esterilizacion
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Esterilización de medios de cultivo
Esterilización
Para poder llevar a cabo una fermentación con éxito es imprescindible y obligatorio tener en todas las etapas cultivos libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador de producción.
La presencia de otros microorganismos puede producir competencia por los nutrientes y/o producción de compuestos que inhiban la producción de productos de interés, por ello se necesita que al inicio de la fermentación el sistema se encuentre libre de m.o.
Existen procesos que necesitan que los efluentes se encuentren libre de m.o., es el caso de las etapas finales de los procesos de tratamientos de agua servidas o RILes.
Algunas definiciones previas:
1. Esterilización: Erradicación, remoción, destrucción o inactivación de todo tipo de vida, de tal manera que las células remanentes no puedan reproducirse, es decir, una eliminación de la capacidad de reproducción.
2. Desinfección: Remoción, destrucción o inactivación de esas células que podrían causar deterioro en el medio (no todas las células).
3. Pasteurización: Remoción, destrucción o inactivación de todo los patógenos viables naturales por medio de tratamiento térmico tanto para sólidos como líquidos.
¿DONDE SE CONTROLA LA ESTERILIDAD?
– Mantener la pureza del inóculo.
– Esterilizar el medio de cultivo y los aditivos.
– Esterilizar el material en contacto con el medio ( recipiente, fermentador, válvulas y conductos)
– Esterilizar los gases entrantes y salientes.
– Mantener las condiciones asépticas durante la manipulación.
– Construcción apropiada del biorreactor para su esterilización y para la prevención durante la fermentación.
Elementos que se deben esterilizar
1. Medio de cultivo
2. Fermentador
3. Equipos accesorios 1. Mangueras
2. Electrodos
3. Agitadores
4. Filtros
4. Aire que circula por el fermentador 1. Entrada
2. Salida
METODO CONDICIONES
USO OBSERVACIONES
Calor Húmedo (vapor)
121°C (250F), 14.7 psig, 15 minutos
Medios LíquidosSólidos
BaratoEficiente
Calor seco 130 - 150°C1 - 2 horas
Elementos de Vidrio, Sólido
Más caro que el calor húmedo y más lento.
Filtración 0.2 m Para productos sensibles a la temperatura, tales como enzimas, aire.
Agentes químicos
Capacidad Oxidativa o alcalina: Cloración que requiere de etapas posteriores para eliminar el cloro. Ozonificación.
Mecánicos Vibración Ultrasonido Centrifugación a alta velocidad
Radiación UV, Rayos X
Degradación del DNAUtilizada en tratamiento de efluentes con flujos bajos
ESTERILIZACION POR CALOR SECO
a) Flameo o llama directa
b) Aire calienteSe realiza usando un horno especial que toma el nombre de horno bacteriologico u horno Pasteur.
ESTERILZACION POR CALOR HUMEDO
Por ebullición
Vapor de agua sin presión Consiste en colocar el material a esterilizarse a la acción del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100 oC. Para esterilizar sustancias que de otra manera se alteran o destruyen a elevadas temperaturas como la leche, caldo selenito, medios de cultivo azucarados, etc.
Por vapor de agua con Presión
ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO
Por tindalización : esterilización fraccionada, que Consiste en calentar el material a 100o C por 30 minutos durante tres días consecutivamente, con incubación de los intervalos. Se emplean para esterilizar medios de cultivo y otras sustancias que no pueden ser calentadas a temperaturassuperiores a 100o C.
PasteurizaciónCuando es lenta, consiste en someter el liquido a esterilizar a una temperatura que fluctúa alrededor de los 63o C durante 20 minutos y cuando es rápida, alrededor de 73o C durante 20 minutos aunque nodestruye la totalizada de organismos.Se usa para la conservación de la leche, de bebidas alcohólicas, como vinos, cervezas, etc.
ESTERILIZACION POR FILTRACION
Se utiliza frecuentemente para todos los componentes de la solución de nutrientes que son sensibles al calor y que serían por tanto desnaturalizados durante el proceso de esterilización por vapor utilizado normalmente en fermentación industrial. Las vitaminas, los antibióticos o los componentes de la sangre son ejemplos de compuestos lábiles al calor que deben ser esterilizados por filtración.
El aire exterior tiene 10 - 100.000 partículas por m3 y 5 - 2.000 microorganismos por m3. De estos, el 50% son esporas de hongos y el 40% son bacterias. (filtros de lana de vidrio, filtros de cartucho)
Esterilización Química
No se utiliza ampliamente dado que la mayoría de los desinfectantes tienen baja acción. Adicionalmente pueden interferir en el crecimiento de los m.o. Se buscan agentes que: Actúen en forma rápida
No sean caros No sean inflamables No sean explosivos No sean tóxicos
Los más utilizados :
• -propiolactona• Oxido de etileno (en medio frio)• Fenol o compuestos fenílicos (Cresol, ortofenil fenol)• Alcoholes: Etanol, Metanol• Halógenos: Hipoclorito, Cloroaminas.
Oxido de etileno: es un líquido que hierve a 10,7° C. Se usa en la industria para la esterilización de placas Petri, jeringas y otros objetos de plástico que se funden a temperaturas superiores a los 100° C. Debido a su alto poder de penetración estos objetos se empaquetan primero y después se esterilizan. El óxido de etileno actúa inactivando enzimas y otras proteínas que contienen grupos (R-SH) mediante una reacción llamada alquilación (R-S-CH2CH2O-H).
ESTERILIZACIÓN POR RADIACION
La esterilización por rayos ultravioleta (UV) desinfecta alterando el componente
DNA de los microorganismos e impidiendo su reproducción, por tanto es un medio
no-químico que inactiva bacterias, esporas, protozoos, levaduras y virus. El UV es un
proceso en línea, por lo tanto no requiere tanque de contacto, el tiempo de retención
requerido se mide en segundos en lugar de minutos.
ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS LÍQUIDOS
Cinética de muerte de los microorganismos
La cinética de inactivación de los m.o es una cinética de primer orden respecta al número de m.o.
Se expresa como:
- dN/dt = k N (1)
Donde:
N : Número total de células viables;
t : tiempo de esterilización
k : Constante de decaimiento o muerte, es función de la temperatura,
Su dependencia con la temperatura es del tipo Arrhenius:.
Cinética de Inactivación
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1 3 5 7 9 11 13
Tiempo
Nu
me
ro m
.o.
)(RT
E
o
a
ekk
T = f (t)
Si se integra la expresión (1) se tiene:
)exp(ln0
dtkNNdtkNN t
o
o
t
o
Si se trabaja a temperatura constante se tiene:
donde No es el número de m.o iniciales en el sistema.
).exp(. tkNN o
M.0. Resistencia Relativa
•Células de bacterias y Levaduras
•Virus y bacteriófagos•Esporas de hongo•Esporas de bacterias
1
1-5
2-10
3 000 000
RESISTENCIA RELATIVA DE MICROORGANISMOS A LA
DESTRUCCION TERMICA
Parámetros de las cinéticas de desactivación de diferentes m.o.
Microorganismo T
°C
Constante decaimiento
k
sec-1
Energía de activación
Ea
kcal/mol
Esporas de B.subtilis 121 0.0051 76
B.stearothermophilus 104
131
0.57
250
67.7
C.Botulinum 104 7 82
E.coli 127
Esporas en general 121 0.0167 Mas fácil de eliminar
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1 21 41 61 81 101 121
Tiempo
Nume
ro m.
o.
Esporas Bacillus Bacillus Esporas
Efecto de la Temperatura T3>T2 > T1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1 3 5 7 9 11 13
TiempoNu
mero
m.o
.T1 T2 T3
Comparación de Cinéticas de decaimiento a diferentes temperaturas
Comparación de cinéticas de decaimiento de diferentes m.o
Más resistentes
Destrucción térmica de células de E.Coli Destrucción térmica de esporas de B.
Stearothermophilus
Los datos de la tabla adjunta reportan el recuento de células viables luego de la esterilización de un medio a 85 y 90 °C.a. Calcular la constante de muerte específica.b. ¿Cómo varía la energía de “activación” para la muerte térmica según la temperatura?
Microorganismos viablest (min) 85 °C 90 °C
0 2400000000 24000000000.5 2390000000 23800000001 2370000000 23000000001.5 22900000002 2330000000 22100000003 2320000000 21700000004 2280000000 2120000000
Diseño de procesos de esterilización
Objetivo: Determinar el ciclo de esterilización
Se define el factor “DEL”, (Criterio de Diseño), como:
Donde: No número de microorganismos iniciales
Nt número de microorganismos finales.
dtkN
N t
t
oTotal
0
ln
Los criterios de diseño son:
1. Si no se conoce k.
2. Imposibilidad de esterilidad absoluta, grado de esterilidad, deseable a llegar Nt = 10-3 esporas o m.o (estadístico).
3. Si la esterilidad inicial es desconocida, se asume una concentración, , del orden de 109 esporas/Litro.´
0N
VNN .´0 V : Volumen de liquido a esterilizar
Procesos de esterilización
RT
E
0
-eKK
El proceso de esterilización discontinua comprende tres etapas:
a) Etapa de calentamiento
b) Etapa de mantención
c) Etapa de enfriamiento
Por lo tanto el factor “DEL” puede
dividirse en estas tres etapas:
toenfriamienmantenciónntocalentamieTotal
Esterilización Batch
Las etapas de calentamiento y/o enfriamiento pueden ser:
Para Calentamiento• a) Vapor Directo (Modelo hiperbólico)• b) Resistencia Eléctrica (Modelo Lineal)• c) Camisa de calefacción con fuente isotérmico (Modelo Exponencial)
VaporCamisa de Vapor
Resistencia Eléctrica
Esterilización Batch
Para Enfriamiento
d) Camisa de enfriamiento alimentada con fuente no-isotérmica y recirculación.
Camisa de Enfriamiento
Los factores “DEL”
Calentamiento
donde la temperatura es una función del tiempo, ie. T = f(t)
Dependen del tipo de calentamiento utilizado.
Mantención
mantención = kT* t3-t2
dtRTE
k a
t
t
ontocalentamie
exp
2
1
dtKt
t
T3
2
Enfriamiento
donde la temperatura es una función del tiempo, ie. T = f(t)
Dependen del tipo de enfriamiento utilizado.
Modalidad de Esterilización en el mismo Fermentador y
Procedimiento en Autoclaves
dtRTE
k a
t
t
otoenfriamien
exp
4
31
Algoritmo para el diseño del proceso de esterilización batch.
El objetivo es determinar el tiempo que debe durar la etapa de mantención, dado el tiempo de las etapas de calentamiento y enfriamiento dependen del proceso de transferencia utilizado.
a) Medir o calcular T = f(t)b) Calcular Total = ln (No/Nt)c) Determinar perfiles de T vs tiempo de duración de las etapasd) Graficar k vs t, dependiendo del proceso de calentamiento y
enfriamiento.e) Integrar el área de k vs tiempo para las etapas de calentamiento y
enfriamiento. Integración gráfica, algebraica o numérica.
T
toenfriamienntocalentamietotal
T
mantencióncionesteriliza kk
t)(
Diseño de sistemas de esterilización continua
Los equipos de esterilización continua pueden ser de dos tipos:
Inyección directa de vapor.
Resultan ser más eficientes dado que no hay barreras entre el medio y el vapor.
Diseño de sistemas de esterilización continua
Intercambiadores de calor.
Placa
Los que deben trabajar a bajas presiones, pero presentan una mayor área de transferencia de calor
Tubo y carcaza
Se recomiendan cuando se utilizan líquidos viscosos
Ventajas que presenta la forma de operación continua v/s la batch
1. Presentan mayor reproducibilidad
2. Tiempos cortos (2 a 3 minutos)
3. Mejor control sobre el proceso
4. Equipo compacto
5. Pueden operar a temperaturas más altas (>135ºC)
6. Son fáciles de automatizar (menor mano de obra)
7. Menor gasto de vapor
8. Se puede recuperar el calor
9. Apropiados para procesos continuos
Desventajas que presenta la forma de operación continua v/s la batch
1. Instalación mas rígida en cuanto a cambios de condiciones de operación.
2. Exige gran cuidado en el diseño, montaje y operación del sistema para mantener la esterilidad.
3. Problemas de sobreesterilización (o subesterilización) de porciones o zonas de liquido que fluye.
4. Inadecuado para instalaciones pequeñas
Diseño para sistemas de esterilización continua
Resultan ser análoga a la forma batch salvo que se debe diseñar el “largo de la zona de esterilización, L” en vez del tiempo de esterilización.
Conocidos: Te,
Q : Caudal del medio a esterilizar
Se puede calcular la velocidad seleccionando el diámetro de Tubería d Donde la ū = Q/A
El algoritmo de resolución debe considerar que en este tipo de proceso de esterilización los tiempos de calentamiento y enfriamiento son despreciables
(calentamiento continuo = enfriamiento continuo = 0)
por lo cual se cumple que:
mantención continuo = ln (No/Nt) = kT*mantención
El tiempo de mantención es:
mantención = ln (No/Nt)/( kT)
El largo del esterilizador se puede calcular por:
L = mantención * ū
