estableciendo la especificidad de la adhesión de
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Estableciendo la especificidad de la adhesión de
esporangios de Phytophthora Infestans y
Phytophthora Betacei a sus hospederos por
espectroscopía de fuerzas.
Esta disertación se entrega como parte de los
requisitos para el grado de
Físico
Juan Pablo Barrero Flores
Universidad de los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Física
Director
Antonio Manu Forero Shelton. Ph.D
Bogotá D.C. Colombia
2018
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A mis padres y mi hermana
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Agradecimientos
En primer lugar, quiero agradecer a Manu Forero, Silvia Restrepo
y Cesar Quintana, por su constante apoyo intelectual y paciencia
durante el tiempo que trabajamos juntos en el desarrollo de esta
tesis. En segundo lugar, A mis padres, Vale, Cami y toda mi familia
por apoyarme emocionalmente durante los años que le dediqué a
esta carrera. Y, por último, de forma muy especial a todos mis
amigos y a Valentina, quienes me apoyaron durante todo este
proceso y me ayudaron con palabras de aliento siempre que las
necesité. Agradezco con mucho cariño a Pipe, quien me apoyó y
acompaño en los proyectos que llevaron a que realizara esta tesis.
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Estableciendo la especificidad de la adhesión de
esporangios de Phytophthora Infestans y
Phytophthora Betacei a sus hospederos por
espectroscopía de fuerzas.
Juan Pablo Barrero Flores
Universidad de los Andes
Resumen Las especies de Oomicetes pertenecientes al género Phytophthora hacen
parte de los patógenos de planta más devastadores en el mundo, pues han
causado grandes hambrunas por infecciones a cultivos, por ejemplo, la gran
hambruna de Irlanda del siglo XIX. En Colombia se presentan dos especies
particulares de este género, a saber, Phytophthora infestans y Phytophthora
betacei, que infectan una gran variedad de plantas frutales del género
Solanum. En general, el contacto y la adhesión del patógeno a su hospedero
es crucial en el proceso de infección, sin embargo, no se ha caracterizado
dicha interacción entre Oomicetes y hojas de planta. En este estudio, con la
intención de entender mejor el proceso de infección, se usaron variantes de
técnicas de microscopía de fuerza atómica, haciendo mediciones sobre un
único propágulo del patógeno, para caracterizar las propiedades mecánicas
de la adhesión temprana del patógeno a su hospedero. En este trabajo se
midieron las magnitudes de las fuerzas de interacción entre propágulos de P.
infestans y P. betacei y sus hospederos respectivos S. tuberosum (papa var.
R12) y S. betaceum (Tomate de árbol var. Común), teniendo en cuenta que
P. betacei es especialista de S. betaceum.
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Stablishing the specificity of adhesion between
Phytophthora Infestans and Phytophthora Betacei
sporangia and their hosts through force
spectroscopy.
Juan Pablo Barrero Flores
Universidad de los Andes
Abstract The Oomycet species belonging to the genus Phytophthora are among the
most destructive plant pathogens in the world. They have caused big famines
due to crop infections, like the great famine of Ireland in the XIX century. In
Colombia there are two species that belong to this genus: Phytophthora
infestans and Phytophthora betacei, they infect a great variety of fruit plants
from the genus Solanum. It is well known that contact and adhesion between
the pathogen and its host is crucial for the infection process, never the less,
the early stages of this specific interaction have not been characterized. In
this study, with the intent of fully understanding the infection process, we
used different atomic force microscopy techniques, measuring with just one
sporangium (the pathogens mean of transport and infection), to get the
mechanic properties of early adhesion of the pathogen to its host. In this
study the force magnitudes of the interaction between propagules of P.
infestans and P. betacei and their respective hosts S. tuberosum and S.
betaceum, where measured in order to compere the interactions, considering
that P. betacei is specialist of S. betaceum.
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Tabla de contenido Resumen .............................................................................................................................7
Capítulo 1 ......................................................................................................................... 11
Introducción ..................................................................................................................... 11
Capítulo 2 ......................................................................................................................... 14
Marco teórico y trabajo previo en Phytophthora infestans y betacei .................................. 14
2.1) Phytophthora .......................................................................................................... 14
2.1.1) Características ................................................................................................. 14
2.2.2) Infección .......................................................................................................... 16
Capítulo 3 ......................................................................................................................... 18
Marco teórico y trabajo previo en mediciones de adhesión usando técnicas de AFM........ 18
3.1) Funcionamiento...................................................................................................... 18
3.2) Espectroscopía de fuerza atómica (SCFM)............................................................. 20
3.3) Trabajo previo en Phytophthora haciendo uso de SCFM ........................................ 21
Capítulo 4 ......................................................................................................................... 24
Muestras biológicas para la experimentación ................................................................... 24
4.1) Obtención de esporangios .................................................................................. 24
4.2) Obtención de hojas ............................................................................................ 25
4.3) Manejo del material biológico para las muestras de AFM ................................. 25
Capítulo 5 ......................................................................................................................... 27
Implementación de técnicas de espectroscopía de fuerza atómica en las mediciones de
adhesión............................................................................................................................ 27
5.1) Preparación del microscopio .................................................................................. 27
5.2) Adhesión de un único esporangio a la punta de AFM para hacer SCFS ................. 28
Capítulo 6 ......................................................................................................................... 32
Resultados ........................................................................................................................ 32
6.1) Esporangios de P. betacei con hojas de S. betaceum ................................................ 32
6.2) P. betacei con sustratos de control .......................................................................... 35
6.3) Barridos de flujo .................................................................................................... 37
6.4) P. infestans con hojas de S. betaceum...................................................................... 38
6.5) P. betacei con hojas de S. tuberosum ....................................................................... 39
Capítulo 7 ......................................................................................................................... 43
Comparación y discusión .................................................................................................. 43
Capítulo 8 ......................................................................................................................... 47
Conclusiones y trabajo a futuro ........................................................................................ 47
Referencias. ...................................................................................................................... 49
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Capítulo 1
Introducción
Phytophthora es un género del filo Pseudofungi con más de 100 especies incluyendo
importantes patógenos de plantas que infectan y devastan poblaciones naturales y de
importancia agrícola (Kroon, Brouwer, de Cock, & Govers, 2012). Este pertenece a la
clase Oomycetes, un grupo diverso de organismos heterótrofos con características
morfológicas y fisiológicas similares a las de los hongos, pero filogenéticamente distantes
(Agrios, 1996; «Introducción a los Oomicetes», s. f.). En Colombia, se han realizado
importantes avances en la caracterización y aislamiento de P. infestans y P. betacei
(Céspedes et al., 2013; Maria F Mideros et al., 2016; M.F. Mideros et al., 2018). P.
infestans es un organismo modelo causante de enfermedades en diferentes plantas frutales
(Cepero de García, Restrepo Restrepo, & Franco-Molano, 2012). Mientras que, P. betacei
es un organismo especialista (no infecta otras especies) que infecta tomate de árbol y se
identificó recientemente en cultivos en Antioquia, Nariño y Putumayo (M.F. Mideros
et al., 2018).
Los propágulos de Phytophthora, entre los que encontramos Oosporas zoosporas
y zoosporangios, requieren llevar a cabo un proceso de adhesión y penetración de órganos
o tejidos vegetales que desencadenan luego en la colonización, crecimiento y
reproducción. Se sabe que el proceso de unión entre los propágulos de un hongo y su
hospedero es supremamente importante para que la infección sea exitosa (Nicholson &
Epstein, 1991), sin embargo, aún no se tienen indicios a cerca de lo que significa la
adhesión temprana, a saber, los primeros instantes de interacción entre propágulos, en
este estudio esporangio, y el sustrato, para el proceso de infección, por lo tanto, es de total
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relevancia caracterizar dicha interacción. Además, puede dar nuevos indicios y ahondar
en lo que se sabe hasta ahora a cerca de los procesos infecciosos y como evitarlos.
Ahora bien, en términos del proceso de infección se ha encontrado existe la
posibilidad de que haya sitios específicos en la superficie del hospedero con
susceptibilidades más altas a ser colonizados que otros(Tyler, 2002). Del mismo modo,
los mecanismos de resistencia a infecciones en las plantas, en ciertos casos, dependen de
receptores específicos que permiten el reconocimiento de moléculas en la membrana del
patógeno, así como de estructuras como tricomas o la cutícula vegetal. Un ejemplo de lo
anterior se encuentra en los mecanismos de resistencia de no-hospedero en N.
benthamiana contra P. infestans que dependen de la edad y sugieren un rol crucial de los
genes SGT1 y HSP90 para el reconocimiento de patrones moleculares conservados en el
patógeno (Shibata, Kawakita, & Takemoto, 2011). Lo anterior sirve para justificar que el
estudio de las propiedades mecánicas que tienen influencia sobre estos procesos puede
ser de gran utilidad para comprender la interacción planta-patógeno y su relación con el
rango de hospedero y los procesos de infección.
La Espectroscopia de Fuerzas de Única Célula por Microscopía de Fuerza
Atómica (AFM-SCFS) es una herramienta útil para estudiar la adhesión de propágulos en
diferentes sustratos (Friedrichs et al., 2013). Una de las técnicas más aceptadas, y con la
que a futuro se espera complementar este estudio, para cuantificar la adhesión de
propágulos fúngicos, bacterias y otros patógenos en diferentes sustratos ha sido el conteo
de células barridas por un flujo o lavado. No obstante, esta técnica tiene algunas
limitaciones, por ejemplo no permite encontrar valores experimentales de las fuerzas de
adhesión ni brinda información sobre los procesos que se dan en células individua les
(Nicholson & Epstein, 1991). Por otro lado, la sensibilidad del AFM permite realizar
mediciones del orden de pico Newtons y ha sido usada en contadas ocasiones para
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cuantificar la adhesión de propágulos fúngicos: Por ejemplo, en un estudio miden las
fuerzas de adhesión entre esporas de Aspergillus niger y su dependencia con el tiempo y
el pH en solución (Wargenau & Kwade, 2010). Por otro lado, se han realizado ensayos
de AFM-SCFS entre esporas de Phanerochaete chrysosporium y superficies modelo que
han logrado mostrar una especial afinidad de estas con sustratos hidrofóbicos (Dufrêne,
2000).
El objetivo de este proyecto consistió en estudiar el rol de la adhesión temprana
de esporangios de P. infestans y P. betacei en su rango de hospedero. Para ello se usó una
variante metodológica de las técnicas usadas por Dufrêne (Dufrêne, 2000) para adherir
un esporangio a un cantiléver de AFM y caracterizar su adhesión a sustratos vegetales, es
decir, hojas de S. tuberosum var. R-12 (Papa) y S. betaceum var. Común (Tomate de
árbol). Se realizaron mapas de fuerza en el tiempo sobre regiones de las hojas para
comparar la adhesión en los primeros segundos de contacto esporangio-sustrato. Con
esto, se esperaba observar una adhesión diferencial entre esporangios y hojas
dependiendo de su capacidad infectiva y el grado de especialización para la infección de
ciertas especies vegetales como también cambios en la adhesión de acuerdo con las
estructuras y al tiempo de medida dada una posible respuesta de la célula vegetal.
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Capítulo 2
Marco teórico y trabajo previo en Phytophthora
infestans y betacei
2.1) Phytophthora
2.1.1) Características
La palabra Phytophthora traduce al español “destructor de plantas”, nombre que le dio el
micólogo alemán Heinrich Anton de Bary a un género de patógenos de planta por los
devastadores efectos que tuvo en los cultivos de papa irlandeses en el siglo XIX, causando
la gran hambruna de Irlanda. Este está conformado por más de cien especies (este número
aumenta cada mes) que se han clasificado históricamente por sus diferencias y similitudes
morfológicas y fisiológicas(Kroon et al., 2012) y pertenece a la clase Oomicetes, un
grupo diverso de organismos heterótrofos con características morfológicas y fisiológicas
similares a las de los hongos, pero que son filogenéticamente distantes (Agrios, 1996).
Los Oomicetes crecen de forma filamentosa, se nutren a partir de absorción y se
reproducen a través de zoosporas por lo que los biólogos y fitopatólogos los consideraron
durante mucho tiempo parte de los hongos («Introducción a los Oomicetes», s. f.), sin
embargo, a medida que los estudios sobre las especies de este género avanzan se ha
demostrado que estos dos tipos de organismos no son iguales. En el caso del género
Phytophthora las zoosporas son transportadas en zoosporangios, mostrados en la figura
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1, (que llamaremos esporangios en el desarrollo de este texto) a través de vías aéreas hasta
llegar al hospedero para iniciar el proceso de infección.
Los Oomicetes Phytophthora se presentan en diversos lugares del mundo
incluyendo varios países de América Latina. En particular, en Colombia se presentan
varias especies de Phytophthora que infectan tanto cultivos agrícolas de los que depende
la alimentación y la economía de muchos de los individuos del país, como ecosistemas
salvajes, libres de intervención humana. Por lo anterior, en este país se han realizado
importantes avances en la caracterización y aislamiento de dos especies especificas del
género, a saber, P. infestans y P. betacei (Céspedes et al., 2013; Maria F Mideros et al.,
2016; M.F. Mideros et al., 2018).
P. infestans es un organismo modelo del género Phytophthora, causante de la gota
o tizón tardío de la papa (S. tuberosum), así como de enfermedades en papa criolla (S.
Fig 1: Fotografía de esporangios de P. betacei capturada por el autor haciendo uso de un
microscopio óptico marca Zeiss en luz transmitida con un objetivo 5x.
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phureja), tomate de mesa (S. lyocopersicum), tomate de árbol (S. betaceum), berenjena
(S. melongena), lulo (S. quitoense) y uchuva (Physalis peruviana) (Cepero de García
et al., 2012). Por otro lado, P. betacei es un organismo que infecta únicamente plantas de
tomate de árbol, es decir, es un organismo especialista de esta especie, y se identificó
recientemente en cultivos en Antioquia, Nariño y Putumayo (M.F. Mideros et al., 2018).
En este sentido, se vuelve importante caracterizar y describir correctamente los procesos
que llevan a una infección exitosa de las diferentes plantas.
2.2.2) Infección
Los propágulos de Phytophthora, a saber, las oosporas (producidas por reproducción
sexual), zoosporas y esporangios, (producidos por reproducción asexual), requieren pasar
por un proceso de adhesión y penetración, que es crucial en la partenogénesis de los
individuos del género y tiene factores asociados con el rango de hospedero de órganos o
tejidos vegetales que desencadenan luego en la colonización, crecimiento y reproducción
del patógeno (Nicholson & Epstein, 1991). Esta dependencia que se da entre el éxito de
la infección y la adhesión del esporangio al organismo hospedero se debe a que, en
general, dicho proceso implica que el esporangio inicie la creación de quistes germinosos
sobre la superficie que infectará y el crecimiento de tubos germinales que puedan penetrar
la epidermis de la planta. Esto pasa ̧ por lo general, a través de las estomas (Riedel,
Werres, McKeever, Elliott, & Shamoun, 2012). No obstante, aún no se ha cuantificado ni
se ha logrado determinar cuál es el rol de los primeros momentos de contacto entre
esporangio y hospedero en el proceso de infección.
Ahora bien, distintos procesos de migración activa de zoosporas de Phytophthora
sugieren la posible presencia de sitios específicos en la superficie del hospedero más
susceptibles para ser colonizados (Tyler, 2002). Del mismo modo, los mecanismos de
resistencia en plantas (barreras químicas constitutivas, barreras mecánicas o defensas
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inducibles) en ciertos casos dependen de receptores específicos en la superficie vegetal
para el reconocimiento de moléculas en la membrana del hospedero, así como de
estructuras como tricomas o la cutícula vegetal. Un ejemplo de lo anterior se encuentra
en los mecanismos de resistencia de no-hospedero en N. benthamiana contra P. infestans
que dependen de la edad y sugieren un rol crucial de los genes SGT1 y HSP90 para el
reconocimiento de patrones moleculares conservados en el patógeno (Shibata et al.,
2011). Confirmando así que estudiar las fuerzas y barreras energéticas que gobiernan
estos procesos puede ser de gran utilidad para comprender la interacción temprana planta -
patógeno y su relación con el rango de hospedero.
Por lo anterior, la motivación principal para realizar estos experimentos es poder
determinar si la adhesión temprana entre esporangios y sustratos vegetales tiene
influencia en el rango de hospedero de cada patógeno, en otras palabras, determinar si las
magnitudes de adhesión entre esporangios de P. betacei y su hospedero S. betaceum es
mayor a la que este sustrato tendría con esporangios de P. infestans, y repetir este
procedimiento para S. tuberosum.
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Capítulo 3
Marco teórico y trabajo previo en mediciones de
adhesión usando técnicas de AFM El campo de la microscopía de fuerza atómica (AFM) ha crecido rápidamente gracias a
que ha logrado demostrar, dadas sus características y versatilidad, que es de gran utilidad
en diferentes ciencias. Estos microscopios hacen parte de un grupo de aparatos llamados
microscopios de sonda de barrido (SPM) que se caracterizan por su método particular de
obtención de imágenes de las muestras(«Atomic Force Microscopy For Biologists (2nd
Edition)», s. f.). Los AFM, y en general los SPM, se diferencian de los microscopios
ópticos en que aquellos, en lugar de tomar imágenes de la muestra recibiendo luz reflejada
o transmitida, usan diferentes métodos para hacer contacto con ella y de este modo medir
propiedades que no se limitan únicamente a observaciones ópticas.
Esta metodología permite que el microscopio haga imágenes con una resolución
mucho mayor que la de los microscopios ópticos tradicionales y, además, permite la
obtención tanto de imágenes topográficas de la muestra, como de propiedades mecánicas
tales como la fuerza de interacción entre distintos sustratos o entre la muestra y el
microscopio mismo (Seo & Jhe, 2008). Por lo que ha demostrado ser una herramienta de
gran utilidad en las ciencias biológicas, tanto para observación de materiales biológicos
en tiempo real, como para caracterizar las interacciones entre diferentes sustratos y sus
propiedades mecánicas, cosa que es el objetivo primordial de este estudio.
3.1) Funcionamiento.
En general, los AFM funcionan haciendo uso de cantiléver reflectivos, un láser, un sensor
fotoeléctrico, un piezoeléctrico y una punta extremadamente fina que se monta sobre el
cantiléver y permite que el microscopio interactúe con el sustrato que se quiere
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estudiar(Fitzgerald & Catravas, s. f.). Estos componentes se organizan como se muestra
en la figura 2.
Ahora bien, aunque la punta permite la interacción entre el microscopio y la muestra, el
componente esencial para lograr el registro de los datos es el piezoeléctrico, pues, este al
ser comprimido produce una diferencia de potencial eléctrico y por lo tanto permite
cambiar la posición del cantiléver según la topografía de la muestra con una precisión
atómica(«Atomic Force Microscopy For Biologists (2nd Edition)», s. f.). De este modo,
el piezoeléctrico es el que controla la posición en el eje z del cantiléver, mientras que los
ejes x y y se controlan moviendo la muestra. Por otro lado, están el laser y el sensor
fotoeléctrico que son los que permiten monitorear la posición del cantiléver a medida que
se mueve a lo largo de la muestra. Para lograrlo se tiene un sensor fotoeléctrico dividido
en cuatro porciones en las que puede incidir el láser. Las diferencias de potencial que se
dan entre las porciones superiores e inferiores del sensor, calculadas a partir de la
intensidad del rayo incidente, se pueden convertir para cuantificar el movimiento de la
Fig 2: Funcionamiento de un microscopio de fuerza atómica. [17]
20
punta hacia arriba y hacia abajo, mientras que la diferencia de potencial entre los sensores
de los lados da valores de doblamiento que permiten observar las fricciones entre la punta
y la muestra. Ahora bien, dentro de esta metodología existe una técnica particular que
permite determinar los valores de fuerza en una única célula. Dicha técnica se llama
microscopía de fuerzas de única célula (SCFM) y es la técnica que se usa en este estudio
3.2) Espectroscopía de fuerza atómica (AFM)
La Espectroscopia de Fuerzas de Única Célula por Microscopía de Fuerza Atómica
(AFM-SCFS) es una herramienta útil para estudiar la adhesión de propágulos en
diferentes sustratos (Friedrichs et al., 2013). Históricamente, una de las practicas más
comunes para cuantificar la adhesión de propágulos fúngicos en sustratos ha sido el
conteo de células por campo visual en una laminilla posterior a lavados. Sin embargo,
esta técnica se limita a algunos sustratos y no permite caracterizar mecánicamente la
adhesión ni brinda información sobre los procesos que se dan en células individua les
(Nicholson & Epstein, 1991), además de hacer difícil la observación de las estructuras
que producen mayor adhesión en los diferentes sustratos. Habiendo dicho esto, cabe
aclarar que esta técnica puede ser útil para complementar el estudio pues permite una
mayor cantidad de experimentos en un menor tiempo y da resultados cuantitativos sobre
la adhesión de propágulos al sustrato. La técnica del SCFM consiste en pegar una sola
célula a la punta (que en este caso es cambiada por una pequeña esfera) o directamente al
cantiléver de AFM para poder ponerla en contacto directamente con las superficies con
las que se busca que interactúe. Además, la sensibilidad del AFM permite realizar
mediciones del orden de pico Newtons y ha sido usada en contadas ocasiones para
cuantificar la adhesión de propágulos fúngicos: Por ejemplo, en un estudio miden las
fuerzas de adhesión entre esporas de Aspergillus niger y su dependencia con el tiempo y
el pH en solución (Wargenau & Kwade, 2010). En este sentido, se han realizado ensayos
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de AFM-SCFS entre esporas de Phanerochaete chrysosporium y superficies modelo de
CH3/CH3, CH3/OH, y OH/OH mostrando una especial afinidad de estas con sustratos
hidrofóbicos (Dufrêne, 2000). Ahora bien, es importante aclarar que en este estudio se
usará una variante metodológica de las técnicas usadas por Dufrêne (Dufrêne, 2000) para
adherir un único esporangio a un cantiléver de AFM y de esta forma caracterizar su
adhesión a sustratos vegetales, es decir, hojas de S. tuberosum var. R-12 (Papa) y S.
betaceum var. Común (Tomate de árbol).
3.3) Trabajo previo en Phytophthora haciendo uso de SCFM
En la Universidad de los Andes se hicieron, previo a la presente investigac ión,
experimentos y caracterizaciones de adhesión entre P. infestans y S. betaceum, haciendo
uso de la técnica de espectroscopia de fuerzas de única célula mencionada arriba. En estos
experimentos se obtuvieron datos para las fuerzas de adhesión en regiones celulares de la
hoja, es decir, en las secciones de color verde de la hoja que se pueden ver en la figura 3
Fig 3: Región celular de la hoja, tomada en un microscopio óptico con objetivo 10x.
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tomada por el autor, y en nervaduras que son las secciones de alargadas de color
amarillento
En estos experimentos se obtuvieron datos que serán relevantes para el desarrollo
a profundidad de la investigación y por lo tanto se usarán para dar conclusiones en
conjunto con los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis. En dicho estudio
hicieron mapas de fuerza en el tiempo, es decir, diferentes mapas de fuerza sobre una
misma región sin dar tiempo de espera, para los que obtuvieron los siguientes datos de
fuerza de adhesión, reportados en la figura 4.
En general, en estos datos se puede observar que las fuerzas de adhesión entre los
esporangios de P. infestans y las hojas de tomate de árbol son del orden de un nano
Newton y que tienen una pequeña variación con el tiempo. Como se mostrará más
adelante en la sección de resultados, estos datos de adhesión son realmente bajos a
Fig 4: Gráficas adhesión entre nervaduras y regiones celulares de hojas de tomate de árbol
var.Común y esporangios de P. infestans en el tiempo. Las gráficas se realizaron a partir de
datos obtenidos antes de este estudio.
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comparación de los obtenidos en otras configuraciones, por ejemplo, entre P. betacei y
tomate de árbol.
24
Capítulo 4
Muestras biológicas para la experimentación Para este proyecto hay dos muestras biológicas fundamentales: los esporangios y los
sustratos vegetales. Para poder tener datos experimentales que sean comparables es de
suma importancia mantener una metodología de obtención de muestras constante, pues
de este modo se evitan variaciones en la adhesión por variaciones en las condiciones de
las muestras. En este sentido, los protocolos que se exponen a continuación fueron
constantes durante todo el trabajo experimental desde que se encontraron las condiciones
óptimas para las muestras.
4.1) Obtención de esporangios
En primer lugar, hablaremos del protocolo de crecimiento y almacenamiento de los
esporangios. Estos debían ser guardados en soluciones a baja concentración para
garantizar que el proceso de adhesión a las puntas del AFM fuera correcta. Para realizar
una solución con esporangios se usaron muestras de P. infestans RC110 y P. betacei
P8084 proporcionados por el laboratorio LAMFU de la Universidad de los Andes. Dichas
muestras fueron cultivadas en agar tomate de árbol por un periodo de entre 5-20 días a
temperatura ambiente y una alta humedad relativa para garantizar la producción de
esporangios en el micelio. Luego, se realizó un raspado con palillos estériles y se mezcló
el material biológico obtenido con 1 ml de agua de Petri modificada (con bajo contenido
en calcio para promover generación de esporas) (1 mM MgSO4, 1mM KH2PO4, 0.8 mM
KCl). A partir de esto se realizaron stocks de 100 µL de la solución con baja concentración
de esporangios que fue previamente filtrada con gazas estériles y se guardaron a -80°C.
A la hora de llevar a cabo la toma de datos es necesario poner 50µL de la solución de
esporangios en la laminilla y 100µL de agua adicionales al lado de la hoja (no encima)
para evitar que los esporangios inicien procesos de adhesión no deseados. Los
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esporangios, tras acabar la experimentación, son desechados según todas las
especificaciones de riesgo biológico para evitar contaminaciones ecológicas.
4.2) Obtención de hojas
En segundo lugar, fue importante mantener las hojas en una edad constante, ya que, de
estudios previos se sabe que hay varios factores que pueden afectar la adhesión de la hoja,
entre ellos su edad y su posición (Visker et al., 2003). Para lograrlo se tomaron hojas de
tamaños cercanos y de un punto específico de las plantas, como se muestra en las
imágenes de la figura 5, pues de este modo se garantiza que la edad, siempre y cuando se
mantengan plantas con tamaños similares, es similar. De este modo, para garantizar que
los tamaños de las plantas, de las que se sacan las hojas para cada experimento, fueran
similares se fueron renovando aproximadamente cada seis semanas por plantas más
jóvenes. En este sentido, para evitar variaciones epigenéticas en las muestras, las plantas
se consiguieron siempre con el mismo proveedor.
4.3) Manejo del material biológico para las muestras de AFM
A la hora de preparar la muestra para llevarla al AFM se debía pegar con super bonder un
recorte, relativamente grande, de la hoja (preferiblemente el borde para evitar múltip les
Fig 5: Muestran los criterios de selección de las hojas para experimentación. En general, en
los experimentos el tamaño se mantuvo constante en el rango de 4.5 − 5𝑐𝑚. También, se
tomaron las hojas siempre de la segunda posición marcada en la imagen con un 2.
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laceraciones) a una laminilla limpia cómo se muestra en la figura 6 hecha por el autor.
Esto se empezó a hacer pues en un principio, a diferencia de lo que se ve en la figura 6,
se recortaba la hoja por la mitad y se ponían los esporangios sin discriminar el lado, sin
embargo, durante la toma de datos preliminares se observó que las laceraciones en la hoja
hacían que ésta secretara fluidos que interferían con la toma de datos haciendo que el
esporangio se despegara o que las puntas de AFM se doblaran o rompieran. Por lo tanto,
se puede decir que es preferible poner las gotas de esporangios y de agua del lado que no
tiene laceraciones, además de pegar la hoja completa y recortar únicamente aquello que
sale de la laminilla.
Fig 6: imagen ilustrativa del posicionamiento de las diferentes partes de la muestra sobre la
laminilla. La gota azul clara representa el agua pura, la gota azul oscura representa la gota
con esporangios y el rectángulo blanco es la laminilla de microscopía.
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Capítulo 5
Implementación de técnicas de espectroscopía de
fuerza atómica en las mediciones de adhesión
Para lograr mediciones de adhesión se pueden utilizar varias técnicas, sin embargo, el
objetivo de este experimento es comparar las fuerzas de adhesión, en tanto a sus
propiedades mecánicas, que se dan en las diferentes estructuras presentes en las hojas,
por lo tanto, se usó una técnica particular de microscopía de fuerza atómica llamada
espectroscopia de fuerzas de única célula (SCFC). Esta técnica, como se dijo previamente,
consiste en tomar, como su nombre lo indica, una única célula y ponerla en cantiléver de
AFM para hacer de esta forma la toma de datos experimental. Por su configuración la
SCFS permite hacer mediciones exactas de las magnitudes de fuerzas de adhesión con
valores del orden de pico-Newtons, por lo tanto, se adecúa bastante bien al objetivo del
proyecto y permite hacer comparaciones entre las fuerzas que generan las diferentes
estructuras.
5.1) Preparación del microscopio
Se incuba un cantiléver sin punta de AFM (Arrow TL-2, Nano World) en una solución
de clorhidrato de dopamina (12mg de clorhidrato de Dopamina en 1.5 mL de agua
esterilizada) dentro de un capilar previamente sometido a sonicación. Esto se hace para
garantizar que el cantiléver sea suficientemente adhesivo para mantener los esporangios
pegados durante todo el procedimiento experimental y se usa un capilar para evitar que
las puntas del cantiléver se rompan por la presión del agua. Posteriormente, se debe poner
la muestra, preparada como se mostró en el capítulo anterior, en la base del microscopio
y sobre ella la punta ya unida al montaje del AFM.
28
Para lograr una toma de datos exitosa es importante mantener los parámetros
constantes a lo largo de los diferentes experimentos. Por lo anterior, al iniciar cada sesión
se debe hacer una calibración, previa a adherir el esporangio a la punta, para eliminar los
errores sistemáticos en los cálculos de la constante elástica de la punta y los voltajes
necesarios para calibrar el piezoeléctrico que permite controlar la posición en z de la
punta, como se mencionó en el capítulo 3, y es esencial para el cálculo de las
magnitudes de adhesión, y del fotosensor que permite calcular la deflexión del láser que
incide en la punta (cuyo valor inicial debe estar en 0). Para esto ponemos la punta primero
sobre la sección de la muestra que contiene agua estéril únicamente y procedemos a hacer
la calibración a través del software IGOR de la compañía Resarch Asylum que es la
creadora del microscopio.
5.2) Adhesión de un único esporangio a la punta de AFM para hacer SCFS
Después de haber hecho la calibración se cambia cuidadosamente la posición del
cantiléver, haciendo uso de los controles de movimiento que tiene disponibles el
microscopio, hasta llegar a una zona de la muestra en la que haya esporangios. Aquí se
pone en contacto con un único esporangio que se ubica, a lo largo del experimento,
29
haciendo uso de un microscopio óptico con un objetivo de 10x y se pega al cantiléver de
la siguiente forma.
Tras pegar el esporangio a la punta se debe recalibrar la constante elástica del
cantiléver, pues esta puede cambiar por la acción del esporangio, y llevar el esporangio
al área del sustrato vegetal que se quiere estudiar, usando el microscopio óptico con
objetivo de 10x, teniendo cuidado de que no se despegue de la punta, e iniciar la toma de
datos con los siguientes parámetros: velocidad constante de 1.2 µm/s, con un trigger de
fuerza de 3 nN, tiempo de contacto de 1s. Cabe aclarar que estos parámetros fueron
obtenidos de experimentos preliminares dado que son los que optimizan el tiempo de
toma de datos y además son los más efectivos para mantener el esporangio pegado al
cantiléver durante la experimentación. Se hacen distintos diagramas de fuerza del sistema
cantiléver-esporangio contra el sustrato vegetal en puntos individuales y 5 Mapas de
Fig 7: Imagen tomada en el AFM de un esporangio pegado al cantiléver de forma
adecuada. En este experimento específico el esporangio que se está usando es inmaduro.
30
fuerza de 5x5 µm (4 puntos y 5 lineas) correspondientes aproximadamente a 15 minutos
de toma de datos, estos datos son reportados por el programa como mapas de fuerza de la
siguiente manera.
En el transcurso de la experimentación, cómo se observará en los datos
preliminares de la sección de resultados, se encontró, analizando los valores obtenidos
para la adhesión, que una porción de estos podría darse por interacciones de adhesión
inespecífica, es decir, adhesión que no necesariamente es producida por la interacción
entre el esporangio y el sustrato vegetal. Por esto se hicieron dos experimentos de control
para encontrar los niveles de adhesión inespecífica que podría tener el esporangio con el
sustrato con el que interactúa. Como esta adhesión inespecífica depende de la naturaleza
hidrofóbica del sustrato con el que interactúa el esporangio, se usaron dos sustratos
distintos parafina y vidrio. La hidrofobicidad de los sustratos se encontró haciendo uso
Fig 8: En esta gráfica, obtenida con el software IGOR de Asylum Research, se pueden observar
los valores de fuerza en cada punto del área escaneada.
31
de los ángulos medidos entre el borde de una gota de agua y la horizontal. Dichos ángulos
se pueden observar en la figura 9.
Así, se determinó que una forma de evitar que la adhesión inespecífica entre los
esporangios y las hojas fuera un parte tan grande de los datos es tomar datos de adhesión
sobre mapas de área grande para identificar los sitios de alta adhesión en la hoja. Esta
nueva metodología sirve bien en los tricomas, en tanto que es posible hacer un mapa más
grande gracias a su topografía relativamente constante, sin embargo, no logra eliminar la
alta variabilidad de los datos. Por otro lado, en la región celular de las hojas hacer los
mapas de adhesión con más de 10µm se vuelve una tarea difícil, como se mostrará en la
sección de resultados, pues la superficie de la hoja cambia de alturas radicalmente
Fig 9: Imagen comparativa del ángulo que forma el agua con tres sustratos. Con estos
ángulos se determina la hidrofobicidad.
32
Capítulo 6
Resultados En el desarrollo de esta investigación, para cumplir con los objetivos que se plantearon,
se hicieron varios experimentos en los que se midieron los valores de la fuerza de
adhesión entre esporangios de P. infestans y P. betacei y hojas tanto de S. tuberosum,
como de S. betaceum, haciendo uso la técnica de SCFM mencionada en el Capítulo 3.
Estos resultados se presentarán teniendo en cuenta qué tipo de esporangio estaba entrando
en contacto con qué tipo de hoja.
6.1) Esporangios de P. betacei con hojas de S. betaceum
En primer lugar, se hicieron mediciones de fuerza de adhesión entre esporangios de P.
betacei y hojas de S. betaceum, pues se esperaba obtener datos de alta adhesión, dado que
aquel es un patógeno específico de este. Para lograr estos datos se usó el montaje
experimental presentado en el Capítulo 5. En un principio se hicieron mediciones de
adhesión en el tiempo, es decir, se hicieron varios mapas seguidos sobre una misma zona
de la hoja empezando el segundo mapa en el último punto del primero, así sucesivamente
hasta llegar a cinco mapas de adhesión en una misma región. Posteriormente, se
33
empezaron a hacer mapas individuales sobre diferentes zonas de la región celular. Para
estas mediciones se obtuvieron los datos reportados en la gráfica 1.
En estos datos se puede observar que hay regiones en las que las fuerzas de adhesión son
bastante altas, como los mapas 5 (con adhesiones del orden de 150 nanoNewtons), 8 y 9
(con adhesiones del orden de 50 nanoNewtons) y que la variabilidad en los datos de
adhesión para la misma es alta cuando hay regiones de alta adhesión. Por esta variación
se tomó la decisión de quitar los datos de alta adhesión de la gráfica para así determinar
si esta variación se da también en las regiones de adhesión más baja obteniendo la gráfica
2 en la que se puede observar de nuevo una variación bastante grande entre los datos
tomados tanto en una misma zona en el tiempo, como en una zona individual.
Graf 1: boxplots de las fuerzas de adhesión entre esporangios de P. betacei y región celular
de S. betaceum. 1-5 datos de adhesión en el tiempo. 7-12 mediciones individuales sobre
diferentes áreas del sustrato.
34
Estos datos sirvieron para tener una idea preliminar de cómo se comportarían los datos
en general. Por esto, y por la dificultad que presenta ubicar sobre qué tipo de células se
encuentra el esporangio en el AFM como se puede apreciar en la figura 10, se tomó la
Graf 2: boxplots de las fuerzas de adhesión entre esporangios de P. betacei y región celular
de S. betaceum. Se eliminan los boxplots que representan adhesiones altas para observar la
variación en las regiones de menor adhesión
Fig 10: Visualización del cantiléver en región celular. Como bien se ve, no es fácil ubicar el
esporangio, ni determinar sobre qué tipo de células está.
35
decisión de verificar si los datos tenían la misma variabilidad en otras regiones de la hoja
por lo que se hicieron mediciones sobre los tricomas.
Para los tricomas, por cuestiones de tiempo de experimentación, no se hicieron
mapas de fuerza en el tiempo, sin embargo, se tomaron datos sobre regiones distintas de
los tricomas y sobre tricomas distintos que se reportan en la gráfica 3.
En estos datos se puede observar que los tricomas, en general, tienen valores menores de
adhesión que las regiones celulares, sin embargo, se sigue teniendo una variación bastante
alta en los datos de una misma zona.
6.2) P. betacei con sustratos de control
Ya habiendo confirmado que la alta variación en los datos se da en las diferentes regiones
de la hoja (inclusive se sabe que hay variación en nervadura por los datos de la Subsección
3.3), se determinó, como se mencionó en la Subsección 5.2, que esta podía venir de la
hidrofobicidad de las diferentes estructuras de la hoja, por lo que se tomaron datos de
Graf 3: boxplots de las fuerzas de adhesión entre esporangios de P. betacei y tricomas de S.
betaceum sin los boxplots que representan adhesiones altas. Para observar la variación en las
regiones de menor adhesión
36
control con dos sustratos con hidrofobicidades conocidas, a saber, vidrio y parafina. De
este modo, se obtuvieron los datos reportados en la gráfica 4.
Con estos datos se logró confirmar que la hidrofobicidad genera fuerzas de adhesión entre
el esporangio y el sustrato con el que se pone en contacto, por lo que se tomó la decisión
de sumar una nueva metodología de experimentación que podría permitir que se
cuantifique de forma más sencilla la adhesión. Esta metodología consiste en tomar datos
de adhesión sobre mapas de área grande (20 ∗ 20 μ𝑚) para identificar los sitios de alta
adhesión en la hoja, como se mostrará en la Sección 6.5.
Graf 4: boxplots de las fuerzas de adhesión entre esporangios de P. betacei y sustratos de
control.
37
6.3) Barridos de flujo
Dicha metodología consiste en hacer barridos de flujo, es decir, poner esporangios sobre
la hoja, dejarlos asentar para que haya contacto, hacer un conteo, aplicar un flujo
constante y hacer un nuevo conteo para comparar cuantos esporangios cayeron. Además,
se pensaba observar los esporangios sobre la hoja y determinando sobre qué estructuras
se quedan pegados, sin embargo, durante el proceso de estandarización se encontró que
los esporangios no son visibles sobre las hojas haciendo uso de microscopios ópticos.
Para determinarlo se tomaron fotos de una hoja sin esporangios, posteriormente se
pusieron esporangios y se tomó una nueva foto como se ve en la figura 11.
Es claro que los esporangios no se ven sobre la hoja, por lo que se ideó una nueva forma
de hacer el conteo. Esta se reportará en la sección de trabajo a futuro. En paralelo a esta
estandarización se siguieron haciendo mediciones de adhesión con AFM.
B A
C D
Fig 11: A: esporangios en laminilla con objetivo 10x. B: hoja sin esporangios con objetivo
5x. C: hoja con esporangios con objetivo 10x. D: hoja con esporangios con objetivo 5x.
38
6.4) P. infestans con hojas de S. betaceum
En el caso de P. infestans, teniendo en cuenta que ya se tenían datos previos a la
investigación, sólo se tomaron datos de fuerza de adhesión con tricomas de S. betaceum.
Estos resultados pueden ser realmente importantes, pues en esta investigación se busca
confirmar si el rango de hospedero de los Oomicetes se ve influenciado por la adhesión
temprana entre propágulo y hospedero, y si hay sitios específicos de la hoja que generen
más adhesión. Las fuerzas de adhesión se pueden ver la gráfica 5.
Ahora bien, P. infestans es un organismo que, como se dijo en el Capítulo 2, puede
infectar una gran variedad de especies, por lo que no se espera que haya una gran
diferencia entre los datos de adhesión obtenidos para este y os obtenidos para P. betacei.
Por otro lado, es fácil notar que hay pocas repeticiones y, por ende, no se puede dar una
respuesta definitiva ni hacer una comparación entre muestras que sea determinante, sin
embargo, estos datos dan una idea buena de qué se puede esperar de datos tomados a
futuro y cuál va a ser la tendencia de los datos con respecto a los de otras configuraciones,
como la de P. betacei con tricomas de S. tuberosum.
Graf 5: Boxplot con las fuerzas de adhesión entre P. infestans y tricomas de S. betaceum.
39
6.5) P. betacei con hojas de S. tuberosum
Por último, se encontraron datos de fuerzas de adhesión entre esporangios de P. betacei
y hojas de S. tuberosum. Estos datos pueden ser de gran importancia para definir si la
adhesión temprana tiene influencia sobre el rango de hospedero, pues, como ya se dijo
antes, P. betacei es un organismo especialista de S. betaceum, lo que quiere decir que no
infecta otras especies, por lo que se espera que las fuerzas de adhesión sean más bajas que
la obtenidas para la configuración usada en la Sección 6.1. Para esta toma de datos hubo
un pequeño cambio de metodología inspirado por la gran variabilidad hallada en todos
los casos anteriores. Aquí se hicieron mapas de adhesión de un tamaño mucho más grande
(20 ∗ 20 𝜇𝑚) que el usado anteriormente (5 ∗ 5 μ𝑚) con el objetivo de identificar las
zonas de alta adhesión de la hoja y así poder tomar datos únicamente sobre estas regiones.
Dichos mapas tienen un problema, pues cuando se hacen sobre regiones celulares, debido
a la topografía extremadamente variable de la hoja, la sonda no alcanza a bajar el
esporangio hasta hacer contacto por lo que no se encuentran fuerzas en todo el mapa. Para
ilustrar mejor dicha problemática esto se muestra en la figura 12
Adhesión en región celular Adhesión en tricomas
Fig 12: Mapas de regiones de 20 ∗ 20 μ𝑚 tomados sobre tricomas y región celular de S.
tuberosum. Las secciones rojas del mapa de región celular representan lugares donde el
cantiléver no alcanzó a hacer contacto con el sustrato.
40
Con esto en mente se puede pasar a analizar los datos obtenidos para tricoma que se
muestran en la gráfica 6.
Ahora, si bien, al igual que los datos obtenidos en la Sección 6.4 estos datos no
son suficientes para llegar a conclusiones definitivas se puede ver que en tricomas las
adhesiones entre las diferentes especies son similares y además se logró ver que sin
importar si uno se encuentra en una región de alta o baja adhesión, sigue habiendo una
gran variabilidad en los datos. Esta variabilidad también se puede ver en los datos
obtenidos para región celular que se reportan en la gráfica 7.
Graf 6: Fuerzas de adhesión entre P. betacei y tricomas de S. tuberosum. Los plots uno, dos
y tres se realizaron sobre zonas aleatorias del tricoma. Los plots llamados Mapa se hicieron
sobre regiones de 20 ∗ 20 μ𝑚 con el fin de identificar zonas de alta adhesión para caracterizarlas. Los plots llamados RAA, fueron tomados en regiones de alta adhesión sobre
el tricoma
41
Este set de datos al igual que el de tricomas nos provee de informac ión
importante, pues la mayor cantidad de datos tomados para la interacción entre P. infestans
y S. tuberosum puede venir de adhesiónes inespecíficas. Si bien reportar estos datos es
importante la parte crucial de este estudio se encuentra en comparar los diferentes datos
obtenidos para así poder llegar a conclusiones preliminares que permitan direccionar la
investigación hacia la forma de obtener resultados relevantes en el campo de la biofís ica.
Graf 7: Fuerzas de adhesión entre P. betacei y reigones celulares de S. tuberosum. El plot
llamado Mapa se hizo sobre una región de 20 ∗ 20 μ𝑚 con el fin de identificar zonas de alta adhesión para caracterizarlas. Se hizo un a toma en regiones de alta adhesión y otra en
una región e baja adhesión.
42
Estos datos permitieron notar que en general hay un comportamiento bimodal,
como se observa en la gráfica 8, en los datos obtenidos para la adhesión, por lo que, en
conjunto con los datos reportados en la Sección 6.2, logramos encontrar que los valores
que se encuentran por debajo de un umbral de 5nN corresponden a adhesiones no
específicas. Estas adhesiones, si bien pueden ser relevantes en el proceso de infección, se
pueden descartar para hacer comparaciones de la interacción entre diferentes sustratos
para caracterizar adhesión.
Adhesión en mapas de región celular
Graf 8: Histograma hecho por el autor. Muestra que los datos si comportan de forma
bimodal.
43
Capítulo 7
Comparación y discusión Reportar los datos obtenidos durante la experimentación es importante, sin embargo, la
parte más crucial de este estudio se encuentra en comparar los diferentes datos obtenidos
para así poder llegar a conclusiones preliminares que permitan direccionar la
investigación hacia la forma de obtener resultados relevantes en el campo de la biofís ica.
Para empezar, se hará una comparación entre los datos de P. betacei con hojas de S.
betaceum y los datos reportados en la sección 3.3, por lo que sólo se tomarán datos de
región celular. De esta comparación se espera que los datos de adhesión, más
específicamente los valore máximos estén en rangos parecidos, pues, aunque se sabe que
P. betacei es especialista de S. betaceum, P. infestans es un patógeno con un rango de
hospedero muy amplio y S. betaceum hace parte de este. Los datos de adhesión para estos
se encuentran en la gráfica 9, de modo que sea fácil hacer una comparación.
Si bien es cierto que, al igual que con el resto de los datos, la cantidad de repeticiones,
especialmente para las adhesiones entre P. infestans y S. betaceum no son suficientes
para llegar a una conclusión estadísticamente aceptable se puede observar que los
máximos de adhesión entre P. betacei y su hospedero son considerablemente
más grandes que las que produce la interacción entre este y P. infestans. Dicha
Graf 9: Gráfica que permite comparar entre las fuerzas adhesion encontradas en estudios
anteriores para P. infestans y S. betaceum y las encontradas en el desarrollo de esta
investigación para P. betaceum y S. betaceum.
44
afirmación, aunque va en contra de la hipótesis original para esta comparación, podría
confirmar que la adhesión temprana tiene una influencia en el rango de hospedero, por
lo que es importante seguir tomando datos de adhesión entre P. infestans y S. betaceum.
Del mismo modo, otra comparación que podría dar indicios de sí la adhesión temprana
tiene influencia en el rango de hospedero es la comparación entre los datos obtenidos
para la interacción de P. betacei con S. betaceum y los obtenidos para la interacción de
P. betacei con S. tuberosum. En este caso se espera que los datos de adhesión sean
sumamente distintos entre una interacción y la otra, pues P. betacei no infecta especies
distintas a S. betaceum, por lo que, en caso de que la adhesión temprana influya en el
rango de hospedero, no debería tener adhesiones altas con hojas de S. tuberosum. En
primer lugar, se mostrarán los datos obtenidos sobre tricomas tanto de S. betaceum,
como de S. tuberosum en la gráfica 10.
Si bien es cierto que los datos son muy similares en general, se puede observar que los
máximos de adhesión claramente se encuentran en la interacción entre P. betacei y S.
betaceum, sin embargo, es necesario, si se quiere dar una afirmación bien sustentada
seguir tomando datos que permitan confirmar que la adhesión temprana de P. betacei es
mayor con S. betaceum que con S. tuberosum. De estas interacciones hay aún más datos
Graf 10: Gráfica comparativa de las fuerzas de adhesión entre tricomas de S. betaceum y S.
tuberosum y esporangios de P. betacei.
45
que podrían dar información relevante, por lo que se pasará a analiza r los datos de
adhesión obtenidos para las interacciones en región celular.
En la gráfica 11 se puede observar que, de nuevo haciendo la distinción de que hace falta
tener un set datos más grande, que las fuerzas de adhesión que presenta P. betacei con S.
tuberosum son considerablemente menores, en términos de los máximos, que aquellas
medidas para la interacción de este Oomicete con hojas de S. betacei. Esto podría llevar
a concluir dos cosas, en primer lugar, que el rango de hospedero si esta mediado por la
adhesión temprana, pues los datos encontrados para la interacción con S. tuberosum son
pequeños y están por debajo de los valores de adhesión hallados para los experimentos
de control, es decir pueden ser adhesiones inespecíficas. Y, en segundo lugar, que,
comparándolos con los datos obtenidos para tricoma, se puede observar que la adhesión
puede ser sitio-especifica, es decir, que la interacción entre el esporangio y regiones
celulares permitirá la infección más que la interacción con tricomas, cosa que sería
sensata, pues los tricomas son una barrera física de defensa de las hojas. No obstante, para
hacer determinaciones claras de los datos aún hace falta obtener una mayor cantidad de
datos que las respalden, es decir, hace falta hacer más robusto el set de datos
experimentales.
Graf 11: Datos de adhesión para la interacción de P. betacei con S. betaceum (S.b) y S.
tuberosum (S.t).
46
Para resumir, se tomaron los datos de cada uno de los montajes experimentales, se
promediaron y posteriormente se graficaron uno al lado de otro para observar las
diferencias en la adhesión. Estos datos están reportados en la gráfica 11.
Aquí, se puede ver que el mayor promedio está en la interacción entre esporangios de P.
betacei y la región celular de S. betaceum. Este es un resultado esperado, dado que se
sabe que P. betacei es especialista de esta especie de plantas y por lo tanto se cree que su
adhesión será mayor que en otros sustratos. Esto también lo confirma el promedio de
adhesión que tiene P. betacei con tricomas de S. betaceum, que es mayor que los otros
promedios de adhesión con tricomas. Si bien es cierto que esta gráfica tiene datos
importantes, la cantidad de datos, como ya se dijo antes, es muy baja para dar
conclusiones definitivas por lo que es necesario continuar la experimentación.
Graf 12: Tabla comparativa de los promedios de adhesión.
47
Capítulo 8
Conclusiones y trabajo a futuro Caracterizar los procesos de adhesión temprana entre un Oomicete y sus diferentes
hospederos podría contribuir a entender cómo evitar infecciones de las plantas y cultivos
de Colombia y el mundo. Sin embargo, aún queda un largo camino por recorrer para
lograr entender y tener datos que permitan saltar a conclusiones acerca del
comportamiento y la influencia que este tipo de interacciones tienen sobre el rango de
hospedero de un patógeno particular. En este sentido, los resultados obtenidos en está
investigación presentan un punto de partida importante para dicha investigación a futuro,
pues dan indicios de cómo es el comportamiento de las fuerzas de adhesión entre
patógeno y hospedero y muestran que puede la influencia mencionada anteriormente
puede existir. Esto hace interesante el desarrollo a futuro de los experimentos y la
caracterización completa del proceso. Se logró observar que hay máximos pronunciados
para las fuerzas de adhesión entre patógenos especialistas y sus hospederos y que hay
diferencias en las adhesiones en distintas estructuras de la misma hoja. No obstante, es
importante aclarar que esta investigación no está terminada y que presenta grandes retos
a los investigadores, bien sea por la naturaleza variable de los datos y la dificultad que
esta trae al análisis, por la dificultad que se tiene para determinar si los datos de adhesión
inespecífica son relevantes para la investigación, o por los largos periodos de tiempo
empleados en la toma de datos. De este modo, aún hace falta hacer más experimentos
para hallar los valores de las fuerzas de adhesión haciendo uso de AFM, para así poder
hacer afirmaciones que estén respaldadas en los datos obtenidos y en criterios estadísticos
que confirmen su validez. Además, es importante, para complementar el estudio, hacer
barridos de flujo con una metodología nueva, esta consiste en poner una cantidad
conocida de esporangios sobre hojas de S. betaceum y S. tuberosum hacer un barrido de
48
flujo y contar los esporangios que quedan en el agua utilizada para el barrido. Esto podría
dar una idea de las diferencias en adhesión entre ambas especies.
49
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