623; p<1
iderando la
ló el desvío
o límite de p
iderando es
nidos con la
plen con el m
o se observ
ficativas fren
nsayos de E
357. En el r
o respuestas
s respuestas
, provenient
la elevada
2 sugiere qu
POT.
a, parecen e
respuestas m
oner a prueb
puso a prue
cias significa
mediante grá
itmo natural
n menciona
s que se resa
datos fueron
de varianza
OVA de 2 fac
toquina” y “A
neas B autólo
d según el t
10 12).
diferencia s
estándar pa
positivada m
te criterio d
as líneas B
mencionado c
va en la fig
nte al péptid
LISPOT. La m
resto de las
monofuncio
s secretoras
tes de linfoc
magnitud de
ue gran part
existir diferen
medidas fren
ba estas obse
eba el supue
ativas (p<10
áficos Q Q y
l normalizab
da. Analizan
altan en rojo
reanalizado
s (p=0,528)
ctores. El mis
Autóloga” (F
ogas o heter
tipo de resp
significativa
ra cada una
más allá del
de positivida
sensibilizad
criterio.
gura III.23.,
do A03P28, l
misma situac
combinacion
onales como
de IFN en
citos citotóxi
e respuesta
te de la resp
85
ncias import
nte a líneas B
ervaciones s
esto de igua
0 4). Por lo
y se determ
ba la distribu
ndo los dato
en la tabla I
os con la pru
). Los datos
smo arrojó c
F6,30=0,407; p
ólogas (F1,30=
uesta medid
observada e
de ellas y d
cual las res
ad se muest
das detallan
las muestr
as cuales fu
ción fue obs
nes de CMS
polifunciona
ncontradas p
cos capaces
monofuncio
puesta péptid
tantes en la
B autólogas
e realizó un
aldad de var
o tanto se
inó que la t
ción (ver An
os en gráfic
II.9. Luego d
ueba de Leve
s transform
omo resulta
p=0,868) y c
=2,307; p=0,
da como can
en la propor
icho valor m
puestas med
ran en las f
do con un
ras F197 y
eron detecta
servada para
P frente a d
ales. Los dat
por ELISPOT
de secretar
onal, tanto se
do específica
polifunciona
o heteróloga
análisis de A
rianza. Segú
procedió a
transformac
exo V). Por l
os de boxpl
de ser retirad
ene, la cual c
mados fuero
do ausencia
confirmó la i
139) y la dife
ntidad y tipo
rción de cad
multiplicado p
didas serían
iguras III.23
asterisco a
F289 no e
adas y confi
a la muestra
distintos pép
tos sugieren
eran respue
r también M
ecretora de
a no es dete
alidad de las
as parece no
ANOVA de d
ún la prueba
a analizar l
ión de los d
lo tanto se p
lot se identi
dos los valor
confirmó el s
on entonces
de interacci
gualdad de
erencia muy
o de citoquin
da tipo de re
por dos fue
considerada
. y III.24. lo
quellas resp
evidenciaron
rmadas prev
a F060 frente
ptidos se han
también que
estas polifun
MIP 1 y/o IL
MIP 1 com
ectada en los
s respuestas
o diferir. Con
dos factores.
a de Levene
os residuos
datos con la
procedió con
ificaron tres
res extremos
supuesto de
s analizados
ión entre los
la respuesta
significativa
nas distintas
espuesta, se
considerado
as positivas.
s resultados
puestas que
respuestas
viamente en
e al péptido
n observado
e la mayoría
ncionales, es
L 2. Por otro
mo secretora
s ensayos de
s
n
.
e
s
a
n
s
s
e
s
s
a
a
s
e
o
.
s
e
s
n
o
o
a
s
o
a
e
F
El en
confi
signif
de lo
polifu
Figura III.23. R
nsayo fue re
rmados en l
ficativa frent
os péptidos
uncionales.
Figura
Resultados ob
paci
ealizado tam
as curvas de
te al péptido
s A03P28 y
a III.24. Resul
btenidos en lo
entes previam
mbién para
e ELISPOT. Co
o A03P90 en
y B07P357
ltados obtenid
86
os ensayos de
mente caracte
otras mues
omo se obse
ninguna de l
se detectar
dos en los en
e polifunciona
erizados en la
stras con ot
erva en la fig
las muestras
ron tanto r
sayos adicion
alidad para pé
a sección 3.3.
tros péptido
gura III.24., n
s ensayadas,
respuestas m
nales de polifu
éptidos espec
os que no
no se observ
mientras qu
monofuncio
uncionalidad.
cíficos en
habían sido
vó respuesta
ue en el caso
nales como
o
a
o
o
III.3.6
A fin
técni
fenot
anter
pued
Mate
En la
novo
R
El gru
tetrá
previ
esque
amar
pacie
anális
mues
SSC q
asoci
6. Caracteriz
de estudiar
ca de tetrám
tipo del tota
riormente de
en analizar
eriales y Mét
figura III.25
. Los tetráme
Figura III
Estreptavidi
Recordar que
upo bajo an
meros tamb
amente en
ematiza en c
rillo para res
ente, se utiliz
sis tuvo que
stras analiza
que sugiere
ada al transp
zación del niv
r indicios de
meros. Se elig
al de los Li
esarrolladas
las células
todos y se uti
5. se muestra
eros A02P84
I.25. Control d
na (SAV). Se o
para la const
nálisis, inicial
bién detallad
los ensayos
color en la m
spuestas baj
zaron dos flu
e ser reducid
das, el análi
la muerte
porte de las
vel de agota
e agotamien
gió esta técn
nfocitos Cito
como ELISPO
respondedo
ilizó como in
a el control
4T y A03P28K
de síntesis de
observa que e
trucción final l
lmente cons
os. La selecc
s de ELISPOT
misma tabla (
as). Cuando
uorocromos
do ya que, co
sis de citom
de la mayo
muestras a
87
amiento de la
nto de la res
nica porque t
otóxicos esp
OT y Citome
oras. Se sigu
ndicio de ago
de producci
K se encontra
tetrámeros e
el agregado rá
la SAV se agre
forma tetram
sistía en las
ción de esto
T; la intensi
rojo para res
más de un
distintos par
omo se mue
metría de fluj
ría de las c
la ciudad de
a respuesta
spuesta inm
teóricament
pecíficos par
tría de flujo
uió la metod
otamiento el
ión de los te
aban ya sinte
en Gel SDS PA
ápido de SAV f
ega lentament
mérica.
muestras de
os pacientes
dad de la r
spuestas alta
tetrámero t
ra realizar el
estra en la fi
o muestra u
células. Esta
e Atlanta en E
epítope esp
mune péptido
te es la única
ra un péptid
para la liber
dología desc
marcador P
etrámeros pa
etizados prev
AGE luego del
forma todas la
te para favore
etalladas en
fue basada
espuesta an
as, naranja p
tuvo que se
l marcado. S
igura III.26.,
una alteració
elevada mo
Estados Unid
pecífica
o específica
a capaz de de
do, ya que
ración de cito
cripta en la
D 1.
ara los 6 con
viamente.
tratamiento
as variantes p
ecer la formac
la tabla III.
en la respue
nteriormente
para respuest
r evaluado e
in embargo,
en cuatro d
ón important
ortalidad ce
dos donde e
se utilizó la
eterminar el
las técnicas
oquinas sólo
sección de
nstruídos de
con
posibles.
ción de la
10. para los
esta medida
e medida se
tas medias y
en el mismo
el grupo de
de las nueve
te en FSC vs
lular estuvo
l análisis fue
a
l
s
o
e
e
s
a
e
y
o
e
e
s
o
e
A fin
indivi
simul
fluore
indica
tiemp
para
desag
en es
resum
citóm
vi
Una
contr
pépti
tiemp
negat
Cons
n de realiza
iduales y cé
ltánea de l
escente pas
a la cantidad
po que se en
distinguir c
gregada se d
sta subpobla
men los resu
metro de flujo
Figura III.2
Inicialmente
ables (IP nega
dificultad qu
rol negativo,
ido bajo aná
po, sea segu
tivo se utiliz
iderando qu
ar adecuada
lulas agrega
os parámet
a por el láse
d total de s
ncuentra baj
élulas indivi
determina la
ación se dete
ultados obte
o.
27. Estrategia
se selecciona
ativas) y de ba
ue presenta
, ya que el
álisis por un
ro que el pa
ó la proporc
ue el valor es
amente el
das. Esto es
tros “altura”
er. La “altur
eñal medida
jo el haz de
iduales de a
a proporción
ermina la pro
enidos y en
a de análisis u
n aquellas con
aja complejida
la técnica d
mismo deb
no distinto q
aciente no p
ción de célul
sperado par
89
análisis de
s posible cua
”, “área” y
ra” del pulso
a y el “anch
l laser. En la
agregadas. L
de células C
oporción qu
la figura III
utilizada para
n menor altur
ad. Sobre esta
posterior an
de tetrámer
bería consist
que tenga re
osea respue
as CD8 nega
a este porce
tetrámeros
ando el citó
“ancho” d
o indica la m
o” indica el
a figura III.27
Luego de se
CD8+ recono
e expresa el
I.28. se mue
distinguir cél
ra y ancho. Lu
a población se
nálisis.
ros para su
tir del tetrá
estricción po
esta específic
ativas que pr
entaje es 0,
s, debe dis
metro de flu
del pulso a
mayor intens
tamaño de
7. se muestr
leccionar la
ocidas por e
l marcador P
estran los re
ulas individua
ego se selecc
e seleccionan l
análisis es l
ámero utiliza
or el mismo
ca. Como ap
resentaban t
se utilizó el
stinguirse en
ujo permite
medida qu
sidad del pu
la célula de
ra la estrate
población C
l tetrámero.
PD 1. En la t
esultados ob
ales de agrega
ionan las pob
las células CD
a de no ten
ado pero ca
o alelo y qu
roximación
tinción por e
doble del v
ntre células
la medición
ue la célula
ulso, el área
e acuerdo al
egia utilizada
CD3+ viva y
. Finalmente
abla III.9. se
btenidos del
adas.
laciones
3+ para su
ner un claro
ambiando el
e, al mismo
a un control
el tetrámero.
alor medido
s
n
a
a
l
a
y
e
e
l
o
l
o
l
.
o
como
propo
que c
espec
realid
subpo
CD8+
célula
para
célula
posit
result
Pacie
F03
F04
F08
F17
F06
En
CD
Como
cump
aunq
A03P
que l
ellos.
o aproximac
orciones ma
cumplieron
cíficas que e
dad específi
oblación qu
+Tetrámero
as realmente
solucionar e
as CD8+tetrá
ivos estimad
tados correg
Ta
nte Péptid
37 A02P8
48 A02P8
A03P2
A03P90
A02P65
80 A02P8
A03P2
A03P90
A02P65
74 A02P8
60 B07P35
n negro se re
D8+marcadas
o se observa
plieron el cri
ue fueron ev
P90 en 1 de l
a proporción
.
ción al límit
yores de CD
este criterio
expresan PD
cas para el
ue represe
que podría
e específicas
este problem
ámero que
da en el cont
gidos se mue
abla III.11. Res
do
Porcencélulaque recel tetr
4T 0,
4T 0,
8K 0,
0Q 0,3
5Q 0,
4T 0,2
8K 0,2
0Q 0,
5Q 0,2
4T 0,7
57G 0,0
saltan aquella
s (tercera colu
a en la tabla
terio de pos
valuados sol
os 2 casos e
n de células
te de confia
8+ teñidas c
o. Un segund
1 es que si
tetrámero
nta al con
a expresar n
s y de esta m
ma que se ap
expresan PD
trol) corregir
estran tambié
sumen de los
ntaje deas CD8+conocenrámero
P
qe
102
164
,14
322
185
284
208
193
231
732
096
as marcacion
umna) superab
a, de las 11
sitividad. Tet
o en dos cas
valuados. El
expresando
90
anza para c
on el tetrám
do problema
iendo que p
sino que en
njunto de
niveles signi
manera alte
plicó en el pr
D 1 y con es
r la proporció
én en la tabl
resultados o
Porcentaje decélulas CD8ue reconocenel tetrámero
0,024
0,145
0,279
0,315
0,32
0,128
0,491
0,063
0,586
0,226
0
es exitosas, e
ba al doble ob
combinacio
trámeros com
sos. El A02P8
B07P357 fu
PD 1 fue me
considerar p
mero. En la ta
a que surge
parte de las
n cambio so
falsos posi
ificativamen
rar los porce
resente traba
e valor (y co
ón medida e
a III.11.
btenidos del
n
Porcentacélulas CTet+ q
expresan
26,5
39,1
42,4
40,8
44,6
37,9
44,4
39,9
39,9
89,8
74,7
es decir, aque
btenido en la p
nes de mue
mo el A02P6
84 fue positiv
e positivo en
enor al 50%
positivas las
abla III.9. se r
al analizar l
células CD8+
on falsos po
itivos provi
te distintos
entajes estim
ajo fue dete
onsiderando
n la població
análisis de te
je deCD8+uePD 1
PorccéluTe
expre
5
1
4
8
6
9
4
9
9
8
7
ellas donde e
población CD8
estra y tetrá
65 y el A03P
vo en 3 de lo
n el único ca
en tres caso
muestras q
resaltan las m
a proporció
+Tetrámero+
ositivos de
iene de la
de PD 1 q
mados. La a
erminar la pr
la proporció
ón CD8+Tetr
trámeros.
entaje deulas CD8+et queesan PD 1 a
48,0
38,5
40,9
68,7
69,2
el porcentaje
8 (cuarta colu
mero analiz
P28 resultaro
os 4 casos ev
so evaluado
os y casi 100%
que posean
marcaciones
n de células
+ no son en
marca, esta
a población
que aquellas
proximación
roporción de
ón de falsos
amero+. Los
Porcentajecorregido deagotamiento
19,9
37,4
39,4
99,2
74,7
de células
umna).
adas, solo 5
on negativos
valuados y el
o. Se observa
% en uno de
n
s
s
n
a
n
s
n
e
s
s
5
s
l
a
e
Figura III.28. Resulta
91
dos obtenidoos del análisis de tetrámeroos.
III.4.
El est
escap
del tr
logró
estuv
pacie
mililit
emba
Esto
la sec
en el
A par
escap
restri
todas
fuero
afinid
detal
en el
F
. Evaluació
tudio del imp
pe se realizó
ratamiento y
ó secuenciar
vo asociada a
entes con niv
tro de sang
argo, de las 3
sugiere que
cción de mat
34% (11/32
rtir de las se
pe así como
icción media
s las muestra
on resumidos
dad predicha
les de las se
Anexo VI. Lo
igura III.29. R
ón del impa
pacto del tra
mediante el
y luego de su
exitosamen
a la cantidad
veles indete
gre) y 2 pos
34 muestras
aun con baj
teriales y mé
) de los pacie
ecuencias vir
o también la
ante análisis
as disponible
s en la tabla
a por el alelo
ecuencias pe
os resultados
Resultados de
acto del tra
atamiento an
l análisis de
u inicio. Del t
te 29 y 6 de
d de virus en
ectables de v
seían valore
s exitosamen
a eficiencia,
étodos result
entes en los
rales obtenid
a afinidad p
in sílico. Ini
es de los pa
a III.4. Para c
o y se compa
ptídicas en c
s del análisis
l análisis in sí
92
atamiento
ntirretroviral
las secuencia
total de 50 se
e ellas, respe
la muestra:
virus en san
s cercanos
nte amplifica
la metodolo
tó relativam
cuales no se
das fue posib
predicha fre
cialmente se
cientes eval
cada epítope
aró con la ma
cada muestra
s se muestran
ílico de afinida
de ELISP
o antirretro
l en la selecc
as virales pre
egundas y 10
ectivamente
de las 26 m
ngre (debajo
a la indetec
adas, 11 prov
ogía de ultrac
ente exitosa
e detectaba e
ble evaluar t
ente al alelo
e analizó la s
uados en la
e analizado e
agnitud de la
a y los valor
n en la figura
ad frente a la
POT.
oviral
ción y persist
esentes en p
0 terceras m
. La baja efi
uestras no e
o de las 50 c
ctabilidad (5
venían del m
centrifugació
a ya que perm
el virus.
tanto la pres
o del gen H
secuencia am
sección ant
en ensayos d
a respuesta
es predichos
a III.29.
a magnitud de
tencia de mu
pacientes ant
muestras reco
ciencia de a
exitosas 21 p
copias de AR
53 y 72 cop
mismo tipo d
ón del virus
mitió secuen
sencia de mu
HLA para el
minoacídica
erior y cuyo
de ELISPOT s
medida. La t
s de afinidad
e respuesta en
utaciones de
tes del inicio
olectadas, se
mplificación
provenían de
RN viral por
pias/ml). Sin
e pacientes.
descripta en
nciar el virus
utaciones de
cual poseía
del virus en
s resultados
se analizó la
tabla con los
d se proveen
n ensayos
e
o
e
n
e
r
n
.
n
s
e
a
n
s
a
s
n
Estos
la pr
signif
Luego
respu
de es
la pre
evide
que r
analiz
mues
Fi
Como
casos
surgi
fuero
En la
muta
mues
s resultados s
resencia de
ficativas (F3,8
o, mediante
uesta citotóx
scape cuando
edicción in s
encia de coex
representara
zado para ca
stran en la fig
igura III.30. Co
o se observa
s donde exis
miento del e
on analizadas
tabla III.10.
ado) en cada
stras.
sugieren que
secuencias
86=0,829; p=0
e análisis de
xica. Para cad
o cumplían la
sílico de afin
xistencia de
a la mayor v
ada epítope
gura III.30.
omparación d
a, la mayoría
ste un camb
escape ocurr
s en mayor d
se muestra
a muestra,
e la detecció
s peptídicas
0,481).
secuencia
da combinac
a condición d
nidad sugerí
más de una
entaja para
y comparad
de las variante
a de las sec
bio de frecu
rió en algún m
detalle para
para cada c
y en rojo a
93
ón de respue
de mayor
se evaluó la
ción de mues
de presentar
ía la desapa
variantes pe
el virus. El n
do en las pr
es salvajes ym
muestra
uencias pres
uencia entre
momento en
identificar e
combinación
quellos en
sta inmune p
afinidad, a
a existencia
stra péptido
r la mutación
arición del e
eptídicas se
número de p
rimeras y seg
mutadas enco
as.
sentaban ev
la primera
ntre ambas t
evidencia de
n analizada e
los cuales o
péptido espe
aunque las
o no de ev
o se identificó
n previamen
pítope, en l
seleccionó p
péptidos “sa
gundas mue
ontradas en la
videncia de e
y segunda
omas. Por es
selección ac
el estado de
ocurrió un c
ecífica estuv
diferencias
videncia de
ó aquellas co
te identifica
os casos en
para este aná
alvajes” y “m
estras. Los re
as primeras y
escape inmu
muestra sug
sta razón, la
ctiva de esca
cada epítop
ambio de e
o asociada a
no fueron
escape a la
on evidencia
da o cuando
que existía
álisis aquella
mutados” fue
esultados se
segundas
une y en los
giere que el
s secuencias
ape inmune.
pe (salvaje o
estado entre
a
n
a
a
o
a
a
e
e
s
l
s
.
o
e
Cuan
pépti
se m
secue
se en
Tabla
E
e
do se analiz
ido en los en
uestra en la
encia tendían
ncontraban e
III.10. Esquem
Pa
En la tabla se
casos donde
estuvo presen
ninguna de l
an estos dat
nsayos de EL
figura III.31
n a presenta
en estado sal
matización de
acienteAP1
F026
F027
F030
F037
F047
F048
F050
F060
F063
F070
F080
F087
F090
F119
F133
F155
F174
F182
F189
F197
F244
resume la com
la secuenciac
te en ambas m
as muestras y
tos en conju
ISPOT, no se
1., los epítop
ar mayores p
vaje en amb
el estado de l
A01125
A02P65
mparación de
ción fue exitos
muestras, en a
y en rojo, aque
se
94
unto con la m
e encontraro
pes donde ex
proporciones
bas muestras
os distintos e
A02P84
A03P28
secuencias v
sa). En naranja
azul las comb
ellas donde la
elección entre
magnitud de
n asociacion
xistía eviden
s de ensayos
s (61,9%).
epítopes en la
A24P30
B07P35
irales en las d
a se resaltan l
inaciones don
as secuencias
muestras.
e respuesta o
nes significat
cia de escap
negativos (7
s primeras y s
757
B40P95
BP
os muestras o
as combinacio
nde el escape
analizadas sug
observada fr
ivas. Sin emb
pe en base a
70,8%) que a
segundasmu
B40218
B57P242
obtenidas (en
ones donde e
no estuvo pre
gieren un pro
rente a cada
bargo, como
al análisis de
aquellos que
estras.
aquellos
l escape
esente en
ceso de
a
o
e
e
En la
en lo
comb
Como
ser re
A02P
anális
prese
el ree
pacie
pacie
epíto
A03P
emer
igualm
B40P
revirt
mues
al epí
tabla III.11.
os casos en l
binaciones an
o se observa
econocidas
P65, mientras
sis in sílico e
ente tesis qu
emplazo de u
ente ya pose
ente F244 tam
opes A02P84
P28 que en
rgieron muta
mente elim
95. Del paci
tió a salvaje
stra (hacia 20
ítope B40P9
se muestra
los que se e
nalizadas se
, el paciente
como de va
s que en 200
ra reconocid
ue fue demos
una variante
eía la varian
mbién evide
4 y B57P242
nuestro aná
aciones disti
inaron dicho
ente F050 s
en el segun
008). Finalm
5.
en detalle la
encontró evid
muestra en
e F048 prese
riantes que
07 poseía so
da por el alel
strada causa
salvaje por
nte de esca
ncia el surgi
. En el pacie
álisis está as
ntas a la ide
o epítope.
e obtuvieron
ndo tiempo
ente, el paci
95
a secuencia
dencia de se
el Anexo VI.
ntaba en 200
no podían
lo una varia
lo pero por o
a de escape.
una de esca
pe coexistie
miento de u
ente F197 e
sociada a la
entificada en
Este pacien
n 3 muestra
(hacia 2006)
iente F047 ta
peptídica y l
elección acti
04 la coexist
ser reconoc
nte, distinta
otro lado pre
Los paciente
pe entre los
endo con la
na mutación
emergió una
desaparició
n este estudi
te también
s donde llam
) y volvió a
ambién sele
Figura III.31.
medida en lo
según el esta
los distintos
los resultado
iva. El mism
tencia tanto
idas por el a
a todas las
esentaba la m
es F090 y F24
años 2004 y
salvaje en
n de escape
mutación d
n del epítop
io para el ep
presentó e
mativamente
mutar hacia
ccionó la mu
. Perfil de res
os ensayos de
ado (salvaje o
s epítopes baj
os del anális
o detalle pa
de variantes
alelo A02 en
anteriores, q
mutación de
44 también
y 2007, aunq
la primera
entre dichos
de escape en
pe. En el pa
pítope A24P3
escape para
e la mutació
el escape e
utación de es
puesta
e ELISPOT
o mutado) de
o estudio
is de escape
ara todas las
s que podían
n el epítope
que según el
scripta en la
presentaron
ue el primer
muestra. El
s años en los
n el epítope
aciente F027
30 pero que
el epítope
n de escape
en la tercera
scape frente
e
s
n
e
l
a
n
r
l
s
e
7
e
e
e
a
e
T
ID
A02P6
F04
F09
F24
A02P8
F24
A03P2
F19
A24P3
F02
F05
B40P9
F02
F04
B57P2
F24
En la
segun
de su
Tabla III.11. D
D
Fecha dtoma
muestr
65
48 08/01/20
25/10/20
90 12/03/20
01/07/20
44 12/11/20
31/05/20
84
44 12/11/20
31/05/20
28
97 12/08/20
31/05/20
30
27 09/12/20
04/12/20
50 12/01/20
04/12/20
17/07/20
95
27 09/12/20
04/12/20
47 08/01/20
04/07/20
242
44 12/11/20
31/05/20
tabla III.10.
nda muestra
urgimiento a
Detalle de las s
evidenc
de
a Tratamie
004 no
007 si
004 no
008 NA
004 no
007 no
004 no
007 no
004 no
007 no
003 no
006 si
004 no
006 no
008 NA
003 no
006 si
004 no
008 no
004 no
007 no
se observa
a. En la tabla
activo de mu
secuencias pe
cia cambios am
entoConteode CD4
521
227
187,2
27
NA
296
NA
296
699
314
150
300
337
455
300
150
300
87
630
NA
296
que no exis
III.11. se obs
utantes de e
96
eptídicas enco
minoacídicos
o4
CargaViral
88157
<50
122893
2162
4061
1317
4061
1317
4697
542
127093
1753
75282
64959
13024
127093
1753
409639
7121
4061
1317
stió reversió
serva que 4
scape entre
ontradas en la
asociados a e
Secuenciapeptídica
ILKQLHPA
..N.....
..D.....
..E.....
.......S
LIGQIQPS
....L...
....L...
ILGQLQPA
.I......
SLYNTVAT
..F....V
RLRPGGKK
........
........
KYRLKHMVW
......I.
.NN..QI.
KYRLKHIVW
R.Q.....
........
VEVRDTKEA
...K.....
IEVRDTKEA
..IK.....
TSTLQEQIG
..N.....A
n del escape
de los 7 paci
muestras n
asmuestras d
escape inmun
Afinidad
AL 0.280
. 0.526
. 0.592
. 0.357
. 0.432
L 0.451
. 0.374
. 0.374
AL 0.492
. 0.298
L 0.7890
V. 0.7937
KK 0.6070
Q 0.1234
P 0.0511
VW 0.4805
. 0.4508
. 0.0147
VW 0.4508
. 0.5875
. 0.5875
AL 0.321
.. 0.358
AL 0.253
.. 0.312
GW 0.536
A. 0.500
e a la forma
ientes donde
o han inicia
de pacientes d
ne.
Predicciónin sílico
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
WB
WB
salvaje entr
e se encuent
do tratamie
donde se
Presencia demutación de
escape
si
si
si
si
si
no
no
no
no
no
no
si
no
si
si
si
si
si
si
no
si
No
Si
No
Si
No
Si
re primera y
tra evidencia
nto hasta el
ee
y
a
l
mom
indet
indag
obser
7 pac
grupo
escap
estar
21%
debe
Esta a
enten
repre
en la
trata
Fig
p
o
mento de la
tectables del
ga en la relac
rva que, si b
cientes (57,1
o de 11 pac
pe inmune. S
ía asociada
(corrección
ríamos aume
aparente aso
nderse en el
esenta a aqu
a figura III.3
miento se ob
gura III.32. Re
población vira
bserva, el aná
muestra se
secuenci
a segunda t
l virus en sa
ción entre el
ien la asocia
1%) que no h
cientes que
Si las propo
al bajo tama
de Yates).
entar el núm
ociación inve
l análisis de
uellos pacien
2., al compa
bserva que la
econstrucción
l presente en
álisis evidencia
relacionan co
ia aminoacídic
toma de m
ngre. Para u
l inicio de tra
ción no resu
han iniciado
iniciaron tra
rciones estim
año muestra
Para detec
mero total ac
ersa entre el
clones de p
ntes donde e
arar la dive
a misma dism
n filogenética
la primera (e
a un recambio
on una sola de
ca de los epíto
97
muestra, y e
uno de ellos
atamiento y
ulta significat
tratamiento
atamiento, s
madas son c
al ya que co
tar una aso
tual de 18 a
inicio del tr
pacientes co
el tratamient
rsidad viral
minuye dram
de las quasie
n cuadrado az
o poblacional
e las variantes
opes dentro d
en particula
el dato no
la presencia
tiva (Prueba
o presentan
sólo 2 (18,2%
correctas, la
n estos dato
ociación sign
60.
atamiento y
n niveles ind
to ha sido al
dentro en c
máticamente
especies virale
zul) y segunda
donde todas
presentes en
de los cuales s
ar sólo una
se encuentr
a de evidenc
a exacta de F
dicha eviden
%) evidencia
falta de un
os tenemos
nificativa co
la selección
detectables
tamente efe
cada pacien
al inhibirse
es en cuatro p
a (en círculo r
las variantes
n la primera. S
e evidenció se
a ha alcanz
a disponible
cia de selecci
Fisher, p=0,1
ncia, mientra
an cambios
na asociación
una potenci
n un 80% d
activa de es
de virus en
ectivo. Como
te antes y d
la replicació
pacientes. Se
rojo)muestra.
presente en la
Se detalla tam
elección posit
ado niveles
e. Cuando se
ión activa se
41), 4 de los
as que en el
asociados a
n estadística
ia de solo el
de potencia
scape puede
sangre, que
o se observa
después del
n viral.
muestra la
. Como se
a segunda
bién la
tiva.
s
e
e
s
l
a
a
l
a
e
e
a
l
III.5.
Arge
Finalm
es un
detal
carac
secue
datos
realiz
result
most
recom
difere
200
alred
ident
enco
todas
estru
recom
detal
. Análisis fi
entina
mente, dispo
na fuente de
ladamente.
cterizadas co
encia con el
s incluía var
zar la optimiz
tados obten
raron que
mbinación. A
entes posicio
(989 en HX
edor del nu
tificada prev
ntraron sign
s las secuen
cturas BF50
mbinación d
lan dichas re
filogenético
oner del con
e importante
Inicialmente
omo recomb
objetivo de
rias secuenc
zación, la reg
nidos a travé
las secuen
Ambas estru
ones: una de
XB2) en nue
cleótido 500
iamente par
nificativamen
cias con una
00 provenían
e la Forma R
egiones bajo
o de las se
njunto de sec
e evidencia
e se analiza
binantes BF
identificar d
ias virales c
gión viral baj
és del anális
ncias recom
ucturas pose
e ellas prese
estro alineam
0 (1301 en H
ra el análisis
nte asociado
a estructura
n de Brasil.
Recombinan
análisis junt
98
cuencias e
cuencias vira
evolutiva. E
ron un tota
y obtenida
istintos patr
caracterizada
jo estudio es
sis de recom
mbinantes B
eían un únic
entaba el pu
miento y la
HXB2). Cabe
s de asociaci
os al país de
BF200 prov
Además, e
nte Circulant
to con las qu
estudiadas
ales obtenida
s por ello q
l de 165 se
s de nuestr
ones de reco
as en Brasil.
staba constit
mbinación de
F presentab
o punto de
nto de reco
otra prese
destacar qu
ón al HLA. E
e muestreo
venían de Ar
el patrón BF
e Numero 1
ue se describ
y el inicio
as durante la
que nos prop
ecuencias de
o estudio y
ombinación.
Luego de a
tuida por un
esarrollado
ban dos es
recombinac
mbinación a
entaba el pu
e la primer
Estos patron
(p<0.001, pr
rgentina, mie
F200 es par
12 (CRF12_B
irán más ade
Figura
region
análisi
estruct
recom
Brasil.
altame
Argent
formas
identif
genom
repres
ARMA
análisi
de la epid
a presente te
pusimos ana
el gen gag p
y de bases d
Este nuevo
alinear las s
total de 114
mediante Bo
structuras d
ción aunque
alrededor de
unto de rec
estructura e
es de recom
rueba exact
entras que 1
rte de la es
F). En la figu
elante.
III.33. Esquem
nes genómicas
is. Las primera
turas son form
binantes circu
La cuarta es l
ente prevalen
tina. Las otras
s recombinan
ficadas en Arg
ma subtipo B e
entado por la
132. Las 3 reg
s se resaltan e
demia en
esis doctoral
alizarlas más
previamente
de datos de
conjunto de
secuencias y
47 bases. Los
ootScanning
distintas de
ubicado en
el nucleótido
combinación
era la misma
mbinación se
a de Fisher:
14 de las 26
structura de
ura III.33. se
ma de las
s virales bajo
as tres
mas
ulantes en
a CRF12_BF
te en
s 6 son
tes únicas
gentina. Un
es
a secuencia
giones bajo
encuadradas.
l
s
e
e
e
y
s
g
e
n
o
n
a
e
:
6
e
e
Con
llevam
perte
anális
Figur
BootS
regió
Análi
conse
Este
Amer
el objetivo
mos a cabo
enecían al su
sis se encon
a III.33.). L
Scanning co
n, y las rela
sis Bayesian
enso estricto
árbol prese
ricano dejan
de rastrear
o un análisi
ubtipo F para
ntraba ubicad
uego de ed
n el objetivo
aciones filog
o. Utilizando
o construido
enta un gra
do parafilét
el origen d
is filogenéti
a evitar efec
da entre las
ditar el alin
o de confirm
genéticas fu
o la primer m
a partir de e
n clado mo
icas a dicho
99
del subtipo F
co sobre la
ctos confund
posiciones
neamiento, t
mar la ausen
ueron inferid
metodología
ellos se mues
onofilético q
clado todas
F que origin
a máxima re
didores por r
nucleotídica
todas las se
ncia de pun
das por los
encontramo
stra en la figu
Figura
subtip
media
Las rmues
mues
mues
(rojo Las escon cy círc
que agrupa
s las secuenc
nó estas for
egión dond
recombinació
as 1401 y 19
ecuencias fu
tos de reco
métodos de
os un total d
ura III.34.
a III.34. Reconpo F. El a
ante el métod
ramas se colstras de origestras de origestras de origeen particular structuras de círculos verdeulos azules pa
a todas las
cias no perte
mas recomb
e todas las
ón. Las regió
951 en HXB2
ueron reana
mbinación d
e Máxima P
e 38 árboles
nstrucción filoanálisis fue do de Máxima
orean en veen brasilero, en argentinoen de afuerapara muestra
recombinació
s para la estrara la estructu
s secuencias
enecientes a
binantes BF,
s secuencias
ón final bajo
2 (dataset 1,
alizadas por
dentro de la
Parsimonia y
s óptimos. El
ogenética deldesarrollado
a Parsimonia.
erde para lasazul para laso y gris paraa de América
as de España).ón se detallanructura BF500ura BF200.
s de origen
l continente
,
s
o
,
r
a
y
l
l o . s s a a . n 0
n
e
Amer
propo
clado
agrup
enco
clado
Para
analiz
traba
consi
Carib
que
corre
y Bra
arbol
ricano. Dent
orciones sign
o Brasilero s
paron en un
ntraba en el
o monofilétic
realizar la r
zamos el ge
ajo de recon
derado el m
be y correspo
se solicito
espondientes
asil (dataset
les óptimos c
tro del clad
nificativamen
olo cuatro d
clado mono
l 48,5% (n=6
cos) y las rest
reconstrucció
n env en lug
nstrucción fi
mejor disponi
ondientes a
a los auto
s a genomas
2, Figura II
cuyo consen
do american
nte diferente
de las 25 (1
ofilético. En
67) de las se
tantes 39,2 (
ón de la ep
gar del gen g
logenética d
ible actualm
individuos i
ores dicho
completos d
I.33.). Utiliza
so se muest
100
no, dos clad
es (p<0,001)
16%) secuen
cambio, den
ecuencias, la
(n=54) corres
idemia B, a
gag. Esto se
de la epidem
ente debido
nfectados m
alineamient
del HIV de su
ando el mét
ra en la figur
Fi
B.
pa
de
co
or
Am
dos recíproc
) las secuenc
cias tenían
ntro del clad
BF500 en e
spondían a s
diferencia d
e debe a que
mia B en Est
o a la incorpo
muy tempran
to y se in
ubtipo B prev
todo de Má
ra III.35.
gura III.35. R
. Al igual que
ara el subtipo
e Máxima P
oloreadas tam
rigen argenti
mérica (en ne
camente mo
cias de Argen
una estructu
do Argentino
el 12,3% (n=
subtipo F pur
de lo realiza
e recienteme
tados Unido
oración de se
namente en
cluyeron se
viamente ide
áxima Parsim
Reconstrucció
el análisis pa
B fue desarro
Parsimonia. L
mbién según o
ino (en azul
egro).
onofiléticos
ntina y Brasi
ura BF200, q
o la estructu
17, cinco de
ro en el gen
ado para la
ente se ha p
os cuyo set
ecuencias de
la epidemia
ecuencias d
entificados e
monia obtuv
n filogenética
ara el subtipo
ollado median
as ramas se
origen brasiler
) y origen d
agrupan en
l: dentro del
que además
ura BF200 se
e ellas en un
gag.
epidemia F,
publicado un
de datos es
e la zona del
. Es por ello
el gen env
en Argentina
imos cuatro
a del subtipo
o F, el análisis
nte el método
e encuentran
ro (en verde),
del resto de
n
l
s
e
n
,
n
s
l
o
v
a
o
o
s
o
n
,
e
Difer
Figur
recíp
anter
orige
Argen
secue
Con
segm
recom
alinea
entre
recon
mues
con s
relac
B. El
proba
regió
entes estrat
a III.35., enc
rocamente
riormente, la
n argentino
ntina. El “cla
encias de los
el objetivo
mento de su
mbinantes B
amiento la r
e las posicio
nstrucción fi
stra en la fig
secuencias r
iones filogen
análisis de o
able al resto
n de subtipo
egias de bús
contramos q
monofilétic
a optimizació
para el otro
ado Argenti
s Estados Un
de identific
ubtipo B pre
BF de Brasil
región bajo
ones 3087 y
logenética m
gura III.36., e
recombinant
néticas no pu
optimización
de las secue
o B de estas r
squeda no lo
que todas las
cos. Al igua
ón de caract
o. El “clado B
ino” poseía
idos.
car el origen
esente en la
para un to
análisis pose
y 3597 del
mediante Má
el consenso e
tes BF de B
udieron ser r
n de caracte
encias en el
recombinant
101
ograron iden
s secuencias
al que par
teres sugirió
Brasilero” po
11 secuenci
n del subtip
a secuencia
otal de 102
eía un total
HXB2 (data
áxima Parsim
estricto pres
rasil y secue
resueltas y co
res mostro
“clado CRF12
tes particula
ntificar mejo
de Argentin
ra las secu
un origen b
oseía 14 secu
ias de Argen
po B que or
de dicha r
secuencias
de 500 cara
aset 3, Figu
monia obtuv
senta a las 1
encias B de
olapsaron en
que la CRF1
2_BF”, sugiri
res.
ores arboles.
na y Brasil a
uencias de
brasilero para
uencias de B
ntina, dos s
riginó la CR
recombinant
seleccionad
acteres, ubic
ra III.33.). L
vimos 49 árb
13 secuencia
Argentina y
n el nodo cor
12_BF es de
iendo un orig
Figura I
filogenética
en la CRF
muestra el a
método de
muestra el
según las ref
Como se m
grupaban en
subtipo F
a uno de los
Brasil y 10 se
ecuencias d
RF12_BF, ana
te y la may
das. Luego d
cada dentro
Luego de de
boles óptimo
s CRF12_BF
y Brasil. El
rrespondient
e hecho el a
gen monofil
III.36. Re
de la región
F12_BF. Nue
análisis desarr
Máxima Pa
origen de
ferencias deta
uestra en la
n dos clados
analizadas
s clados y un
ecuencias de
e Brasil y 3
alizamos un
yoría de las
de editar el
del gen pol
esarrollar la
os. Como se
en un clado
resto de las
te al subtipo
ncestro más
ético para la
econstrucción
de subtipo B
evamente se
rollado con el
rsimonia. Se
las muestras
lladas.
a
s
s
n
e
3
n
s
l
l
a
e
o
s
o
s
a
n
B
e
l
e
s
Finalm
tiemp
Debid
tamb
TACM
simul
árbol
(figur
Estim
F am
III.37
1970
mente, cons
po al ancest
do a que am
bién una esti
MC y las tasa
laciones de
l. Para los d
ra III.37.).
mamos la máx
ericanas a lo
.A), y para la
s[TMRCA 19
siderando la
tro común m
mbas epidem
imación del
as de substit
Monte Carlo
atasets 1 y
xima probab
os comienzo
a introducció
972 (95%HPD
as filogenias
más cercano
mias poseen
año en el c
tución media
o que permi
3 obtuvimos
bilidad para e
os de la déca
ón de las cep
D: 1970 – 19
102
reconstruid
(TACMC) ta
orígenes m
cual se inició
ante un aná
te que las t
s distribucio
Figura
cercano
para lo
subtipo
entre
represe
TACMC
estimad
distribu
casi idé
argenti
muestr
estimad
por Gil
subtipo
subtipo
para la
represe
origen
el ancestro c
ada de 1970
pas de subti
974) para el
das anterior
anto para el
monofiléticos,
ó cada una d
lisis bayesia
asas de sub
ones ligeram
III.37. Estimac
o (TACMC). S
os distintos TA
o F. La primer
los subtipos
enta el TACM
C para la epid
do para este
ución que es u
énticas que re
no y el cla
ra en el con
dos con el m
bert et al[7] q
os B y D (prim
o B en Amér
a CRF12_BF. L
enta el TACM
a las estructu
común más r
0 (TMRCA: 1
po B en Sud
clado argent
mente, nos
subtipo B c
, la estimac
de dichas ep
no basado e
stitución var
ente asimét
ción del tiem
Se muestran
ZZZZZéZZZÁÁÁ
ZZéZZZZZZZZ
MC para el
demia de subt
estudio es re
una superpos
epresentan lo
do B brasile
ntexto de ot
ismo dataset
que represen
mera distribuc
rica (segunda
La distribució
MC para las ce
ras tipo CRF1
eciente de la
1969; 95%HP
damérica tam
tino y 1972
propusimos
como para e
ión de los T
pidemias. Est
en cadenas d
ríen entre la
tricas para e
po al ancestro
los gráficos
CMC para la
n representa l
La segunda
subtipo F a
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epresentado p
ición de dos d
os TACMC pa
ero. Esta inf
ros dos TAC
y previamen
ta la divergen
ción) y la intr
a distribución
n mostrada e
epas de subti
2_BF.
as secuencia
PD: 1959 – 1
mbién a com
(95%HPD: 1
s estimar el
el subtipo F.
TACMC sería
timamos los
de Markov y
as ramas del
el parámetro
o común más
de densidad
epidemia de
a divergencia
distribución
mericano. B.
ncipal TACMC
por la tercera
distribuciones
ra el clado B
formación se
CMC también
nte descriptos
ncia entre los
roducción del
n). C. TACMC
en esta figura
po B que dio
s de subtipo
1978, Figura
ienzo de los
969 – 1974)
l
.
a
s
y
l
o
s
d
e
a
n
.
C
a
s
B
e
n
s
s
l
C
a
o
o
a
s
)
para
diver
(TMR
orige
1966
(0,00
subti
estim
de la
estim
T
Est
po
pri
like
me
tre
gtr
gtr
gtr
gtr
gtr
sit
sit
uc
uc
co
co
tre
sky
el clado b
gencia entre
RCA: 1956, 9
n de las secu
(95%HPD: 1
0374 – 0,004
po F. analiza
mamos la má
década de
maciones se d
abla III.12. De
tadístico
osterior
ior
elihood
eanRate
eeModel.rootH
r.ac
r.ag
r.at
r.cg
r.gt
eModel.alpha
eModel.pInv
ld.mean
ld.stdev
efficientOfVaria
variance
eeLikelihood
yline
brasilero, Fig
e los subtipo
95%HPD: 193
uencias de s
1962 – 1969
64) para el g
ando las reg
xima probab
1970 (TMRC
detalla en la
etalle de los e
Datas
Me
110
11
99
1,
eight
7,
1,
ation
6,
99
10
gura III.37.B
os virales F1
35 – 1972). L
ubtipo B am
), respectiva
gen env del s
iones de sub
bilidad para e
CA: 1969, 9
tabla III.12.
estadísticos ob
set 1 (Subtipo F
edia E
025,772
100,177
925,595
,64E 03
50,097
0,296
0,865 1
0,209
,61E 02
0,149
0,493
0,229 1
,65E 03
0,456 2
0,478 2
,28E 03 8
925,595
033,642
103
B]. Además,
1 y F2 alred
Las estimaci
ericanas con
amente. Las
subtipo B y 0
btipo B de la
el ancestro c
5%HPD: 194
btenidos en lo
F gag) Data
ESS M
288,075 55
210,314
191,025 5
269,647
504,68
899,059
374,083
676,264
275,534
201,065
1417,53
937,733
266,069
172,768
168,515
990,252
191,025 5
226,825
estimamos
dedor de fin
ones para d
n el dataset 2
tasas de sub
0,00167 (0,0
as secuencias
común más c
46 – 1981, F
os análisis filo
aset 2 (Subtipo
Media
5742,037
659,577
55082,46
4,19E 03
50,873
0,5
0,988
0,184
0,188 1
0,183
0,583
0,192
4,22E 03
0,194
0,196
4,52E 03 1
55082,46
602,535
s la máxima
nales de 195
ivergencia e
2 fue 1953 (9
bstitución es
0115 – 0,002
s recombina
cercano de la
Figura III.37.
ogenético por
o B env) Da
ESS
451,943
447,648
245,187
234,56
672,1
4717,204
974,567
1943,266
16443,704
6901,98
3427,117
8646,682
321,588
1029,341
1029,613
10209,668
245,187
1231,041
a probabilid
50s, comienz
entre subtipo
95%HPD: 194
timadas fue
210) para el
antes BF en e
a CRF12_BF
C). La estad
r el método b
ataset 3 (CRF12
Media
7258,805
535,633
6723,173
1,31E 03
53,149
0,211
1,284
0,117
0,129
0,102
0,902
0,401
1,31E 03
0,276
0,281
1,54E 02
6723,173
530,599
dad para la
zo de 1960s
o B y D, y el
47 – 1959) y
ron 0,00419
gen gag del
el dataset 3,
a comienzos
ística de las
bayesiano
2_BF pol)
ESS
266,28
207,007
1122,17
257,282
157,972
9405,613
7067,154
5621,594
4741,266
13502,683
27359,796
28479,785
259,431
1938,911
1938,829
19417,768
1122,17
205,038
a
s
l
y
9
l
,
s
s
Finalm
trans
en pa
aque
II.17.
proba
obten
con H
de SI
q75=
F
M
mente, se u
scurrido desd
articular, dis
llos que han
de materia
abilidad del T
nida para el
HIV 1 en la r
DA. Como s
1985).
Figura III.38. E
Markov. A. Se
donde puede
transición dep
probabilidad
subtipo B en
probabilid
utilizó un m
de el momen
stinguir los c
n conducido
ales y métod
TACMC para
subtipo B co
egión se pue
e muestra e
Estimación de
e muestra la e
en encontrars
penden de las
d para el TACM
n la recombina
dad obtenida
modelo de M
nto de la inf
casos de SID
a la muerte
dos y en el
a la introducc
ontenido en
ede determi
en la figura I
el año de dete
estructura bás
se cada uno de
s variables qu
MC del subtipo
ante CRF12_B
con el modelo
104
Markov de
fección hasta
A diagnostic
e del pacient
Anexo VII).
ción del subt
la CRF12_B
nar el año m
II.38., el valo
ección de los
sica del mode
e los individuo
e se detallan e
o F1 en Sudam
BF (ídem figur
o de Markov p
la epidemia
a el moment
cados por re
te sin ser de
De esta m
tipo F en Arg
F) como la p
más probable
or medio pa
primeros caso
lo con los seis
os hipotéticos
en la figura. B
mérica (ídem f
a III.37.C). En
para los prime
a del HIV p
to de progre
econocimient
etectados (ve
manera utiliza
gentina (que
probabilidad
e de reconoc
ra dicho año
os de SIDA me
s estadíos mut
s analizados. L
B. Se muestran
figura III.37.A)
rojo se muest
eros casos de
ara predeci
esión a SIDA
to de sintom
er detalles e
ando la dist
resulta supe
de la prime
cimiento del
o fue 1981 (
ediante un m
tuamente exc
Las probabilid
n las distribuc
) y para el TAC
tra la distribu
SIDA en la reg
r el tiempo
y muerte, y
matología de
en la sección
tribución de
erpuesta a la
era infección
primer caso
(q25=1978 –
odelo de
cluyentes
ades de
ciones de
CMC del
ción de
gión.
o
y
e
n
e
a
n
o
–
IV. DISCUSIÓN
IV.1.
El pre
que
come
anális
casos
de m
regio
como
analiz
desar
En es
result
datos
podrí
por l
realiz
proce
todas
viral
Si bie
ident
epide
estud
recom
subti
Europ
IV.2.
a la
En es
el fin
B ci
. Las muta
esente traba
son blanco
enzar resalta
sis de datos
s determinar
ayor recono
nes que, en
o un conjunt
zados. De es
rrollo de una
ste sentido, l
taba ideal p
s como son
íamos identi
a respuesta
zado sobre t
edimiento si
s formas, las
Nef como las
en existen v
tificación de
emiología m
dios tambié
mbinantes e
po B podría
pa.
. El HIV 1 S
respuesta
ste sentido, n
al de la secc
rculantes e
aciones de
ajo de tesis
de la resp
ando que la
fue de carác
r característi
ocimiento po
n promedio,
o y que no s
sta manera,
a futura vacu
a estrategia
para llevar a
secuencias v
ificar las reg
a inmune m
odo el geno
gnificaba al
s proteínas v
s más inmun
varios traba
e mutacione
olecular par
n en nuest
entre los sub
an ser signif
Subtipo B d
inmune lu
nuestro anál
ción de Resul
en Argentin
escape en
doctoral tuv
uesta inmun
aproximació
cter poblacio
icas de la re
or la respuest
resultaran m
son necesaria
los resultad
una.
de identifica
cabo este o
virales y car
giones del pr
mediada por
ma viral; sin
comienzo de
virales codifi
nogénicas.
ajos publicad
es de escap
rticular de n
ro país. No
btipos B y F
ficativament
de Argenti
uego de su
lisis filogené
ltados y com
a podrían
106
las varian
vo como pro
ne del hosp
ón utilizada
onal. Esto qu
spuesta inm
ta inmune d
más frecuen
amente las m
dos aportará
ación de mu
objetivo ya q
acterización
roteoma vira
los genes H
embargo de
el presente
icadas por e
dos previam
e mediante
uestra regió
o solamente
F sino que t
e distintas
ina acumul
introducci
tico del orig
mentado más
provenir d
ntes del HIV
opósito pode
pedador en
para el dise
uiere decir q
mune individu
e un individu
temente rec
mejor recono
n al conjunt
taciones de
que, con un
de los gene
al que fuera
HLA I. Idealm
ebido a la co
trabajo, el a
el gen gag, s
mente en rev
análisis es
ón justifica la
e debido al
ambién deb
a las de otr
ló mutacio
ión desde
en de la epid
s adelante, m
de un núm
V en Argen
er identifica
nuestra po
eño de los d
que no se pla
ual como se
uo. En camb
conocidas en
ocidas en cad
to de inform
escape med
conjunto re
es HLA de lo
n más frecu
mente, el a
omplicación
análisis se lim
se considera
vistas intern
stadístico [3
a necesidad
hecho de
bido a que la
ras regiones
ones que fa
Norteamé
demia en Ar
muestra que
mero muy
ntina
r los epítope
oblación. Es
distintos exp
anteó en nin
ría, por ejem
bio, se busca
n la població
da uno de lo
mación releva
iante análisi
elativamente
os individuos
uentemente
nálisis debe
metodológic
mitó al gen v
n, junto con
nacionales a
4,46,54,55,6
de realizar e
que circule
as mismas v
s como Nort
avorecen la
érica
rgentina, des
las variante
reducido d
es del HIV 1
importante
erimentos y
nguno de los
mplo, el sitio
ron aquellas
ón infectada
os individuos
ante para el
s estadístico
e sencillo de
s infectados,
reconocidas
ería haberse
ca que dicho
viral gag. De
n la proteína
acerca de la
65,91,92], la
este tipo de
en variantes
variantes de
teamérica o
a evasión
scripto hacia
s de subtipo
e variantes
1
e
y
s
o
s
a
s
l
o
e
,
s
e
o
e
a
a
a
e
s
e
o
a
o
s
norte
geog
conse
en 24
aque
(OR<
analiz
result
subti
(Figu
amin
amin
A24,
menc
preva
un ca
haya
de la
camb
Previ
acum
idea a
sus d
result
relati
tiemp
evide
comú
30 y
epíto
espec
segun
por la
respe
eamericanas
ráfico bien p
enso Argenti
4 posiciones
llas mutacio
1) que incre
zan secuenc
tados de est
po B de Arge
ra III.37) y,
oácido Lisin
oácidos Arg
A01 y A02
cionadas) se
alencia en nu
ambio simila
realizado un
s secuencias
bios, no han
amente se
mulación de m
analizando d
datos y enc
tado de la p
iva de las va
po. Nuestro
encia que ap
ún. Aunque s
alelos A24)
ope SLYNTVA
cifica[49]; y
ndo residuo
a molecular
ectivamente
que han
podría justif
ina con la se
s de la prote
ones de esca
ementaron s
ias de subtip
ta tesis pod
entina provi
como se ob
na (K), Treo
inina (R), Va
(para los c
encuentran
uestro país e
r en dicha p
n análisis tem
s consenso d
llegado a alc
ha sugerido
mutaciones
dos mutacion
contraron q
propagación
riantes porta
estudio en c
oya la hipóte
solo una de
) luego de l
ATL con restr
las mutacio
del epítope
de HLA de a
[93]). Tamb
colonizado
icar una dife
ecuencia con
eína viral Ga
ape identifica
su frecuenci
po B proveni
ría realizarse
no de la epi
serva en la
onina (T) y
alina (V) y A
cuales posee
entre los m
es muy simi
oblación. Sin
mporal de e
de dicho país
canzar frecue
o que asoci
de escape[3
nes comunes
ue estas m
de un virus
adoras de m
cambio ident
esis de que s
las cuatro pe
a corrección
icción A02 fu
nes V83A en
NSSQVSQN
cuerdo al an
bién encont
107
nuestra reg
erenciación
nsenso de Est
g dentro de
adas en nue
a en el subt
entes de los
e inicialmen
demia de Es
figura III.9.,
Serina (S)
Asparagina (
en restricció
más prevalen
lar a la de E
n embargo, n
ste tipo de m
s de donde s
encias mayor
aciones neg
34,54,65]. En
s de escape.
utaciones a
fundador en
utaciones de
tificó cuatro
se han acum
ermanece si
n filogenétic
ue previame
n el séptimo
Y con restric
nálisis in sílic
tramos para
gión. Y lueg
molecular. D
tados Unido
e una región
estro estudio
tipo B, son
Estados Uni
te con la fig
stados Unido
las posicion
fueron pau
N). Resulta
ón los epíto
tes en Argen
stados Unid
no existen re
manera que
se observa q
ritarias.
gativas (OR<
n particular,
Sin embargo
altamente p
n la població
e escape y sa
mutaciones
ulado en el t
gnificativam
ca, la mutac
ente demostr
o residuo de
cción A01 es
o (IC50 104
las cuatro
go la diverg
De hecho, a
s se observa
total de 39
o a través de
claramente
idos. Un prim
gura III.35 d
os a mediado
nes P30, P83
latinamente
interesante
pes que co
ntina (Figura
os de mane
eportes de E
sólo dispon
ue, en caso
<1) podrían
Leslie et al
o, Battachary
revalentes e
ón, apoyándo
alvaje perma
s de escape a
tiempo hasta
ente asociad
ción T84V en
rada que dis
l epítope SL
s probable q
nM a 162 nM
mutaciones
gencia por
l comparar
an aminoácid
99 aminoácid
e asociacione
minoritarias
mer análisis g
onde se obs
os de la déca
3 y P125 que
reemplazad
recordar qu
ntienen las
a III.3). Por o
ra que podr
Estados Unid
nemos de la
de haber oc
ser el resu
[54] han exp
ya et al [46]
eran probab
ose en que l
anecían cons
altamente p
a volverse el
da al alelo H
n el octavo
minuye la re
LYNTVVTL y S
que reduzcan
M y 61 nM a
s (que actua
aislamiento
la secuencia
dos distintos
dos. Es más,
es negativas
s cuando se
global de los
serva que el
ada de 1970
e poseían el
das por los
ue las alelos
mutaciones
otro lado, su
ía esperarse
os donde se
información
currido estos
ultado de la
plorado esta
reevaluaron
blemente el
a frecuencia
stantes en el
revalentes y
l estado más
LA (posición
residuo del
espuesta CTL
S125N en el
n la afinidad
15,205 nM,
almente son
o
a
s
,
s
e
s
l
0
l
s
s
s
u
e
e
n
s
a
a
n
l
a
l
y
s
n
l
L
l
d
,
n
altam
domi
preva
anális
que 7
enco
Intere
molé
mues
conju
estad
por H
que e
subti
Cons
amin
parec
incre
respu
IV.3.
desa
clínic
Debid
antirr
posib
a sel
droga
Anali
las po
sitios
en nu
proba
mente preva
naban uno d
alencia en el
sis de otras
7 de las 10 i
ntraban ubic
esantemente
cula HLA y
stra en la tab
unto de dato
dística. Por lo
HLA sí exista
encontramos
po B podría
iderando qu
oacídicas fija
cen mostrar
mentos grad
uesta inmune
. La acum
arrollo del
co de la inf
do a que a
retroviral fu
bilidad de qu
ección med
as antirretro
zando estas
osiciones 12
s de clivaje: V
uestro estud
able que fue
lentes tanto
de los dos su
l tiempo (p<
regiones del
identificadas
cadas dentro
e, cuatro de
tres de ella
bla III.2, exce
os no nos p
o tanto, es p
an aunque n
s que cambi
estar relacio
ue a nivel
adas se enc
r un fenóm
duales en m
e mediada p
ulación de
tratamien
fección
nalizamos s
ue desarroll
e los increm
iada por dro
virales sería
regiones en
25 y 357) se
VSQNY/PIVQ
dio se encue
era independ
o en subtipo
ubtipos viral
0,05; Chi cu
l gen gag qu
s (aparte de
o de epítope
ellas se enco
as demostra
epto para aq
permite dete
posible que a
o fuéramos
aron signific
onado con el
de hospeda
contraban as
meno similar
mutaciones a
or HLA.
e las muta
nto antirre
secuencias d
lado y se
mentos de pre
ogas antirre
n aquellos d
ncontramos q
encontraban
QN y KARVL/
ntran ubicad
diente de las
108
B como F)
es, tres de e
adrado para
ue cambiaro
las 2 previa
es conocidos
ontraban ub
aban una re
quellas 3 aso
ectar mayor
aquellas aso
capaces de
cativamente
menor tama
ador se dem
sociadas a re
r a nivel po
a lo largo d
aciones ob
etroviral d
del HIV en
volvió prog
evalencia de
etrovirales. E
onde ocurre
que dos de l
n ubicadas d
AEAMS. Sin
das en esos
fuerzas sele
que en tiem
ellas mostran
a tendencias,
n significativ
amente iden
y las restan
icadas espec
educción sig
ociaciones, la
res asociacio
ciaciones qu
detectarlas.
en el tiemp
año muestra
mostró que
espuesta CT
oblacional, s
de la proteí
bservadas
de las últim
un período
gresivamente
e algunas mu
En la proteín
e el clivaje m
las mutacion
dentro de ep
embargo, ni
sitios espec
ctivas que ac
mpos tempra
ndo increme
, Tabla III.2)
vamente en
ntificadas po
tes 3 dentro
cíficamente e
gnificativa de
as limitacion
ones debido
ue confirman
. También, e
o en el subt
l del primero
la mayoría
L [38,41,94,9
sugiriendo q
na Gag pod
no estaría
mas décad
de tiempo
e más efici
utaciones obs
na Gag, los
mediado por l
nes analizada
pítopes que
inguna de la
cíficos y por
ctúan sobre
anos de la e
entos signific
. De hecho,
el tiempo, e
r análisis est
o de epítope
en el sitio de
e la afinida
nes inherente
o a la falta
n una selecci
el bajo núme
tipo F compa
o.
a de las su
95], nuestro
que la may
dría ser dirig
a relaciona
das ni con
o donde el
iente, consi
servadas fue
sitios bajo
la enzima vir
as (aquellas
se superpon
s mutacione
lo tanto su
los sitios de
epidemia no
cativos de su
mediante el
encontramos
tadístico) se
es predichos.
e anclaje a la
d. Como se
es a nuestro
de potencia
ión mediada
ero de sitios
arado con el
bstituciones
s resultados
yoría de los
gidos por la
ada con el
el estadío
tratamiento
deramos la
eran debidas
presión por
ral Proteasa.
ubicadas en
nían con dos
es analizadas
selección es
clivaje.
o
u
l
s
e
.
a
e
o
a
a
s
l
s
s
s
a
l
o
o
a
s
r
.
n
s
s
s
Resul
de la
diagn
obten
que
enfer
estad
hacie
de pr
IV.4.
el tie
Clasif
difere
negat
mant
asoci
Otras
encue
posic
podrí
indivi
encue
subya
relac
ident
el me
del H
restri
[47,9
lta importan
a infección.
nóstico que
nidas de indi
cambios en
rmedad, se e
díos tempran
endo a las mu
revalencia de
. Las muta
empo
ficando las m
entes dinám
tivas y asoci
tenido const
aciones neg
s mutacione
entran ubic
ciones 76 en
ían haber p
iduos que n
entra en baj
acente a la
ionada con
tificadas a tr
ejor caracter
HIV [50,54]. T
icción A03 q
8].
nte también m
De hecho,
es común e
ividuos que
n las mutac
esperaba qu
nos de la in
uestras toma
e mutaciones
aciones de
muestras de
micas en el t
aciones posi
antes en el
ativas (ahor
es encontrad
adas en res
nuestro est
erdido su a
no poseen e
a prevalenci
tendencia h
el costo e
avés de asoc
rizado y se h
También den
ue se ha dem
mencionar q
considerand
en nuestro
se encontrab
ciones de e
e la mayoría
nfección[91]
adas incluso
s de escape C
e escape ha
acuerdo al
tiempo para
itivas. Aquel
tiempo a un
a el estado
das que han
siduos de a
udio (tercer
asociación co
el alelo selec
ia en la pobl
hacia la acum
en el “fitne
ciaciones po
a demostrad
ntro de este
mostrado qu
109
que se han an
do el retras
país es pro
ban en estad
escape estu
a de las mut
y que persi
en estadíos
CTL.
an present
OR de asoc
a las mutaci
las identifica
na baja preva
consenso) h
n aumentad
anclaje a la
residuo del
on el alelo
ctivo, algo q
ación (como
mulación o l
ess” de la m
ositivas, la T2
do que dismi
grupo se enc
ue revierte e
nalizado mue
o del mom
obable que l
díos avanzad
uvieran influ
taciones de e
istieran lueg
avanzados d
tado tres c
ciación con l
ones de esc
adas por aso
alencia, mie
an aumenta
do su preva
molécula
epítope ELR
HLA como
que ocurriría
o el alelos HL
a permanen
mutación se
242N en el e
inuye signific
cuentra la m
en ausencia d
estras tomad
ento de inf
la mayoría d
dos de la infe
uenciados p
escape CTL f
go de varios
de infección
comportam
os alelos HL
cape identif
ociaciones po
ntras que aq
ado significat
lencia signif
HLA, como
RSLYNTV con
consecuenci
a mucho m
LA B08 para
ncia a baja p
eleccionada.
epítope TW1
cativamente
mutación K28
de presión m
das en el est
fección al m
de las mues
ección. Si bie
por la prog
fueran selec
años de in
apropiadas
mientos di
LA, fue posib
icadas por a
ositivas pare
quellas ident
tivamente e
ficativament
las mutacio
restricción
ia de su pro
ás rápido si
la posición 7
prevalencia
Entre las
0 con restric
e la capacida
8QR del epíto
mediada por
adío crónico
momento de
stras fueran
en es posible
resión a la
ccionadas en
fección [41]
para análisis
istintos en
ble observar
asociaciones
cen haberse
tificadas por
n el tiempo.
te y que se
ones en las
B08[96,97]),
opagación a
i el alelo se
76). La razón
podría estar
mutaciones
cción B57 es
d replicativa
ope RK9 con
el alelo A03
o
e
n
e
a
n
]
s
n
r
s
e
r
.
e
s
,
a
e
n
r
s
s
a
n
3
IV.5.
adap
Por o
que t
decir
limita
posit
analiz
ident
enco
sugie
encue
selec
muta
la re
comu
IV.6.
subt
Los re
pobla
prese
epíto
que l
de la
replic
progr
son n
exper
progr
respu
carga
trans
son c
. La acu
ptativame
otro lado, nu
tienen releva
, encontrars
ados a cam
iva). En el
zadas se enc
tidad proteó
ntrado a tr
eren que la
entra altam
ción negativ
ación en la p
plicación de
unicación pe
. La acum
tipos virale
esultados pr
ación, podría
encia del esc
ope frente a
os virus se a
a epidémia
cativa. En c
resivamente
necesariame
rimentos de
resivamente
uesta inmun
a viral, lo q
smisión por e
característica
umulación
nte
uestro anális
ancia signific
se bajo selec
biar pueden
presente es
cuentran suj
ómica del H
avés de OR
acumulació
ente limitad
va el escape
osición 30 (t
el HIV 1 al m
rsonal).
ulación de
es mediada
resentados e
a ser un fact
cape en el a
la respuesta
daptan hacia
mundial d
contraste, A
menos capa
nte contrad
e competen
menos viru
e a nivel po
que al mism
evento de ex
as esperable
de escap
sis de tasas d
cativa para e
cción negativ
n evoluciona
studio encon
etas a selecc
HIV), dos de
Rs negativos
n de escap
do a cambi
e es más pr
también iden
menos en lí
e estas mu
a por la sel
en la figura II
tor relevante
ncestro tem
a inmune me
a una evasió
el HIV/SIDA
rien et al [
acitado en e
ictorios con
ncia son c
ulento para
blacional de
mo tiempo e
xposición. Ta
es para un v
110
pe ocurre
dS/dN podrí
el “fitness” v
va) mientras
ar adaptativ
ntramos que
ción negativ
e las cuatro
s se encuen
e es posible
ar, mientras
robable que
ntificada a tr
neas de cél
utaciones p
lección inm
II.9. sugieren
e para la ada
mprano daría
ediada por e
n más eficie
A implica qu
[99] han de
l tiempo en
estos hallaz
onsecuencia
el hospedad
escripta en n
es esperabl
anto una me
irus mejor a
e en siti
ía aportar da
viral se encu
s que aquell
vamente (es
e, mientras
a (esto es, s
o posiciones
ntran bajo s
e en aquell
s que en p
revierta. T
ravés de aso
ulas T huma
podría con
mune
n que el subt
aptación a la
a al subtipo
l alelo HLA q
nte de la res
ue se mejo
emostrado q
el hospedad
zgos ya que
as esperada
dor, y una in
nuestro estud
e que resu
enor virulenc
adaptado a l
ios capac
atos ya que
entren bajo
los sitios qu
s decir, enco
que la may
elección hac
(84 y 125
selección po
as posicione
posiciones q
ambién exis
ociación nega
anas (C.S. A
nducir a u
tipo viral, al
a respuesta
que la porta
que la selecc
spuesta inmu
ora progresi
que el HIV
dor humano.
un reducido
as para un
ncrementada
dio conducir
lte en may
cia como una
a población
ces de ev
se espera q
limitación f
e se encuen
ontrarse baj
yoría de las
cia la conser
) donde el
ositiva. Estos
es donde el
ue se encu
ste evidencia
ativa) no tien
Adamson y E
una conver
menos B y F
inmune deb
a una ventaj
ciona. La idea
une a lo largo
ivamente su
parece hab
. Nuestros re
o “fitness” re
virus que
a eficiencia
ría a niveles
ores probab
a mayor tran
de hospeda
volucionar
ue los sitios
funcional (es
ntran menos
jo selección
s posiciones
rvación de la
escape fue
s resultados
l HIV no se
entran bajo
a de que la
ne efecto en
E. O. Freed,
rgencia de
F en nuestra
ido a que la
a a nivel de
a general de
o del tiempo
u capacidad
berse vuelto
esultados no
eplicativo en
se vuelve
en evadir la
mayores de
bilidades de
nsmisibilidad
adores en la
r
s
s
s
n
s
a
e
s
e
o
a
n
,
e
a
a
e
e
o
d
o
o
n
e
a
e
e
d
a
que
mayo
recie
es un
IV.7.
Los e
pacie
se re
vírge
ellos
que
tratad
muta
signif
obten
indet
III.11
Los p
blanc
10 po
camb
de ep
in síli
estad
6 con
de EL
total
tiemp
incre
ident
Con r
sintet
circula [100
ores tasas de
ntemente se
n mejor pred
. La eviden
ensayos inm
entes luego d
ealizó sobre
nes de trata
habían inici
permanecían
dos para ev
aciones iden
ficativament
ner amplific
tectables en
).
primeros res
co de la resp
osiciones (ap
biado con un
pítopes virale
ico (Tabla III.
dística (Tabla
n restricción
LISPOT pudim
de 10 posi
po, la mitad
mentando s
tificadas por
respecto al t
tizaron los p
]. Es import
e decaimient
e ha demost
ictor de la pr
ncia inmun
unológicos i
de un prome
individuos c
amiento mie
ado para en
n sin tratam
valuar el imp
ntificadas, c
e el conjunt
caciones po
sangre (alre
ultados obte
puesta inmun
parte de las
a tendencia
es capaces d
.2). De esta
a III.1) 10 pép
para alelos
mos confirm
ciones de la
son blanco
ignificativam
ORs negativ
total de 12 p
péptidos par
tante aclara
to de células
rado que el
rogresión a S
nológica ap
in vitro se r
edio de 3 año
con diagnóst
ntras que pa
ntonces el tr
miento para
pacto de los
como se d
o de datos a
ositivas deb
dedor de la
enidos perm
ne según el
dos identific
significativa
de ser recono
manera, se s
ptidos que h
poco frecue
ar reconocim
a proteína v
confirmado
mente su pre
vos.
posiciones d
ra 9 de ellos
111
ar que mayo
CD4 que es
decaimiento
SIDA[101].
poya las pr
ealizaron so
os. Es import
tico reciente
ara el mome
atamiento a
la segunda
s antirretrov
detallará má
a analizar me
bido al gra
mitad de los
mitieron conf
análisis de t
cadas por as
en el tiempo
ocidos por u
sintetizaron,
abían sido s
entes en nue
miento en 5
viral Gag qu
de respuest
evalencia en
onde se enc
ya que para
ores niveles
asociado a u
o de los CD4
redicciones
obre segunda
tante record
e de la infec
ento de tom
antirretrovira
toma nos
virales sobre
ás adelante
ediante secu
n número
s pacientes q
firmar algun
endencia. En
sociación est
o y que adem
uno o más al
, junto con a
ugeridos epí
estra poblac
de los 10 pé
ue cambiaro
a inmune es
el tiempo y
contró asocia
a los restant
de carga v
un virus más
y no el incre
s del anális
as muestras
ar que la pri
cción y por
ma de la segu
al. La posibil
permitió te
e la selecció
e, pero al
uenciación al
de pacient
que iniciaron
os de los ep
n dicho anál
tadística con
más se encon
elos HLA seg
aquellos iden
ítopes por es
ión. Como r
éptidos estud
n con tende
specífica cuy
y que se sum
ación a un a
tes 3 no se d
viral pueden
s virulento; s
emento de l
sis estadís
tomadas a
imera toma
lo tanto era
unda muestr
idad de tene
ener grupos
ón y persiste
mismo tie
l reducir la c
tes con ca
n tratamiento
pítopes que
isis se había
alelos HLA)
ntraban ubic
gún el anális
ntificados po
ste análisis, d
esultado de
diados, es de
encia signifi
ya variante d
man a las 3 p
alelo HLA (Ta
disponía de
conducir a
sin embargo,
a carga viral
tico
los mismos
de muestras
an pacientes
ra, varios de
er pacientes
controles y
encia de las
mpo limitó
apacidad de
rgas virales
o, ver Figura
se suponían
n detectado
que habían
cadas dentro
is predictivo
or asociación
descartando
los ensayos
ecir, que del
cativa en el
de escape ha
previamente
abla III.1), se
información
a
,
l
s
s
s
e
s
y
s
ó
e
s
a
n
o
n
o
o
n
o
s
l
l
a
e
e
n
adicio
pudie
los pr
no se
ser d
alelos
detec
evalu
por lo
en es
pacie
sentid
de m
en só
respu
Por o
frecu
respu
que
preve
muta
dicha
poseí
para
meno
los al
una m
preva
IV.8.
depe
Con e
respu
del p
onal que pu
eron confirm
rimeros ensa
e encontró re
ebido a un p
s fue 4, 2 y
ctara respue
uada (15 pac
o tanto lo m
stimular la r
entes portad
do, estos res
utaciones de
ólo 4 pacient
uestas positiv
otro lado, e
encia del 75
uesta. El 50%
nuestros res
enir la prese
ación emergi
a respuesta.
ían el alelo,
los epítope
ores frecuen
elos tanto H
mejor adapt
alencia, podr
. Las mut
endiente d
el objetivo d
uesta inmune
péptido. Es
udiera defini
mar respuest
ayos de ELIS
espuesta inm
problema de
y 4, respecti
esta específi
cientes). Es i
ás probable
espuesta inm
dores del ale
sultados apo
e escape. Pa
tes pero la A
vas en meno
el epítope m
5% en los in
% de los pac
sultados sug
ntación del
ió luego de
Los epítopes
el último a
es con restri
cias de reco
HLA A como H
tación del v
ría ejercer pr
taciones d
de su posici
de evaluar el
e se llevaron
importante
r un epítope
a específica
POT pero res
mune, en el
tamaño mu
vamente. En
ica a pesar
nteresante q
es que la va
mune. De he
elo A24 pose
ortarían a la
ara las otras
A02P83 y A0
os del 30% de
mas reconoc
ndividuos qu
cientes que r
gieren que d
epítope (com
montarse la
s A03P90 y B
lcanzando t
cción para e
nocimiento s
HLA B en nu
irus a la res
resiones sele
de escape
ión relativ
l impacto de
n a cabo los e
recordar qu
112
e a ser sinte
frente a 5 d
sultó negativ
caso de los
uestral ya qu
n el caso de
de ser el s
que esta pos
ariante escap
echo, 13 de
eían la varia
teoría de de
dos posicion
02P84 conte
e los pacient
cido en nue
ue poseían
respondiero
dicha mutac
mo se explic
a respuesta i
B07P357 fuer
ambién resp
el alelo A02
siendo que l
estra poblac
spuesta med
ectivas mayo
impactarí
va al sitio d
e las mutacio
ensayos adic
ue la mayor
etizado. Los
de ellos (el B
vo en los sub
epítopes B5
e el número
el epítope A
segundo ale
sición haya s
pe se haya tr
las 14 mues
ante de esca
esaparición d
nes con ORs
nidas dentro
tes.
estro análisi
el alelo y a
n, presentab
ción parece
cara más ade
inmune espe
ron reconoci
puestas de e
2 (A02P64 y
a frecuencia
ción (Figura I
diada por es
ores que el re
ían en el
de anclaje d
ones identifi
cionales de E
ría de las m
ensayos inm
B57P242 hab
bsiguientes).
7P242, A11P
de paciente
A24P30 resu
lo mas prev
sido identific
ransmitido y
stras exitosa
ape en el ep
de epítopes
negativos, la
o del epítope
is resultó se
lcanzando m
ban la mutac
eliminar la
elante) pode
ecífica perm
idos por el 5
elevada mag
y A02P84) se
del alelo A0
II.3). Esta ob
ste alelo qu
esto de los al
reconocim
del epítope
cadas como
ELISPOT con
mutaciones i
munológicos
bía resultado
De los 4 pa
P118 y A01P
es estudiado
lta llamativo
valente en l
cada por OR
y de esta ma
amente secu
pítope A24P
virales por a
a A01P125 f
e SLYNTVAT
er el A03P2
magnitudes
ción de esca
respuesta e
mos asegura
itiéndole al
50% de los pa
gnitud. Es lla
e hayan enc
02 duplica la
bservación pu
ue, debido a
lelos.
miento de
e
potenciales
curvas de co
identificadas
s finalmente
o positivo en
ra los cuales
125 pudiera
s con dichos
o que no se
a población
negativos y
nera, fallara
uenciadas en
P30. En este
acumulación
fue evaluada
L mostraron
28, con una
elevadas de
ape y siendo
especifica al
ar que dicha
virus evadir
acientes que
amativo que
contrado las
del resto de
uede sugerir
a su elevada
e maneras
s escape a la
oncentración
s parecieran
e
n
s
a
s
e
n
y
a
n
e
n
a
n
a
e
o
l
a
r
e
e
s
e
r
a
s
a
n
n
corre
sólo u
como
podrí
posic
La pr
más
recon
TCR p
nuev
(ubic
muy
podía
III.16
espec
pobla
recon
En es
citotó
La po
B07P
dos p
simila
obser
escap
Los e
ya qu
anter
En re
se en
Con r
fuero
esponder a e
una de las 9
o anclaje al
ían interferi
ción siguiente
rimer implica
eficiente un
nocimiento p
particular pe
o TCR. En e
ada en el sit
difícilmente
a disminuir e
), pero ser
cificidad (co
aciones citot
nocimiento e
ste sentido,
óxicos “anti
osibilidad de
357S que se
pacientes do
ares a las o
rvaron difere
pe parece re
ensayos reali
ue no eviden
riormente, h
esumen, exce
ncontraron ev
respecto a lo
on limitados
escape al rec
donde se co
HLA (A03P2
r con la uni
e al sitio de a
ancia que tie
n escape qu
por un linfoc
ero que perm
este sentido,
tio de anclaje
e reconocida
el reconocim
también su
omo fue en
tóxicas con d
en F197 sugi
existe una p
escape” [102
una interfer
e encuentra
nde fue ensa
observadas
encias en la
ducir el reco
izados sobre
nciaron difer
habían demo
epto para el
videncias de
os ensayos d
. En el prim
onocimiento
onocía o pre
8, ver Tabla
ón al HLA y
anclaje.
ene la posici
ue previene
ito citotóxico
mite la prese
, los resulta
e) muestran
; mientras q
miento por la
sceptible al
el pacient
diferentes es
iere que en
publicación q
2].
rencia con la
ubicada al la
ayada (Figura
para la mu
s respuestas
onocimiento
e el epítope
rencias entre
ostrado difer
mencionado
e alteracione
de medición
mer caso de
113
o por el TCR
dijo el epíto
a III.1). Sin e
ya que 4 de
ión del esca
e la present
o) que una m
entación en
ados de las
que en los
que la muta
respuesta e
reconocimi
e F48). Si
specificidade
el paciente
que demues
a presentació
ado del sitio
a III.19), y de
tación A03P
s al péptido
inmune.
A02P84 arro
e los péptido
encias de re
o epítope A0
s al reconoci
de polifunci
bido a la fa
y no a la un
pe se encon
embargo, aq
las restante
pe es que se
tación en e
mutación que
el HLA y po
curvas de E
dos paciente
ción A02P65
específica (co
ento por ot
bien en el
es, el hecho
F048 emerg
stra el surgim
ón podría se
o de anclaje
e hecho se o
P28Q anteri
B40P218 do
ojaron result
os A02P84T
econocimient
02P84, para
imiento inm
onalidad y t
alta de célu
nión con la m
traba ubicad
uellas ubica
es 8 se enco
e espera que
l HLA (y po
e previene e
r lo tanto el
ELISPOT para
es evaluados
5Q (ubicada
omo fue en
tra població
presente tr
de que la m
gió la especif
miento de p
r real consid
disminuyó e
bservan redu
ormente me
onde la mut
tados en alg
y A02P84V q
to en estudi
los otros cua
une por mut
etrámeros, l
las para rea
molécula del
da en el sitio
das en otra
ontraban ub
e sea signific
or lo tanto
el reconocimi
reconocimi
a la mutació
s la variante
en medio d
el paciente
ón citotóxica
rabajo no d
mutación pue
ficidad contr
poblaciones d
derando que
el reconocim
ucciones de
encionada.
ación identif
guna forma i
que, como s
os de otros
atro epítope
tación.
os resultado
alizar varias
HLA, ya que
o reconocido
s posiciones
icadas en la
cativamente
también el
iento por un
ento por un
ón A03P28Q
mutada era
del epítope)
F197, Figura
a con nueva
distinguimos
eda evadir el
ra el escape.
de linfocitos
la mutación
miento en los
la respuesta
También se
ficada como
nesperados,
se mencionó
grupos [49].
es analizados
os obtenidos
mediciones
e
o
s
a
e
l
n
n
Q
a
)
a
a
s
l
.
s
n
s
a
e
o
,
ó
.
s
s
s
paral
la ciu
En re
suger
epíto
mues
fuero
epíto
estim
La té
const
propo
atribu
A03P
existe
De he
como
con la
realiz
casos
espec
respu
IV.9.
infec
Los a
virale
sílico
a una
debe
como
proye
que p
figura
elas y en el s
dad de Atlan
elación con la
rido una aso
ope de mane
stral analizad
on en la ma
opes mas com
mular una res
écnica de t
trucción de
orción de la
uyera a algú
P28K y A02P6
en controles
echo, el cont
o fueron las m
a asociación
zar este estu
s donde apa
cíficas mostr
uestas polifu
. Las muta
cción y el in
nálisis de se
es presentes
de la afinida
a asociación
ser interpre
o se mencion
ecto no imp
posee valore
a III.29. los g
segundo caso
nta para real
a evaluación
ociación entr
ra que un es
do no nos p
ayoría de la
múnmente re
spuesta espe
etrámero re
los tetrámer
as muestras
ún problema
65Q. En este
s para asegur
trol consistir
muestras uti
entre los pé
dio en Atlan
rentemente
raban bajos
ncionales en
aciones de
inicio del tr
cuenciación
en las mue
ad por la mo
positiva ent
etada como
nó anteriorm
actan signifi
es de afinid
grupos de ba
o debido a la
lizar las med
de la polifun
e la polifunc
scape tempr
permite inda
as muestras
econocidos e
ecífica polifun
esultó meto
ros fueron to
. Analizando
a en la mue
e punto es im
rar la unión
ría en probar
ilizadas en e
éptidos men
nta no nos pe
la técnica r
niveles de a
ncontradas p
e escape s
ratamiento
en las segun
stras donde
olécula del H
re dicha afin
una mayor
mente, la may
icativamente
ad muy red
aja, media y
114
a elevada mo
iciones.
ncionalidad,
cionalidad en
ano previene
agar en dich
evaluadas,
en nuestro e
ncional.
odológicame
odos adecua
o la tabla II
estra F048 y
mportante ac
de las moléc
rlo sobre mu
ste estudio.
ncionados y e
ermitió avan
resultó exito
agotamiento
para los epíto
se seleccio
o podría pr
ndas muestra
se evaluó la
LA que prese
nidad y la res
proporción
yoría de las
e en la afini
ucidos cuan
y alta respue
ortalidad cel
un trabajo p
n la respuest
e el agotami
ha asociació
positivas, y
estudio (A02P
ente complic
ados, la mar
I.11. la falta
por otro la
clarar que e
culas sintétic
estras que s
De manera q
el alelo HLA
zar más en e
osa demostró
que resulta
opes analizad
onan tamb
revenir est
as permitiero
a respuesta
entaba a cad
spuesta med
de escape e
mutaciones
dad por el H
do seleccion
esta, los tres
ular en las m
previo realiza
ta específica
iento. En nue
n. De todas
y demostraro
P65, A02P84
cada. Si bie
rcación fue n
a de marca
do un prob
n el desarro
cas de HLA c
e conozcan p
que el probl
sintético. El
el análisis. De
ó que la may
a, por otro la
dos.
bién en est
te fenómen
on conocer e
inmune. Re
da epítope se
dida. Sin emb
en el grupo n
de escape a
HLA, excepto
na la variant
s valores má
muestras tran
ado Streeck
a y el estado
estro estudio
s formas, los
on la capac
4, A03P28 y B
en los cont
negativa en
podría exp
lema en los
llo de los tet
on el péptid
positivas par
ema podría
tiempo disp
e todas form
yoría de las
ado, consiste
tadíos tard
no
el estado de
alizando pre
e observó un
bargo, esta t
no responde
nalizadas en
o la mutació
te de escap
s bajos corr
nsportadas a
et al [37] ha
mutado del
o, el tamaño
s resultados
cidad de los
B07P357) de
troles de la
una elevada
licarse si se
tetrámeros
trámeros no
o a analizar.
ra el péptido
relacionarse
ponible para
mas, aquellos
células CD8
ente con las
díos de la
los epítopes
edicciones in
na tendencia
endencia no
edor ya que,
n el presente
ón A03P28Q
e (ver en la
esponden al
a
a
l
o
s
s
e
a
a
e
s
o
.
o
e
a
s
8
s
a
s
n
a
o
,
e
Q
a
l
menc
interp
más e
El an
más p
de se
supo
de es
tardía
la ten
un be
de la
trata
result
trans
antirr
favor
IV.10
Estud
pand
dispe
subse
Nues
indep
Unido
los p
Estad
de B
obten
clado
tiemp
cionado epít
pretarse com
eficientemen
álisis de sec
prevalentes
elección ent
ne que la re
scape y en n
as de la infec
ndencia de e
eneficio adic
evolución v
miento exce
tados sugie
smisión de l
retroviral po
reciendo, en
0. Breve di
dios previos
emia del HI
ersión global
ecuentemen
tros resulta
pendientes c
os. Estos res
rimeros caso
dos Unidos y
rasil. Nuestr
nidas previa
o de subtipo
po y muy poc
tope portan
mo una mayo
nte presenta
uenciación t
que las salva
re tomas de
spuesta inm
nuestros dat
cción, estado
estos cambio
cional para la
viral. En este
eden al indiv
ren nuevos
las variantes
odría torcer
última insta
iscusión ac
han estimad
IV y a la int
del HIV com
te se dispers
ados sugiere
con cepas pr
sultados son
os de SIDA f
y nuestra epi
ras estimaci
mente por g
o B de Arge
co tiempo de
ndo la muta
or predispos
ado por el ale
también perm
ajes en los p
e muestra.
mune montad
tos se obser
o clínico cara
os tardíos a o
a terapia ant
e sentido, e
iduo infecta
beneficios
s de escape
r las curvas
ncia, a los nu
cerca del o
do el tiempo
troducción d
menzó con la
saron al rest
en que la
rovenientes
consistentes
fueron ident
demia BF se
iones para e
grupos bras
entina sugirie
espués del in
115
ación de es
sición a mon
elo.
mitió confirm
acientes est
Este hecho
da en la prim
rva que el e
acterístico en
ocurrir en pa
tirretroviral
es conocido
do y alcanza
poblacional
e a la respu
de acumu
uevos individ
origen de la
o al origen d
del HIV en A
a introducció
o de América
epidemia B
de Brasil y o
s con los dat
tificados en
e supone que
el clado de
ileros [19,10
endo que a
ngreso del su
scape). De
ntar una resp
mar que las
udiados y de
resulta part
moinfección e
scape es fac
n el conjunto
acientes que
al prevenir e
que los ben
an una reduc
es al preve
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116
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117
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n
,
l
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VI. ANEXOS
130
VI.1. ANEXO I – Detalle de los pacientes incluidos en el análisis de asociación
genética y polimorfismos virales enrolados en la primera etapa.
Id Id Id Fecha de Fecha recepción Número de Genotipos HLA Conteo Carga
Muestra CNRS Paciente Nacimiento primera muestra Edad muestras HLA-A HLA-B de CD4 Viral
F001 126872 MJORU 3/19/1949 3/24/2003 54 2 2 24 40 49 ND 500000
F002 127197 FVIAR 12/12/1981 4/2/2003 21 1 24 68 35 40 599 658
F004 127617 MJUOS 7/8/1955 4/10/2003 47 1 2 26 7 38 129 169011
F006 131874 MJOCO 7/29/1950 7/4/2003 52 1 24 68 51 7 113 500000
F008 135675 MJUAC 12/1/1967 9/18/2003 35 1 31 25 18 39 ND ND
F009 136042 FMADU 11/5/1959 9/26/2003 43 1 2 31 39 62 185 41039
F011 136115 FMAFA 12/8/1976 9/29/2003 26 1 2 2 18 50 421 63874
F012 136116 FNAEX 1/3/1966 9/29/2003 37 1 2 2 39 51 236 112521
F013 137096 MADBA 12/23/1964 10/15/2003 38 1 1 11 51 49 466 2441
F014 137617 MJAES 9/1/1969 10/22/2003 34 1 2 68 51 40 ND 23464
F017 139194 MLUVA 2/6/1943 11/11/2003 60 1 3 68 62 62 293 74838
F018 139197 MBAGI 1/31/1948 11/11/2003 55 2 1 29 51 8 9 61315
F021 139357 MANCA 10/2/1968 11/13/2003 35 2 2 2 39 35 190 187395
F022 139741 MMAAL 10/27/1969 11/19/2003 34 1 2 31 NA NA ND 275157
F023 140088 MENCI 9/2/1952 11/24/2003 51 2 1 2 8 58 231 51048
F024 140089 FLOAS 9/16/1975 11/24/2003 28 2 24 68 35 53 162 181288
F025 140098 MGUMI 11/9/1963 11/24/2003 40 1 2 24 51 40 108 116908
F026 140992 MMAFA 10/18/1972 12/9/2003 31 2 2 23 40 49 519 451371
F027 141027 MJUDU 9/19/1968 12/9/2003 35 2 24 24 35 40 150 127093
F028 141074 MHERI 10/4/1965 12/10/2003 38 2 11 68 62 35 95 368953
F030 141420 FPALE 9/20/1975 12/15/2003 28 2 1 2 37 7 272 64755
F031 141836 MOSPO 4/28/1955 12/19/2003 48 1 2 26 27 18 76 49478
F032 141837 FLOSA 4/14/1959 12/19/2003 44 1 24 32 8 49 248 11541
F033 141945 FGLSU 2/22/1964 12/22/2003 39 1 23 68 44 39 502 7878
F034 141946 FALHA 7/26/1959 12/22/2003 44 1 1 11 51 48 295 450716
F035 141955 MCARO 6/3/1974 12/22/2003 29 1 2 2 62 18 47 500000
F036 142030 FROGA 8/7/1956 12/23/2003 47 1 3 33 35 14 4 500000
F037 142108 MFRRI 1/27/1977 12/29/2003 26 2 2 2 48 35 543 6102
F038 142109 MBEVA 5/21/1961 12/29/2003 42 1 2 24 62 41 135 500000
F039 142117 MSAFA 5/10/1972 12/29/2003 31 1 1 2 76 62 513 327466
F040 142118 MALFU 6/7/1962 12/29/2003 41 2 1 3 7 57 255 344685
F041 142189 MRIGO 12/20/1973 12/30/2003 30 1 2 31 15 62 123 96026
F042 142190 MFRCH 6/20/1975 12/30/2003 28 1 2 24 70 39 50 844
F043 142191 FOLSA 5/26/1947 12/30/2003 56 1 24 29 35 44 638 75040
F044 142271 MOSDO 1/19/1945 1/5/2004 58 2 24 26 38 52 121 175113
F046 142440 FNADE 5/3/1979 1/7/2004 24 2 11 24 38 35 555 2461
F047 142524 MALTO 6/4/1968 1/8/2004 35 2 2 68 40 44 87 409639
F048 142525 MPEPE 2/20/1968 1/8/2004 35 2 2 3 39 35 521 88157
F050 142683 FANBA 4/6/1955 1/12/2004 48 3 24 68 35 39 337 75282
F053 142785 MCLGO 4/7/1969 1/14/2004 34 1 2 11 44 35 123 106632
F054 143129 FMACA 5/23/1973 1/21/2004 30 1 3 30 8 38 ND 500000
F055 143333 FNESA 10/25/1953 1/26/2004 50 1 2 3 7 40 78 339539
F056 143401 MMAPI 12/20/1966 1/27/2004 37 1 3 24 57 39 722 46683
F057 143402 MROCA 8/30/1958 1/27/2004 45 1 24 34 70 35 93 125869
F058 143403 MCABA 7/10/1978 1/27/2004 25 1 2 32 7 62 797 1991
F059 143428 MJUHU 6/14/1954 1/28/2004 49 1 2 2 62 40 471 6900
131
F060 143511 FNABR 4/19/1980 1/29/2004 23 2 1 24 7 44 351 28694
F061 143512 MROCA 8/2/1976 1/29/2004 27 1 24 34 70 35 134 106638
F062 143617 FSIGA 9/3/1967 2/2/2004 36 1 2 3 18 18 381 143820
F063 143705 MRATE 5/15/1950 2/3/2004 53 3 2 30 35 41 144 20208
F064 143735 MFEDE 9/23/1977 2/4/2004 26 1 26 30 13 27 238 63237
F067 144177 MOSFA 9/8/1948 2/13/2004 55 1 2 11 27 48 277 33900
F068 144245 FCLAG 11/8/1966 2/16/2004 37 1 1 2 57 50 277.2 12178
F069 144303 MJOMA 8/13/1962 2/17/2004 41 1 1 2 51 50 280.33 199019
F070 144418 FSAGO 10/14/1972 2/18/2004 31 2 1 2 7 40 1078.56 7097
F071 144419 MMAFE 10/18/1972 2/18/2004 31 1 2 23 40 49 275.2 163637
F072 144498 MMICE 4/6/1961 2/19/2004 42 3 2 3 14 51 341.55 22234
F073 144561 FESGO 2/19/1963 2/19/2004 41 1 2 24 7 62 388.96 21051
F074 144640 MLULO 12/6/1975 2/20/2004 28 1 68 68 53 53 288 130651
F075 144707 MRUCA 12/12/1962 2/23/2004 41 1 2 2 51 50 39.1 500000
F076 144747 MMAAL 12/21/1976 2/24/2004 27 1 3 24 7 35 338.1 51049
F078 144954 MHODE 12/12/1975 2/27/2004 28 1 2 23 58 35 402.04 130097
F079 144958 MOMMA 3/8/1977 2/27/2004 26 1 25 31 58 62 317.52 28838
F080 145022 MANDA 4/30/1952 3/1/2004 51 3 2 3 57 39 518.7 78246
F081 145121 FLACO 12/29/1949 3/2/2004 54 2 2 24 62 51 402.56 11330
F083 145272 FANPE 11/26/1966 3/4/2004 37 1 68 31 39 39 194.4 33436
F085 145369 FMAPI 10/22/1971 3/5/2004 32 3 24 33 41 52 150.08 4089
F086 145370 MSIDI 11/27/1968 3/5/2004 35 1 2 3 62 51 159.6 139850
F087 145371 MGEMI 3/23/1976 3/5/2004 27 2 3 31 7 45 528.96 216838
F088 145456 FEJAR 7/16/1972 3/8/2004 31 1 11 68 35 14 6.7 500000
F090 145739 FFATO 3/27/1988 3/12/2004 15 2 2 31 35 53 187.2 122893
F092 146095 MDAPE 7/28/1965 3/18/2004 38 1 68 33 14 39 36.12 223153
F093 146196 MGAAB 12/17/1969 3/19/2004 34 1 30 66 52 48 415.8 9672
F095 146198 FMALO 5/31/1977 3/19/2004 26 2 24 33 40 14 371.28 27498
F096 146341 MNELU 2/18/1968 3/23/2004 36 2 26 31 51 38 77.52 167276
F099 146488 MJUBR 6/23/1981 3/25/2004 22 1 30 31 62 13 1101.6 5082
F100 146489 MFABE 4/26/1967 3/25/2004 36 2 2 2 62 13 518 69413
F101 146501 MSAPI 2/7/1972 3/25/2004 32 1 3 31 39 62 319 37627
F104 146741 MOSCH 11/12/1951 3/30/2004 52 1 31 31 51 39 4.83 500000
F105 146742 MJULU 1/6/1961 3/30/2004 43 1 1 68 8 14 114.66 500000
F106 146743 MELVE 7/3/1966 3/30/2004 37 1 2 68 40 35 364.14 6108
F107 146744 FADPA 6/23/1975 3/30/2004 28 1 31 31 51 48 245.52 100370
F108 146811 MRIHE 5/6/1962 3/31/2004 41 1 30 68 14 39 244.8 57540
F109 146814 FROMO 9/23/1976 3/31/2004 27 1 24 68 40 7 436.24 28397
F110 146997 MLUMI 5/15/1985 4/2/2004 18 1 2 3 62 7 395.56 146058
F112 147393 MSADE 09/11/1962 4/15/2004 41 1 3 31 47 39 299.7 21892
F115 147461 FVILI 9/6/1970 4/15/2004 33 1 1 24 57 7 229.4 2876
F116 147525 MROFU 6/15/1959 4/15/2004 44 1 24 66 41 8 155.55 215648
F117 147560 MGUBA 4/1/1976 4/16/2004 28 1 3 68 51 7 427.68 152637
F118 147659 MMIOR 11/13/1962 4/16/2004 41 1 2 31 62 39 36.3 82688
F119 147712 FBEVE 8/21/1965 4/19/2004 38 2 3 24 40 14 281.3 26733
F121 148165 MRUTO 12/27/1979 4/26/2004 24 1 2 24 62 7 371.91 5922
F124 148325 MMICO 21/12/1978 29/04/2004 25 1 2 3 41 47 71.44 449778
F132 149099 MWAAG 3/24/1975 5/11/2004 29 3 31 31 60 60 245 49085
F133 149269 MJECA 12/7/1982 5/13/2004 21 2 2 2 62 35 362 16882
F143 149800 FPACU 12/29/1977 5/21/2004 26 2 25 74 7 51 513 8462
F148 149864 FMAZA 1/20/1960 5/24/2004 44 2 11 24 14 52 84 263181
F155 150493 FMASO 5/27/1972 6/4/2004 32 2 24 68 18 35 618 9926
F158 151034 MRIGA 12/2/1968 6/14/2004 35 3 30 31 44 39 588 34201
132
F171 152147 MANFA 11/29/1964 7/5/2004 39 3 31 68 48 39 136 99222
F174 152594 FRABA 8/30/1968 7/13/2004 35 2 2 68 18 35 184 173594
F182 153114 FGLEN 3/9/1977 7/22/2004 27 2 2 32 8 48 213 >500000
F189 153643 MGUOC 3/18/1970 8/2/2004 34 2 2 X 44 51 107 226533
F197 154296 FALSI 6/16/1972 8/12/2004 32 2 2 3 27 18 699 4697
F235 158693 FMACA 5/9/1962 10/28/2004 42 3 1 30 8 41 266 2780
F244 159622 MSIPU 8/12/1974 11/12/2004 30 2 2 36 57 35 NA 4061
F278 165041 MMAAL 12/18/1981 2/24/2005 23 2 29 31 44 38 675 11891
F279 165082 FMABE 8/15/1978 2/25/2005 26 2 31 68 39 48 291 27529
F280 165180 FCIRU 9/23/1986 2/28/2005 18 2 2 33 60 14 385 10835
F284 165339 MENDI 4/8/1978 3/2/2005 26 3 24 x 39 37 293 9983
F285 165340 MROTO 8/16/1950 3/2/2005 54 2 1 24 14 51 788 460467
F288 165393 FPACU 5/16/1980 3/3/2005 24 2 1 24 14 51 384 79062
F289 165436 MBEMO 7/25/1972 3/3/2005 32 2 1 3 57 7 61 39645
133
VI.2. ANEXO II Detalle de las características de las segundas y terceras muestras
tomadas en la segunda etapa.
Número de
muestra
Fecharecepción
de la muestraId
CNRSConteo de CD4
Carga Viral
Resultados análisis de activación inmune
Muestra Tratamiento CD4DR+38+ CD8DR+38+
F001 2 si 4/30/2007 207402 876 <50 17.261 9.328
F018 2 si 3/27/2007 205977 138 <50 3.915 2.821
F021 2 si 1/31/2007 203551 351 72 12.284 4.882
F023 2 si 3/16/2007 205534 755 <50 7.686 5.709
F024 2 si 6/28/2007 209904 627 <50
F026 2 no 8/19/2008 226966 209 >500000
F027 2 si 12/4/2006 200586 300 1753
F028 2 si 7/17/2008 225660 370 <50
F030 2 si 2/15/2007 204299 383 1798 33.357 10.883
F037 2 no 2/15/2007 204300 741 711 18.346 8.055
F040 2 si 3/23/2007 205780 942 < 50 5.008 2.368
F044 2 si 3/5/2007 204936 456 <50 5.286 3.144
F046 2 si 7/24/2008 225935 174 <50 37.047 8.157
F047 2 no 7/4/2008 225138 630 7121
F048 2 si 10/25/2007 214983 227 <50
F050 2 no 12/4/2006 200663 455 64959
F050 3 NA 7/17/2008 225661 300 13024
F060 2 NA 9/25/2007 213800 44 107070
F063 2 si 12/20/2006 201610 304 805
F063 3 si 7/18/2008 225724 449 <50
F070 2 no 7/3/2008 225079 1143 1264 20.669 8.367
F072 2 si 2/23/2007 204589 293 <50 23.947 7.86
F072 3 si 9/3/2008 227613 420 <50
F080 2 si 12/7/2006 200944 655 <50
F080 3 si 7/30/2008 226180 559 <50
F081 2 NA 7/10/2008 225328 307 60958
F085 2 si 4/17/2007 206763 287 160 16.211 6.503
F085 3 si 7/25/2008 226005 477 <50
F087 2 si 3/6/2007 204994 336 <50 12.196 5.779
F090 2 NA 7/1/2008 224955 27 2162
F095 2 si 3/29/2007 206091 266 <50 25.193 5.897
F096 2 si 7/24/2008 225936 74 11260 71.205 23.22
F100 2 NA 12/27/2007 217875 551 7280
F119 2 si 7/8/2008 225278 582 <50 66.741 24.049
F132 2 si 5/7/2007 207584 363 <50 25.451 8.496
F132 3 si 7/11/2008 225398 588 <50
F133 2 NA 7/1/2008 224954 194 3027
F143 2 no 5/24/2007 208442 442 23260
F148 2 si 5/11/2007 207825 532 <50 No hay células
F155 2 si 5/28/2007 208507 288 2693 55.011 20.588
F158 2 si 5/24/2007 208443 423 <50
F158 3 si 9/12/2008 228104 368 <50
F171 2 si 5/21/2007 208253 180 <50
F171 3 si 7/15/2008 225502 295 <50
F174 2 si 5/10/2007 207766 126 269779
F182 2 si 7/11/2008 225395 370 408
F189 2 si 1/16/2008 218519 159 852
F197 2 no 5/31/2007 208652 314 542 64.537 23.454
134
F235 2 si 6/5/2007 208797 406 53 21.569 3.743
F235 3 si 7/29/2008 226142 441 <50 No hay células
F244 2 no 5/31/2007 208651 296 1317 23.339 7.357
F278 2 no 7/8/2008 225277 580 26673 16.875 6.292
F279 2 no 7/25/2008 226006 255 8088
F280 2 no 6/22/2007 209599 442 28590
F284 2 no 6/25/2007 209656 663 <50 5.238 1.737
F284 3 si 7/7/2008 225205 850 <50 3.253 3.203
F285 2 si 6/25/2007 209655 356 <50 8.278 3.833
F288 2 si 7/7/2008 225204 445 <50 1.205 6.802
F289 2 si 6/12/2007 209117 166 <50 13.065 10.36
135
VI.3. ANEXO III –OUTPUT del análisis de corrección filogenética
A continuación se detallan los resultados de la corrección filogenética desarrollada sobre las 22
posiciones donde se encontró un polimorfismo significativamente asociado con un alelo de los genes
HLA (valor q < 0,2). Se llevaron a cabo 5 corridas por posición. Cuando el mejor modelo que ajustó a
los datos resultó ser el modelo independiente, se muestra en la sexta columna.
DEPENDIENTE MODEL INDEPENDENT MODEL DEPENDIENTE MODEL INDEPENDENT MODEL
Trial LikelihoodHarmonic
Mean
Acceptance Rate
LikelihoodHarmonic
Mean
Acceptance Rate
Best model or LR
Trial LikelihoodHarmonicMe
an
Acceptance Rate
LikelihoodHarmonic
Mean
Acceptance Rate
Bestmodelor LR
P30_A24 P12_B491 -79,909 -0,27 -80,979 -0,283333 2,141052 1 -43,936 -0,303333 -44,618 -0,23 1,36343 2 -80,063 -0,246667 -82,588 -0,303333 5,048832 2 -47,563 -0,383333 -43,912 -0,326667 Independent 3 -79,745 -0,256667 -80,998 -0,303333 2,505056 3 -50,098 -0,273333 -43,184 -0,333333 Independent 4 -79,869 -0,28 -80,949 -0,326667 2,160222 4 -43,231 -0,33 -43,937 -0,29 1,411416 5 -80,034 -0,323333 -81,155 -0,316667 2,241514 5 -43,256 -0,396667 -43,839 -0,356667 1,16582 P83_A02 P55_A031 -74,160 -0,33 -73,432 -0,263333 Independent 1 -58,711 -0,303333 -63,039 -0,32 8,656066 2 -74,577 -0,366667 -73,703 -0,336667 Independent 2 -58,725 -0,223333 -62,976 -0,386667 8,501514 3 -73,972 -0,363333 -73,675 -0,393333 Independent 3 -59,391 -0,28 -63,239 -0,373333 7,697352 4 -74,563 -0,24 -74,271 -0,33 Independent 4 -58,636 -0,243333 -63,069 -0,39 8,8667 5 -74,161 -0,313333 -73,699 -0,346667 Independent 5 -59,079 -0,363333 -63,151 -0,376667 8,144018 P125_A01 P90_B401 -69,711 -0,253333 -68,555 -0,216667 Independent 1 -62,562 -0,26 -60,692 -0,283333 Independent 2 -69,651 -0,336667 -68,832 -0,25 Independent 2 -62,627 -0,26 -60,742 -0,27 Independent 3 -69,192 -0,233333 -69,167 -0,263333 Independent 3 -61,816 -0,253333 -59,865 -0,303333 Independent 4 -70,543 -0,333333 -68,962 -0,246667 Independent 4 -62,132 -0,27 -60,111 -0,316667 Independent 5 -69,216 -0,29 -69,495 -0,25 0,559012 5 -61,616 -0,293333 -60,263 -0,27 Independent P28_A03 P146_A021 -68,414 -0,313333 -77,153 -0,263333 17,477414 1 -95,943 -0,26 -96,498 -0,353333 1,10969 2 -68,686 -0,263333 -78,305 -0,26 19,23724 2 -96,319 -0,286667 -96,548 -0,35 0,458024 3 -68,630 -0,27 -77,913 -0,313333 18,564472 3 -96,687 -0,253333 -96,542 -0,366667 Independent 4 -69,576 -0,296667 -77,007 -0,226667 14,863502 4 -95,949 -0,25 -96,378 -0,313333 0,856946 5 -69,609 -0,313333 -77,644 -0,26 16,071304 5 -95,916 -0,263333 -96,524 -0,346667 1,216658 P46_A24 P215_A011 -74,510 -0,236667 -76,025 -0,27 3,0299 1 -71,102 -0,31 -68,838 -0,366667 Independent 2 -74,646 -0,236667 -75,389 -0,27 1,48498 2 -69,856 -0,263333 -68,598 -0,293333 Independent 3 -74,692 -0,296667 -75,389 -0,273333 1,394476 3 -69,876 -0,293333 -68,181 -0,286667 Independent 4 -75,268 -0,37 -75,934 -0,24 1,331736 4 -69,459 -0,32 -68,119 -0,34 Independent 5 -74,473 -0,253333 -75,473 -0,323333 1,99874 5 -69,365 -0,223333 -68,609 -0,343333 Independent P81_B40 P339_A011 -50,939 -0,256667 -51,632 -0,33 1,38668 1 -61,280 -0,386667 -60,927 -0,39 Independent 2 -50,381 -0,253333 -51,254 -0,343333 1,744834 2 -61,818 -0,38 -60,804 -0,353333 Independent 3 -50,726 -0,293333 -52,302 -0,336667 3,15293 3 -61,837 -0,4 -60,764 -0,39 Independent 4 -50,445 -0,233333 -51,213 -0,316667 1,536788 4 -61,902 -0,326667 -61,042 -0,376667 Independent 5 -50,879 -0,316667 -51,668 -0,326667 1,577856 5 -61,577 -0,39 -61,331 -0,343333 Independent P118_A11 P312_B491 -33,662 -0,32 -36,381 -0,323333 5,437886 1 -60,804 -0,263333 -61,359 -0,373333 1,111334 2 -34,337 -0,236667 -36,532 -0,29 4,39053 2 -62,973 -0,283333 -61,437 -0,276667 Independent 3 -33,420 -0,31 -36,155 -0,326667 5,471404 3 -60,716 -0,316667 -61,128 -0,256667 0,823558 4 -33,820 -0,253333 -36,029 -0,306667 4,418136 4 -60,553 -0,306667 -61,112 -0,216667 1,119274 5 -33,743 -0,246667 -36,257 -0,27 5,027364 5 -61,315 -0,333333 -60,714 -0,226667 Independent P242_B57 P342_A241 -44,783 -0,246667 -48,827 -0,39 8,087374 1 -56,254 -0,323333 -54,463 -0,29 Independent 2 -45,069 -0,36 -50,875 -0,373333 11,610946 2 -56,548 -0,316667 -54,907 -0,296667 Independent 3 -45,489 -0,303333 -49,088 -0,36 7,198572 3 -56,623 -0,256667 -54,746 -0,316667 Independent 4 -45,866 -0,296667 -49,073 -0,33 6,412982 4 -58,037 -0,316667 -54,228 -0,306667 Independent 5 -45,519 -0,356667 -49,089 -0,4 7,139418 5 -56,630 -0,21 -54,705 -0,28 Independent P303_B08 P342_A311 -47,024 -0,203333 -47,167 -0,223333 0,285048 1 -39,333 -0,326667 -38,603 -0,31 Independent 2 -47,315 -0,293333 -47,264 -0,303333 Independent 2 -39,717 -0,29 -39,587 -0,313333 Independent 3 -47,225 -0,243333 -47,288 -0,246667 0,125084 3 -40,592 -0,306667 -39,134 -0,27 Independent 4 -47,557 -0,22 -47,498 -0,2 Independent 4 -38,993 -0,253333 -38,455 -0,223333 Independent 5 -47,926 -0,29 -47,155 -0,286667 Independent 5 -39,465 -0,22 -38,684 -0,293333 Independent P65_A02 P357_A111 -78,613 -0,266667 -79,734 -0,336667 2,24172 1 -53,572 -0,22 -55,381 -0,326667 3,318628 2 -78,611 -0,253333 -80,122 -0,306667 3,021794 2 -52,822 -0,3 -54,681 -0,363333 3,71707 3 -78,806 -0,32 -79,944 -0,346667 2,274386 3 -53,117 -0,273333 -54,656 -0,333333 3,077676 4 -78,469 -0,303333 -79,920 -0,353333 2,901506 4 -53,645 -0,35 -56,699 -0,31 6,109122 5 -78,805 -0,343333 -79,850 -0,286667 2,090716 5 -53,122 -0,22 -56,591 -0,366667 6,938418 P357_B07 P372_A311 -73,839 -0,31 -75,075 -0,373333 2,47302 1 -62,109 -0,256667 -59,910 -0,246667 Independent 2 -74,004 -0,3 -75,016 -0,353333 2,143562 2 -59,910 -0,286667 -59,792 -0,323333 Independent 3 -73,801 -0,313333 -75,054 -0,243333 2,505346 3 -59,895 -0,3 -59,211 -0,223333 Independent 4 -73,942 -0,3 -75,784 -0,276667 3,683128 4 -60,503 -0,273333 -59,253 -0,236667 Independent 5 -73,864 -0,283333 -74,894 -0,32 2,060035 5 -59,829 -0,28 -59,230 -0,316667 Independent
136
VI.4. ANEXO IV – INPUT y OUTPUT del análisis de medidas repetidas
A continuación se detallan los valores medidos de prevalencia de las distintas mutaciones en los tres
intervalos de tiempo bajo análisis. Se detalla también la prevalencia en cada subtipo viral y el nivel
del factor entre sujetos al que pertenecen según lo detallado en la sección correspondiente de
resultados.
Niveles del factor de Medidas Repetidas Subtipo Nivel del factor
Posición 1987 1997 1998 2002 2003 2006 Viral entre sujetos
P028 25 35 29,1 B 1
P028 9,1 25 14,3 F 1
P030 12,5 40 43,6 B 2
P030 100 66,7 71,4 F 3
P046 6,3 25 14,5 B 1
P046 72,7 66,7 71,4 F 1
P055 18,8 25 14,3 B 1
P055 0 8,3 3,3 F 1
P065 0 20 7,1 B 1
P065 0 16,7 16,7 F 1
P081 0 15 10,7 B 1
P081 4,8 12,1 11,9 F 1
P083 52,4 63,6 76,1 F 2
P083 100 95 98,2 B 3
P084 18,7 45 54,4 B 2
P084 95,2 97 97 F 3
P118 6,3 10 8,9 B 1
P118 14,3 18,2 19,4 F 1
P125 25 50 46,4 B 2
P125 100 90,9 100 F 3
P242 0 5 10,5 B 1
P242 14,3 15,2 10,1 F 1
P357 18,8 35 40,4 B 1
P357 9,5 18,2 21,7 F 1
A continuación se detalla la salida del análisis de medidas repetidas realizado sobre los datos de la
tabla anterior con el programa SPSS V12.0
General Linear Model
137
Within-Subjects Factors
Measure: MEASURE_1
T1
T2
T3
factor1
1
2
3
Dependent
Variable
Between-Subjects Factors
4
4
16
0
1
2
Asociacion
N
Box's Test of Equality of Covariance Matricesa
30,646
1,498
12
285,481
,124
Box's M
F
df1
df2
Sig.
Tests the null hypothesis that the observed covariance
matrices of the dependent variables are equal across groups.
Design: Intercept+Asociacion
Within Subjects Design: factor1
a.
Multivariate Testsc
,474 9,007a 2,000 20,000 ,002
,526 9,007a 2,000 20,000 ,002
,901 9,007a 2,000 20,000 ,002
,901 9,007a 2,000 20,000 ,002
,930 9,124 4,000 42,000 ,000
,256 9,762a 4,000 40,000 ,000
2,179 10,352 4,000 38,000 ,000
1,769 18,574b 2,000 21,000 ,000
Pillai's Trace
Wilks' Lambda
Hotelling's Trace
Roy's Largest Root
Pillai's Trace
Wilks' Lambda
Hotelling's Trace
Roy's Largest Root
Effect
factor1
factor1 * Asociacion
Value F Hypothesis df Error df Sig.
Exact statistica.
The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level.b.
Design: Intercept+Asociacion
Within Subjects Design: factor1
c.
138
Mauchly's Test of Sphericityb
Measure: MEASURE_1
,826 3,830 2 ,147 ,852 1,000 ,500
Within Subjects Effect
factor1
Mauchly's W
Approx.
Chi-Square df Sig.
Greenhous
e-Geisser Huynh-Feldt Lower-bound
Epsilona
Tests the null hypothesis that the error covariance matrix of the orthonormalized transformed dependent variables is
proportional to an identity matrix.
May be used to adjust the degrees of freedom for the averaged tests of significance. Corrected tests are displayed in
the Tests of Within-Subjects Effects table.
a.
Design: Intercept+Asociacion
Within Subjects Design: factor1
b.
Tests of Within-Subjects Effects
Measure: MEASURE_1
720,217 2 360,108 11,620 ,000
720,217 1,703 422,875 11,620 ,000
720,217 2,000 360,108 11,620 ,000
720,217 1,000 720,217 11,620 ,003
1749,560 4 437,390 14,114 ,000
1749,560 3,406 513,626 14,114 ,000
1749,560 4,000 437,390 14,114 ,000
1749,560 2,000 874,780 14,114 ,000
1301,546 42 30,989
1301,546 35,766 36,391
1301,546 42,000 30,989
1301,546 21,000 61,978
Sphericity Assumed
Greenhouse-Geisser
Huynh-Feldt
Lower-bound
Sphericity Assumed
Greenhouse-Geisser
Huynh-Feldt
Lower-bound
Sphericity Assumed
Greenhouse-Geisser
Huynh-Feldt
Lower-bound
Source
factor1
factor1 * Asociacion
Error(factor1)
Type III Sum
of Squares df Mean Square F Sig.
Tests of Within-Subjects Contrasts
Measure: MEASURE_1
664,909 1 664,909 18,820 ,000
55,308 1 55,308 2,075 ,164
1274,066 2 637,033 18,031 ,000
475,494 2 237,747 8,922 ,002
741,934 21 35,330
559,612 21 26,648
factor1
Linear
Quadratic
Linear
Quadratic
Linear
Quadratic
Source
factor1
factor1 * Asociacion
Error(factor1)
Type III Sum
of Squares df Mean Square F Sig.
139
Estimated Marginal Means
Análisis de ANOVA de 1 factor para analizar tendencias en el tiempo
Para el nivel 1: Asociaciones positivas (aquellas con OR>1)
Levene's Test of Equality of Error Variancesa
1,062 2 21 ,364
,163 2 21 ,851
,008 2 21 ,992
T1
T2
T3
F df1 df2 Sig.
Tests the null hypothesis that the error variance of the
dependent variable is equal across groups.
Design: Intercept+Asociacion
Within Subjects Design: factor1
a.
Tests of Between-Subjects Effects
Measure: MEASURE_1
Transformed Variable: Average
127136,391 1 127136,391 191,655 ,000
54986,605 2 27493,302 41,446 ,000
13930,545 21 663,359
Source
Intercept
Asociacion
Error
Type III Sum
of Squares df Mean Square F Sig.
Grand Mean
Measure: MEASURE_1
51,465 3,718 43,734 59,196
Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
95% Confidence Interval
Test of Homogeneity of Variances
Prevalencia
,034 2 45 ,966
Levene
Statistic df1 df2 Sig.
140
Para el nivel 2: asociaciones negativas que dominan un subtipo viral (aquellas con OR<1 y el
subtipo en el cual siempre dominaron)
Para el nivel 3: asociaciones negativas que no dominan un subtipo viral (aquellas con OR<1 y en el
subtipo viral que no dominan)
ANOVA
Prevalencia
743,225 2 371,613 1,372 ,264
12185,734 45 270,794
12928,959 47
Between Groups
Within Groups
Total
Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
Test of Homogeneity of Variances
Prevalencia
2,778 2 9 ,115
Levene
Statistic df1 df2 Sig.
ANOVA
Prevalencia
265,527 2 132,763 1,031 ,395
1159,250 9 128,806
1424,777 11
Between Groups
Within Groups
Total
Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
Test of Homogeneity of Variances
Prevalencia
,453 2 9 ,649
Levene
Statistic df1 df2 Sig.
141
ANOVA
Prevalencia
1758,435 2 879,217 4,193 ,052
1887,107 9 209,679
3645,542 11
Between Groups
Within Groups
Total
Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
142
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
Observed Value
-2
-1
0
1
2
Exp
ec
ted
No
rma
l V
alu
e
Normal Q-Q Plot of Standardized Residual for Respuesta
-6 -4 -2 0 2
Observed Value
-6
-4
-2
0
2
Exp
ec
ted
No
rmal
Va
lue
Transforms: natural log
Normal Q-Q Plot of Standardized Residual for Respuesta
VI.5. ANEXO V – OUTPUT del análisis estadístico de la respuesta basal de linfocitos
CD3+/CD8+ frente a líneas B no sensibilizadas
-6 -4 -2 0 2
Observed Value
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
Dev
iati
on
fro
m N
orm
al
Transforms: natural log
Detrended Normal Q-Q Plot of Standardized Residual for Respuesta
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
Observed Value
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
De
via
tio
n f
rom
No
rmal
Detrended Normal Q-Q Plot of Standardized Residual for Respuesta
143
Levene's Test of Equality of Error Variances(a)
Dependent Variable: Ln_Rta
F df1 df2 Sig.
,939 13 30 ,528
Tests the null hypothesis that the error variance of the dependent variable is equal across groups.
a Design: Intercept+Citoquina+Autologa+Citoquina * Autologa
Tests of Between Subjects Effects
Dependent Variable: Ln_Rta
SourceType III Sumof Squares df
MeanSquare F Sig.
Corrected Model 97,772(a) 13 7,521 20,467 ,000
Intercept 276,130 1 276,130 751,459 ,000
Citoquina 96,178 6 16,030 43,623 ,000
Autologa ,848 1 ,848 2,307 ,139
Citoquina *Autologa
,898 6 ,150 ,407 ,868
Error 11,024 30 ,367
Total 364,039 44
Corrected Total 108,796 43
a R Squared = ,899 (Adjusted R Squared = ,855)
2 4 6
Citoquina
-5,00
-4,00
-3,00
-2,00
-1,00
0,00
Ln
_R
ta
144
VI.6. ANEXO VI – Detalle de las secuencias peptídicas encontradas en las distintas
muestras junto con el análisis de predicción y afinidad de epítopes
Alelo A01
Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A01P125 Aff Ep Esc
F070 144418 18/02/2004 no 1078,56 7097 ´----VSQNY 0 si
225079 03/07/2008 no 1143 1264 ......... 0 si
F235 158693 28/10/2004 no 266 2780 NSSQVSQNY 0.6197 E no
F285 165340 02/03/2005 no 788 460467 ´----VSQNY 0 si
F288 165393 03/03/2005 no 384 79062 NA
Alelo A02
Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A02P65 Aff Ep Esc A02P84 Aff Ep Esc
F001 126872 24/03/2003 no ND 500000 ILEQLQSSL 0.3493 si SLFNAVATL 0.9547 E no
..G...P.. 0.5666 E no
F021 139357 13/11/2003 no 190 187395 IIRQLQPSL 0.2058 si SLYNAVAVL 0.9279 E si
....T.... 0.7811 E si
F023 140088 24/11/2003 no 231 51048 ILGQLHPSL 0.5278 E si SLYNTIAVL 0.8528 E si
F026 140992 09/12/2003 no 519 451371 LLGQLQPSL 0.5948 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si
I........ 0.5666 E no
226966 19/08/2008 no 209 >500000 I......A. 0.4926 E no ......... 0.8528 E si
I......S. 0.5666 E no
F030 141420 15/12/2003 no 272 64755 IIGQLQPSL 0.353 si SLFNTIAVL 0.8644 E si
204299 15/02/2007 si 383 1798 .......A. 0.298 si ......... 0.8644 E si
F037 142108 29/12/2003 no 543 6102 ILGQLQPSL 0.566 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si
204300 15/02/2007 no 741 711 ......... 0.566 E no ......... 0.8644 E si
F047 142524 08/01/2004 no 87 409639 IMGQLQSAL 0.371 si SVYNTVATL 0.5534 E no
225138 04/07/2008 no 630 7121 .LIH..PT. 0.612 E no .LF...... 0.8053 E no
F048 142525 08/01/2004 no 521 88157 ILKQLHPAL 0.280 si SLYNTVAVL 0.7811 E si
..N...... 0.526 E si
..D...... 0.592 E si
..E...... 0.357 si
214983 25/10/2007 si 227 <50 .......S. 0.432 E si ......... 0.7811 E si
F063 143705 03/02/2004 no 144 20208 ILGQLQPSL 0.566 E no SLFNTVAVL 0.7937 E si
201610 20/12/2006 si 304 805 ......... 0.566 E no ......... 0.7937 E si
225724 18/07/2008 si 449 <50 NA
F070 144418 18/02/2004 no 1078,56 7097 IIGQLQPSL 0.353 si SLFNTVAVL 0.7937 E si
225079 03/07/2008 no 1143 1264 ......... 0.353 si ......... 0.7937 E si
.....H... 0.318 si
F072 144498 19/02/2004 no 341,55 22234 IIEQLKPSL 0.147 si SLYNTIAVL 0.8528 E si
F080 145022 01/03/2004 no 518,7 78246 IITQLQPSL 0.396 E no SLYNTVAVL 0.7811 E si
200944 07/12/2006 si 655 <50 ......... 0.396 E no ......... 0.7811 E si
226180 30/07/2008 si 559 <50 ......... 0.396 E no ......... 0.7811 E si
F081 145121 02/03/2004 no 402,56 11330 IIAQLQPSL 0.493 E no SLFNTVAVL 0.7937 E si
F090 145739 12/03/2004 no 187,2 122893 LIGQIQPSL 0.451 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si
....L.... 0.374 si ....A.... 0.9998 E si
224955 01/07/2008 NA 27 2162 ....L.... 0.374 si ......... 0.9998 E si
F100 146489 25/03/2004 no 518 69413 ILGQLQPSL 0.566 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si
F133 149269 13/05/2004 no 362 16882 LIGQIQPSL 0.451 E no SLYNTIAVL 0.8528 E si
.M..L.... 0.599 E no .....L... 0.8041 E si
224954 01/07/2008 NA 194 3027 ....L.... 0.3746 si .....L... 0.8041 E si
.M....S.. 0.5382 E no
F174 152594 13/07/2004 no 184 173594 ILGQLQPSL 0.566 E no SLYNTVAVL 0.7811 E si
145
207766 10/05/2007 si 126 269779 ......... 0.566 E no ......... 0.7811 E si
F182 153114 22/07/2004 no 213 >500000 IIGQLHSSL 0.218 si SLYNTIAVL 0.8528 E si
225395 11/07/2008 si 370 408 ......... 0.218 si ......... 0.8528 E si
F189 153643 02/08/2004 no 107 226533 ILRQLQPSL 0.416 E no SLFNTVAVL 0.7937 E si
218519 16/01/2008 si 159 852 ..E...... 0.481 E no ......... 0.7937 E si
..G...... 0.566 E no
..R..H... 0.373 E si
..K..Q... 0.396 E no
F197 154296 12/08/2004 no 699 4697 ILGQLQPSL 0.566 E no SLYNTVATL 0.7890 E no
208652 31/05/2007 no 314 542 .......A. 0.492 E no ......... 0.7890 E no
F244 159622 12/11/2004 no NA 4061 ILGQLQPAL 0.492 E no SLYNTVATL 0.7890 E no
208651 31/05/2007 no 296 1317 .I....... 0.298 si ..F....V. 0.7937 E si
Alelo A03
Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A03P28 Aff Ep Esc A03P90 Aff Ep Esc
F040 142118 29/12/2003 no 255 344685 RLRPGGKKR 0.4458 E no FVHRKVEVK 0.3794 E NC
F048 142525 08/01/2004 no 521 88157 RLRPGGKKQ 0.2004 si CVHQRIEVR 0.1234 NC
214983 25/10/2007 si 227 <50 ......... 0.2004 si ......... 0.1234 NC
F072 144498 19/02/2004 no 341,55 22234 RLRPEGKKR 0.3824 E si YVHRRVEVK 0.2808 NC
F080 145022 01/03/2004 no 518,7 78246 RLRPGGKKQ 0.2004 si CVHQRIEVR 0.1234 NC
0.3727 E ......A.. NC
200944 07/12/2006 si 655 <50 ......... 0.3727 E si ......A.. 0.1234 NC
226180 30/07/2008 si 559 <50 ......... 0.4119 E si ......T.. 0.1234 NC
F087 145371 05/03/2004 no 528,96 216838 RLRPGGKKK 0.4117 E no FVHQRVEVK 0.6070 E NC
204994 06/03/2007 si 336 <50 ......... 0.4458 E no ...RK.... 0.6070 E NC
F119 147712 19/04/2004 no 281,3 26733 RLRPGGKKQ 0.4117 E si FVHQRVEVK 0.1234 NC
225278 08/07/2008 si 582 <50 ......... 0.4117 E si ......... 0.1234 NC
F197 154296 12/08/2004 no 699 4697 RLRPGGKKK 0.3865 E no CVHQKIEVK 0.6070 E NC
208652 31/05/2007 no 314 542 ........Q 0.4143 E si ....R..I. 0.1234 NC
........P si 0.0511
F289 165436 03/03/2005 no 61 39645 QLRPGGKKK 0.3737 E no FVHQKVEVK 0.4241 E NC
Alelo A11
Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A11P118 Aff Ep Esc A11P357
F028 141074 10/12/2003 no 95 368953 `-----AADT 0 NC GVGGPSHKAR 0.319 si
NC
F046 142440 07/01/2004 no 555 2461 KTQQQAADK 0.635 WB NC GVGGPGHKAR 0.273 no
Alelo A24
Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV A24P30 Aff Ep Esc
F001 126872 24/03/2003 no ND 500000 KYRLKHLVW 0.4970 E si
F024 140089 24/11/2003 no 162 181288 KYRLKHVVW 0.4469 E si
F027 141027 09/12/2003 no 150 127093 KYRLKHMVW 0.4805 E si
......I.. 0.4508 E si
200586 04/12/2006 si 300 1753 .NN..QI.. 0.0147 si
F044 142271 05/01/2004 no 121 175113 KYRLKHIVW 0.4508 E si
F046 142440 07/01/2004 no 555 2461 KYRLKHIVW 0.4508 E si
F050 142683 12/01/2004 no 337 75282 KYRLKHIVW 0.4508 E si
200663 04/12/2006 no 455 64959 R.Q...... 0.5875 E no
225661 17/07/2008 NA 300 13024 ......... 0.5875 E si
F060 143511 29/01/2004 no 351 28694 KYRMKHLIW 0.4593 E si
213800 25/09/2007 NA 44 107070 ...L..IV. 0.4508 E si
F081 145121 02/03/2004 no 402,56 11330 KYRMKHLIW 0.4593 E si
146
F085 145369 05/03/2004 no 150,08 4089 KYRLKHIVW 0.4508 E si
F095 146198 19/03/2004 no 371,28 27498 KYRLKHIVW 0.4508 E si
F119 147712 19/04/2004 no 281,3 26733 QYRMKHLIW 0.3838 E si
225278 08/07/2008 si 582 <50 ......... 0.3838 E si
F155 150493 04/06/2004 no 618 9926 KYRLKHIVW 0.4508 E si
208507 28/05/2007 si 288 2693 ......... 0.4508 E si
F284 165339 02/03/2005 no 293 9983 NA
209656 25/06/2007 no 663 <50 NIDLKHIVW 0.0229 si
F285 165340 02/03/2005 no 788 460467 KYKLKHIVW 0.4929 E no
Q........ 0.4190 E no
F288 165393 03/03/2005 no 384 79062 NA
Alelo B07
Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV B07P357 Aff Ep Esc
F030 141420 15/12/2003 no 272 64755 GPGHKARVL 0.6483 E no
204299 15/02/2007 si 383 1798 ......... 0.6483 E no
F040 142118 29/12/2003 no 255 344685 GPGHKARVL 0.6483 E no
F060 143511 29/01/2004 no 351 28694 GPGHKARVL 0.6483 E no
213800 25/09/2007 NA 44 107070 ......... 0.6483 E no
F070 144418 18/02/2004 no 1078,56 7097 GPGHKARVL 0.6483 E no
225079 03/07/2008 no 1143 1264 ......... 0.6483 E no
F087 145371 05/03/2004 no 528,96 216838 GPGHKARVL 0.6483 E no
204994 06/03/2007 si 336 <50 ......... 0.6483 E no
F289 165436 03/03/2005 no 61 39645 GPGHKARVL 0.6483 E no
Alelo B40
Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV B40P95 Aff Ep Esc B40P215 Aff Ep Esc
F001 126872 24/03/2003 no ND 500000 IDVKDTKEAL 0.050 si AEWDRLHPV 0.444 WB no
F026 140992 09/12/2003 no 519 451371 IDVKDTKEAL 0.050 si AEWDRLHPV 0.444 WB no
226966 19/08/2008 no 209 >500000 .......... 0.050 si ......... 0.444 WB no
F027 141027 09/12/2003 no 150 127093 VEVRDTKEAL 0.321 no ADWDRLHPV 0.079 si
200586 04/12/2006 si 300 1753 ...K...... 0.358 si NA
F047 142524 08/01/2004 no 87 409639 IEVRDTKEAL 0.253 no AEWDRLHPV 0.444 WB no
225138 04/07/2008 no 630 7121 ..IK...... 0.312 si ......... 0.444 WB no
F070 144418 18/02/2004 no 1078,56 7097 VDVKDTKDAL 0.064 si AEWDRLHPV 0.444 WB no
225079 03/07/2008 no 1143 1264 .......... 0.064 si ......... 0.444 WB no
F095 146198 19/03/2004 no 371,28 27498 IEIKDTKEAL 0.312 si AEWDRLHPV 0.444 WB no
..V....... 0.285 si
F119 147712 19/04/2004 no 281,3 26733 VEVKDTKEAL 0.358 si ADWDRLHPA 0.050 si
225278 08/07/2008 si 582 <50 .......... 0.358 si ......... 0.050 si
Alelo B57
Paciente CNRS Fecha Tratamiento CD4 CV B57P242 Aff Ep Esc
F040 142118 29/12/2003 no 255 344685 TSTPQEQIQW 0.686 SB no
F080 145022 01/03/2004 no 518,7 78246 TSNLQEQIQW 0.500 WB si
200944 07/12/2006 si 655 <50 .......... 0.500 WB si
226180 30/07/2008 si 559 <50 .......... 0.500 WB si
F244 159622 12/11/2004 no NA 4061 TSTLQEQIGW 0.536 WB no
208651 31/05/2007 no 296 1317 ..N.....A. 0.500 WB si
F289 165436 03/03/2005 no 61 39645 TSNLQEQIQW 0.500 WB si
147
148
VI.7. Anexo VII – Validación del modelo de Markov de la epidemia del HIV
A continuación se presentan los principales resultados que, si bien exceden los objetivos específicos
de la presente tesis doctoral, validan el modelo utilizado en la última sección.
Una vez construido el modelo, la etapa en ausencia de tratamiento (historia natural de la infección)
fue comparada con la obtenida en el seguimiento de una cohorte de individuos primoinfectados
(Cohorte CASCADE). Los resultados se muestran en la figura A.VII.1. y muestran la concordancia entre
las predicciones del modelo y lo observado en pacientes infectados.
Figura A.VII.1. Comparación de las predicciones del modelo y los datos observados en la cohorte
CASCADE acerca del tiempo a SIDA y muerte desde la primoinfección.
Para validar la etapa de tratamiento, el principal análisis consistió en comparar las curvas de
supervivencia predichas con las observadas en una cohorte de Dinamarca (Lohse et al Ann Intern
Med. 2007; 146:87 95). Se observa en la figura A.VII.2. que la curva predicha por el modelo se solapa
con la correspondiente a los pacientes bajo regímenes de tratamiento actuales. En particular, se
observa que el modelo predice que un diagnóstico tardío de la infección modifica los niveles de
supervivencia hacia regímenes anteriores menos eficientes.
149
Figura A.VII.2. Comparación de las curvas de sobrevida observadas y predichas por el modelo. En
celeste claro es muestran las curvas observadas en pacientes reales para los tres períodos de
tratamiento. En azul se muestran las predicciones del modelo y en particular, en negro se muestra la
curva sobrevida predicha para aquellos individuos con SIDA al momento del diagnóstico.
Mas allá de los objetivos específicos de la presente tesis de doctorado, cabe destacar dos resultados
principales del modelo de Markov desarrollado: La primera se muestra en la figura A.VII.3. y
corresponde al impacto del diagnóstico temprano en la expectativa de vida. La segunda se muestra
en la figura A.VII.4. y corresponde al impacto del diagnóstico temprano en la mortandad en el primer
año de tratamiento y, a nivel poblacional, en la proporción de individuos que requieren tratamiento
al momento del diagnóstico.
Figura A.VII.3. Estimaciones de la expectativa de vida según el estadío clínico al momento del
diagnóstico. Aunque a simple vista las diferencias no parezcan importantes, el rango de años cubierto
por el eje Y cubre toda la vida de un individuo. La infección por HIV reduce la media de expectativa de
vida media en 10 años mientras que, si el diagnóstico es logró tardíamente, la expectativa de vida media
150
se reduce otros 10 años mas (20 años menos que el individuo no infectado, siguiendo los esquemas de
tratamiento actuales).
Figura A.VII.4. Impacto del retardo en el diagnóstico sobre la mortandad en el primer año de
tratamiento y el requerimiento de tratamiento. En la figura se detallan las predicciones para cada
parámetro según el tiempo transcurrido entre el momento de la infección y el diagnóstico. Obsérvese
que logrando diagnosticar a todos los individuos dentro de los primeros 5 años de infección se lograría
reducir la mortalidad en el primer año de tratamiento a proporciones muy reducidas y al mismo tiempo
la gran mayoría de los individuos no necesitarían tratamiento y el médico podría realizar un seguimiento
más detallado para optimizar el inicio del tratamiento cuando fuera necesario.