espectrómetro de masas quattro micro api de waters · el espectrómetro de masas quattro micro api...

Espectrómetro de masasQuattro micro API

de WatersGuía de funcionamiento

34 Maple StreetMilford, MA 01757, EE.UU.

715020586ES, Revisión C

AVISO

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Micromass y Waters son marcas registradas, y MassLynx y Quattro micro son marcas comerciales de Waters Corporation.

PEEK es una marca comercial de Victrex Corporation.

Rheodyne es una marca registrada de Rheodyne, L.P.

Swagelok es una marca registrada de Swagelok, Inc.

Upchurch es una marca registrada de Scivex, Inc.

Windows® es una marca registrada de Microsoft Corporation.

Todas las demás marcas comerciales o marcas registradas son propiedad exclusiva de sus respectivos propietarios.

Información de seguridad

General

Micromass Quattro micro™ API ha sido diseñado para utilizarse únicamente como espectrómetro de masas. Si se intenta utilizar el instrumento para otro uso, se podría deteriorar y la garantía quedaría invalidada.

El Espectrómetro de masas Quattro micro API de Micromass se ajusta a los requisitos de la norma europea EN61010-1:2001, relativos a la seguridad de equipos eléctricos referentes a la medición, el control y el uso en el laboratorio. Parte 1: Requisitos generales.

El instrumento se ha diseñado y verificado de acuerdo con normas de seguridad reconocidas. Si no se siguen los procedimientos especificados por el fabricante al utilizar este instrumento, las medidas de protección que aquí se recomiendan podrían resultar insuficientes.

Cuando la protección de seguridad del instrumento se vea comprometida, se deberá desconectar el instrumento de todas las tomas de corriente y evitar su funcionamiento.

El instrumento deberá estar instalado de forma que el usuario pueda acceder fácilmente y aislar la fuente de alimentación.

Símbolos de seguridad

Las advertencias de esta guía o sobre el instrumento se deberán acatar durante todas las fases del mantenimiento, la reparación, la instalación y el funcionamiento del instrumento. En caso de no seguir estas precauciones, se estarían incumpliendo las normas de seguridad de diseño y uso del instrumento.

Waters Corporation no asume ninguna responsabilidad por el incumplimiento de estos requisitos por parte del usuario.

Se utilizarán los siguientes símbolos de seguridad en la presente guía o en el instrumento. Una Advertencia es una instrucción que avisa al usuario del riesgo de que se produzcan daños personales e incluso la muerte; una Señal de peligro es un aviso al usuario respecto al peligro de que el instrumento resulte dañado.

Advertencia: Este es un símbolo de advertencia general, que indica que existe un riesgo potencial para la salud o la seguridad. El usuario deberá consultar esta guía para conocer las instrucciones al respecto.

Advertencia: Este símbolo indica la posible presencia de voltajes peligrosos.

Advertencia: Este símbolo indica la posible existencia de superficies calientes.

Advertencia: Este símbolo indica que existe peligro de presencia de sustancias corrosivas.

Advertencia: Este símbolo indica que existe peligro de presencia de sustancias tóxicas.

Advertencia: Este símbolo indica que existe peligro de presencia de sustancias inflamables.

Advertencia: Este símbolo indica que existe el peligro de radiación por láser.

Precaución: Este símbolo de precaución general indica que se debe proceder con cuidado para evitar deteriorar el instrumento o interferir en su funcionamiento.

Información sobre el espectrómetro de masas Quattro micro API

Uso previsto

El Espectrómetro de masas Quattro micro API de Micromass se puede utilizar como una herramienta de investigación para conseguir una medición de masas exacta autenticada en modo MS y MS/MS. No se debe utilizar para procedimientos de diagnóstico.

Peligro biológico

Cuando se analizan fluidos fisiológicos, todas las muestras se deben tratar como potencialmente infecciosas y se deben tomar todas las precauciones necesarias. Las precauciones se especifican en CDC Guidelines on Specimen Handling, CDC – NIH Manual, 1984 (Pautas para el manejo de muestras del CDC, Manual CDC-NIH, 1984).

Calibrado

Deberán utilizarse siempre métodos de calibrado aceptables con estándares puros para calibrar métodos de calibrado. Para generar una curva estándar será necesario utilizar por lo menos cinco estándares. La gama de concentraciones deberá cubrir el rango completo de muestras de control de calidad, muestras habituales y muestras atípicas.

Control de calidad

Se recomienda analizar periódicamente tres muestras de control de calidad. Éstas deberán representar los niveles por debajo de lo normal, normal y por encima de lo normal de un compuesto. Los resultados del análisis de estas muestras de control de calidad deberán encontrarse dentro de un rango aceptable y se deberá evaluar la precisión a diario y después de cada análisis. Los datos recopilados cuando las muestras de control de calidad estén fuera del rango no se considerarán válidos. Tampoco se incluirán en el informe hasta que el rendimiento del sistema se considere aceptable.

Tabla de contenido

Capítulo 1 Descripción del instrumento .................................................................................. 1

1.1 Descripción general........................................................................................... 1

1.2 Entrada de la muestra ........................................................................................ 2

1.3 Sistema de vacío................................................................................................ 2

1.4 Sistema de tratamiento de datos ........................................................................ 3

1.5 Software MassLynx........................................................................................... 4

1.6 Teoría y principios de funcionamiento.............................................................. 4

1.6.1 Ionización por electrospray (ESI) ....................................................... 4

1.6.2 Ionización química a presión atmosférica (APcI) ............................... 5

1.6.3 Modos de funcionamiento de la espectrometría de masas (MS) ........ 5

1.6.4 Modos de funcionamiento MS/MS ..................................................... 6

1.7 Controles, indicadores y conexiones del panel frontal.................................... 12

1.7.1 Gas de cono, gas de desolvatación y gas de nebulización ................ 12

1.7.2 Conexiones eléctricas ....................................................................... 13

1.7.3 Válvula de disociación por colisión inducida (CID) ........................ 13

1.7.4 Válvula de desviación o de inyección ............................................... 14

1.7.5 Visualización del estado .................................................................... 15

1.8 Conexiones del panel posterior ....................................................................... 16

1.8.1 Analog Channels (Canales analógicos) ............................................ 17

1.8.2 Contact Closure (Conector de contacto) ........................................... 17

1.8.3 Mux Interface (Interfaz multiplexada) .............................................. 17

1.8.4 Events (Eventos) ............................................................................... 17

1.8.5 PC Link (Conexión al PC) ................................................................ 18

Tabla de contenido vii

Capítulo 2 Procedimientos rutinarios .................................................................................... 19

2.1 Puesta en marcha de Quattro micro API ......................................................... 19

2.2 Instalación de la sonda de ionización por electrospray (ESI) ......................... 22

2.3 Instalación de la bomba de jeringa.................................................................. 23

2.4 Instalación de Quattro micro API.................................................................... 24

2.4.1 Preparación para trabajar con electrospray ....................................... 24

2.4.2 Obtención de un haz de iones en el modo de ESI ............................. 30

2.4.3 Preparación para trabajar con APcI en el modo de ESI .................... 31

2.4.4 Obtención de un haz de iones y conversión al modo de APcI .......... 32

Capítulo 3 Ajuste ........................................................................................................................... 39

3.1 Descripción general......................................................................................... 39

3.2 Página Tune (Ajuste)....................................................................................... 39

3.3 Impresión de la información de ajuste ............................................................ 40

3.4 Registro experimental ..................................................................................... 41

3.5 Almacenamiento y recuperación de los valores de los parámetros de ajuste.. 41

3.6 Modificación de la pantalla Peak Display (Visualización de picos) ............... 43

3.7 Cambio del modo de visualización ................................................................. 46

3.7.1 Personalización del aspecto del gráfico ............................................ 46

3.7.2 Traza .................................................................................................. 48

3.7.3 Intensidad .......................................................................................... 48

3.7.4 Cuadrícula ......................................................................................... 48

3.8 AutoTune (Ajuste automático) ........................................................................ 49

3.9 Modo de ionización......................................................................................... 51

3.10 Parámetros del objetivo del análisis ................................................................ 52

3.11 Controles del gas ............................................................................................. 52

3.12 Controles de rampa.......................................................................................... 53

3.13 Recuperación del nivel cero ............................................................................ 54

viii Tabla de contenido

3.14 Control de lecturas .......................................................................................... 55

3.15 Modificación de la configuración de los parámetros de ajuste ....................... 56

3.16 Voltajes de la fuente ........................................................................................ 56

Capítulo 4 Adquisición de datos ............................................................................................... 59

4.1 Inicio de una adquisición de datos .................................................................. 59

4.1.1 Inicio de una adquisición desde la pantalla de ajuste ....................... 59

4.1.2 Varias muestras ................................................................................. 61

4.1.3 Cuantificación automática de la lista de muestras ............................ 64

4.2 Supervisión de una adquisición....................................................................... 65

4.2.1 Ventana de progreso de la adquisición (Informe del barrido) ........... 65

4.2.2 Actualización del cromatograma en tiempo real .............................. 66

4.2.3 Actualización del espectro en tiempo real ........................................ 66

4.3 Umbrales de datos del instrumento ................................................................. 68

4.3.1 MaxEnt .............................................................................................. 69

4.3.2 Datos del perfil .................................................................................. 69

4.3.3 Datos centroides ................................................................................ 69

4.3.4 Datos SIR .......................................................................................... 70

4.3.5 Umbral de recuento de iones ............................................................ 70

4.3.6 Datos de perfil: supresión de los aumentos bruscos de ruido (spikes) ................................................................................ 72

4.3.7 Datos analógicos ............................................................................... 73

4.4 Administrador del sistema............................................................................... 74

4.5 Parada de la adquisición.................................................................................. 74

Tabla de contenido ix

4.6 Editor de la lista de funciones ......................................................................... 74

4.6.1 Introducción ...................................................................................... 74

4.6.2 Barra de herramientas del editor de la lista de funciones ................. 77

4.6.3 Adición de una nueva función .......................................................... 78

4.6.4 Modificación de una función existente ............................................. 78

4.6.5 Copia de una función existente ......................................................... 78

4.6.6 Eliminación de una función .............................................................. 79

4.6.7 Cambio del orden de las funciones ................................................... 79

4.6.8 Configuración del desfase del eluyente ............................................ 79

4.6.9 Canales analógicos ............................................................................ 80

4.6.10 Memorización y recuperación de una lista de funciones .................. 81

4.6.11 Configuración de una función de rango de masas completo ............ 82

4.6.12 Configuración de una función SIR ................................................... 85

4.6.13 Configuración de las funciones de barrido MS/MS .......................... 88

4.6.14 Configuración de una función MRM ................................................ 91

4.6.15 Configuración de una función de estudio ......................................... 91

Capítulo 5 Calibrado de masas ................................................................................................. 99

5.1 Introducción .................................................................................................. 100

5.2 Descripción general....................................................................................... 100

5.2.1 Tipos de calibrado ........................................................................... 101

5.2.2 El proceso de calibrado ................................................................... 101

5.3 Electrospray................................................................................................... 102

5.3.1 Introducción .................................................................................... 102

5.3.2 Preparación para el calibrado .......................................................... 102

5.3.3 Opciones de calibrado ..................................................................... 105

5.3.4 Selección de parámetros ................................................................. 106

5.3.5 Realización de un calibrado ............................................................ 110

x Tabla de contenido

5.3.6 Comprobación del calibrado ........................................................... 116

5.3.7 Calibrado del electrospray con PEG ............................................... 124

5.4 Ionización química a presión atmosférica (APcI) ......................................... 126

5.4.1 Introducción .................................................................................... 126

5.4.2 Preparación para el calibrado .......................................................... 127

5.4.3 Opciones de calibrado ..................................................................... 128

5.4.4 Selección de los parámetros de calibrado ....................................... 128

5.4.5 Realización de un calibrado ............................................................ 129

5.4.6 Fallos en el calibrado ...................................................................... 139

5.4.7 Calibrado incorrecto ....................................................................... 141

5.4.8 Modificación manual de la correspondencia de picos .................... 142

5.4.9 Almacenamiento del calibrado ....................................................... 143

5.4.10 Verificación manual ........................................................................ 143

Capítulo 6 Mantenimiento ........................................................................................................ 147

6.1 Programa de mantenimiento.......................................................................... 147

6.2 Seguridad y manejo....................................................................................... 148

6.2.1 Procedimientos para un funcionamiento adecuado ........................ 148

6.2.2 Equipo de mantenimiento ............................................................... 148

6.3 Mantenimiento sistemático .......................................................................... 149

6.3.1 “Gas-ballast” de la bomba rotatoria ................................................ 149

6.3.2 Comprobación del aceite de la bomba rotatoria ............................. 150

6.3.3 Cambio de aceite de la bomba rotatoria .......................................... 151

6.3.4 Limpieza del conjunto de la fuente ................................................. 152

6.3.5 Limpieza y sustitución del electrodo de descarga en corona .......... 164

6.3.6 Limpieza del extremo de la sonda APcI ......................................... 167

Tabla de contenido xi

6.4 Sustitución de piezas ..................................................................................... 167

6.4.1 Sustitución del calefactor del cartucho del bloque de ionización ... 167

6.4.2 Sustitución del capilar de acero inoxidable de la sonda de ESI ...... 169

6.4.3 Sustitución del extremo de la sonda de ESI .................................... 171

6.4.4 Sustitución del calefactor de la sonda de APcI ............................... 172

6.4.5 Sustitución del capilar de sílice fundida de APcI y del filtro ......... 173

Capítulo 7 Diagnóstico y corrección de anomalías .......................................................... 175

7.1 Recambios ..................................................................................................... 175

7.2 Seguridad y manejo....................................................................................... 175

7.3 Diagnóstico y corrección de anomalías del sistema...................................... 176

7.4 Detección y corrección de anomalías del hardware ...................................... 177

7.4.1 No aparecen picos en la pantalla de ajuste (no hay haz de iones) .. 178

7.4.2 Picos inestables o de baja intensidad (haz de iones) ....................... 180

7.4.3 Presión de trabajo del sistema de cromatografía líquida (LC) anormalmente elevada ...............................................182

7.4.4 Presión de trabajo del sistema de cromatografía líquida (LC) anormalmente baja .....................................................182

7.4.5 Vacío insuficiente ............................................................................ 183

7.4.6 Fuga de nitrógeno ........................................................................... 183

7.4.7 Aceite de vacío depositado en el tubo de evacuación ..................... 184

7.4.8 Funcionamiento incorrecto del calefactor de fuente y de desolvatación ...........................................................................184

7.4.9 Funcionamiento incorrecto del calefactor de APcI ......................... 184

7.4.10 Error del fusible de la bomba rotatoria ........................................... 185

7.4.11 Fallo en el modo de ionización ....................................................... 185

7.4.12 Error al reconocer un tipo de sonda en concreto ............................ 186

7.4.13 Fluctuaciones .................................................................................. 186

7.4.14 Pérdida de comunicación con el instrumento ................................. 187

7.4.15 Errores en la comunicación IEEE ................................................... 187

xii Tabla de contenido

7.5 Niveles de ruido elevados en análisis MRM................................................. 188

7.5.1 Ruido químico ................................................................................. 188

7.6 Ruido electrónico .......................................................................................... 189

7.7 Teléfono de contacto de Waters..................................................................... 189

Capítulo 8 Información de referencia .................................................................................. 191

8.1 Descripción general....................................................................................... 191

8.2 Modificación de un archivo de referencia..................................................... 191

8.3 Ionización positiva ........................................................................................ 192

8.3.1 Mioglobina de corazón de caballo .................................................. 193

8.3.2 Polietilenglicol ................................................................................ 193

8.3.3 Mezcla de yoduro de sodio y yoduro de cesio ................................ 194

8.3.4 Yoduro de sodio y yoduro de rubidio .............................................. 194

8.4 Ionización negativa ....................................................................................... 195

8.4.1 Solución de yoduro de sodio para la ionización por electrospray negativa ................................................................195

Apéndice A Características del entorno ................................................................................ 197

A.1 Acceso .......................................................................................................... 197

A.2 Ubicación ..................................................................................................... 197

A.2.1 Quattro micro API .......................................................................... 197

A.2.2 Bomba rotatoria de vacío ................................................................ 198

A.2.3 Sistema de tratamiento de datos ...................................................... 198

A.2.4 Sistema de cromatografía líquida (LC) ........................................... 198

Tabla de contenido xiii

A.3 Dimensiones y espacios libres ...................................................................... 199

A.3.1 Altura .............................................................................................. 201

A.3.2 Longitud .......................................................................................... 201

A.3.3 Anchura ........................................................................................... 201

A.4 Peso .............................................................................................................. 201

A.4.1 Elevación y transporte .................................................................... 201

A.5 Temperatura de trabajo ................................................................................. 202

A.6 Humedad ...................................................................................................... 202

A.7 Temperatura de transporte y almacenamiento .............................................. 202

Apéndice B Especificaciones eléctricas .................................................................................. 203

B.1 Instalación .................................................................................................... 203

B.1.1 Frecuencia de la línea ..................................................................... 205

B.1.2 Fusibles ........................................................................................... 205

B.2 Seguridad eléctrica ....................................................................................... 205

Apéndice C Especificaciones de funcionamiento ................................................................ 207

C.1 Ionización positiva por electrospray ............................................................ 207

C.2 Ionización negativa por electrospray ............................................................ 207

C.3 Ionización APcI positiva .............................................................................. 207

Apéndice D Mantenimiento y suministros ............................................................................ 209

D.1 Salida de gases ............................................................................................. 209

D.1.1 Bomba rotatoria .............................................................................. 209

D.1.2 Nitrógeno ........................................................................................ 209

D.2 Drenaje del disolvente .................................................................................. 210

D.3 Gases y reguladores ...................................................................................... 210

D.3.1 Experimentos de CID ...................................................................... 211

xiv Tabla de contenido

D.4 Sistemas de suministro de eluyente .............................................................. 211

D.4.1 Electrospray .................................................................................... 211

D.4.2 Ionización química a presión atmosférica ...................................... 211

D.5 Bucles de la muestra e inyectores ................................................................ 211

D.6 Reactivos ...................................................................................................... 212

D.7 Aceite de bomba de vacío ............................................................................ 212

D.8 Muestras de prueba ....................................................................................... 212

D.9 Equipo de mantenimiento ............................................................................. 213

D.10 Resumen de elementos que debe proporcionar el usuario ........................... 213

D.10.1 Salida de gases de la bomba rotatoria ............................................. 213

D.10.2 Salida de gases de (N2) de API ...................................................... 214

D.10.3 Suministro de (N2) de API ............................................................. 214

D.10.4 Conexión de gas de CID ................................................................. 214

D.10.5 Sistema de desviación/inyección .................................................... 214

D.10.6 Fuente de alimentación de Quattro micro API ............................... 215

D.10.7 Alimentación del sistema de tratamiento de datos .......................... 215

Tabla de contenido xv

xvi Tabla de contenido

Capítulo 1Descripción del instrumento

1.1 Descripción general

Figura 1-1 Quattro micro API de Micromass

El detector Quattro micro API (Figura 1-1) es un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo de alta resolución diseñado para trabajar en LC/MS/MS.

Descripción general 1

El instrumento se puede combinar con los siguientes sistemas de introducción de líquidos:

• Sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), para proporcionar información sobre el peso molecular a partir de un análisis LC o para realizar cuantificaciones y análisis selectivos.

• Bomba de jeringa, para analizar compuestos valiosos en baja concentración.

La ionización de la muestra se produce en la fuente a presión atmosférica. Estos iones se muestrean a través de una serie de orificios del primer cuadrupolo, donde se filtran según su relación masa/carga (m/z). Los iones separados en función de su masa pasan a la cámara de colisión del hexapolo, donde se produce una disociación por colisión inducida (CID) o pasan directamente al segundo cuadrupolo. A continuación, las masas de los iones producto se analizan en el segundo cuadrupolo.

Finalmente, un sistema de detección con fotomultiplicador, dinodo de conversión y fósforo detecta los iones transmitidos. La señal de salida se amplifica, digitaliza y transmite al sistema de tratamiento de datos.

1.2 Entrada de la muestra

Un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o una bomba de infusión suministran la muestra hasta una sonda de ionización por electrospray (ESI) o sonda de ionización química a presión atmosférica (APcI).

Se puede cambiar el modo de ionización cambiando las sondas. El sistema reconoce el método de ionización por medio de las clavijas de identificación de las sondas.

1.3 Sistema de vacío

Para generar el vacío se utiliza una bomba rotatoria externa y una bomba turbomolecular con división de flujo. La bomba turbomolecular evacua el analizador y la zona de transferencia de iones.

El sistema supervisa la velocidad de la bomba turbomolecular y mide constantemente el vacío mediante un medidor de Pirani integrado. En caso de fugas, fallo eléctrico o fallo de la bomba de vacío, se producirá una pérdida de vacío. El medidor de Pirani también actúa como interruptor, ya que detiene el funcionamiento del instrumento si detecta una pérdida de vacío.

2 Descripción del instrumento

La válvula de aislamiento de fácil acceso permite realizar el mantenimiento rutinario de la fuente sin que se rompa el vacío.

1.4 Sistema de tratamiento de datos

El sistema de tratamiento de datos adquiere la información procedente del analizador de masas y se compone de:

• Un PC integrado.

• Una estación de trabajo externa.

• El software MassLynx™.

El sistema de tratamiento de datos de la estación de trabajo, que incorpora el software MassLynx, controla el espectrómetro de masas y, según el caso, el sistema HPLC, el inyector automático, la válvula de desviación o la válvula del inyector. La estación de trabajo utiliza el entorno gráfico Windows® con gráficos en color y proporciona una interacción completa por parte del usuario, bien con el ratón o con el teclado. MassLynx permite controlar totalmente el sistema: instalación, configuración y funcionamiento de los diversos sistemas HPLC, y ajuste, adquisición y procesamiento de datos. El control del instrumento con MassLynx procesa todos los datos en el PC integrado del instrumento. La estación de trabajo y el PC integrado se comunican mediante una conexión de red.

El sistema de tratamiento de datos es capaz de procesar muestras analógicas y, por lo tanto, de almacenar de forma simultánea los datos obtenidos a partir de detectores de cromatografía líquida (LC) convencionales, como los de absorbancia (UV) o los de dispersión de light scattering (ELSD), y los datos obtenidos en la espectrometría de masas. También es capaz de obtener datos procedentes de un detector de fotodiodos en el rango UV para algunos sistemas como, por ejemplo, el PDA 996 de Waters. En MassLynx User’s Guide (Guía del usuario de MassLynx) se incluye información exhaustiva sobre el funcionamiento de MassLynx.

Sistema de tratamiento de datos 3

1.5 Software MassLynx

El software MassLynx es una aplicación para Windows® que permite realizar las siguientes operaciones:

• Configurar Quattro micro API.

• Crear métodos de introducción de muestras y de espectrometría de masas (MS) que definan los parámetros operativos del análisis.

• Ajustar y calibrar Quattro micro API.

• Analizar muestras.

• Monitorizar el análisis.

• Adquirir datos.

Para obtener más información sobre la instalación y el funcionamiento de MassLynx, se recomienda consultar la MassLynx User’s Guide (Guía del usuario de MassLynx) y Help (Ayuda).

1.6 Teoría y principios de funcionamiento

1.6.1 Ionización por electrospray (ESI)

En la ESI, se aplica una fuerte carga eléctrica al fluido conforme emerge de un nebulizador, con lo que se produce un aerosol de gotas microscópicas con carga eléctrica. La evaporación del eluyente reduce el tamaño de las gotas hasta que se obtiene una densidad de carga suficiente para que se liberen iones de muestra de la superficie de las gotas (evaporación de iones). Los iones se caracterizan por tener una o varias cargas eléctricas y el analizador de masas los clasifica según su relación masa/carga (m/z). Los compuestos con un peso molecular elevado se miden normalmente como iones con cargas múltiples. Se pueden admitir caudales de eluyente de hasta 1 mL/min, aunque para la ionización por electrospray se recomienda dividir el caudal de modo que entren de 100 a 200 µL/min de eluyente en la fuente del espectrómetro de masas.


1.6.2 Ionización química a presión atmosférica (APcI)

La APcI produce por lo general precursores protonados o desprotonados a partir de la muestra por medio de un mecanismo de transferencia de protones (iones positivos) o de eliminación de protones (iones negativos). La muestra se evapora en un nebulizador calentado antes de pasar a un plasma constituido por iones del disolvente formados dentro de la fuente a presión atmosférica gracias a una descarga en corona. Es entonces cuando tiene lugar la transferencia de protones entre los iones del disolvente y la muestra. Se admiten caudales de eluyente de hasta 2 mL/min sin necesidad de división de flujo.

1.6.3 Modos de funcionamiento de la espectrometría de masas (MS)

Figura 1-2 Recorrido de los iones

El modo MS1, en el que MS1 actúa como filtro de masas, es el método más habitual y dotado de mayor sensibilidad para la realización de análisis MS y equivale a utilizar un espectrómetro de masas con un único cuadrupolo.

El modo de funcionamiento MS2 se utiliza, con el gas de colisión presente, al pasar rápidamente del modo de funcionamiento MS al MS/MS y viceversa. Este modo también proporciona una herramienta muy útil en el ajuste y calibrado del instrumento previos al análisis MS/MS y para el diagnóstico de anomalías.

Tabla 1-1 Modos de funcionamiento de la espectrometría de masas (MS)

Modo de funcionamiento

MS1 Cámara de colisión MS2

MS1 En resolución Sólo radiofrecuencia (RF) (paso de todas las masas)

MS2 Sólo radiofrecuencia (RF) (paso de todas las masas)

En resolución

Teoría y principios de funcionamiento 5

1.6.4 Modos de funcionamiento MS/MS

1.6.4.1 General

En la Tabla 1-2 se resumen las cuatro funciones de barrido MS/MS más habituales.

1.6.4.2 Espectro de ión hijo (Daughter Ion Spectrum)

Figura 1-3 Modo de espectro de iones hijo

Éste es el modo de barrido MS/MS más utilizado.

Tabla 1-2 Modos de funcionamiento MS/MS

Modo de funcionamiento

MS1Cámara de

colisiónMS2

Espectro de iones hijo

Estático(selección de la masa

del precursor)

Sólo radiofrecuencia (RF) (paso de

todas las masas)

Barrido

Espectro del ión precursor

BarridoEstático

(selección de la masa de los iones producto)

Monitorización de múltiples reacciones

(MRM)

Estático(selección de la masa

del ión precursor)

Estático(selección de la masa de los

iones producto)

Espectro de pérdida constante de

fragmentos neutros

Barrido(sincronizado con MS2)

Barrido(sincronizado con MS1)


Las aplicaciones habituales son:

• Caracterización de estructuras (por ejemplo, secuencias peptídicas).

• Desarrollo de métodos para estudios MRM (Monitorización de múltiples reacciones):

– Identificación de iones hijo para su utilización en transiciones MRM.

– Optimización de las condiciones para el ajuste de la CID para maximizar la producción de un ión hijo específico que se utilizará en un análisis MRM.

Ejemplo:

Iones hijo de un ión precursor específico en relación masa/carga de 609 de reserpina en modo de ionización por electrospray positivo. Consultar la Figura 1-4.

Figura 1-4 Iones hijo de un ión precursor específico en relación masa/carga de 609 de reserpina en modo de ionización por electrospray positivo


1.6.4.3 Espectro de ión precursor (Parent Ion Spectrum)

Figura 1-5 Modo de espectro de ión precursor

Aplicación habitual:

• Caracterización de estructuras.

– Información complementaria o de confirmación (para datos de barrido de iones producto).

Ejemplo:

Iones precursores del ión producto específico en relación masa/carga de 195 de reserpina en modo de ionización por electrospray positivo. Consultar la Figura 1-6.


Figura 1-6 Iones precursores del ión producto específico en relación masa/carga de 195 de reserpina en modo de ionización por electrospray positivo

1.6.4.4 MRM: Monitorización de múltiples reacciones (MRM)

Figura 1-7 Modo de monitorización de múltiples reacciones (MRM)


Este modo es el equivalente MS/MS de la monitorización de iones seleccionados (SIR). Dado que tanto MS1 como MS2 son estáticos, se permite un mayor tiempo de residencia de iones de interés y, por lo tanto, una mayor sensibilidad en comparación con el barrido MS/MS.


• Examen rápido de muestras sucias para analitos conocidos:

– Estudios farmacocinéticos y de metabolitos en fármacos.

– Análisis medioambientales, por ejemplo, de pesticidas y herbicidas.

– Aplicaciones forenses o toxicológicas. Por ejemplo, investigación del dopaje en el deporte.

Ejemplo:

Monitorización de la transición (reacción de fragmentación específica) de la reserpina con una relación masa/carga de 609 a 195 en modo de LC/MS/MS con ionización por electrospray positivo.

El modo de monitorización de múltiples reacciones (MRM) no genera un espectro, ya que sólo se registra una transición. Se obtiene un cromatograma, al igual que en SIR.

Figura 1-8 Transición con una relación masa/carga de 609 a 195 de la reserpina en modo LC/MS/MS con ionización por electrospray positivo


1.6.4.5 Espectro de pérdida constante de fragmentos neutros

Figura 1-9 Modo de pérdida constante de fragmentos neutros

La pérdida de un determinado fragmento o grupo funcional neutro de un precursor o precursores sin especificar.


• Estudio de mezclas en busca de una clase específica de compuesto caracterizada por un patrón de fragmentación común.

Los barridos de MS1 y MS2 están sincronizados. Cuando MS1 transmite un ión precursor específico, MS2 indaga si ese ión precursor pierde un fragmento de cierta masa. En caso afirmativo, lo registra en el detector.

Resultado:

El espectro muestra las masas de todos los precursores que realmente han perdido un fragmento de cierta masa.


1.7 Controles, indicadores y conexiones del panel frontal

Figura 1-10 Panel frontal

1.7.1 Gas de cono, gas de desolvatación y gas de nebulización

Los conductos de teflón (PTFE) para el gas de desolvatación y el gas de nebulización están conectados a la parte frontal del instrumento mediante conexiones Legris que se encajan en las respectivas entradas. La conexión para el gas de cono se encuentra dentro de la fuente y utiliza conductos de teflón (PTFE).

1.7.1.1 Controles del caudal de masas

El gas de cono y el gas de desolvatación están regulados electrónicamente de 0 a 500 L/h y de 0 a 1.200 L/h respectivamente, y los controla MassLynx desde la página de ajuste del instrumento.


En caso de que el gas de desolvatación disminuya a menos del 4 % de su límite superior, el instrumento genera una señal para que los mecanismos eviten la acumulación de disolvente en la carcasa de la fuente. Los disolventes se drenan desde un conducto situado a la derecha de la parte frontal del instrumento.

Para aplicaciones de nanoflujo en las que se necesita un caudal de gas muy bajo, esta señal puede anularse mediante Select Gas (Seleccionar gas) y Fail Gas Override (Cancelar fallo de gas) en la página de ajuste.

1.7.2 Conexiones eléctricas

La conexión eléctrica de una sonda de APcI o del calefactor de ESI se realiza a través del multiconector ESI / APcI. Éste se extrae del panel frontal tirando del manguito metálico del enchufe. Los calefactores de ionización por electrospray y de ionización química a presión atmosférica utilizan este conector.

La conexión de alto voltaje de la sonda ESI se realiza mediante la conexión ESI del panel frontal.

La conexión de alto voltaje del electrodo de descarga en corona se realiza en el interior de la fuente.

1.7.3 Válvula de disociación por colisión inducida (CID)

La válvula de gas CID es una válvula de 15 vueltas. El caudal del gas de colisión aumenta al girar la válvula en sentido contrario a las agujas del reloj.

Advertencia: Se debe comprobar que el instrumento esté en el modo Standby (En espera) cuando se ajuste el electrodo de descarga en corona.

Precaución: Para evitar daños en la válvula de gas CID, se recomienda tomar precauciones para no apretarla en exceso durante el corte del suministro.

Controles, indicadores y conexiones del panel frontal 13

1.7.4 Válvula de desviación o de inyección

Figura 1-11 Válvula de desviación o de inyección

La válvula de desviación o de inyección (Figura 1-11) es un inyector Rheodyne® controlado eléctricamente que se puede utilizar de varios modos en función de la disposición de las líneas fluídicas:

• Como válvula de inyección, con el puerto de la aguja y el bucle del inyector colocados.

• Como válvula de desviación, para cambiar el caudal de disolvente durante un análisis LC.

• Como válvula de conmutación; por ejemplo, para pasar del sistema LC a la bomba de jeringa con el patrón y viceversa.

La válvula se controla principalmente desde el sistema de tratamiento de datos. Los dos conmutadores con las etiquetas Load (Cargar) e Inject (Inyectar) permiten que el usuario controle manualmente la válvula durante las inyecciones en el bucle desde el instrumento.


Para obtener más información sobre la utilización de la válvula como una válvula de desviación, consulte la Sección 4.6.8, Configuración del desfase del eluyente.

1.7.5 Visualización del estado

Figura 1-12 Visualización del estado

El estado del instrumento se indica de las siguientes formas:

Indicador LED de vacío (Vacuum)

Estado Indicador LED de vacío (Vacuum)

Creando vacío Verde intermitente

Vacío creado, por debajo del límite Verde fijo

Vacío creado, por encima del límite Ámbar no parpadeante

Fallo de la bomba Rojo parpadeante

Controles, indicadores y conexiones del panel frontal 15

Indicador LED de funcionamiento (Operate)

1.8 Conexiones del panel posterior

Figura 1-13 Conexiones del panel posterior

EstadoIndicador LED de funcionamiento (Operate)

En espera Apagado

En funcionamiento, por encima del límite Ámbar no parpadeante

En funcionamiento, por debajo del límite Verde no parpadeante

Error de radiofrecuencia (RF) Rojo parpadeante


1.8.1 Analog Channels (Canales analógicos)

Existen cuatro entradas de canales analógicos disponibles para la adquisición simultánea de otros datos, como la salida de un detector de absorbancia (UV).

El voltaje diferencial de entrada no debe ser superior a un voltio. Los datos analógicos se procesan mediante una conversión de señal analógica a digital de 12 bits con una ganancia de hasta 2×1020 unidades.

Si el cable de entrada es de sólo dos hilos, es posible que haya que conectar a tierra el polo negativo de cada canal.

1.8.2 Contact Closure (Conector de contacto)

Existen dos tipos de cierre de contacto:

• In (Entrada): se proporcionan dos entradas, Event 1 (Evento 1) y Event 2 (Evento 2), lo que permite que los dispositivos externos inicien la adquisición. La señal de Event In (Entrada evento) puede ser de lógica transistor-transistor (TTL) o de conector de contacto, con un voltaje máximo de 5 V.

• Out (Salida): se proporcionan dos salidas, Event 1 (Evento 1) e Event 2 (Evento 2), lo que permite que el espectrómetro de masas active un evento externo.

1.8.3 Mux Interface (Interfaz multiplexada)

Este conector de tipo D de 9 vías permite la interacción con la unidad de control multiplexada (MUX).

1.8.4 Events (Eventos)

1.8.4.1 CE Int (Bloqueo de electroforesis capilar)

Este conector permite la interacción con una fuente de alimentación de un sistema de electroforesis capilar para que el instrumento esté protegido frente a voltajes elevados.

1.8.4.2 GF (Fallo de gas)

En caso de que el gas de desolvatación disminuya a menos del 4 % de su rango completo, el instrumento generará una señal para que los mecanismos eviten la acumulación de disolvente en la carcasa de la fuente. Los disolventes se drenan desde un conducto situado a la derecha de la parte frontal del instrumento.

Conexiones del panel posterior 17

Asimismo, se puede utilizar esta señal para detener el caudal de eluyente hacia la fuente conectándola a Stop Flow (Detener caudal) en el sistema HPLC.

Para aplicaciones en las que se necesita un caudal de gas muy bajo, esta señal se puede anular mediante Select Gas (Seleccionar gas) y Fail Gas Override (Cancelar fallo de gas) en la página de ajuste.

1.8.4.3 FC (Control de FractionLynx)

Se proporciona una señal analógica de 100 mV que permite activar un colector de fracciones externo. Para ello, es necesario adquirir el software FractionLynx opcional.

1.8.5 PC Link (Conexión al PC)

Este conector RJ45 conecta el instrumento al sistema de tratamiento de datos mediante el cable de red suministrado.


Capítulo 2Procedimientos rutinarios

2.1 Puesta en marcha de Quattro micro API

Para iniciar Quattro micro API se deben seguir los pasos que se explican a continuación:

1. Activar el conmutador ubicado bajo el lateral izquierdo del panel frontal. Consultar la Figura 2-1.

Figura 2-1 Interruptor On/Off (Encendido/apagado)

2. Esperar unos tres minutos a que el PC integrado arranque. Cuando el PC esté preparado, se emitirá una alerta sonora.

3. Iniciar el software MassLynx. Se abrirá la pantalla predeterminada y la palabra Ready (Preparado) aparecerá en la barra de estado de la parte inferior de la página. Consultar la Figura 2-2.

Puesta en marcha de Quattro micro API 19

Figura 2-2 Página predeterminada de MassLynx

4. Hacer clic en (en la página predeterminada) para activar la página de ajuste. Consultar la Figura 2-3.

5. Seleccionar Pump (Bomba) en el menú Options (Opciones) de la página de ajuste.

6. Hacer clic en la ficha Diagnostics (Diagnósticos).

7. Monitor Turbo Speed (Monitorización de velocidad turbo). Este parámetro debería alcanzar entre el 98 y el 100 % transcurridos aproximadamente 5 minutos de la selección de la bomba.

8. Comprobar que el instrumento ha bombeado lo suficiente como para que el LED de vacío (Vacuum) del panel frontal esté en color verde fijo (consultar la Sección 1.7.5, Visualización del estado). El espectrómetro de masas habrá creado suficiente vacío y podrá funcionar dentro de 20 minutos.

20 Procedimientos rutinarios

Figura 2-3 Pantalla Tune (Ajuste)

Puesta en marcha de Quattro micro API 21

2.2 Instalación de la sonda de ionización por electrospray (ESI)

Figura 2-4 Sonda de ESI

Para instalar la sonda de ESI (Figura 2-4):

1. Comprobar que el mando de la válvula de aislamiento esté completamente girado a la izquierda, lo que indica que la válvula está abierta.

2. Insertar el cable eléctrico de la placa de ajuste de la sonda en el puerto inferior (y más grande) de los dos que hay en el panel frontal.

3. Conectar el tubo de teflón (PTFE) de la placa de ajuste de la sonda al puerto del gas de desolvatación que hay en el panel frontal.

4. Retirar la protección, en su caso, del extremo de la sonda de ionización por electrospray.


5. Deslizar la sonda de ionización por electrospray en el orificio de la placa de ajuste de la sonda hasta que el cuerpo de la sonda descanse sobre ésta. Comprobar que las clavijas de identificación de la sonda estén en contacto con los tornillos correspondientes en la placa.

6. Asegurar la sonda con los dos tornillos.

7. Conectar el tubo de teflón (PTFE) de 4 mm a la sonda y al puerto con la etiqueta Neb.

8. Conectar el cable eléctrico a la sonda y al conector del capilar del panel frontal.

2.3 Instalación de la bomba de jeringa

Figura 2-5 Bomba de jeringa

Para instalar la bomba de jeringa:

1. Fijar el cable de toma de tierra, situado en la esquina inferior derecha del panel frontal, a la aguja de inyección mediante el clip de conexión.

2. Montar la jeringa en la bomba y fijar el tope de forma apropiada.

3. Enroscar el puerto de la aguja Rheodyne 9013 en la conexión PEEK™ y ajustar bien para que no gotee.

Precaución: Micromass ha incorporado a la bomba un tope para evitar que se rompan ciertos tipos de jeringas. De cualquier modo, se recomienda la colocación del ajuste del tope como medida de protección adicional frente a posibles roturas. Esto evita que el émbolo recorra toda la distancia del cilindro de la jeringa, con lo que se reducen las posibilidades de rotura.

Instalación de la bomba de jeringa 23

4. Llevar el capilar (kit de instalación de la sonda de ESI) de la parte superior de la cubierta a la zona de la jeringa. Conectar el capilar a la conexión PEEK mediante una tuerca Upchurch® Scientific, una férula y el tubo de teflón (PTFE).

5. Hacer un corte limpio y perpendicular en ambos extremos del capilar antes de instalarlo mediante una cuchilla de cerámica para sílice. Comprobar que los cortes sean perpendiculares mediante una lupa. Al cortar el capilar, se deberá dejar una longitud suficiente para formar bucles donde haya ángulos o esquinas. No retorcer nunca el capilar ni tensarlo.

6. Conectar el otro extremo del capilar a la entrada de la sonda de ESI con una tuerca Upchurch Scientific, una férula y el tubo de teflón (PTFE).

7. Hacer clic en (en la página predeterminada) para acceder a la página de ajuste.

8. Escoger el tipo de jeringa adecuado en el editor de selección, seleccionando en la página de ajuste Options (Opciones) y Syringe Type (Tipo de jeringa).

2.4 Instalación de Quattro micro API

2.4.1 Preparación para trabajar con electrospray

1. Conectar un extremo del capilar de sílice fundida a la jeringa y el otro extremo a la sonda de ESI.

2. Llenar la jeringa con la solución de referencia y colocarla en la bomba de jeringa.

3. Hacer clic en en la página predeterminada (Figura 2-6) para activar la página de ajuste. La página de ajuste de ejemplo, que aparece en la Figura 2-7, utiliza iones de una solución de PPG1000, reserpina y ß cyclodextrina.

Advertencia: Fijar el cable de toma de tierra, que está situado en la esquina inferior derecha del panel frontal, a la aguja de inyección mediante el clip de conexión.

Advertencia: Se recomienda comprobar que la aguja esté conectada a tierra mediante el cable suministrado a tal efecto.


Figura 2-6 Página predeterminada

4. Abrir el menú Options (Opciones) de la barra de menús y hacer clic en Pump (Bomba). La bomba rotatoria comenzará a evacuar el detector. Pasados unos 20 minutos, el instrumento dispondrá de un vacío suficiente para funcionar y el indicador de vacío (Vacuum) del panel frontal se volverá verde.

5. Para visualizar los valores reales de los parámetros del instrumento, seleccionar Readbacks (Lecturas) en el menú Options (Opciones) y, a continuación, Always On (Siempre activado).

6. Introducir los valores iniciales para la solución de referencia recomendados en la Tabla 2-1 en los campos correspondientes de la página de ajuste. Estos valores son orientativos. Los valores óptimos pueden variar en función del instrumento.

Instalación de Quattro micro API 25

Figura 2-7 Página de ajuste de ES+

Tabla 2-1 Valores iniciales para la solución de referencia en la página de ajuste

Mass (Masa) Span (Intervalo) Gain (Ganancia)

175.1 5 8

609.2 5 20

1080.8 5 40

2034.6 5 50


7. Introducir los parámetros recomendados en la tabla Tabla 2-2 en los campos correspondientes de la página ES+ Source (Fuente ES+).

8. Hacer clic en la ficha Analyser (Analizador). Consultar la Figura 2-8.

9. Introducir los valores de parámetros que aparecen en la Tabla 2-3, en función de si se trata de un ajuste para MS1 o MS2.

Precaución: Si el gas de desolvatación no circula mientras que se realiza la ESI, la fuente puede sufrir daños debido al calor.

Tabla 2-2 Valores para los parámetros de la página ES+ Source (Fuente ES+)

Parámetro Valor recomendado

Capillary (kV) (Capilar) 3.0

Cone (V) (Cono) 60

Extractor (V) 3

RF Lens (V) (Lente RF) 0.2

Source Temp (°C) (Temperatura de la fuente) 120

Desolvation Gas (L/h) (Gas de desolvatación) 150

Cone Gas (L/h) (Gas de cono) 0


Tabla 2-3 Valores de los parámetros del analizador

ParámetroValor recomendado

MS1Valor recomendado

MS2

LM Resolution 1 (Resolución para masas bajas 1)

15

HM Resolution 1 (Resolución para masas elevadas 1)

15

Ion Energy 1 (Energía de iones 1) 0.5

Entrance (Entrada) 50 2

Collision (Colisión) 0 0

Exit (Salida) 50 2

LM Resolution 2 (Resolución para masas bajas 2)

15 15

HM Resolution 2 (Resolución para masas elevadas 2)

15 15

Ion Energy 2 (Energía de iones 2) 3 0.5

Multiplier (Multiplicador) 650 650


Figura 2-8 Página Analyser (Analizador)

10. Se puede obtener una resolución apropiada si se ajustan la resolución para masas bajas y la resolución para masas elevadas.

11. Hacer clic en el icono para abrir el caudal de nitrógeno.


2.4.2 Obtención de un haz de iones en el modo de ESI

1. Comprobar que la sonda de ESI esté instalada como se describe en la Sección 2.2, Instalación de la sonda de ionización por electrospray (ESI).

2. Pasar el modo de ionización a ESI, en caso de ser necesario (la ficha de la página de ajuste actual indica el modo de ionización):

Seleccionar Ion Mode > Electrospray+ (Modo de ionización > Electrospray+) en el menú de la página de ajuste.

3. Mantener la ficha ES+ Source (Fuente ES+) abierta para seguir los pasos restantes de la sección.

4. Fijar Source Temp (Temperatura de la fuente) en 120 °C.

5. Permitir que la temperatura de la fuente alcance los 120 °C.


7. Seleccionar, en el menú Options (Opciones), el tipo de jeringa que se desea utilizar. Por ejemplo, seleccionar la jeringa hermética a gases Hamilton de 250 µL del kit de inicio.

8. Hacer clic en Press For Operate (Pulsar para trabajar) para generar los voltajes altos del instrumento.

9. Establecer la velocidad de flujo de la jeringa en 10 µL/min y hacer clic en en la barra de menús de la página de ajuste.

10. En la página de ajuste, establecer Desolvation Gas (Gas de desolvatación) en 150 L/h.

11. Comprobar que no haya fugas en las conexiones de la sonda o de la jeringa.

12. Monitorizar los picos de masas. Los picos deberán aparecer aproximadamente en los valores de masas introducidos en la ficha ES+ Source (Fuente ES+).

13. Aumentar los valores de los campos Gain (Ganancia) hasta que se vean con nitidez los picos de las masas.

Precaución: Para poder calibrar correctamente el instrumento, debe obtenerse una señal óptima.


14. Si la señal es relativamente débil y con ruido, se debe mejorar ajustando la orientación de la sonda respecto al orificio del cono de muestra con el botón de ajuste de la sonda. También se puede mejorar la señal regulando el caudal de gas de desolvatación en la ficha ES+ Source (Fuente ES+) de la página de ajuste.

Una vez completados estos pasos, la fuente está preparada para la utilización del electrospray. Se aconseja consultar el Capítulo 3, Ajuste para obtener más información.

2.4.3 Preparación para trabajar con APcI en el modo de ESI

Si se está trabajando en modo de ESI y se quiere cambiar al modo de APcI, se deben seguir los pasos siguientes:

1. Cambiar al modo Standby (En espera) haciendo clic en Press for Standby (Pulsar para espera), en la parte inferior derecha de la página de ajuste.

2. Desconectar el nebulizador y las dos conexiones eléctricas del panel frontal.

3. Extraer la sonda de ESI desatornillando las dos tuercas de la sonda.

4. Extraer la sección media de la cubierta y aflojar los cuatro tornillos para extraer la cubierta de la carcasa de la fuente.

5. Retirar el tapón de obturación del puerto del electrodo de descarga en corona y colocar en su lugar el electrodo de descarga en corona. Comprobar que el extremo de éste esté alineado con el extremo del cono de la muestra.

6. Volver a ajustar la cubierta de la carcasa de la fuente y la sección media de la cubierta.

Precaución: Si se cierra el suministro de nitrógeno al instrumento durante la noche, se recomienda comprobar que el parámetro API Gas (Gas API) de la página de ajuste esté en Off (Apagado) antes de volver a abrir el caudal de nitrógeno. De lo contrario, podría estropearse el caudalímetro.

Advertencia: El bloque de la fuente de iones, que puede alcanzar temperaturas de 150 °C, mantiene la temperatura establecida, aunque se retire la carcasa.


Una vez colocado en su sitio el electrodo de descarga en corona, se debe proceder del modo siguiente:

1. Insertar la sonda de APcI en la fuente y enroscar los dos tornillos.

2. Conectar el conducto de gas de nebulización de 6 mm a la sonda y al puerto del instrumento con la etiqueta Neb.

3. Extraer el cable de la placa de ajuste de la sonda del panel frontal y colocarlo en el orificio de soporte situado justo debajo de su zócalo eléctrico.

4. Conectar el cable eléctrico de la sonda de APcI al puerto Source/Probe (Fuente/sonda) del panel frontal.

5. Conectar el tubo de la bomba de LC a la sonda de APcI.


7. Establecer APCI Probe Temp (Temperatura de la sonda APCI) en 20 °C con un caudal de líquido y de nitrógeno de cero.

8. Establecer el instrumento en Operate (Funcionamiento).

La fuente queda así preparada para trabajar en el modo de APcI.

2.4.4 Obtención de un haz de iones y conversión al modo de APcI

Para obtener un haz de iones:

1. Comprobar que el electrodo de descarga en corona esté en su sitio y que la sonda de APcI esté instalada como se describe en la Sección 2.4.3.

2. Cambiar el modo de ionización a APcI, si fuera necesario. Seleccionar Ion Mode (Modo de ionización) en el menú de la página de ajuste. La ficha de la página de ajuste actual indica el modo de ionización.

3. Mantener abierta la ficha APCI+ Source (Fuente APCI+) de la página de ajuste. Consultar la Figura 2-9.

Precaución: Antes de volver a abrir el caudal de nitrógeno tras esta interrupción, se debe detener el flujo de gas de API en la página de ajuste. Si hay flujo de nitrógeno a la vez que de gas de API se puede deteriorar el caudalímetro.

Precaución: No abrir el flujo de líquido hasta que el flujo de gas y el calefactor de la sonda estén encendidos y la sonda esté colocada en su sitio.


Figura 2-9 Pantalla de ajuste de la APcI

4. Comprobar que el conducto del gas de desolvatación esté conectado al panel frontal.


6. Establecer Corona en 2 µA y Sample Cone (Cono de la muestra) en 50 V.

7. Permitir que la temperatura de la fuente alcance los 130 °C.


9. Establecer Desolvation Gas (Gas de desolvatación) en 250 L/h en la página de ajuste de APCI+ Source (Fuente APCI+).

10. Seleccionar uno de los cuadros de visualización de los picos y establecer Mass (Masa) en 50 y Span (Intervalo) en 90.


11. Hacer clic en Press to Operate (Pulsar para trabajar).

12. Establecer APCI Probe Temp (Temperatura de la sonda APCI) en 500 °C para una solución de acetonitrilo:agua 1:1 que fluye a 1 mL/min.

Para proporciones mayores de la fase móvil orgánica se necesitan temperaturas inferiores.

13. Permitir que la temperatura de la sonda de APcI alcance los 500 °C.

14. Encender la bomba de LC a 1,0 mL/min.

15. Ajustar el spray aproximadamente a mitad de camino entre el electrodo de descarga en corona y el cono de la muestra mediante el regulador de la sonda.

Consultar la Sección 2.4.4.1, Análisis de una muestra para obtener más información sobre el ajuste de la fuente.

2.4.4.1 Análisis de una muestra

La Tabla 2-4 muestra los parámetros habituales para un análisis cualitativo general de las mezclas. Ajustar los valores de Corona, Cone (Cono) y APCI Probe Temp (Temperatura de la sonda APCI) para optimizar el rendimiento.

Advertencia: La carcasa de la fuente y las piezas de la placa de ajuste de la sonda pueden alcanzar temperaturas altas durante su funcionamiento.

Advertencia: Cerrar el flujo de líquido y dejar que la sonda se enfríe a menos de 100 °C antes de extraerla de la fuente.

Precaución: Si el gas de desolvatación no circula mientras que la sonda de ESI está en funcionamiento, la fuente puede sufrir daños debido al calor.


2.4.4.2 Ajuste específico para obtener la máxima sensibilidad

Para un análisis cuantitativo, es necesario obtener unas condiciones de APcI óptimas para cada analito mediante soluciones estándar.

El ajuste en caudales altos en la APcI puede realizarse mediante una pieza en T para introducir una solución estándar (normalmente de 100 a 1000 pg/µL) a 10 µL/min en el caudal de la fase móvil.

También se pueden realizar varias inyecciones directas de bucle de una solución estándar (normalmente de 10 a 100 pg/µL) en el caudal de la fase móvil para optimizar la APcI.

2.4.4.3 Posición de la sonda

Para optimizar la señal, ajustar girando el regulador de la sonda. El spray debería estar aproximadamente a mitad de camino entre el electrodo de descarga en corona y el cono de la muestra.

Tabla 2-4 Parámetros habituales para análisis cualitativos generales de mezclas

Parámetro Valor habitual

Corona (µA)* 2

Cone (V) (Cono) 25 (monitorizar los iones y regular el ajuste para optimizar)

Extractor (V) 5

RF Lens (V) (Lente RF) 0.2

Source Temp (°C) (Temperatura de la fuente)

130

APCI Probe Temp (°C)* (Temperatura de la sonda APCI)

500

Desolvation Gas (L/h)* (Gas de desolvatación)

300

Cone Gas (L/h)* (Gas de cono)

100

* Consulte la Sección 2.4.4.2 para obtener detalles de ajuste específicos.


2.4.4.4 Corriente de corona

La corriente de corona influye en gran medida en la sensibilidad. La intensidad de la corriente de corona necesaria dependerá de la polaridad del compuesto y de la polaridad de la fase móvil de análisis. La optimización se debe llevar a cabo en presencia de la fase móvil que se va a analizar.

Se puede mejorar la señal si se reduce la corriente de corona a menos de 2 µA, en el caso de los compuestos polares analizados en fases móviles polares.

Se puede mejorar la señal si se aumenta la corriente de corona a más de 2 µA, en el caso de los compuestos de polaridad baja analizados en una fase móvil de polaridad baja.

Para encontrar el valor óptimo de la corriente de corona:

1. Establecer Corona Current (Corriente de corona) en 2 µA.

2. Aumentar dicho valor en intervalos de 2 µA hasta encontrar el valor óptimo. Esperar a que la corriente se estabilice antes de realizar una lectura.

3. Si la señal disminuye constantemente, devolver el valor a 2 µA y reducirlo en intervalos de 0,5 µA hasta encontrar el valor óptimo.

El uso de un valor de Corona Current (Corriente de corona) superior a 0 µA proporcionará los mejores resultados para la mayoría de las muestras de este tipo.

2.4.4.5 Temperatura de la sonda

Para obtener la sensibilidad máxima, se debe optimizar la temperatura de la sonda de APcI como se explica a continuación, al tiempo que se comprueba que esto se realiza en presencia de la fase móvil de análisis:

Comenzar con una temperatura de 650 °C y reducir la temperatura de la sonda de APCI en intervalos de 50 °C, al tiempo que se permite que la temperatura se estabilice antes de realizar una lectura.

Es posible que la temperatura establecida sea demasiado baja para la fase móvil. A menudo, esto tiene como resultado una asimetría significativa de los picos cromatográficos.

2.4.4.6 Gas de desolvatación

En la mayoría de los casos, el flujo del gas de desolvatación influye muy poco en la intensidad de la señal. Sin embargo, en algunos casos, puede afectar a los niveles de ruido químico. El ajuste de este gas puede eliminar el ruido químico.


2.4.4.7 Gas de cono

Se aconseja establecer el caudal del gas de cono para reducir la formación de aductos de disolvente. El valor recomendado es de aproximadamente 50 L/h.


Capítulo 3Ajuste


Para conseguir la máxima precisión en las masas, el instrumento debe ajustarse y calibrarse con un compuesto de referencia adecuado antes de la adquisición de los datos de la muestra.

• Consultar la sección correspondiente de este manual para obtener más información sobre los procedimientos de ajuste de la fuente en el modo operativo elegido.

• Regular los parámetros de ajuste en los menús Source (Fuente) y Analyser (Analizador) para optimizar la intensidad y la forma del pico en la resolución de la unidad de masa.

• Proceder con cuidado a la hora de optimizar el valor de la energía de colisión. Recordar que en los modos Daughter (Producto) y Parent (Precursor), los parámetros Collision (Colisión) y Exit (Salir) son parámetros interactivos.

3.2 Página Tune (Ajuste)

Apertura de la página de ajuste:

Pulsar en el panel MS de la pantalla MassLynx.

Consultar la Figura 3-1 para obtener más detalles sobre la disposición de la página de ajuste.


3.3 Impresión de la información de ajuste

Para imprimir un informe con una copia de la información sobre los picos de ajuste en pantalla y con un registro de cada configuración de parámetros:

Pulsar o seleccionar Print (Imprimir) en el menú File (Archivo) de la página de ajuste.

El usuario no podrá configurar este informe.

Figura 3-1 Página Tune (Ajuste)

40 Ajuste

3.4 Registro experimental

Los parámetros de ajuste se guardan con todos los archivos de datos dentro del registro experimental. Los parámetros de ajuste de un archivo de datos concreto se pueden ver o imprimir desde el explorador de datos. Consultar la MassLynx NT User's Guide (Guía del usuario de MassLynx NT) para obtener más información.

3.5 Almacenamiento y recuperación de los valores de los parámetros de ajuste

Se pueden guardar en el disco conjuntos completos de parámetros de ajuste del instrumento en forma de archivo con nombre para poder recuperarlo más adelante.

Un archivo de parámetros de ajuste contiene los últimos parámetros configurados para los controles de la fuente de todos los modos de ionización admitidos y no únicamente del modo de ionización seleccionado actualmente. Los archivos de parámetros de ajuste también contienen la configuración del analizador, los puntos configurados de entrada y la visualización de picos.

Para guardar los parámetros de ajuste actuales con el nombre de archivo existente:

1. Pulsar o seleccionar Save (Guardar) en el menú File (Archivo) de la página de ajuste.

2. Pulsar Save (Guardar).

Para guardar los parámetros de ajuste actuales con un nuevo nombre de archivo:

1. Seleccionar Save As (Guardar como) en el menú File (Archivo) de la página de ajuste. Se abrirá el cuadro de diálogo Save As (Guardar como). Consultar la Figura 3-2.

Registro experimental 41

Figura 3-2 Cuadro de diálogo Save As (Guardar como)

2. Introducir un nuevo nombre de archivo o seleccionar uno existente en la lista que aparece en pantalla.


4. Si el archivo seleccionado ya está en el disco, aparecerá una advertencia. Pulsar Yes (Sí) para sobrescribir la información existente o No para introducir un nombre de archivo distinto.

Para recuperar un conjunto de parámetros guardados:

1. Pulsar o seleccionar Open (Abrir) en el menú File (Archivo) de la página de ajuste. Se abrirá el cuadro de diálogo Open (Abrir). Consultar la Figura 3-3.

42 Ajuste

Figura 3-3 Cuadro de diálogo Open (Abrir)

2. Seleccionar el archivo de parámetros de ajuste escribiendo su nombre o seleccionándolo en la lista.

3. Pulsar Open (Abrir).

3.6 Modificación de la pantalla Peak Display (Visualización de picos)

La pantalla de ajuste de la visualización de picos se modifica mediante los controles de ajuste de los picos o con el ratón directamente en la pantalla. Para seleccionar picos:

1. Pulsar o seleccionar Options (Opciones), Peak Editor (Modificación de picos).

2. Elegir los picos que se desean ver en pantalla activando las casillas correspondientes.

3. En cada pico activo, seleccionar los valores de Mass (Masa), Span (Intervalo) y Gain (Ganancia).

Para cambiar de función:

Seleccionar una función para el pico en la lista desplegable.

Modificación de la pantalla Peak Display (Visualización de picos) 43

En las funciones MS/MS está activado el parámetro Set (Fijar) y se puede introducir la masa del precursor, el producto, la pérdida de fragmentos neutros o la ganancia de fragmentos neutros.

Para modificar la masa de ajuste:

Seguir uno de estos procedimientos:

1. Hacer clic y arrastrar el ratón dentro de los límites del eje para trazar una “zona de visualización” alrededor de la región de interés.

2. Soltar el botón.

Este rango pasa a ocupar toda la ventana. El valor que aparece en el campo Mass (Masa) es la masa del centro de la ventana.

Esta operación se puede repetir tantas veces como sea necesario.

3. Al pulsar una vez aparecerán el rango y la masa ampliados anteriormente. Si se vuelve a pulsar, se volverá a la configuración predeterminada.

O bien:

1. Introducir un valor en el campo Mass (Masa) del pico seleccionado y pulsar Return (Entrar).

Éste será ahora el valor predeterminado, por lo que si el rango se modifica con el

ratón y se pulsa dos veces , el campo Mass (Masa) volverá a recuperar este valor.

O bien:

1. Colocar el cursor en la parte superior de la ventana de los picos, justo por debajo de la línea que indica la ganancia.

2. Cuando aparezca , hacer clic con el botón izquierdo del ratón y arrastrar éste hasta que aparezca la masa de interés en el campo Mass (Masa) de la parte superior de la ventana.


ratón y se pulsa dos veces , el campo Mass (Masa) volverá a recuperar este valor.

44 Ajuste

Para modificar el intervalo de un pico, se debe seguir uno de estos procedimientos:

1. Pulsar el botón izquierdo del ratón en un extremo de la región de interés y, sin soltarlo, arrastrar el ratón en dirección horizontal hasta el otro extremo.

Cuando se arrastra el ratón, la “zona de visualización” se expande para mostrar el rango seleccionado.

No sobrepasar los límites del eje.

2. Soltar el botón del ratón para ver de nuevo el rango seleccionado de modo que ocupe la pantalla actual por completo.

Esta operación se puede repetir tantas veces como sea necesario.

Al pulsar una vez aparecerá el rango de ampliación anterior. Si se vuelve a pulsar, se volverá a la configuración predeterminada.

O bien:

Introducir un valor en el campo Span (Intervalo) del pico seleccionado y pulsar Return (Entrar).


ratón y se pulsa dos veces , el campo Span (Intervalo) volverá a recuperar este valor.

Para modificar la ganancia de un pico:

1. Hacer doble clic en la línea que aparece por encima del pico y que indica la ganancia para doblar la ganancia aplicada a dicho pico.

2. Hacer doble clic por debajo del pico para dividir la ganancia por la mitad.

O bien:

1. Pulsar el botón izquierdo del ratón en un extremo de la región de interés y, sin soltarlo, arrastrar el ratón en dirección vertical hasta el otro extremo.

Cuando se arrastra el ratón, se marca el rango seleccionado.

No sobrepasar los límites del eje.

2. Soltar el botón del ratón para ver de nuevo el rango seleccionado de modo que ocupe la pantalla actual por completo.

O bien:

Introducir un valor en el campo Gain (Ganancia) del pico seleccionado y pulsar Return (Entrar).

Modificación de la pantalla Peak Display (Visualización de picos) 45

3.7 Cambio del modo de visualización

Para cambiar el modo de visualización con el ratón:

Hacer clic en el área de visualización del pico con el botón derecho del ratón para abrir el menú emergente Peak Display (Visualización de picos). Consultar la Figura 3-4.

Figura 3-4 Menú emergente Peak Display (Visualización de picos)

El área de visualización de cada pico se puede modificar individualmente. Por ejemplo, el color del pico 1 puede ser rojo, el 2 verde, etc.

3.7.1 Personalización del aspecto del gráfico

Para modificar el color de fondo y el de las trazas, así como el número de trazas que deben aparecer en pantalla:

Seleccionar Customise (Personalización), Plot Appearance (Aspecto del gráfico) en el menú emergente Peak Display (Visualización de picos). Consultar la Figura 3-4.

Se abrirá el cuadro de diálogo Customise Plot Appearance (Personalización del aspecto del gráfico). Consultar la Figura 3-5.

46 Ajuste

Figura 3-5 Cuadro de diálogo Customise Plot Appearance (Personalización del aspecto del gráfico)

Para modificar los colores de la pantalla:

Pulsar Newest Trace (Traza más reciente), Background (Fondo) o Trace Fill (Relleno de traza) y elegir un color nuevo en el cuadro de diálogo que aparece.

Para cambiar el número de trazas:

Usar para modificar el número o introducir un valor nuevo en el campo Visible Traces (Trazas visibles) entre 2 y 20.

Si aparece más de una traza, las más antiguas podrán verse con un tono distinto del de las nuevas. Para ello:

Arrastrar el control deslizante Colour Interpolation (Interpolación de colores) hasta el máximo. Los colores de las trazas antiguas aparecerán en el campo Trace colour sample (new->old) (Muestra de color de las trazas [nueva->antigua]).

Cambio del modo de visualización 47

3.7.2 Traza

En el menú emergente Peak Display (Visualización de picos) (Figura 3-4), se debe seguir uno de estos procedimientos:

Seleccionar Trace (Traza) y la opción Outline (Perfil) para que aparezca sólo el perfil del pico.

O bien:

Seleccionar Trace (Traza) y la opción Fill (Relleno) para rellenar la traza con el color elegido.

O bien:

Seleccionar Trace (Traza) y la opción Min/Max (Mínimo/máximo) para ver sólo los puntos de datos mínimo y máximo.

La opción elegida llevará una marca al lado.

3.7.3 Intensidad

1. En el menú emergente Peak Display (Visualización de picos) (Figura 3-4), seleccionar Intensity (Intensidad), Relative Intensity (Intensidad relativa), o bien Intensity (Intensidad), Absolute Intensity (Intensidad absoluta), según sea necesario.

2. Seleccionar Intensity (Intensidad), Normalise Data (Normalización de datos) para ver los datos normalizados.

Las opciones elegidas llevarán una marca al lado.

3.7.4 CuadrículaLas opciones del menú emergente Peak Display (Visualización de picos) (Figura 3-4) permiten ver u ocultar las líneas verticales y horizontales de la cuadrícula independientemente.

Las opciones seleccionadas llevan una marca al lado. Si se hace clic en una opción por segunda vez, dejará de estar seleccionada.

48 Ajuste

3.8 AutoTune (Ajuste automático)

MassLynx puede ajustar automáticamente el espectrómetro de masas en los modos de ionización APcI y de electrospray. AutoTune (Ajuste automático) regula los valores de los parámetros de ajuste hasta conseguir la mejor intensidad, resolución y perfil del pico.

Para ejecutar AutoTune (Ajuste automático):

1. Pulsar en la página de ajuste para iniciar la función API gas (Gas API) y seleccionar Operate (Funcionamiento).

2. Seleccionar AutoTune (Ajuste automático) en el menú Options (Opciones) de la página ajuste. Se abrirá el cuadro de diálogo AutoTune (Ajuste automático) (Figura 3-6).

Figura 3-6 Cuadro de diálogo AutoTune (Ajuste automático)

3. Pulse Setup (Configuración) para especificar los parámetros de configuración de AutoTune (Ajuste automático). Se abrirá el cuadro de diálogo AutoTune Setup (Configuración del ajuste automático). Consultar la Figura 3-7.

AutoTune (Ajuste automático) 49

Existen dos niveles de ajuste automático:

• Full AutoTune (Ajuste automático completo) utiliza un conjunto predeterminado de parámetros de ajuste.

• Maintenance AutoTune (Ajuste automático de mantenimiento) emplea los parámetros de ajuste actuales que se hayan configurado en la página de ajuste y puede ser más rápido que el anterior.

Sólo se puede realizar un ajuste automático de mantenimiento si el instrumento ya está razonablemente bien ajustado. Si el ajuste actual no es el adecuado, AutoTune (Ajuste automático) indicará error y solicitará que se realice el proceso Full AutoTune (Ajuste automático completo).

Figura 3-7 Cuadro de diálogo AutoTune Setup (Configuración del ajuste automático)

El parámetro Tune Mass (Masa de ajuste) configura la masa que se va a ajustar.

Cuando los parámetros de AutoTune Setup (Configuración del ajuste automático) sean satisfactorios:

1. Pulsar OK (Aceptar) para salir.

2. Pulsar Start (Inicio).

La barra AUTOTUNE STATUS (Estado del ajuste automático) se actualizará para indicar la marcha del proceso.

50 Ajuste

Se realizarán los pasos siguientes:

• Inicialización de parámetros y comprobaciones del instrumento:

– Comprobación de que los indicadores esenciales de estado muestran valores correctos.

– Comprobación de que se han definido los valores de todos los parámetros del instrumento controlables por el usuario y que éstos han pasado al sistema de tratamiento de datos.

– Comprobación de que las lecturas de estos parámetros se encuentran dentro del margen especificado.

• Detección del haz.

• Ajuste de la lente focal.

• Ajuste de la energía de iones.

• Ajuste de las resoluciones de masas altas y bajas.

– Estos cuatro últimos pasos suponen la ejecución del algoritmo de ajuste automático de ESP/APcI. Esto significa que se modifican los parámetros principales de uno en uno para aumentar en lo posible la intensidad de un pico de referencia con respecto a ese parámetro. Actualmente, el ajuste automático ESP/APcI se lleva a cabo de acuerdo con un solo pico de referencia especificado por el usuario.

Una vez concluido el ajuste automático, aparece una ventana de estado para indicar que el proceso se ha realizado satisfactoriamente.

Pulsar OK (Aceptar) para volver a la página de ajuste.

Los parámetros de ajuste obtenidos durante la ejecución de AutoTune (Ajuste automático) se guardan en el archivo actual de parámetros de ajuste.

3.9 Modo de ionización

El modo de ionización se selecciona en el menú Ion Mode (Modo de ionización) de la página de ajuste. El modo elegido llevará una marca al lado.

Modo de ionización 51

3.10 Parámetros del objetivo del análisis

El cuadro de diálogo Scope Setup (Configuración del objetivo del análisis) (Figura 3-8) se

abre al pulsar o al seleccionar Options (Opciones), menú Scope Parameters (Parámetros del objetivo del análisis) en la página de ajuste.

Figura 3-8 Cuadro de diálogo Scope Setup (Configuración del objetivo del análisis)

Las opciones Scan Time (Tiempo de barrido) e Inter Scan Delay (Intervalo entre barridos) controlan la velocidad de actualización de la visualización de picos de ajuste en pantalla.

El ajuste será más efectivo si los parámetros se configuran con valores bajos.

Para cambiar los parámetros del objetivo del análisis:

1. Pulsar o elegir Scope Parameters (Parámetros del objetivo del análisis) en el menú Options (Opciones) de la página de ajuste.

2. Realizar los cambios necesarios en los parámetros.

3. Pulsar OK (Aceptar).

3.11 Controles del gas

Para activar o desactivar el uso de gas:

Pulsar (si se trata de gas de nebulización, de desolvatación o de cono) o (gas de colisión), o bien seleccionar el gas deseado en el menú Gas de la página de ajuste.

Si anteriormente se había cerrado el gas, ahora se abrirá. Aparecerá una marca junto al gas cuando esté abierto.

52 Ajuste

3.12 Controles de rampa

Para configurar una rampa de voltaje del cono, se deberán seguir estos pasos:

1. Seleccionar Cone Ramp Gradient (Gradiente de la rampa del cono) en el menú Ramps (Rampas) de la página de ajuste. Se abrirá el cuadro de diálogo Cone Ramp (Rampa de cono). Consultar la Figura 3-9.

Figura 3-9 Cuadro de diálogo Cone Ramp (Rampa de cono)

Se establecen dos valores de voltaje del cono para dos masas específicas. Estos valores definen un gradiente para el voltaje del cono que se extrapolará para abarcar todo el intervalo comprendido entre estas masas.

2. Realizar los cambios que se requieran y pulsar OK (Aceptar) para salir.

Para iniciar la rampa de voltaje del cono:

Pulsar o seleccionar Use Cone Ramp (Usar rampa del cono) en el menú Ramps (Rampas) de la página de ajuste.

Aparecerá una marca junto a esta opción del menú cuando esté seleccionada la rampa de voltaje del cono.

Para configurar una rampa de energía de colisión, se deberán seguir estos pasos:

1. Seleccionar Collision Energy Ramp Gradient (Gradiente de la rampa de energía de colisión) en el menú Ramps (Rampas) de la página de ajuste. Se abrirá el cuadro de diálogo Collision Ramp (Rampa de colisión). Consultar la Figura 3-10.

Controles de rampa 53

Figura 3-10 Cuadro de diálogo Collision Ramp (Rampa de colisión)

Se establecen dos valores de energía de colisión para dos masas específicas. Estos valores definen un gradiente para el voltaje de energía de colisión que se extrapolará para abarcar todo el intervalo comprendido entre estas masas.

2. Realizar los cambios que se requieran y pulsar OK (Aceptar) para salir.

Para iniciar la rampa de voltaje de energía de colisión:

Pulsar o elegir Use Collision Energy Ramp (Usar rampa de energía de colisión) en el menú Ramps (Rampas) de la página de ajuste.

3.13 Recuperación del nivel cero

Se puede recuperar el nivel cero (o la línea de base) pulsando o seleccionando Reinitialize (Reinicialización) en el menú Options (Opciones) de la página de ajuste.

Mediante este comando, el sistema de control del instrumento mide la posición de la señal de ruido para compensar cualquier desviación de la línea de base causada por los componentes electrónicos o los instrumentos.

Se recomienda reajustar en el nivel cero siempre que se modifique el voltaje del multiplicador.

54 Ajuste

3.14 Control de lecturas

El cuadro de diálogo Readbacks (Lecturas) (Figura 3-11) se abre seleccionando Options (Opciones), Readbacks (Lecturas) en la página de ajuste.

Figura 3-11 Cuadro de diálogo Readbacks (Lecturas)

Hay tres opciones de visualización de las lecturas del sistema en la pantalla de ajuste:

• Las lecturas de datos se muestran de forma continua.

• Las lecturas de datos se ocultan.

• Las lecturas únicamente se ven si difieren de los valores definidos en más de un 10 %.

Hay una serie de lecturas que se utilizan sólo para el diagnóstico y su función se limita a confirmar que hay voltaje. La variación aceptable entre el valor asignado y el valor de lectura depende del parámetro de ajuste en cuestión. En caso de duda sobre alguna lectura, se recomienda ponerse en contacto con el servicio técnico local para recibir asesoramiento al respecto.

Para modificar el formato de la lectura, se debe hacer lo siguiente:

1. Seleccionar Readbacks (Lecturas) en el menú Options (Opciones) de la página de ajuste.

2. Elegir el formato de lectura deseado.

3. Pulsar OK.

Control de lecturas 55

3.15 Modificación de la configuración de los parámetros de ajuste

La mayoría de los parámetros se pueden cambiar del modo siguiente:

• Arrastrar el control deslizante con el ratón.

• Hacer clic en el control y utilizar las flechas de izquierda y derecha para cambiar el valor de unidad en una unidad.

Al activar el control, la ventana de modificación se actualiza.

• Escribir un valor nuevo en la ventana de modificación.

Otros parámetros sólo disponen de una ventana de modificación y se pueden cambiar escribiendo directamente.

La velocidad con la que el sistema responde a las modificaciones depende de la velocidad de actualización de la visualización de picos. Para obtener una respuesta más rápida, se debe asignar a los parámetros Scan Time (s) (Tiempo de barrido) e Inter Scan Delay (s) (Intervalo entre barridos) del cuadro de diálogo Scope Setup (Parámetros del objetivo del análisis), valores lo más breves posible. Consultar la Figura 3-8.

3.16 Voltajes de la fuente

La Tabla 3-1 enumera los distintos componentes del sistema óptico de iones Quattro micro API. El nombre de la primera columna de la tabla es el que se utiliza en este manual para describir ese componente. Cuando corresponde, la segunda columna muestra el término utilizado en la versión actual de MassLynx NT.

56 Ajuste

Los voltajes que aparecen son los habituales en un instrumento en buenas condiciones. Las polaridades que se ofrecen son las que se aplican realmente a los electrodos. En la página de ajuste sólo es necesario introducir los valores positivos.

Tabla 3-1 Voltajes de la fuente

Denominación en la página Tune (Ajuste)

ESI+ve ESI-ve APcI+ve APcI-ve

Sonda del electrospray Capillary (Capilar)

+3,0 (kV) -3,0 (kV) No aplicable

Electrodo de descarga en cadena de APcI

Corona No aplicable 2 µA 2 µA

Cono de la muestra Cone (Cono) +50 (V) -50 (V) +50 (V) -50 (V)

Cono de extracción Extractor +3 (V) -3 (V) +3 (V) -3 (V)

Hexapolo RF Lens (Lente RF)

+0,2 (V) -0,2 (V) +0,2 (V) -0,2 (V)

Voltajes de la fuente 57

58 Ajuste

Capítulo 4Adquisición de datos

4.1 Inicio de una adquisición de datos

Existen dos modos de iniciar la adquisición:

• Analizar una muestra única desde la pantalla de ajuste.

• Analizar varias muestras desde la pantalla de nivel superior MassLynx.

4.1.1 Inicio de una adquisición desde la pantalla de ajuste

• El modo más sencillo de realizar la adquisición de datos es hacerlo directamente desde la pantalla de ajuste.

• Las adquisiciones se pueden iniciar y detener.

• La mayoría de los parámetros de barrido se pueden controlar.

• No se pueden utilizar programas de entrada de muestras.

• No se pueden adquirir datos analógicos.

• No se pueden adquirir secuencias de varias muestras.

Para iniciar una adquisición de una única muestra:

1. Pulsar Acquire (Adquirir) en la página de ajuste o seleccionar Acquire (Adquirir) en el menú Window (Ventana) de la página de ajuste. Se activará el cuadro de diálogo Adquisition (Adquisición). Consultar la Figura 4-1.

Para realizar esto, se deberá modificar la configuración para ajustarla al rango de masas y a los tiempos de barrido necesarios.

2. Pulsar Start (Inicio).

El nombre del archivo de datos puede tener un máximo de 128 caracteres. Si el archivo ya está en el disco, se pedirá al usuario que cambie el nombre del archivo o que sustituya el existente. El archivo se almacena en el directorio de datos del proyecto actual.

Inicio de una adquisición de datos 59

Figura 4-1 Cuadro de diálogo Start Acquisition (Iniciar adquisición)

Para cambiar el directorio en el que se almacenan los datos:

1. Cancelar la adquisición.

2. Crear un proyecto nuevo seleccionando Project Wizard (Asistente para proyectos) o abrir uno existente seleccionando Open Project (Abrir proyecto) en el menú del archivo de nivel superior MassLynx.

El área Text (Texto) se utiliza para introducir una descripción de la muestra. La descripción puede incluirse en cualquier informe de resultados de los datos adquiridos y puede tener un máximo de 74 caracteres. Para ver el texto en varias líneas, pulsar Ctrl+Entrar al final de una línea.

Se puede utilizar una de las funciones de adquisición siguientes:

• MS

• MS2

• Daughter (Producto)

• Parent (Precursor)

• Neutral Loss (Pérdida de fragmentos neutros)

• Neutral Gain (Ganancia de fragmentos neutros)

60 Adquisición de datos

Se puede obtener más información en la Sección 4.6, Editor de la lista de funciones.

El formato de adquisición y almacenamiento de datos en el disco puede ser:

• Centroid (Centroide)

• Continuum (Continuo)

• MCA

Se puede obtener más información sobre estos formatos de datos en la secciones posteriores de este capítulo.

Set Mass (Establecer masa) especifica la masa de interés (masa de un producto, masa de precursor, etc.) que se utiliza para el tipo de función específica. Este control se desactiva si la función seleccionada no requiere el establecimiento de la masa.

Start Mass (Masa inicial) y End Mass (Masa final) especifican las masas a las que comienza y finaliza el barrido. La masa inicial debe ser inferior a la masa final.

Run Duration (Duración del análisis) es la longitud de la adquisición, medida en minutos.

Scan Time (Tiempo de barrido) especifica la duración en segundos de cada barrido.

Inter Scan Time (Tiempo entre barridos) especifica los segundos transcurridos entre el fin de un barrido y el inicio de otro. Durante este periodo no se almacenan datos.

Si se pulsa Origin (Origen) se podrá introducir información adicional sobre la muestra que se va a analizar en los campos siguientes:

• Submitter (Autor)

• Job (Trabajo)

• Task (Tarea)

• Conditions (Condiciones)

4.1.2 Varias muestras

La página predeterminada de MassLynx contiene un editor de la lista de muestras para definir las muestras que se pueden utilizar juntas para realizar un análisis cuantitativo. La lista de las muestras se configura mediante un editor de estilo de hojas de cálculo que se puede adaptar para satisfacer distintos requisitos.

Para iniciar una adquisición de varias muestras:

1. Configurar una lista de muestras (consultar la MassLynx NT User’s Guide [Guía del usuario de MassLynx NT] para obtener más detalles).


2. Seleccionar Start (Inicio) en el menú Run (Análisis) de nivel superior o pulsar .

Esto activa el cuadro de diálogo Start Sample List Run (Iniciar análisis de la lista de muestras). Consultar Figura 4-2.

Figura 4-2 Cuadro de diálogo Start Sample List Run (Iniciar análisis de la lista de muestras)

3. Seleccionar los cuadros Acquire Sample Data (Adquirir datos de muestras), Auto Process Samples (Proceso automático de las muestras) y Auto Quantify Samples (Cuantificación automática de las muestras), según sea necesario.

4. Introducir valores en los cuadros Run (Análisis), From Sample (Desde la muestra) y To Sample (Hasta la muestra).

La opción predeterminada es todas las muestras de la lista.

5. Seleccionar los cuadros Priority (Prioridad) o Night Time Process (Proceso nocturno), según sea necesario. Consultar la MassLynx NT User’s Guide (Guía del usuario de MassLynx NT) para obtener más información.



7. Repetir el proceso anterior según sea necesario.

Las listas de muestras se añaden a una cola y se analizan de forma secuencial a menos que se haya seleccionado Priority (Prioridad) o Night Time Process (Proceso nocturno).

La muestra en curso va acompañada de un icono en la lista de muestras.

Los Process controls (Controles del proceso) permiten que se ejecuten los procesos antes y después de la adquisición. El control Pre-Run (Ejecución previa) se utiliza para especificar el nombre de un proceso ejecutado antes de la adquisición de archivos de la lista de muestras.

El control Post-Run (Ejecución posterior) se utiliza para especificar el nombre de un proceso ejecutado tras la adquisición de archivos de la lista de muestras. Este control se podría utilizar, por ejemplo, para apagar el instrumento y para cerrar varios gases.

Para ejecutar un proceso después de adquirir datos de todas las muestras de la lista:

Formatear la lista de muestras para mostrar la columna Process (Proceso) e introducir el nombre del proceso que se va a ejecutar para cada una de las muestras.

Para que el proceso trabaje automáticamente en el archivo de datos que se acaba de adquirir:

No seleccionar Use Acquired File as Default (Utilizar archivo adquirido como predeterminado) en la ficha System (Sistema) del cuadro de diálogo MassLynx Options (Opciones MassLynx).

Se puede acceder al cuadro de diálogo MassLynx Options (Opciones de MassLynx) seleccionando Options (Opciones) en el menú MassLynx Tools (Herramientas de MassLynx).


4.1.3 Cuantificación automática de la lista de muestras

Para activar el cuadro de diálogo Quantify Samples (Cuantificación de muestras) (Figura 4-3):

Seleccionar Process Samples (Proceso de muestras) en el menú Quantify (Cuantificar). Seleccionar los cuadros necesarios y pulsar OK (Aceptar).

El cuadro de diálogo Quantify Samples (Cuantificación de las muestras) permite realizar el procesamiento automático de los archivos de datos después de la adquisición. Para realizar la integración, el calibrado de estándares, la cuantificación de muestras y la impresión de los informes de cuantificación seleccione los cuadros de selección pertinentes. Consultar la MassLynx NT User’s Guide (Guía del usuario de MassLynx NT) para obtener más información sobre el análisis automatizado de las listas de muestras.

Integrate Samples (Integrar muestras) integra todos los archivos de datos de muestras especificados en la lista de picos.

Calibrate Standards (Estándares de calibrado) utiliza los resultados de la integración para trazar curvas de calibrado de cuantificación.

Quantify Samples (Cuantificación de las muestras) utiliza los resultados de la integración y las curvas de calibrado de cuantificación para calcular las concentraciones de los compuestos.

Figura 4-3 Cuadro de diálogo Quantify Samples (Cuantificación de las muestras)


Print Quantify Reports (Imprimir informes de cuantificación) imprime copias en papel de los resultados de integración y cuantificación.

Export Results to LIMS (Exportar resultados a LIMS) crea un archivo de texto que contiene detalles de los resultados de cuantificación para su utilización con los sistemas LIMS. Si este cuadro está seleccionado, se habilita el botón LIMS Export Browse (Explorar exportaciones a LIMS). Pulsar Browse (Explorar), seleccionar un archivo o introducir el nombre de un archivo nuevo y pulsar Save (Guardar).

El campo Project (Proyecto) muestra el proyecto en el que se adquieren los datos.

Para cambiar el proyecto en el que se adquieren los datos, se debe cancelar la adquisición y crear un proyecto nuevo seleccionando Project Wizard (Asistente para proyectos) o un proyecto existente abierto mediante Open Project (Abrir proyecto), en el menú File (Archivo) de nivel superior de MassLynx.

From Sample and To Sample (De muestra en muestra) establece el rango de muestras en la lista de muestras que se analiza.

4.2 Supervisión de una adquisición

El progreso de la adquisición se muestra en la pantalla MassLynx. El tiempo de ejecución se muestra en el panel de MS y el estado del barrido, el número de muestra y el número de barrido se muestran en la barra de estado situada en la parte inferior de la página.

4.2.1 Ventana de progreso de la adquisición (Informe del barrido)

Las ventanas de progreso de la adquisición o Scan Report (Informe del barrido) proporcionan un informe estadístico barrido por barrido del progreso de la adquisición. Se recomienda consultar la Figura 4-4.

Supervisión de una adquisición 65

Figura 4-4 Ventana Scan Report (Informe del barrido)

Para activar la ventana Scan Report (Informe del barrido):

Seleccionar Acquisition Status (Progreso de la adquisición).

Ésta muestra los detalles del barrido del que se están adquiriendo datos actualmente.

4.2.2 Actualización del cromatograma en tiempo real

Para visualizar en tiempo real el cromatograma de la adquisición en curso:

1. Abrir el archivo de datos mediante el explorador de datos MassLynx.

2. Pulsar o seleccionar Real-Time Update (Actualización en tiempo real) en el menú Display (Visualizar). La pantalla del cromatograma se actualiza a medida que la avanza la adquisición.

4.2.3 Actualización del espectro en tiempo real

Para visualizar en tiempo real el espectro de la adquisición en curso:

1. Abrir el archivo de datos mediante el explorador de datos MassLynx.


2. Pulsar o seleccionar Real-Time Update (Actualización en tiempo real) en el menú Display (Visualizar). Aparecerá el cuadro de diálogo Spectrum Real-Time Update (Actualización del espectro en tiempo real). Consultar la Figura 4-5.

Figura 4-5 Cuadro de diálogo Spectrum Real-Time Update (Actualización del espectro en tiempo real)

3. Seleccionar Enable Real-Time update (Permitir la actualización en tiempo real).

La actualización en tiempo real también puede activarse y desactivarse mediante el botón de la barra de herramientas de tiempo real del espectro.

Cuando la actualización en tiempo real está activada, la pantalla se actualiza continuamente con espectros de la adquisición actual. La información real que se visualiza se determinará seleccionando uno de los siguientes botones de radio:

La opción Latest scan (Último barrido) muestra el último barrido realizado. Ésta es la opción predeterminada.

La opción Average all scans (Promedio de todos los barridos) actualiza la pantalla con espectros obtenidos del promedio de todos los espectros adquiridos hasta el momento.

La opción Average latest scans (Promedio de los últimos barridos) actualiza la pantalla con espectros obtenidos del promedio de los últimos n barridos adquiridos, donde n se especifica en el control de modificación asociado.

Supervisión de una adquisición 67

4.3 Umbrales de datos del instrumento

MassLynx presenta varios parámetros que permiten el control sobre el modo en el que el sistema realiza un procesamiento previo de datos antes de enviarlos al ordenador principal. Estos parámetros se especifican en el cuadro de diálogo Instrument Threshold Settings (Configuración de los umbrales del instrumento). Consultar Figura 4-6.

Figura 4-6 Cuadro de diálogo Instrument Threshold Settings (Configuración de los umbrales del instrumento)

Los umbrales de datos del instrumento permiten especificar el tipo de datos que se adquirirán y grabarán en el disco y el tipo de datos que se desecharán y no se grabarán en el disco. Limitar la cantidad de datos almacenados en el disco puede resultar de especial utilidad cuando se adquieren datos continuos o se realizan análisis de LC largos.

Para cambiar los umbrales de adquisición de datos:

1. Seleccionar Set Instrument Threshold (Establecer umbral del instrumento) en el menú Options (Opciones) de la página de ajuste.

2. Realizar los cambios necesarios.


Estos nuevos parámetros se descargan al iniciarse el siguiente barrido de adquisición.


4.3.1 MaxEnt

El algoritmo MaxEnt debe calcular con exactitud el ruido en un archivo de datos. Por esta razón, Ion Counting Threshold (Umbral de recuento de iones) debe establecerse en cero cuando se adquieran datos para analizarlos mediante MaxEnt.

4.3.2 Datos del perfil

Los controles de los datos del perfil permiten el control de la cantidad de datos adquiridos durante una adquisición de datos continua.

Baseline Level (Nivel de la línea de base) se utiliza para elevar o bajar el nivel de la línea de base para ver más o menos ruido situando la línea de base por encima de cero. A esta opción se le suele asignar el valor cero.

También es posible utilizar una línea de base negativa que reducirá el ruido visible y actuará como un umbral que se aplicará a muestras del tipo 1/16 uma. Esta acción tiene lugar después del recuento de iones y su efecto es menor que el del Ion Counting Threshold (Umbral de recuento de iones).

Para ver más ruido, se deberá utilizar un valor positivo.

En el campo Points per Dalton (Puntos por Dalton) puede aparecer uno de los tres valores siguientes: 4, 8 ó 16.

• Si se seleccionan 8 puntos en lugar de 16, el tamaño de los archivos de datos será de la mitad.

• Si se adquieren 16 puntos por Dalton se obtendrá la mejor resolución.

• Si se adquieren 4 puntos por Dalton, éstos tendrán un aspecto uniforme.

4.3.3 Datos centroides

Minimum centroid height (Altura centroide mínima) fija una altura por debajo de la cual los picos detectados se omitirán. Esta función reduce el tamaño de los archivos de datos adquiridos y es de utilidad cuando se trabaja solamente con los picos de interés mayores. Si se inspeccionan los niveles de ruido espectral, se podrá obtener un valor adecuado que se debe evaluar para cada sistema individual.

Minimum points per peak (mínimo de puntos por pico) es el número mínimo de puntos que debe tener un pico continuo para ser centroide. Un valor habitual sería 10.

Umbrales de datos del instrumento 69

4.3.4 Datos SIR

SIR Baseline Level (Nivel de línea de base SIR) fija la posición de la línea de base SIR por encima de cero. El nivel de la línea de base normalmente se establece en 0. Si se aumenta el valor ello provocará que la línea de base aparezca más alta.

4.3.5 Umbral de recuento de iones

Ion Counting Threshold (Umbral de recuento de iones) fija el nivel de intensidad por debajo del cual se omitirán los puntos de adquisición de datos. Este umbral se aplica a todas las adquisiciones, con independencia del modo de barrido y es la variable de manipulación de datos más importante, puesto que se aplica primero a los datos sin procesar.

Cuando se inicia una adquisición, el instrumento realiza un “barrido previo” con el haz de iones desconectado, de forma que se puedan medir el nivel de ruido electrónico del sistema de adquisición y su desviación estándar. El umbral de recuento de iones sólo afecta al nivel de ruido electrónico del sistema.

El nivel introducido para el umbral de recuento de iones se multiplica por 1/10 de la desviación estándar del ruido para determinar el nivel de intensidad que se va a utilizar, de forma que un valor de 10 es igual a la desviación estándar del nivel de ruido electrónico.

• Se pueden fijar valores entre 0 y 1000; cuanto mayor sea el valor, mayor será el número de datos desechados.

• Si se introduce un valor de cero, el nivel de intensidad se fijará en la mitad del ruido, lo que significa que se adquirirá aproximadamente la mitad de los datos de ruido.

• Si se fija un valor de 10, el umbral quedará justo por encima del ruido y se adquirirán prácticamente todos los datos.

• Si se fija un valor de 200, el umbral se situará justo por encima del ruido y se adquirirán muy pocos datos de ruido.

• Un valor de 30 es adecuado para la mayoría de los datos.

El umbral de recuento de iones se debe establecer para eliminar el ruido de fondo sin reducir significativamente la intensidad de los picos de interés menores.

La Tabla 4-1 muestra los efectos de modificar el ruido de la línea de base y el umbral de recuento de iones en el ruido de fondo y en los picos de baja intensidad.


Tabla 4-1 Efectos de modificar el ruido de la línea de base y el umbral de recuento de iones

Niv

el d

elín

ea d

e b

ase

Um

bra

l de

recu

ento

de

ion

es

Ru

ido

de

fon

do

hab

itu

al

Per

fil d

e p

ico

hab

itu

al

Red

ucc

ión

de

inte

nsi

dad

Alm

acen

amie

nto

hab

itu

alen

tam

año

de

arch

ivo

.DA

T

0 0 0 0

1 0 0

2 0 0

5 0

0 10 4 % 8 %

0 20 11 % 10 %


4.3.6 Datos de perfil: supresión de los aumentos bruscos de ruido (spikes)

Los aumentos bruscos del ruido (spikes) se distinguen de los datos reales porque los picos son muy estrechos e intensos, en comparación con los picos inmediatos. Los puntos de adquisición de datos considerados como aumentos bruscos de ruido se eliminan fijando el valor de este punto de adquisición de datos en el valor medio de los picos vecinos.

La eliminación de aumentos bruscos del ruido implica un procesamiento adicional durante la adquisición y reduce la velocidad de adquisición en un 30 % aproximadamente.

0 40 37 % 61 %

0 60 66 % 69 %

0 250100 %

83 %

Tabla 4-1 Efectos de modificar el ruido de la línea de base y el umbral de recuento de iones (Continuación)

Niv

el d

elín

ea d

e b

ase

Um

bra

l de

recu

ento

de

ion

es

Ru

ido

de

fon

do

hab

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Per

fil d

e p

ico

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itu

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Red

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ión

de

inte

nsi

dad

Alm

acen

amie

nto

hab

itu

alen

tam

año

de

arch

ivo

.DA

T


Para llevar a cabo la eliminación de aumentos bruscos del ruido durante una adquisición:

1. Seleccionar Use Spike Removal (Utilizar eliminación de aumentos bruscos del ruido).

2. Consultar las intensidades en la página de ajuste para calcular un valor adecuado para el umbral de intensidad por debajo del cual los aumentos bruscos de ruido se omitirán. Asignar este valor a Minimum Spike Intensity (Intensidad mínima de los aumentos bruscos de ruido).

3. Una señal de muy baja intensidad podría contener eventos de iones únicos que se pueden combinar para crear picos significativos. Para este tipo de datos, asignar a Minimum Spike Intensity (Intensidad mínima de los aumentos bruscos de ruido) un valor apropiado, de modo que estos eventos de iones únicos no se desechen como aumentos bruscos de ruido.

4. Establecer un valor apropiado para Spike Percentage Ratio (Relación de aumentos bruscos de ruido).

Este porcentaje se utiliza para determinar si un punto adquirido es un aumento brusco de ruido comparando el punto adquirido con sus vecinos inmediatos. Por ejemplo, si se asigna a este campo el valor 33 %, un punto adquirido se considerará un aumento brusco de ruido si su intensidad es como mínimo tres veces mayor que la de sus vecinos inmediatos. Si se asigna un valor de 20 %, se requerirá una relación de intensidad de 5:1 para identificar un aumento brusco de ruido.

5. Pulsar OK (Aceptar) para aceptar los cambios.

No se cargará ningún cambio si se pulsa Cancel (Cancelar).

4.3.7 Datos analógicosSeleccionar el número de muestras que se adquirirán por segundo en la lista desplegable.


4.4 Administrador del sistema

Para comprobar las comunicaciones entre el software MassLynx y el PC integrado:

Seleccionar Communications Status (Estado de las comunicaciones). Se activará la pantalla System Manager (Administrador del sistema). Consultar Figura 4-7.

Figura 4-7 Ventana System Manager (Administrador del sistema)

4.5 Parada de la adquisición

Para detener la adquisición:

1. En la página de ajuste, pulsar Stop (Detener).

2. En la pantalla MassLynx, seleccionar Stop (Detener) en el menú Run (Análisis) o

pulsar .

Los datos adquiridos hasta ese momento se guardan.

4.6 Editor de la lista de funciones

4.6.1 Introducción

El Function List Editor (Editor de la lista de funciones) (Figura 4-8) se utiliza para configurar las funciones que utiliza el espectrómetro de masas para realizar barridos del instrumento durante la adquisición. Una lista de funciones puede ser una combinación de diferentes técnicas de barrido que se ejecutan de manera secuencial o simultánea durante una adquisición.


Para acceder a Function List Editor (Editor de la lista de funciones):

Pulsar en el panel de MS de la pantalla MassLynx.

Los usos habituales de las adquisiciones con funciones mixtas son la adquisición de distintos grupos SIR en distintos tiempos de retención.

Se crea una lista de funciones, se graba en el disco y se hace referencia a ella por el nombre asignado al iniciar una adquisición.

Figura 4-8 Editor de la lista de funciones

Editor de la lista de funciones 75

En la Figura 4-8 se muestra una lista de funciones simples que consta de una sola función: un rango de masas completo en modo centroide, entre 500 y 1.500 uma, en modo de ionización ES+. Inmediatamente por encima de la barra de funciones existe un indicador de tiempo que muestra desde cuándo está activa la función y durante cuánto tiempo se ejecuta. En este caso, la función se inicia transcurridos 5 minutos y se ejecuta durante 35 minutos. Así, el total de tiempo transcurrido es de 40 minutos.

En la Figura 4-9 se muestra una lista de funciones más complejas, con cuatro funciones SIR que se ejecutan de forma secuencial durante 5 minutos cada una.

La función seleccionada se resalta y aparece en un marco rectangular. Si en la pantalla hay más de una función, se podrá seleccionar una función distinta haciendo clic con el ratón o utilizando las flechas del teclado.

Figura 4-9 Lista de funciones con cuatro funciones SIR


4.6.2 Barra de herramientas del editor de la lista de funciones

La barra de herramientas aparece en la parte superior de la pantalla de ajuste y permite realizar algunas operaciones habituales con un solo clic. En la Tabla 4-2 aparecen las funciones de los botones de la barra de herramientas.

Tabla 4-2 Barra de herramientas de Function List Editor (Editor de la lista de funciones)

Botón de la barra de herramientas

Función

Crea una nueva lista de funciones.

Abre una lista de funciones existente.

Guarda la lista de funciones actual en el disco.

Imprime la ventana en pantalla en formato vertical.

Modifica la función seleccionada.

Elimina la función seleccionada.

Mueve la función seleccionada hacia arriba en la lista de funciones.

Mueve la función seleccionada hacia abajo en la lista de funciones.

Crea una nueva función SIR.

Crea una nueva función MRM.

Crea una nueva función Full Scan (Rango de masas completo).

Crea una nueva función Parent (Precursor).

Crea una nueva función Daughter (Producto).

Crea una nueva función Neutral Loss (Pérdida de fragmentos neutros).

Crea una nueva función Survey (Estudio).


4.6.3 Adición de una nueva función

Para añadir una nueva función a la lista:

1. Hacer clic en uno de los botones de la barra de herramientas o seleccionar la función necesaria en el menú Function (Función).

Se abrirá el editor del tipo de función seleccionado con los valores predeterminados.

2. Realizar los cambios necesarios en los parámetros y pulsar OK (Aceptar) para agregar la nueva función.

El editor de funciones de los distintos tipos de barrido se explica de forma detallada posteriormente en este capítulo.

4.6.4 Modificación de una función existente

Para modificar una función existente:

1. Seleccionar la función en la lista de funciones.

2. Pulsar o hacer doble clic en la función.

Se abrirá el editor correspondiente al tipo de función y se podrán realizar cambios.

Si se han realizado cambios, la pantalla de la lista de funciones se actualizará.

Si se introduce un valor nuevo en Total Run Time (Tiempo total de análisis) y se pulsa se establece el tiempo de retención máximo para el experimento. La relación de las funciones definidas se mantiene. Por ejemplo, si se han definido dos funciones, una de 0 a 5 minutos y la otra de 5 a 10 minutos, se visualizará un tiempo total de análisis de 10 minutos. Si este valor se modifica a 20, la primera función se ejecutará de 0 a 10 minutos y la segunda de 10 a 20 minutos.

4.6.5 Copia de una función existente

Para copiar una función existente:


2. Seleccionar Copy (Copiar) y Paste (Pegar) en el menú Edit (Edición).

3. Modificar los parámetros como se ha descrito anteriormente.


4.6.6 Eliminación de una función

Para eliminar una función:


2. Pulsar o seleccionar Delete (Borrar) en el menú Edit (Edición) o pulsar Del (Supr) en el teclado.

3. Cuando se solicite confirmación de la eliminación, seleccionar Yes (Sí).

4.6.7 Cambio del orden de las funciones

Las funciones se muestran en orden ascendente en Start Time (Tiempo de inicio) y en End Time (Tiempo de finalización) y este orden no se puede modificar. Para las funciones con el mismo tiempo de inicio y de finalización, se podrá modificar el orden en que se ejecutan, siguiendo estos pasos:

1. Seleccionar la función requerida.

2. Pulsar varias veces el icono o hasta que la función esté en la posición requerida.

4.6.8 Configuración del desfase del eluyente

Para establecer un desfase del eluyente para una lista de funciones:

Seleccionar Solvent Delay (Desfase del eluyente) en el menú Options (Opciones). Aparecerá el cuadro de diálogo Solvent Delay (Desfase del eluyente). Consultar Figura 4-10.

Durante el periodo de desfase del eluyente no se guarda ningún dato, lo que significa que no aparecerán los picos de eluyente que normalmente aparecerían en el cromatograma TIC.

En las funciones APcI, la temperatura de la sonda de APcI se establece en el valor especificado en el control APcI Probe Temp (Temperatura de la sonda APcI) para el periodo del desfase del eluyente.

Para activar la válvula de desviación/inyector que se utilizará como válvula de desviación, seleccionar Enable Divert Valve (Activar válvula de desviación). De este modo, se desviará el flujo de eluyente durante el periodo de desfase configurado hacia la fuente o en dirección contraria.


Se pueden programar hasta cuatro desfases de eluyente.

Figura 4-10 Cuadro de diálogo Solvent Delay (Desfase del fluido)

4.6.9 Canales analógicos

Se pueden adquirir hasta cuatro canales de datos analógicos que se almacenan con los datos adquiridos del espectrómetro de masas. Los canales analógicos se suelen utilizar para adquirir datos de unidades externas, como los detectores UV, que deben estar conectados a la tarjeta de circuitos impresos de entrada/salida del usuario como se describe en la Sección 1.8, Conexiones del panel posterior.

Al final de cada barrido se realiza una lectura del canal externo que se almacena con los datos del barrido. La resolución del análisis cromatográfico para un canal analógico depende, por tanto, de la velocidad de barrido utilizada en la adquisición de los datos de espectrometría de masas.

Para tener acceso al cuadro de diálogo Analog Data (Datos analógicos) (Figura 4-11):

Seleccionar Analog Data (Datos Analógicos) en el menú Options (Opciones) del cuadro de diálogo Scan Functions (Funciones de barrido).


Figura 4-11 Cuadro de diálogo Analog Data (Datos analógicos)

Para guardar datos procedentes de un canal analógico:

1. Seleccionar las casillas correspondientes al canal requerido.

2. Introducir el texto de descripción de cada canal analógico seleccionado.

Esta descripción se utiliza en el cuadro de diálogo de cromatograma analógico como descripción de los canales. Consultar la MassLynx NT User’s Guide (Guía del usuario de MassLynx NT).

3. Introducir el desfase de tiempo necesario para alinear la señal de la unidad externa con la del espectrómetro de masas.


4.6.10 Memorización y recuperación de una lista de funciones

Para guardar una lista de funciones:

1. Seleccionar Save As (Guardar como) en la lista de funciones del menú File (Archivo).

2. Introducir un nuevo nombre de archivo o seleccionar un archivo existente en la lista que aparece.


Si el archivo ya está en el disco, se pedirá confirmación al usuario para sobrescribir la información existente.

4. Hacer clic en Yes (Sí) para sobrescribir el archivo o en No para seleccionar un nombre distinto.

Cuando se cierra el editor, aparece un mensaje para guardar las listas de funciones modificadas.


Para recuperar una lista de funciones guardada:

1. Seleccionar Open (Abrir) en la lista de funciones del menú File (Archivo).

2. Seleccionar el nombre de la lista de funciones que se desea abrir escribiendo su nombre o seleccionándolo en la lista visualizada.

3. Pulsar Open (Abrir).

4.6.11 Configuración de una función de rango de masas completo

El editor de la función de rango de masas completo, (Figura 4-12) activado al pulsar

o al seleccionar MS Scan (MS Scan) del menú Functions (Funciones), se utiliza para configurar funciones centroides, continuas y MCA.

Figura 4-12 Editor de funciones de rango de masas completo


Masa (relación masa/carga)

Start Mass (Masa inicial) y End Mass (Masa final) especifican las masas a las que comienza y finaliza el barrido. La masa inicial debe ser inferior a la masa final.

Start Time (Tiempo de inicio) y End Time (Tiempo de finalización) especifican el tiempo de retención, en minutos, durante el que se activa la función y se adquieren los datos.

Voltaje de cono

Cuando está seleccionada la opción Use Tune Page (Utilizar página de ajuste), se utiliza el voltaje de cono establecido en la página de ajuste al inicio de la adquisición.

El valor del voltaje del cono no se puede modificar durante la adquisición mediante la escritura de nuevos valores en la pantalla de ajuste, puesto que, durante la adquisición, no se descargan nuevos valores. Esto sólo se puede llevar a cabo realizando la adquisición desde la pantalla de ajuste.

Para aplicar una rampa al voltaje del cono:

Seleccionar Use Cone Voltage Ramp (Utilizar rampa de voltaje de cono) y pulsar CV Ramp (Rampa de voltaje de cono) para activar el cuadro de diálogo Cone Ramp (Rampa de cono). Consultar la Figura 4-13.

Figura 4-13 Cuadro de diálogo Cone Ramp (Rampa de cono)

Estos valores definen un gradiente para el voltaje de cono que se extrapolará para abarcar el rango de masas completo de la función.


Método

Ionization Mode (Modo de ionización) especifica el modo de ionización y la polaridad que se utilizará durante la adquisición.

Data (Datos) especifica el tipo de datos que se adquirirán y se almacenarán en el disco. Existen tres opciones:

• Centroid (Centroide) almacena los datos como picos centroides, de intensidad y masa asignadas. Se guardan los datos de cada barrido.

• Continuum (Continuo). La señal recibida por los componentes electrónicos de la interfaz se almacena periódicamente y permite representar gráficamente la intensidad analógica de los datos en curso de adquisición. Los datos no se convierten en picos centroides, sino que se almacenan en una señal continua para cada barrido.

Debido a que la adquisición de datos se realiza continuamente, incluso cuando no se adquieren picos, los archivos de datos suelen ser mayores que los de los datos centroides.

Sin embargo, también es posible configurar un umbral por debajo del cual no se almacenarán los datos. En función de la naturaleza de los datos adquiridos, estos efectos se pueden ver reducidos considerablemente. El umbral se puede configurar para que los datos que se consideran “ruido” se puedan desechar y mejorar así la velocidad de adquisición de los datos, al tiempo que se reduce el tamaño de los archivos de datos. Para obtener más información sobre la configuración de los umbrales de datos del instrumento, se recomienda consultar “Umbrales de datos”, en la página.

• MCA (análisis multicanal). Los datos MCA se pueden considerar como un “continuo sumado” en el que sólo se almacena un barrido de intensidad acumulada para un experimento específico. A medida que se adquieren los datos del barrido, los datos de intensidad se añaden a los datos acumulados de barridos anteriores.

Una ventaja del MCA es que el ruido aleatorio no se acumula tan rápidamente como en los datos reales y, por tanto, se puede calcular la media de una serie de barridos de forma eficaz. De este modo, se resaltan los datos reales y se mejoran la relación de señal/ruido.

Una ventaja adicional del MCA es que las velocidades de barrido se pueden aumentar y requieren bastante menos espacio de almacenamiento, ya que los datos se escriben en el disco sólo al final de un experimento.

El inconveniente del MCA es que, puesto que sólo hay un barrido, no se puede utilizar para los datos de resolución temporal.

En MCA, Scans to Sum (Barridos a sumar) define el número de barridos que se van a sumar para crear un espectro.


Duración del barrido (s)

Scan Time (Tiempo de barrido) especifica la duración de cada barrido en segundos, mientras que Inter-Scan Delay (Intervalo entre barridos) especifica el tiempo, en segundos, entre la finalización de un barrido y el comienzo de otro. Durante este periodo no se almacenan datos.

Sonda de APcI

Probe Temp (Temperatura de la sonda), en grados centígrados, se activa cuando el modo de ionización se establece en API.

Cuando está seleccionada la opción Use Tune Page Settings (Utilizar los valores programados en la pantalla de ajuste), se utiliza la temperatura de la sonda de APcI establecida en la página de ajuste al inicio de la adquisición. Este control se habilita si el modo de ionización se establece en API.

El valor de la temperatura de la sonda APcI no se puede modificar durante la adquisición mediante la escritura de nuevos valores en la pantalla de ajuste, ya que durante la adquisición no se descargan nuevos valores. Esto sólo se puede llevar a cabo realizando la adquisición desde la pantalla de ajuste.

4.6.12 Configuración de una función SIR

La técnica SIR (monitorización de iones seleccionados) se suele utilizar en situaciones donde sólo interesa monitorizar unas masas específicas. Debido a que la mayor parte del tiempo de adquisición de datos se dedica a estas masas, la técnica es mucho más sensible que un rango de masas completo.

El editor de funciones SIR (Figura 4-14) se utiliza para introducir las masas de interés, junto con los tiempos de residencia, intervalos y tiempos de desfase entre canales.


Figura 4-14 SIR Function Editor (Editor de funciones SIR)

Para configurar una función SIR:

Pulsar o seleccionar SIR en el menú Functions (Funciones).

Muchos de los campos se han descrito anteriormente para el editor de la función Full Scan (Rango de masas completo). A continuación, sólo se describen los campos que difieren.

Channels (Canales)

Se pueden monitorizar hasta 32 masas. Para introducir una masa:

1. Introducir los valores requeridos en las casillas Mass (Masa), Dwell (Residencia) y Cone (Cono).

2. Pulsar Add (Agregar).



Dwell (Residencia) especifica la duración, en segundos, que la masa seleccionada se monitoriza.

Para modificar la configuración existente:

1. Hacer doble clic en una masa de la lista.

Esto muestra los valores de la masa seleccionada en los campos de modificación.

2. Cambiar los valores de la masa, la residencia y del cono, según sea necesario.

3. Pulsar en Change (Cambiar) para actualizar los valores de la lista.

Para clasificar la lista en orden ascendente de masas:

Pulsar Sort (Ordenar).

Method (Método)

Inter Channel Delay (Tiempo de desfase entre canales) determina el tiempo, en segundos, transcurrido entre el final de la monitorización de la masa seleccionada y el principio de la monitorización de la masa siguiente de la función.

Repeats (Repeticiones) sólo es pertinente para los experimentos con más de una función y especifica el número de repeticiones de la función.

Span (Intervalo) especifica una pequeña ventana que aparece en el centro de la masa seleccionada. Durante la adquisición, se realiza un barrido de este intervalo en el tiempo de residencia especificado. Se puede establecer un intervalo de cero para, simplemente, “retener” la masa especificada.

Retention Window (Ventana de retención)

Start (Inicio) y End (Final) especifica el tiempo de retención, en minutos, durante el cual está activa la función.

4.6.13 Configuración de las funciones de barrido MS/MS

Figura 4-15 Editores de funciones de barrido MS/MS

Muchos de los campos de los editores MS/MS son similares a los del editor de la función Full Scan (Rango de masas completo). A continuación, sólo se describen los campos que difieren significativamente.


Mass (Masa)

Daughter (Producto)

Éste es el modo MS/MS que se utiliza con más frecuencia y sirve para observar las fragmentaciones de un ion específico. MS1 se establece en la masa del precursor, mediante Daughters of (Productos de), y no se realiza un barrido.

La resolución de MS1 se puede reducir hasta que la anchura de la base del pico sea de dos masas de ancho y el espectro del producto no contenga iones de las masas de los precursores adyacentes.

Start (Inicio) y End (Fin) especifican el rango de masa que se va a barrer con MS2.

Se puede seleccionar una masa de producto mayor que la del precursor. En este caso, se detectarán los iones que han ganado masa en la cámara de colisión o cuya relación masa/carga es superior. Esto puede ocurrir cuando un ión con varias cargas eléctricas se fragmenta y pierde una carga.

Parent (Precursor)

Este modo se utiliza para buscar el precursor de un fragmento específico.

MS2 se establece en la masa del fragmento, mediante Parents of (Precursores de), y no se realiza un barrido.

Start (Inicio) y End (Fin) especifican el rango de masas en el que se barre MS1. Start (Inicio) normalmente se establece justo por debajo de Parents of (Precursores de) y End (Fin) por encima de la mayor masa de precursor prevista.

Un producto puede provenir de diferentes masas, de modo que cualquier fragmento puede proceder de una serie de picos distintos.

MS2

En este modo MS2 está en resolución, mientras que MS1 transmite iones en un amplio rango de masas. Aunque este modo de barrido se puede utilizar para adquirir datos, se utiliza principalmente en la pantalla de ajuste para configurar y optimizar las condiciones de adquisición.

Neutral Loss (Pérdida de fragmentos neutros)

En este modo, se detecta, en un espectro, el pico correspondiente a la pérdida de fragmentos neutros especificada en Loss of (Pérdida de). MS1 efectúa un barrido de la masa del precursor y MS2 efectúa un barrido de esta masa menos la pérdida de masa de fragmentos neutros. Las masas iniciales se detectan, por lo tanto, en la escala de masas de MS1. Start (Inicio) (de MS1) debería ser superior a Loss of (Pérdida de) para que MS2 disponga de una masa de inicio válida.


Neutral Gain (Ganancia de fragmentos neutros)

Este modo no se utiliza con mucha frecuencia, puesto que la masa seleccionada por MS2 no suele ser superior a la de MS1. Esto es aplicable a estudios en los que un ión precursor gana masa por una reacción ión-molécula o en los que los iones con varias cargas eléctricas se fragmentan en partículas con un valor de relación masa/carga superior.

Collision Energy (Energía de colisión)

Indica la energía de colisión, en electrón-voltios, que se utilizará para la cámara de colisión durante el barrido.

Si se selecciona Use Tune Page Settings (Utilizar los valores programados en la pantalla de ajuste), se utiliza la energía de colisión establecida en la página de ajuste. Si se deben ajustar los valores durante una adquisición, ésta deberá iniciarse desde la página de ajuste.

Para aplicar una rampa a la energía de colisión:

1. Seleccionar Use Collision Energy Ramp (Utilizar rampa de energía de colisión).

2. Pulsar CE Ramp (Rampa de energía de colisión) para activar el cuadro de diálogo Collision Ramp (Rampa de colisión). Consultar la Figura 4-16.

Figura 4-16 Cuadro de diálogo Collision Ramp (Rampa de colisión)

Los cuatro parámetros definen valores de energía de colisión para dos masas concretas. Este gradiente de energía de colisión se extrapola para cubrir todo el rango de masas de la función.


4.6.14 Configuración de una función MRM

Las funciones MRM se configuran de modo similar a las funciones SIR, aunque permiten la monitorización de una serie de transiciones MS/MS (fragmentaciones) entre MS1 y MS2.

Todos los campos del editor de funciones MRM (Figura 4-17) son similares a los ya descritos.

Figura 4-17 MRM Function Editor (Editor de funciones MRM)

4.6.15 Configuración de una función de estudio

Los barridos de estudio se utilizan para buscar iones precursores. Para acceder al cuadro de diálogo:

Pulsar o seleccionar Survey Scan (Barrido de estudio) en el menú Functions (Funciones) en el editor de funciones de barrido.


El editor de la lista de funciones no añade funciones de estudio a la lista si hay funciones que no son de estudio presentes.

4.6.15.1 Páginas de estudio y plantilla MSMS

Las páginas Survey (Estudio) y MSMS Template (Plantillas MSMS) (Figura 4-18) permiten configurar los parámetros para el barrido MS y MS/MS durante el estudio y son similares a las páginas de editores de funciones normales.

Figura 4-18 Páginas Survey (Estudio) y MSMS Template (Plantilla MSMS)


4.6.15.2 Conmutación de MS a MS/MS

Figura 4-19 Página MS to MSMS (MS a MSMS)

Criterio de conmutación

El barrido MS/MS comienza:

• Si la opción TIC está seleccionada y el TIC del espectro rebasa el umbral especificado.

• Si la opción Intensity (Intensidad) está seleccionada y la intensidad del pico mayor rebasa el umbral especificado.


Cuando se localiza el máximo de un pico, no se buscan otros picos en la Detection Window (Ventana de detección) especificada.

Number of Components (Número de componentes) está establecido actualmente en 1 y no se puede modificar. El número de precursores no coeluyentes en un sólo análisis es ilimitado.

Precursor Selection (Selección de precursores)

Si está seleccionada la opción Automatic (Automático) se monitorizan todas las masas válidas que cumplan los criterios de selección.

Si está seleccionada Included masses only (Sólo masas incluidas), sólo se monitorizan las masas de Include List (Lista de inclusión; consultar las secciones siguientes).

Si está seleccionada la opción Included masses and Automatic (Masas incluidas y automático), tendrán prioridad las masas de Include List (Lista de inclusión). Si no se encuentran precursores, se monitorizan otras masas válidas.

Una masa es válida si no se encuentra en Exclude List (Lista de exclusión), (consultar las secciones siguientes) y cumple los criterios de selección de los precursores.

Detected Precursor Inclusion (Inclusión de precursores detectados)

Auto exclude (Exclusión automática) y Always include (Incluir siempre) no están disponibles actualmente.

Si está seleccionada la opción Include after time (Incluir tras el tiempo), siempre se deja un tiempo de incorporación antes de incluir a los precursores.

Data (Datos)

Discard uninteresting survey scans (Descartar barridos de estudios no interesantes) sólo permite el almacenamiento de los barridos de estudio que han detectado iones precursores. Esto ahorra espacio en el disco, ya que los barridos de estudio que contienen datos irrelevantes se rechazan.


4.6.15.3 Conmutación de MS/MS a MS

Figura 4-20 Pantalla MSMS to MS (MSMS a MS)

Una vez generadas las funciones MS/MS, se llevarán a cabo de forma paralela hasta que se den las condiciones ideales para el paso a MS.

Una vez interrumpidas todas las funciones MS/MS, se volverá a llevar a cabo la función de estudio MS.


Método de conmutación

Si el método de conmutación de MS/MS a MS es Default (Predeterminado), la función MS/MS se detiene cuando se cumplen los criterios de conmutación de MS/MS a MS.

Si el método de conmutación de MS/MS a MS está configurado en After Time (Tras el tiempo), la función MS/MS se detiene cuando se cumplen los criterios de conmutación de MS/MS a MS o cuando ha transcurrido el tiempo especificado.

Criterio de conmutación

Para definir el momento en el que se reanuda el barrido de MS:

1. Seleccionar una de las tres condiciones.

2. Establecer Threshold (Umbral) en un valor apropiado.


4.6.15.4 Inclusión y exclusión de masas

Figura 4-21 Página Include/Exclude Masses (Incluir/excluir masas)

Los rangos de masas y las masas individuales que se van a incluir o excluir de los barridos MS/MS se introducen en los cuadros Range (Rango) relevantes.

Las masas incluidas en la lista de exclusión no se tienen en cuenta para la detección.

Los rangos presentan el formato masaX_masaY.

Las masas y los rangos de una lista se delimitan mediante comas, por ejemplo, 100_200,202,236,250_300.


4.6.15.5 Monitorización de adquisiciones

Cuando se inicie una adquisición, se abrirá el cuadro de diálogo Function Switching Status (Estado de conmutación de las funciones) con los precursores que se están analizando actualmente. Consultar Figura 4-22.

Figura 4-22 Cuadro de diálogo Function Switching Status (Estado de conmutación de las funciones)


Capítulo 5Calibrado de masas

Figura 5-1 Calibrado de masas

99

5.1 Introducción

Este capítulo se divide en tres secciones:

• Una breve descripción general del proceso de calibrado.

• Un calibrado de masas completo de Quattro micro API en modo de ionización por electrospray con una mezcla de yoduro de sodio y yoduro de rubidio como compuesto de referencia.

• Un calibrado de masas completo de Quattro micro API mediante ionización química a presión atmosférica (APcI) con polietilenglicol (PEG) como compuesto de referencia.

Consultar el Capítulo 8, Información de referencia para obtener información sobre las soluciones de calibrado y su preparación.


MassLynx NT permite realizar calibrados de masas totalmente automáticos, con modos de adquisición estática y de barrido para el instrumento, así como diversos rangos de masas y velocidades de barrido.

Mediante este sistema se adquiere el espectro de masa de un compuesto de referencia (un archivo de calibrado) y posteriormente se compara con una tabla de masas previstas de los picos del compuesto de referencia, que se conservan en un archivo. Las diferencias de masas entre los picos de referencia y los de calibrado son los puntos de calibrado. Posteriormente se traza una curva entre los puntos de calibrado.

Se calcula asimismo la distancia vertical de cada punto de calibrado a la curva. Esta distancia representa la diferencia de masa restante (o residual) una vez realizado el calibrado.

También se calcula la desviación típica de los residuos. Esta cifra es el mejor indicador de exactitud del calibrado.

100 Calibrado de masas

5.2.1 Tipos de calibrado

Cada analizador de masas cuadrupolo precisa un máximo de tres curvas de calibrado:

• Una curva de calibrado estático para “detener” con precisión el detector en una masa de interés específica (por ejemplo, en el ajuste, en SIR y en MRM).

• El calibrado de barrido permite realizar una medición de masa precisa de los picos obtenidos en una adquisición de barrido.

• Un calibrado de compensación de velocidad de barrido compensa el tiempo de desfase en el sistema cuando se realiza un barrido rápido del instrumento.

Para cada tipo de calibrado elegido se adquiere un espectro de masa independiente del compuesto de referencia.

Quattro micro API requiere estos tres calibrados tanto para MS1 como para MS2, por lo que se genera un máximo de seis curvas de calibrado. La Tabla 5-1 muestra los tipos de calibrado necesarios para ciertas clases de análisis.

5.2.2 El proceso de calibrado

• Ajustar el detector.

• Seleccionar el archivo de referencia adecuado para la muestra de referencia que se va a utilizar.

• Iniciar un calibrado automático.

• Revisar el informe del calibrado.

Tabla 5-1 Requisitos de calibrado

AnálisisTipo de calibrado necesario

MS1 MS2

MS Todos -

SIR Estático -

MS/MS Todos Todos

MRM Estático Estático


5.3 Electrospray

5.3.1 IntroducciónUna vez concluido el calibrado, se pueden adquirir datos de cualquier rango de masas dentro del intervalo calibrado. Por lo tanto, se recomienda realizar el calibrado de un rango de masas amplio.

El calibrado de todo el rango de masas del instrumento se puede realizar con una mezcla de yoduro de sodio y yoduro de rubidio.

Figura 5-2 Espectro del yoduro de rubidio

5.3.2 Preparación para el calibrado

5.3.2.1 Introducción del compuesto de referencia

En este ejemplo se describe un calibrado automático que exige que el compuesto de referencia esté presente durante algunos minutos. La introducción óptima del compuesto de referencia se consigue utilizando la bomba de jeringa del instrumento:

1. Rellenar la bomba con la solución de referencia. Consultar la Sección 2.3, Instalación de la bomba de jeringa.

2. Conectar la bomba a la sonda del electrospray con tubos de sílice fundida.

3. Ajustar la bomba a un caudal de 10 µl/min.


5.3.2.2 Ajuste

Antes de comenzar el calibrado, y con la solución de referencia introducida en la fuente:

1. Ajustar el multiplicador a 650 V.

2. Ajustar los parámetros de la fuente para conseguir una forma y una intensidad óptimas de los picos.

3. Ajustar los parámetros de resolución y de energía iónica de la resolución de la unidad de masa en MS1 y en MS2.

Obtención de una buena distribución de los picos a lo largo de todo el rango de masas:

1. Ajustar la intensidad de algunos de los picos de referencia por encima de 1000 uma.

2. Ajustar la intensidad del pico a la relación masa/carga 173.

3. Comprobar que en la página de ajuste no hay ningún pico saturado con una ganancia de 1. Si es necesario, reducir el multiplicador o diluir la muestra.

Suele ser adecuado un voltaje del cono próximo a 45.

5.3.2.3 Parámetros de umbral del instrumento

Antes de iniciar el procedimiento de calibrado, es necesario revisar ciertos parámetros del instrumento.

En la mayoría de los calibrados de rango de masa bajo, los datos de calibrado se adquieren en modo continuo.

El uso de velocidades de barrido adecuadas requiere ajustar correctamente los parámetros de los datos del continuo:

1. En la página de ajuste del instrumento, seleccione Options (Opciones) y después Set Instrument Threshold (Ajuste del umbral del instrumento) para abrir el cuadro de diálogo Instrument Threshold Settings (Configuración de los umbrales del detector). Consultar la Figura 5-3.

Electrospray 103

Figura 5-3 Cuadro de diálogo Instrument Threshold Settings (Configuración de los umbrales del detector)

2. En la sección Profile Data (Datos del perfil), ajustar el valor de Baseline Level (Nivel de la línea de base) a 0 y el de Points per Dalton (Puntos por Dalton) a 16.

3. Ajustar según corresponda los valores de Ion Counting Threshold (Umbral de recuento de iones) y de Spike Removal (Eliminación de aumentos bruscos en el ruido). Consultar la Sección 4.3, Umbrales de datos del instrumento.

4. Elegir OK (Aceptar) para guardar los parámetros.


5.3.3 Opciones de calibrado

Para tener acceso al cuadro de diálogo Calibration Options (Opciones de calibrado) (Figura 5-4):

Elegir Calibration (Calibrado) y después Calibrate Instrument (Calibrar instrumento) en la página de ajuste.

Figura 5-4 Cuadro de diálogo Calibration Options (Opciones de calibrado)

5.3.3.1 Selección del archivo de referencia

Para elegir el archivo de referencia adecuado:

1. Hacer clic en la flecha del cuadro Reference File (Archivo de referencia) y desplazarse por los archivos.

2. Elegir nairb.ref si se desea utilizar una solución de referencia de yoduro de sodio y yoduro de rubidio.

Electrospray 105

5.3.3.2 Eliminación de los calibrados actuales

Para eliminar el calibrado actual:

1. Elegir default.cal en la opción del menú Calibrate (Calibrar).

2. Guardar los cambios realizados en el archivo default.cal.

3. Comprobar que no existe ningún calibrado anterior asociado a default.cal.

De este modo, se garantiza que no hay ningún archivo con calibrados activo en el instrumento y se evita que se modifiquen o reemplacen los calibrados que se guardaron anteriormente.

5.3.4 Selección de parámetros

Antes de iniciar un calibrado, se deberán configurar varios parámetros. Los parámetros predeterminados se establecen cuando se carga el software al principio, con lo que generalmente se consigue un calibrado adecuado, pero en determinadas condiciones puede ser necesario reajustarlos.

5.3.4.1 Comprobación del calibrado automático

Al cuadro de diálogo Automatic Calibration Check (Comprobación del calibrado automático) (Figura 5-5) se tiene acceso desde Edit (Modificar), AutoCal Check Parameters (Parámetros de la comprobación del calibrado automático).

Figura 5-5 Cuadro de diálogo Automatic Calibration Check (Comprobación del calibrado automático)


Este cuadro de diálogo permite especificar unos límites para poder calibrar el instrumento correctamente. Se pueden configurar dos parámetros de usuario:

• Missed Reference Peaks (Picos de referencia no encontrados) indica el número máximo permitido de picos consecutivos no encontrados cuando se compara el espectro de referencia con el adquirido en el calibrado. El calibrado no será válido si se supera este número. El valor predeterminado para este parámetro, 2, suele ser adecuado en casi todos los casos.

• El valor de Maximum Std Deviation (Desviación típica máxima) se suele situar en 0.20. Para cada par de picos encontrados, durante el calibrado se calcula la diferencia entre la masa medida del archivo de calibrado y la masa real que aparece en el archivo de referencia. El calibrado no será válido si la desviación típica de la diferencia entre las dos masas supera el valor establecido. Al disminuir el valor de la desviación típica, el límite será más riguroso. El aumento de este valor implica que los requisitos serán de más fácil cumplimiento. Sin embargo, también es posible que se realicen correspondencias incorrectas entre los picos. No se deberían utilizar valores superiores a 0.20, a menos que se den condiciones excepcionales.

Siempre se deberá seleccionar Apply Span Correction (Aplicar corrección de barrido). Esto permite el barrido de diferentes rangos de masas del intervalo calibrado sin que ello afecte a la asignación de masas.

Si se activa Check Acquisition Calibration Ranges (Comprobar intervalos de calibrado en la adquisición), aparecerán varios mensajes de aviso al intentar adquirir datos fuera del intervalo calibrado de masas y de velocidad de barrido. Se recomienda dejar esta opción seleccionada.

5.3.4.2 Parámetros de calibrado

Si se elige Edit (Modificar), Calibration Parameters (Parámetros de calibrado), se abre el cuadro de diálogo Calibration Parameters (Parámetros de calibrado). Consultar la Figura 5-6.

Electrospray 107

Figura 5-6 Cuadro de diálogo Calibration Parameters (Parámetros de calibrado)

Los parámetros de la sección Peak Match (Correspondencia de picos) determinan los límites dentro de los que deben estar los datos adquiridos para que el software pueda reconocer las masas y llevar a cabo un calibrado satisfactorio. Los valores predeterminados aparecen en la Figura 5-6.

Si se aumentan los valores de Peak window (Ventana del pico) e Initial error (Error inicial), aumentan las posibilidades de que se produzcan discrepancias en los picos. Los picos del espectro adquirido que se encuentren por debajo del valor de Intensity Threshold (Umbral de intensidad) (medido como porcentaje del pico más intenso del espectro) no se tendrán en cuenta en el proceso de calibrado.

El orden polinómico de la curva tiene valores del 1 al 5 como opciones disponibles:

• No deben utilizarse órdenes polinómicos de 1.

• Un orden de 2 es adecuado para rangos de masas amplios en el extremo superior de la escala de masas y para calibrar con picos de referencia muy separados. El yoduro de sodio, en concreto, tiene picos muy espaciados (a una distancia de 150 uma), y para calibrar rangos de masas más elevados se utiliza mioglobina de corazón de


caballo. Por lo tanto, este es el orden polinómico recomendado para estos calibrados.

• Un orden de 3 asigna una curva de tercer grado al calibrado.

• El cuarto se usa para calibrados con los rangos de masas más reducidos y picos de referencia próximos. Esta opción sería adecuada para calibrados con PEG y una masa inferior a 300 uma.

• El orden 5 no supone prácticamente ninguna mejora con respecto a un polinomio de cuarto orden.

5.3.4.3 Parámetros de medida de las masas

Si se elige Edit (Modificar), Mass Measure Parameters (Parámetros de medida de las masas), se abre el cuadro de diálogo Mass Measure (Medida de las masas). Consultar la Figura 5-7.

Figura 5-7 Cuadro de diálogo Mass Measure (Medida de las masas)

Electrospray 109

Si se adquieren datos continuos o de MCA para el calibrado, estos parámetros deberán configurarse antes de realizar el calibrado. Si se utilizan datos centroides para el calibrado, no se utilizarán parámetros de medida de masas.

En los calibrados por electrospray, en especial con el yoduro de sodio, que presenta picos de baja intensidad en masas elevadas, se recomienda la adquisición de datos continuos o MCA.

Es importante que los datos estén bien suavizados y que la anchura del pico a mitad de altura (PWHH) se introduzca en los parámetros de suavizado, tal como se muestra en la Figura 5-7.

En velocidades de barrido elevadas, es probable que la resolución del instrumento disminuya. Comprobar que los parámetros para análisis centroides estén configurados para poder utilizar la parte superior del pico, de manera que la asignación de masas de los picos sea precisa.

5.3.5 Realización de un calibrado

MassLynx permite realizar tres tipos de calibrado:

• Static Calibration (Calibrado estático)

• Scanning Calibration (Calibrado de barrido)

• Scan Speed Compensation (Compensación de velocidad de barrido)

El tipo de calibrado se elige en el cuadro de diálogo Automatic Calibration (Calibrado automático) (consultar la Figura 5-8), que se abre mediante la opción Start (Inicio) del cuadro de diálogo Calibrate (Calibrar).


Figura 5-8 Cuadro de diálogo Automatic Calibration (Calibrado automático)

Se recomienda realizar los tres tipos de calibrado para poder modificar los rangos de masas y las velocidades de barrido al tiempo que se mantienen las asignaciones de masas correctas. Sin embargo, se puede realizar cualquier combinación de los siguientes calibrados:

• Si solamente se realiza el calibrado estático, el detector queda calibrado para adquisiciones en las que los cuadrupolos se limitan a una masa única (como SIR o MRM).

• Si solamente se realiza un calibrado de barrido, el aparato estará calibrado únicamente para barridos con una velocidad y un rango de masas idénticos a los que se utilizaron en el calibrado.

• Si solamente se realiza una compensación de velocidad de barrido (sin calibrado de barrido), la compensación de velocidad de barrido se interpreta como un calibrado de barrido y el detector queda calibrado solamente para adquisiciones de barridos con el mismo rango de masas y velocidad que los utilizados en el calibrado.

Electrospray 111

Para utilizar correctamente la compensación de velocidad de barrido también debe hacerse un calibrado de barrido.

• Si se realizan calibrados estáticos y de barrido, el instrumento se calibrará para adquisiciones donde el cuadrupolo esté ajustado para una masa única, o bien para un rango de masas que esté comprendido en el rango de masas del calibrado de barrido, siempre y cuando la velocidad de barrido sea la misma.

Por ejemplo, si se calibra el instrumento para relaciones de masa/carga de 100 a 900 con un barrido de 2 s (400 uma/s), se pueden adquirir datos entre 100 y 500 uma con un tiempo de barrido de 1 segundo (y también a 400 uma/s) manteniendo las asignaciones de masas correctas. En este caso, el calibrado estático determinaría la masa inicial para la adquisición y el calibrado de barrido determinaría las masas y el intervalo de barrido.

• Si se realizan el calibrado de barrido y la compensación de velocidad, el instrumento estará calibrado solamente para adquisiciones de barrido dentro del rango de masas utilizado en el calibrado. La velocidad de barrido se puede cambiar, siempre y cuando se mantenga en las velocidades utilizadas para ambos calibrados. Sin embargo, no se puede cambiar el rango de masas, ya que no hay un calibrado estático para localizar la masa inicial.

• Si se realizan los tres tipos de calibrado se pueden utilizar todos los tipos de adquisiciones, siempre y cuando el rango de masas y la velocidad de barrido permanezcan dentro de los límites superior e inferior utilizados en el calibrado de barrido y en la compensación de velocidad de barrido.

Para realizar un calibrado completo:

1. Activar las casillas del área Types (Tipos) del cuadro de diálogo situadas junto a Static Calibration (Calibrado estático), Scanning Calibration (Calibrado de barrido) y Scan Speed Compensation (Compensación de velocidad de barrido).

2. Activar las casillas MS1 y MS2.

3. En la zona Process (Proceso) del cuadro de diálogo, activar Acquire & Calibrate (Adquirir y calibrar) y Print Report (Imprimir informe).


5.3.5.1 Parámetros de adquisición

Hacer clic en el cuadro de diálogo Acquisition Parameters (Parámetros de adquisición) en el cuadro de diálogo Automatic Calibration (Calibrado automático) para abrir el cuadro de diálogo Calibration Acquisition Setup (Configuración de la adquisición del calibrado) (consultar la Figura 5-9), en el que se configuran los rangos de masas, las velocidades de barrido y el modo de adquisición. La primera vez que se abre este cuadro aparecen parámetros predeterminados de acuerdo con el archivo de referencia elegido. Estos parámetros predeterminados muestran los límites del intervalo y de la velocidad de barrido de los parámetros de calibrado y el aparato seleccionados.

Figura 5-9 Cuadro de diálogo Calibration Acquisition Setup (Configuración de la adquisición del calibrado)

En la zona superior Acquisition Parameters (Parámetros de adquisición) se configuran el rango de masas, el tiempo de análisis y el tipo de datos.

Cuando el aparato está totalmente calibrado, se puede utilizar cualquier rango de masas o cualquier velocidad de barrido, siempre que se encuentren dentro de los límites fijados en el calibrado.

Seleccionar el archivo nairb.ref.

Electrospray 113

La solución que se describe en el Capítulo 8, Información de referencia se puede aplicar a este archivo.

Si se utilizan archivos de referencia y soluciones de referencia compatibles, basta con elegir Default (Predeterminado); no es necesario introducir parámetros manualmente.

Run Duration (Duración del análisis) especifica el tiempo que se invierte en la adquisición de datos para cada fase del calibrado. Debe ser suficiente para efectuar un mínimo de tres barridos a la velocidad más lenta que se utilice. Si el valor de Run Duration (Duración del análisis) es demasiado breve, no se adquirirán datos. La velocidad más lenta suele ser 100 uma/s. Cuando se fija Scan From (Barrido desde) en 20 uma y Scan To (Barrido hasta) en 2000 uma, se necesita un tiempo de barrido de 19,8 segundos, y el valor de Inter Scan Delay (Tiempo de descanso entre barridos) (en la parte inferior del cuadro de diálogo) que se suele emplear es de 0,1 segundos. Por tanto, la duración del análisis debe ser mayor de 59,6 segundos (para 3 barridos y 2 descansos entre barridos). Lo adecuado será situar Run Duration (Duración del análisis) en 1,00 minuto.

Scan Parameters (Parámetros de barrido) se encuentra en la zona inferior del cuadro de diálogo Calibration Acquisition Setup (Configuración de la adquisición del calibrado).

Cuando un aparato adquiere datos para un calibrado estático, examina el archivo de referencia para buscar las masas de referencia que cabe esperar y adquiere datos de un pequeño intervalo de masas alrededor de la posición prevista para cada pico. Por tanto, los datos adquiridos no contienen barridos continuos. Cada espectro contiene pequeñas regiones de datos adquiridos alrededor de cada pico, separadas entre sí por otras de las que no se han adquirido datos.

Static Span (Intervalo estático) determina el tamaño de esta pequeña zona de barrido alrededor de cada pico de referencia. Lo habitual es un intervalo de 4,0 uma.

Static Dwell (Duración del análisis estático) determina cuánto tiempo se invierte en la adquisición de datos dentro del intervalo. Un valor adecuado sería 0,1 s.

Slow Scan Time (Tiempo de barrido lento) determina la velocidad de barrido utilizada para el calibrado. Si se va a realizar un calibrado de barrido y una compensación de la velocidad de barrido, entonces dicha velocidad de barrido debería ser aproximadamente de 100 uma/s (un tiempo de barrido de 19,8 s para un rango de masas entre 20 y 2000 uma). Si solamente se va a realizar un calibrado de barrido (sin compensación de la velocidad de barrido), entonces la velocidad de barrido debería ser la que se vaya a utilizar en las adquisiciones futuras.


Fast Scan Time (Tiempo de barrido rápido) determina la velocidad utilizada en la compensación de la velocidad de barrido, así como la velocidad máxima que se utilizará en las adquisiciones futuras. En la mayoría de los casos se puede utilizar un tiempo de barrido rápido de 4000 uma/s. Un intervalo de barrido entre 20 y 1100 uma requiere un tiempo de barrido rápido de 0,26 s y un tiempo de descanso entre barridos de 0,1 s. Es necesario modificar los valores de Acquisition Setup (Configuración de la adquisición) para realizar el calibrado dentro del rango de masas deseado.

Seleccionar OK (Aceptar) para regresar al cuadro de diálogo Automatic Calibration (Calibrado automático). Si se necesita otro intervalo de calibrado, deberán introducirse los valores correspondientes.

5.3.5.2 Inicio del proceso de calibrado

Para comenzar el proceso de calibrado:

Elegir OK (Aceptar) en el cuadro de diálogo Automatic Calibration (Calibrado automático).

El instrumento realizará la adquisición de todos los archivos de calibrado programados en el mismo orden y con los nombres del archivo de datos de la Tabla 5-2.

Una vez adquiridos todos los datos, cada archivo de datos se combina con los demás para generar un único espectro que después se compara con el de referencia para obtener un calibrado. Este proceso tiene lugar en el mismo orden que se muestra en la Tabla 5-2. Si se abre el cuadro de diálogo general de calibrado, aparecerá un mensaje de estado del proceso que se actualizará constantemente.

Tabla 5-2 Orden del calibrado y archivos de datos

Calibrado Archivo de datos

MS1 static (Estático MS1) STATMS1

MS1 scanning (Barrido MS1) SCNMS1

MS1 scan speed compensation (Compensación de velocidad de barrido MS1)

FASTMS1

MS2 static (Estático MS2) STATMS2

MS2 scanning (Barrido MS2) SCNMS2

MS2 scan speed compensation (Compensación de velocidad de barrido MS2)

FASTMS2

Electrospray 115

Una vez finalizado el proceso, si los datos estadísticos del calibrado reúnen los requisitos de los parámetros de calibrado elegidos, aparecerá un mensaje para indicar que el calibrado se ha realizado satisfactoriamente. Se imprimirá un informe con una curva para cada uno de los procesos de calibrado.

Para que la adquisición se pueda utilizar, se deberá guardar con un nombre de archivo adecuado.

5.3.6 Comprobación del calibrado

El proceso de calibrado (se lleve a cabo con éxito o no) se puede ver con más detalle mediante la función Process (Proceso), Calibration From File (Calibrado desde el archivo) en el cuadro de diálogo Calibration (Calibrado). Se abrirá el cuadro de diálogo (Figura 5-10) que permite ver el tipo de calibrado elegido. Una vez elegido el calibrado en cuestión, se abrirá automáticamente el archivo de calibrado correspondiente.

Figura 5-10 Cuadro de diálogo Scanning Calibration (Calibrado de barrido)

Hacer clic en Browse (Explorar) para elegir el archivo de datos de calibrado (por ejemplo, STATMS1, SCNMS1, FASTMS1, STATMS2, etc.). El archivo seleccionado deberá proceder del proyecto adecuado.


Si se hace clic en OK (Aceptar), se repite el proceso de calibrado para ese archivo específico y aparece un informe de calibrado (consultar la Figura 5-11).

Figura 5-11 Informe de calibrado

Electrospray 117

El informe del calibrado consta de cuatro pantallas:

• El espectro adquirido.

• El espectro de referencia.

• Una representación de la diferencia de masas en función de la masa (curva de calibrado).

• Una representación de los errores residuales en función de la masa.

Para ampliar una zona, se puede hacer clic en ella y arrastrarla con el botón izquierdo del ratón. De este modo, los picos menos intensos del espectro se pueden examinar para verificar que se obtienen los picos adecuados. Los picos del espectro adquirido que se corresponden con un pico del de referencia aparecen resaltados en un color diferente.

5.3.6.1 Fallos en el calibrado

Si las estadísticas del calibrado no reúnen los requisitos establecidos, aparecerá un mensaje donde se indica en qué punto y por qué ha fallado el calibrado. En este mensaje también se indicará dónde se pueden ver los datos del intento de calibrado para averiguar el motivo exacto del fallo. Consultar la Figura 5-12.

Figura 5-12 Mensaje Calibration Failure (Fallos en el calibrado)

Existen diversos motivos por los que pueden producirse fallos en el calibrado:

No aparece ningún pico

Si el archivo de datos del calibrado no contiene picos, el calibrado no será válido. Esto puede deberse a lo siguiente:

• No hay compuesto de referencia.

• No hay flujo de fluido en la fuente.

• El multiplicador está muy bajo.


Se han perdido demasiados picos consecutivos

Si su número es superior al valor establecido en el campo Missed Reference Peaks (Picos de referencia no encontrados) de Automatic Calibration Check (Comprobación del calibrado automático), entonces el calibrado no se realizará satisfactoriamente. Los picos pueden no encontrarse por diferentes motivos:

• La solución de referencia se está agotando y los picos menos intensos no se pueden detectar.

• El multiplicador está tan bajo que no se detectan los picos menos intensos.

• Se ha elegido un modo de ionización incorrecto. Compruebe que los datos se han adquirido con Ion Mode (Modo de ionización) en la posición ES+.

Se puede calibrar con el electrospray en modo de ionización negativo si se utiliza el archivo de referencia naineg.ref con una solución de referencia adecuada.

• El valor de Intensity threshold (Umbral de intensidad) en el cuadro de diálogo Calibration Parameters (Parámetros del calibrado) es demasiado alto. Los picos se encuentran en el archivo de calibrado adquirido, pero se han omitido por encontrarse por debajo del umbral.

• Los valores de Initial error (Error inicial) o de Peak window (Ventana del pico) que se encuentran en el cuadro de diálogo Calibration Parameters (Parámetros del calibrado) son demasiado pequeños. Los picos del calibrado se encuentran fuera de los límites establecidos por estos parámetros.

• Se ha superado el valor de Maximum Std Deviation (Desviación estándar máxima) elegido en el cuadro de diálogo Automatic Calibration Check (Comprobación del calibrado automático).

• Se ha elegido un archivo de referencia incorrecto. Comprobar que se ha seleccionado el archivo correcto (en este caso, nairb.ref) en el cuadro de diálogo Calibrate (Calibrar).

En caso de que falten demasiados picos consecutivos:

• Examinar el informe de calibrado en pantalla para comprobar si los picos no encontrados se encuentran en el archivo de calibrado adquirido.

• Si los picos no están presentes, lo más probable es que el fallo se deba a los tres motivos descritos en el apartado “No aparece ningún pico”.

• Si los datos contienen los picos, pero no son reconocibles en el calibrado, se deberá seguramente a cualquiera de las cuatro últimas causas (apartado “Se han perdido demasiados picos consecutivos”).

Electrospray 119

Una vez tomadas las medidas necesarias, se deberá hacer lo siguiente:

1. Si los valores de Intensity threshold (Umbral de intensidad), Initial error (Error inicial) y Peak window (Ventana del pico) se han ajustado para obtener un buen calibrado, comprobar el informe de calibrado en pantalla para comprobar que se han encontrado los picos correctos.

Si se establece un umbral muy bajo e intervalos demasiado amplios para Initial error (Error inicial) y Peak window (Ventana del pico), es posible que el calibrado se considere “válido” aunque se hayan seleccionado los picos incorrectos. Esto puede ocurrir sobre todo en los calibrados con PEG, donde puede haber picos muy próximos correspondientes a PEG+H+, PEG+NH4+, PEG+Na+, así como especies con doble carga.

2. Hacer clic en OK (Aceptar) en la ventana del informe de calibrado para aceptar el calibrado nuevo, o bien hacer clic en Cancel (Cancelar) para guardar el calibrado anterior.

5.3.6.2 Calibrado incorrecto

Si se utilizan los parámetros de calibrado recomendados y se han adquirido unos datos de calibrado correctos, el instrumento debería estar calibrado correctamente. Sin embargo, en algunas circunstancias es posible que se cumplan los criterios de calibrado y no se hayan identificado los picos correctos. Aunque este caso sea poco frecuente, siempre es recomendable revisar el informe de calibrado que aparece en pantalla para asegurarse de que se han encontrado los picos adecuados. Esto puede ocurrir cuando se adjudican los valores siguientes a los parámetros:

• El umbral de intensidad asignado es igual a 0.

• El error inicial es demasiado elevado (»2.0).

• El segmento del pico es demasiado elevado (»1.5).

• El valor asignado a la desviación típica máxima es demasiado elevado (»0.2).

El calibrado será correcto si el espectro obtenido es como el de referencia y aparecen resaltados todos los picos esperados.


Otra causa posible de calibrados incorrectos pueden ser los picos contaminantes o picos de fondo. Si un pico contaminante o de fondo se encuentra en uno de los segmentos de los picos encontrados y su intensidad es mayor que la del pico de referencia de ese segmento, entonces el pico seleccionado es incorrecto. En algunas circunstancias, esto puede suceder en el análisis de PEG. Existen dos maneras de contrarrestar este efecto:

• Si el pico de referencia está más cerca del centro del segmento del pico, dicho segmento se podrá estrechar hasta que se excluya el pico de contaminación. Comprobar que no se excluye ningún otro pico de referencia.

• Si el pico de referencia no está cerca del centro del segmento o si al estrechar el segmento se eliminan otros picos de referencia, modificar el calibrado de forma manual.

5.3.6.3 Modificación manual de la correspondencia de picos

Si se ha encontrado un pico incorrecto en el proceso de calibrado, este pico se puede eliminar manualmente del informe de calibrado en pantalla mediante estos pasos:

1. Con el ratón, situar el cursor sobre el pico del espectro de referencia y hacer clic con el botón derecho.

2. Situar el cursor sobre el pico del espectro adquirido y hacer clic con el botón derecho del ratón.

El pico se eliminará y dejará de aparecer resaltado.

Si está presente el pico de referencia verdadero, se puede incluir en el calibrado del modo siguiente:

Situar el cursor sobre el pico deseado y hacer clic con el botón derecho del ratón.

El pico se comparará con el más próximo del espectro de referencia.

La modificación manual de un pico no tiene por qué afectar al resto de los picos del calibrado.

5.3.6.4 Almacenamiento del calibrado

Si el instrumento está completamente calibrado, este proceso deberá guardarse en un archivo para poder aplicarlo y recuperarlo en el futuro.

El calibrado que se recupera tiene las mismas restricciones de rango de masas y velocidad que el original. También se conservan los parámetros de energía iónica y de resolución, ya que pueden afectar a las asignaciones de masas.

Electrospray 121

5.3.6.5 Verificación

Una vez llevado a cabo el calibrado completo de un instrumento, no siempre es necesario volver a repetirlo en la siguiente ocasión en que se utilice el instrumento. En su lugar, se puede llevar a cabo una verificación del calibrado. (La verificación individual de los calibrados no supone ninguna ventaja; el recalibrado tarda el mismo tiempo en realizarse.)

Si se va a adquirir un barrido y desea comprobarse el calibrado:

1. Configurar el instrumento y abrir el cuadro de diálogo de calibrado como si se fuera a realizar un calibrado completo.

2. Establecer todos los parámetros que coinciden con los picos en los valores utilizados para el calibrado.

3. Abrir el cuadro de diálogo Automatic Calibration (Calibrado automático) (Figura 5-13) mediante la función Start (Inicio) del cuadro de diálogo Calibrate (Calibrar).

Figura 5-13 Cuadro de diálogo Automatic Calibration (Calibrado automático)


4. Seleccionar Scanning Calibration (Calibrado de barrido) y desactivar Static Calibration (Calibrado estático) y Scan Speed Compensation (Compensación de velocidad de barrido).

5. Desactivar Acquire & Calibrate (Adquirir y calibrar) y elegir Acquire & Verify (Adquirir y verificar) y Print Report (Imprimir informe).

6. Elegir MS1 o MS2 de acuerdo con el tipo de adquisición que se vaya a realizar.

7. Elegir Acquisition Parameters (Parámetros de adquisición) para que se abra el cuadro de diálogo Calibration Acquisition Set-up (Configuración de la adquisición del calibrado).

Los parámetros introducidos deben ser idénticos a los utilizados en el calibrado original que se va a verificar.

8. Situar Scan From (Barrido desde), Scan To (Barrido hasta), Run Duration (Duración del análisis), Data Type (Tipo de datos), Scan Time (Tiempo de barrido) e Inter Scan Delay (Tiempo de descanso entre barridos) en los valores que se vayan a utilizar para la adquisición de datos.

Si sólo se elige Scanning Calibration (Calibrado de barrido), no se podrá acceder a ninguna de las demás opciones de este cuadro de diálogo.

9. Hacer clic en OK (Aceptar) para regresar al cuadro de diálogo anterior y volver a hacer clic en OK (Aceptar) para empezar el proceso de verificación.

Se realizará la adquisición de barrido. Una vez finalizado el proceso, los datos se combinan para obtener un único espectro que se compara con el archivo de referencia. Se genera una curva de calibrado y se imprime un informe similar al del calibrado original.

A diferencia del procedimiento de calibrado inicial, el calibrado del instrumento no se modifica y el informe impreso sirve como verificación. Consultar la Figura 5-14.

Electrospray 123

Figura 5-14 Informe de verificación típico

5.3.7 Calibrado del electrospray con PEG

Es necesario tener cuidado al calibrar con PEG en el modo de electrospray debido al número de picos que se producen. Aunque se agregue acetato amónico a la solución de referencia de PEG para producir iones [M+NH4]+, en determinadas circunstancias es bastante habitual encontrar [M+H]+, [M+Na]+ e iones con carga doble.


El espectro que aparece en la Figura 5-15 demuestra cómo los iones de carga doble pueden dominar el espectro de PEG (en este caso, [M+2NH4]2+) si se eligen las condiciones equivocadas. En este caso, la concentración de acetato amónico en la solución de referencia es excesiva (la cantidad máxima de acetato amónico que debe emplearse es de 5 mmol) y el valor de Cone (Cono) es demasiado bajo.

Figura 5-15 Espectro del PEG con electrospray

El uso de una tensión baja en el cono favorece la producción de iones con carga doble. La tensión debe situarse como mínimo en 35 V.

Se pueden identificar picos con carga doble debido a que entre los picos de los isótopos 13C y 12C sólo hay 0,5 Da/e. Si el instrumento está configurado con unidad de masa y se obtienen los datos en modo continuo, los picos con doble carga aparecerán más amplios, ya que los isótopos no tendrán resolución.

Electrospray 125

5.4 Ionización química a presión atmosférica (APcI)

5.4.1 Introducción

En esta sección se describe el proceso completo de calibrado de masas de Quattro micro API mediante ionización química a presión atmosférica. Los procedimientos que se describen a continuación sólo deben realizarse una vez leída la Sección 5.3, Electrospray, donde se describe el calibrado automático con ionización por electrospray.

Debido a los elevados caudales que se utilizan en la APcI, el tiempo de residencia de una inyección de solución de referencia en la fuente es demasiado breve como para permitir un calibrado completamente automático, de manera que el procedimiento debe realizarse en varias etapas.

El compuesto de referencia recomendado para la APcI es una solución de polietilenglicol (PEG) con acetato amónico. Consultar el Capítulo 8, Información de referencia para obtener más datos sobre cómo preparar la solución de referencia. La Figura 5-16 muestra un espectro típico del PEG + NH4+.

Cuando se utiliza polietilenglicol, el intervalo de calibrado posible depende de la distribución de peso molecular de los polietilenglicoles utilizados en la solución de referencia. En este ejemplo se han utilizado polietilenglicoles entre PEG 200 y PEG 1000.


Ionización química a presión atmosférica (APcI) 127

Figura 5-16 Espectro típico de la APcI del PEG

5.4.2 Preparación para el calibrado

5.4.2.1 Introducción del compuesto de referencia

Es preferible utilizar un bucle de inyección de gran volumen (50 µL) con un sistema de suministro de eluyente preparado para suministrar 0,2 mL/min de solución de acetonitrilo y agua o de metanol y agua al 50:50 a través del inyector y en la fuente de APcI. Una inyección de 50 µL de solución de referencia tarda aproximadamente 15 s en realizarse, tiempo suficiente para realizar un calibrado de barrido lento.

5.4.2.2 Ajuste

Antes de iniciar el calibrado:

1. Ajustar el multiplicador a 650 V.

2. Ajustar los parámetros de la fuente y de la lente para conseguir una forma y una intensidad óptimas de los picos.

3. Ajustar los parámetros de resolución y de energía iónica de la resolución de la unidad de masa en MS1 y en MS2.

Una vez concluido el calibrado completo, se pueden adquirir datos de cualquier rango de masas dentro del intervalo calibrado. Por tanto, se recomienda efectuar el calibrado con un rango de masas amplio; en este ejemplo, el calibrado cubre hasta 1050 uma.

5.4.3 Opciones de calibradoEl acceso a las opciones de calibrado se obtiene con un clic en la opción Calibrate (Calibrar) de la página de ajuste.

5.4.3.1 Selección del archivo de referencia

1. Hacer clic en la flecha del cuadro de archivos de referencia y desplazarse de una fila a otra hasta elegir el archivo pegnh4.ref.

2. Dejar en blanco el cuadro Use Air Refs (Usar referencias de aire) al calibrar en el modo de APcI.

5.4.3.2 Eliminación de los calibrados actuales

1. Seleccionar Default (Predeterminado) en la opción del menú Calibrate (Calibrar).

2. Introducir Yes (Sí) para guardar el calibrado en el directorio de proyecto más adecuado.

De este modo, se garantiza que no hay ningún archivo con calibrados activo en el instrumento y se evita que se modifiquen o reemplacen los calibrados que se guardaron anteriormente.

5.4.4 Selección de los parámetros de calibrado

Antes de iniciar un calibrado, se deberán configurar varios parámetros. La mayoría de estos parámetros se pueden configurar con los mismos valores que con electrospray. Sin embargo, se recomienda utilizar un orden polinómico de 3 en el parámetro de calibrado Curve Fit (Ajuste de la curva).


5.4.5 Realización de un calibrado

Los tres tipos de calibrado (estático, de barrido y de velocidad de barrido) se deben realizar en un solo paso.

5.4.5.1 Calibrado estático

1. Abrir el cuadro de diálogo Automatic Calibration (Calibrado automático) mediante la función Start (Inicio) de la página Calibrate (Calibrar).

2. Activar las casillas Static Calibration (Calibrado estático) y MS1 en la zona Types (Tipos) del cuadro de diálogo.

3. En la zona Process (Proceso) del cuadro de diálogo, activar Acquire & Calibrate (Adquirir y calibrar).

Parámetros de adquisición

La selección de Acquisition Parameters (Parámetros de adquisición) abre el cuadro de diálogo Calibration Acquisition Setup (Configuración de la adquisición del calibrado), donde se encuentran los rangos de masa, las velocidades de barrido y el modo de adquisición correspondientes al archivo de referencia pegnh4.ref. Consultar la Figura 5-17.


Figura 5-17 Cuadro de diálogo Calibration Acquisition Setup (Configuración de la adquisición del calibrado)

En la zona superior Acquisition Parameters (Parámetros de adquisición) se configuran el rango de masas, el tiempo de análisis y el tipo de datos. Cuando el aparato está totalmente calibrado, se puede utilizar cualquier rango de masas o cualquier velocidad de barrido, siempre que se encuentren dentro de los límites fijados en el calibrado. Por lo tanto, se recomienda realizar el calibrado de un rango de masas amplio. Dado que el archivo de referencia pegnh4.ref contiene picos de relación masa/carga entre 89 y 2017, se puede realizar el calibrado en este rango de masas. Un calibrado efectivo hasta 1000 uma es suficiente para la mayoría de las aplicaciones en que se utiliza APcI. En el ejemplo siguiente se muestra la configuración necesaria para su realización.

Run Duration (Duración del análisis) especifica el tiempo que se invierte en la adquisición de datos para el calibrado estático. El valor de tiempo que se utilice debe permitir la inyección de un volumen de solución de referencia y la adquisición de varios barridos.


Data Type (Tipo de datos) permite elegir si el tipo de datos que se adquieren será en forma centroide, continua o MCA. En el modo APcI, aunque se pueden utilizar datos continuos o centroides, se recomienda usar los primeros.

Scan Parameters (Parámetros de barrido) se encuentra en la zona inferior del cuadro de diálogo Calibration Acquisition Setup (Configuración de la adquisición del calibrado).

Cuando un instrumento adquiere datos para un calibrado estático, primero busca las masas de referencia esperadas en el archivo de referencia elegido. A continuación, adquiere los datos de un intervalo de masa pequeño alrededor de la posición esperada de cada pico. De este modo, los datos adquiridos no provienen de barridos continuos, sino que cada “espectro” se compone de pequeñas zonas de datos adquiridos alrededor de cada pico, separados por espacios de los que no se adquieren datos.

Static Span (Intervalo estático) determina el tamaño de esta pequeña zona de barrido alrededor de cada pico de referencia. Lo habitual es utilizar un valor de 4 uma.

Static Dwell (Duración del análisis estático) determina cuánto tiempo se invierte en la adquisición de datos dentro del intervalo. Un valor adecuado sería 0.1 s.

Slow Scan Time (Tiempo de barrido lento) y Fast Scan Time (Tiempo de barrido rápido) no están disponibles cuando se elige solamente un calibrado estático.

Si elige OK (Aceptar) en el cuadro de diálogo Calibration Acquisition Setup (Configuración de la adquisición del calibrado), regresará a Automatic Calibration (Calibrado automático).

Adquisición de datos

Instrucciones para dar comienzo a la adquisición:

1. Elegir OK (Aceptar) en el cuadro de diálogo Automatic Calibration (Calibrado automático).

El instrumento adquiere un archivo listo para el calibrado estático cuyo nombre de archivo es STAT.

2. Inyectar la solución de referencia mientras se adquieren los datos.

Una vez adquiridos los datos, el instrumento intentará realizar de forma automática un calibrado estático. El archivo de datos sólo contiene algunos barridos del compuesto de referencia; los demás permanecen en segundo plano.

Dado que el procedimiento de calibrado automático combina todos los barridos del archivo de datos para producir un espectro de calibrado, el espectro resultante puede ser demasiado débil para conseguir un calibrado satisfactorio. Tanto si el calibrado se realiza correctamente como si no, es recomendable revisar el calibrado manualmente.


Calibrado manual

Realización de un calibrado manual con los datos adquiridos:

1. En la ventana del cromatograma, abrir el archivo de calibrado STATMS1.

2. Especificar el número de barridos al principio y al final del pico del cromatograma para la solución de referencia.

Para ello, utilizar Process (Proceso), Combine Spectra (Combinar espectros) y arrastrar el ratón sobre el pico con el botón izquierdo pulsado. En el cuadro de diálogo Combine Spectra (Combinar espectros) aparecen los barridos inicial y final.

3. Regresar al cuadro de diálogo Calibrate (Calibrar). Las opciones del calibrado manual se encuentran en el cuadro de diálogo Display Calibration Graphs (Ver gráficos de calibrado) (Figura 5-18), al que se accede mediante las opciones Calibrate (Calibrar), From File (Desde el archivo).

Figura 5-18 Cuadro de diálogo Display Calibration Graphs (Ver gráficos de calibrado)

4. Seleccionar Static calibration (Calibrado estático) y MS1.

5. En la zona inferior debe seleccionarse automáticamente el archivo de datos STATMS1. De lo contrario, se puede elegir el archivo correcto a través de la opción Browse (Explorar).


6. Introducir los barridos inicial y final de los datos de referencia en las casillas From (Desde) y To (Hasta).

7. Elegir OK (Aceptar) para realizar el calibrado y ver el informe correspondiente en la pantalla. Consultar la Figura 5-19.

El informe consta de cuatro pantallas:

• El espectro adquirido.

• El espectro de referencia.

• Una representación de la diferencia de masas en función de la masa (curva de calibrado).

• Una representación de los errores residuales en función de la masa.

Para ampliar una zona, se puede hacer clic en ella y arrastrarla con el botón izquierdo del ratón. De este modo, los picos menos intensos del espectro se pueden examinar para verificar que se obtienen los picos adecuados. Los picos del espectro adquirido que se corresponden con un pico del de referencia aparecen resaltados en un color diferente.

Comparar los espectros adquiridos y de referencia para comprobar que se han encontrado los picos correctos.

Si no se han encontrado suficientes picos o si éstos son erróneos, consultar la Sección 5.4.6, Fallos en el calibrado.

Si se han encontrado picos correctos, se puede imprimir el informe:

Elegir Print (Imprimir), Print from the report display (Imprimir de la pantalla del informe).

Aceptación del calibrado:

Elegir OK (Aceptar) en el informe de calibrado.


Figura 5-19 Informe de calibrado: MS1 estático


Figura 5-20 Informe de calibrado: MS1 de barrido


Figura 5-21 Informe de calibrado: compensación de velocidad de barrido


5.4.5.2 Calibrado de barrido y compensación de la velocidad de barrido

Adquisición de datos

Para finalizar el calibrado del instrumento deben adquirirse otros dos archivos de datos. Ambos archivos se adquieren en el modo de barrido sobre el mismo rango de masas, uno a la velocidad más lenta necesaria para las adquisiciones de barrido y otro a la más rápida. Una vez adquiridos los archivos y utilizados para el calibrado, se pueden adquirir datos de cualquier lugar del rango de masas a cualquier velocidad de barrido que se encuentre entre los valores utilizados para ambos conjuntos de datos. Estos datos no es imprescindible adquirirlos mediante el cuadro de diálogo Calibration (Calibrado), sino que también se pueden adquirir a través de la configuración normal de barrido y con el cuadro de diálogo Calibration (Calibrado) según se explica a continuación.

Calibrado de barrido

La velocidad recomendada para el calibrado de barrido es de 100 uma/s.

1. Situar Scan From (Barrido desde) en 50 uma y Scan To (Barrido hasta) en 1050 uma.

2. Situar Scan Time (Tiempo de barrido) en 10 s e Inter Scan Delay (Tiempo de descanso entre barridos) en 0.1 s.

3. Elegir Continuum (Continuo) en Data Type (Tipo de datos).

Aunque se recomienda utilizar Continuum (Continuo), también pueden utilizarse datos Centroided (Centroides).

4. Situar Run Duration (Duración del análisis) en 2.0 minutos.

De este modo, habrá tiempo suficiente para iniciar la adquisición, inyectar la solución de referencia y adquirir varios barridos. Con un caudal de eluyente de 200 µL/min y un bucle de 50 µL en el tubo, una inyección de solución de referencia tarda aproximadamente 15 s, lo que permite adquirir al menos un barrido completo de datos útiles.

5. Elegir un nombre de archivo para los datos.

Se puede usar la denominación SCNMS1, utilizada durante el calibrado automático.

6. Iniciar la adquisición e inyectar la solución de referencia.


Compensación de velocidad de barrido

La velocidad recomendada para la compensación de la velocidad de barrido es de 4000 uma/s.

1. Situar Scan From (Barrido desde) en 50 uma y Scan To (Barrido hasta) en 1050 uma.

2. Situar Scan Time (Tiempo de barrido) en 0.24 s e Inter Scan Delay (Tiempo de descanso entre barridos) en 0.1 s.

3. Elegir Continuum (Continuo) en Data Type (Tipo de datos).

Aunque se recomienda utilizar Continuum (Continuo), también pueden utilizarse datos Centroided (Centroides). En el modo Centroided (Centroides) se pueden realizar barridos más rápidos, pero es poco probable que con un uso normal se necesiten velocidades de adquisición mayores.

4. Situar Run Duration (Duración del análisis) en 2.0 minutos.

5. Elegir un nombre de archivo para los datos.

Se puede usar la denominación FASTMS1, utilizada durante el calibrado automático.

6. Iniciar la adquisición e inyectar la solución de referencia.

Calibrado manual

1. Buscar los barridos inicial y final de los datos de referencia de cada archivo del mismo modo que en el archivo de barrido estático.

2. Seleccionar Calibration (Calibrado) en la página de ajuste.

3. Seleccionar Scanning calibration (Calibrado de barrido), MS1, Calibrate Instrument (Calibrar instrumento) y Calibrate From File (Calibrar desde archivo).

4. En la zona inferior debe seleccionarse automáticamente el nombre del archivo de datos SCNMS1. Si no es éste el caso o si se ha utilizado otro nombre de archivo para la adquisición de barrido lento, hacer clic en Browse (Explorar) para elegir el archivo correcto.

5. Introducir los barridos inicial y final de los datos de referencia en las casillas From (Desde) y To (Hasta).

6. Elegir OK (Aceptar) para realizar el calibrado y ver el informe correspondiente en la pantalla de un modo similar al de Static calibration (Calibrado estático).

7. Compare los espectros adquiridos y de referencia para comprobar que se han encontrado los picos correctos.


Si se han encontrado los picos correctos, se puede imprimir el informe de calibrado:

Elegir Print (Imprimir), OK (Aceptar) en la pantalla del informe.

Si no se han encontrado suficientes picos o si éstos son erróneos. Consultar la Sección 5.4.6, Fallos en el calibrado.

Aceptación del calibrado:

Elegir OK (Aceptar) en el informe de calibrado.

En la compensación de velocidad de barrido se utiliza el mismo procedimiento, excepto que en el cuadro de diálogo se elige Scan Speed Compensation (Compensación de velocidad de barrido) y se utiliza el archivo de barrido rápido. Es necesario tener en cuenta que en la compensación de velocidad de barrido el archivo predeterminado es FASTMS1. Si se ha utilizado otro nombre de archivo, deberá elegirse éste en el explorador.

Una vez realizados los tres calibrados (estático, de barrido y de compensación de velocidad de barrido), se puede utilizar el instrumento con cualquier rango de masas que se encuentre dentro de los límites de los calibrados de barrido, y con cualquier velocidad entre 100 y 4000 uma/s.

Calibrado de MS2

El calibrado de MS2 se lleva a cabo exactamente según el procedimiento anterior, excepto que los datos se adquieren en el modo MS2 en lugar de MS1.

Uso del instrumento

Una vez realizados los seis calibrados (estático, de barrido y de compensación de velocidad de barrido, cada uno de ellos con MS1 y MS2), se puede utilizar el instrumento con cualquier rango de masas que se encuentre dentro de los límites de los calibrados de barrido, y con cualquier velocidad entre 100 y 4000 uma/s.

5.4.6 Fallos en el calibrado

Cuando el calibrado se realiza manualmente no aparece ningún mensaje de advertencia para indicar que el calibrado no reúne los criterios establecidos. Esto debe evaluarse a través del informe de calibrado de la pantalla y del examen de los picos encontrados y de las estadísticas asociadas al informe. Existen diversos motivos por los que pueden producirse fallos en el calibrado:


No aparece ningún pico

Si el archivo de datos del calibrado no contiene picos, el calibrado no será válido. Esto puede deberse a lo siguiente:

• No hay compuesto de referencia.

• Se utilizan barridos o archivos de datos erróneos para el calibrado.

• No hay flujo de fluido en la fuente.

• El multiplicador está muy bajo.

Se han perdido demasiados picos consecutivos

Si el número de picos consecutivos que no se han encontrado es superior a los límites establecidos en el cuadro de diálogo Automatic Calibration Check (Comprobación del calibrado automático), el calibrado no se habrá realizado satisfactoriamente. Los picos pueden no encontrarse por diferentes motivos:

• La solución de referencia se está agotando, con lo que los picos menos intensos no se pueden detectar.

• El multiplicador está muy bajo y no se detectan los picos menos intensos.

• Se ha elegido un modo de ionización incorrecto. Compruebe que los datos se han adquirido con Ion Mode (Modo de ionización) en la posición APcI+.

• El valor de Intensity Threshold (Umbral de intensidad) en el cuadro de diálogo Calibration Parameters (Parámetros del calibrado) es demasiado alto. Los picos se encuentran en el archivo de calibrado adquirido, pero se han ignorado por encontrarse por debajo del umbral.

• Los valores de Initial error (Error inicial) o de Peak window (Ventana del pico) que se encuentran en el cuadro de diálogo Calibration Parameters (Parámetros del calibrado) son demasiado pequeños. Los picos del calibrado se encuentran fuera de los límites establecidos por estos parámetros.

• Se ha superado el valor de Maximum Std Deviation (Desviación típica máxima) elegido en el cuadro de diálogo Automatic Calibration Check (Comprobación del calibrado automático).

• Se ha elegido un archivo de referencia incorrecto. Compruebe que se ha seleccionado el archivo correcto (en este caso, pegNH4.ref) en el cuadro de diálogo Calibrate (Calibrar).


En caso de que falten demasiados picos consecutivos:

• Examinar el informe de calibrado en pantalla para comprobar si los picos no encontrados se encuentran en el archivo de calibrado adquirido.

• Si los picos no están presentes, lo más probable es que el fallo se deba a los cuatro primeros motivos descritos en el apartado “No aparece ningún pico”.

• Si los datos contienen los picos, pero no se reconocen en el calibrado, se deberá seguramente a cualquiera de las cuatro últimas causas (apartado “Se han perdido demasiados picos consecutivos”).

Una vez tomadas las medidas necesarias, se deberá hacer lo siguiente:

1. Si los valores de Intensity Threshold (Umbral de intensidad), Initial error (Error inicial) y Peak window (Ventana del pico) se han ajustado para obtener un buen calibrado, comprobar el informe de calibrado en pantalla para verificar que se han encontrado los picos correctos.

Si se establece un umbral muy bajo e intervalos demasiado amplios para Initial error (Error inicial) y Peak window (Ventana del pico), es posible que el calibrado se considere “válido” aunque se hayan seleccionado los picos incorrectos. Esto puede ocurrir sobre todo en los calibrados con PEG, donde puede haber picos correspondientes a PEG+H+, PEG+NH4+ y PEG+Na. Aunque este caso sea poco frecuente, siempre es recomendable revisar el informe de calibrado que aparece en pantalla para asegurarse de que se han encontrado los picos adecuados.

2. Hacer clic en OK (Aceptar) en la ventana del informe de calibrado para aceptar el calibrado nuevo, o bien hacer clic en Cancel (Cancelar) para guardar el calibrado anterior.

5.4.7 Calibrado incorrecto

Si se utilizan los parámetros de calibrado recomendados y se han adquirido unos datos de calibrado correctos, el instrumento por lo general se calibra correctamente. En algunas circunstancias es posible, sin embargo, que se cumplan los criterios de calibrado sin que se identifiquen los picos correctos.

Aunque este caso sea poco frecuente, siempre es recomendable revisar el informe de calibrado que aparece en pantalla para asegurarse de que se han encontrado los picos adecuados. Esto puede ocurrir cuando se adjudican los valores siguientes a los parámetros:

• El umbral de intensidad asignado es igual a 0.

• El error inicial es demasiado elevado (>2.0).

• El segmento del pico es demasiado elevado (>1.5).

• El valor asignado a la desviación típica máxima es demasiado elevado (>0.2).


El calibrado será correcto si el espectro adquirido es como el de referencia y aparecen resaltados todos los picos esperados.

Otra causa posible de fallos en el calibrado pueden ser los picos contaminantes o picos de fondo. Si un pico contaminante o de fondo se encuentra en uno de los segmentos de los picos encontrados y su intensidad es mayor que la del pico de referencia de ese segmento, entonces el pico seleccionado es incorrecto. En algunas circunstancias, esto puede suceder en el análisis de PEG. Existen dos maneras de contrarrestar este efecto:

• Si el pico de referencia está más cerca del centro del segmento del pico, dicho segmento se podrá estrechar hasta que se excluya el pico de contaminación. Comprobar que no se excluye ningún otro pico de referencia.

• Si el pico de referencia no está cerca del centro del segmento o si al estrechar el segmento se eliminan otros picos de referencia, se puede modificar el calibrado de forma manual.

5.4.8 Modificación manual de la correspondencia de picos

Si se ha encontrado un pico incorrecto en el proceso de calibrado, este pico se puede eliminar manualmente del informe de calibrado en pantalla mediante estos pasos:

1. Con el ratón, situar el cursor sobre el pico del espectro de referencia y hacer clic con el botón derecho.

2. Situar el cursor sobre el pico del espectro adquirido y hacer clic con el botón derecho del ratón.

El pico se eliminará y dejará de aparecer resaltado.

Si está presente el pico de referencia verdadero, se puede incluir en el calibrado del modo siguiente:

Situar el cursor sobre el pico deseado y hacer clic con el botón derecho del ratón.

El pico se comparará con el más próximo del espectro de referencia.

La modificación manual de un pico no tiene por qué afectar al resto de los picos del calibrado.


5.4.9 Almacenamiento del calibrado

Si el instrumento está completamente calibrado, este proceso deberá guardarse en un archivo para que entre en vigor y poder recuperarlo en el futuro. Por ejemplo, se pueden guardar los calibrados para su uso con distintos modos de ionización, de manera que al cambiar de fuente de ionización se pueda recuperar el calibrado correspondiente.

El calibrado que se recupera tiene las mismas restricciones de rango de masas y velocidad que el original. También se conservan los parámetros de energía iónica y de resolución, ya que pueden afectar a las asignaciones de masas.

5.4.10 Verificación manual

Una vez llevado a cabo el calibrado completo de un instrumento, no siempre es necesario volver a repetirlo en la siguiente ocasión en que se utilice el instrumento. En su lugar, se puede llevar a cabo una verificación del calibrado. (La verificación individual de los calibrados no supone ninguna ventaja; el recalibrado tarda el mismo tiempo en realizarse.)

Si se va a adquirir un barrido y desea comprobarse el calibrado:

1. Configurar una adquisición de barrido en el rango de masas y con la velocidad de barrido deseada según el procedimiento normal.

2. Iniciar la adquisición e inyectar la solución de referencia para adquirir los datos correspondientes.

3. Detener la adquisición.

4. Abrir el cuadro de diálogo Calibrate (Calibrado) y adjudicar a todos los parámetros para encontrar picos con los mismos valores utilizados en el calibrado.

5. Seleccionar Process (Proceso), Verification from file (Verificación desde el archivo) y se abrirá el cuadro de diálogo Display Verification Graphs (Ver gráficos de verificación). Consultar la Figura 5-22.

6. Seleccionar Scanning Calibration (Calibrado de barrido) y MS1 o MS2, de acuerdo con el tipo de dato adquirido.

7. Hacer clic en Browse (Explorar), elegir el archivo adquirido e introducir los barridos inicial y final de los datos de referencia.

8. Elegir OK (Aceptar) para verificar el calibrado.

Se genera una curva de calibrado y se muestra en la pantalla de un modo similar al del calibrado original. La Figura 5-23 muestra un ejemplo.


Figura 5-22 Cuadro de diálogo Display Verification Graphs (Ver gráficos de verificación)

Figura 5-23 Informe de verificación


Si se elige OK (Aceptar) en este informe, a diferencia del procedimiento de calibrado original, no varía el calibrado del instrumento. Dado que el procedimiento de verificación utiliza los mismos parámetros de comparación que el procedimiento de calibrado, se puede validar el calibrado actual sin necesidad de recalibrar el instrumento.

El informe se imprime con un clic en Print (Imprimir), OK (Aceptar), dentro del informe de verificación.


Capítulo 6Mantenimiento

6.1 Programa de mantenimiento

En la Tabla 6-1 se indican los procedimientos de mantenimiento periódico que se deberán llevar a cabo para optimizar el rendimiento del equipo.

La frecuencia del mantenimiento que se muestra en la tabla es válida para un uso moderado.

Tabla 6-1 Mantenimiento

Mantenimiento Frecuencia

“Gas-ballast” de la bomba rotatoria. A diario (APcI).Una vez por semana (ESI).

Comprobar y ajustar el nivel de aceite de la bomba rotatoria.

Una vez por semana.

Sustituir el aceite de la bomba rotatoria. Cada 3000 horas de funcionamiento de la bomba.

Limpiar el cono de gas, cono de muestra y placa difusora.

Cuando la sensibilidad desciende a niveles inaceptables.

Limpiar el extremo de las sondas de ESI y de APcI.


Limpiar el electrodo de descarga en corona (modo APcI).


Limpiar el conjunto del bloque de ionización.

Cuando se vea que está sucio.Cuando los contaminantes de los picos mayores o la señal de fondo son excesivamente altos.

Limpiar todos los componentes de la fuente.

Cuando la sensibilidad desciende a niveles inaceptables.Cuando la limpieza del cono de gas, del cono de muestra y de la placa difusora no es suficiente para mejorar los resultados del análisis.

Programa de mantenimiento 147

6.2 Seguridad y manejo

Se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones de seguridad cuando se lleve a cabo el mantenimiento del equipo.

6.2.1 Procedimientos para un funcionamiento adecuado

Se deben seguir todos los procedimientos y directrices recomendados para que el detector funcione de forma eficaz.

6.2.2 Equipo de mantenimiento

La limpieza rutinaria de los componentes precisa el siguiente equipo:

• Un baño de ultrasonidos con un tamaño de cámara mínimo de 300 mm × 150 mm × 100 mm (12 in × 6 in × 4 in).

• Recipientes de vidrio, de aproximadamente 100 mm (4 in) de diámetro y 120 mm (4,25 in) de altura.

• Una probeta graduada de 500 mL (para limpiar el conjunto del hexapolo).

Advertencia: No abrir nunca la parte superior del instrumento o los paneles laterales para acceder a las fuentes de alimentación o a otros componentes. El instrumento no tiene componentes cuyo mantenimiento pueda ser realizado por el usuario.

Advertencia: Se deberán seguir las buenas prácticas de laboratorio al manipular los disolventes, cambiar los tubos o trabajar con Quattro micro API. Se deben conocer las propiedades físicas y químicas de los disolventes que se van a utilizar. Se recomienda la consulta de las hojas de datos sobre seguridad de materiales correspondientes.

Precaución: No se debe desconectar nunca una unidad eléctrica con el sistema conectado a la alimentación, ya que esto podría estropear los componentes eléctricos. Antes de desconectar una unidad eléctrica, se recomienda apagar el instrumento y esperar unos 10 segundos.

Precaución: No se deben tocar los circuitos integrados ni el resto de componentes de la placa de circuitos. La electricidad estática podría deteriorar los componentes electrónicos.

148 Mantenimiento

6.3 Mantenimiento sistemático

6.3.1 “Gas-ballast” de la bomba rotatoria

Cuando la bomba rotatoria desplaza grandes cantidades de vapor de disolvente, estos vapores tienden a condensarse en el aceite de la bomba, lo que afecta negativamente al rendimiento de ésta. El dispositivo “gas-ballast” purga los contaminantes condensados del aceite y devuelve a la bomba el aceite acumulado en el filtro de vapores. Se recomienda la utilización del dispositivo de “gas-ballast” en la bomba rotatoria cuando se cumplan las siguientes condiciones:

• Si se trabaja en modo de ESI, una vez por semana.

• Si se trabaja en modo de APcI de forma frecuente, una vez al día.

• Si el aceite de la bomba está turbio.

• Si el vacío es mayor de lo normal.

• Si hay condensación en el tubo de evacuación de la bomba rotatoria.

• Si se cambia el aceite de la bomba rotatoria:

• Si el nivel de aceite acumulado en el filtro de vapores de aceite es elevado.

Para hacer un “gas-ballast” de la bomba:

1. Cerrar la válvula de estanqueidad del sistema de vacío, girando completamente la manecilla a la derecha.

2. Activar el “gas-ballast”. Consultar Figura 6-1.

Precaución: Si no se utiliza de forma sistemática el dispositivo de “gas-ballast” en la bomba rotatoria, se acortará la vida útil del aceite y, por consiguiente, de la bomba.

Precaución: No se deben evacuar los gases del instrumento mientras se lleva a cabo el “gas-ballast” de la bomba rotatoria.

Precaución: No se debe hacer un “gas-ballast” en la bomba cuando el Quattro micro API está en funcionamiento.

Precaución: No se debe hacer nunca un “gas-ballast” en la bomba durante más de dos horas.

Mantenimiento sistemático 149

Figura 6-1 Bomba rotatoria

3. Cuando el aceite está limpio y se ha drenado en la bomba rotatoria, volver a girar el control del “gast-ballast” a su posición original.

4. Abrir la válvula de estanqueidad del sistema de vacío.

6.3.2 Comprobación del aceite de la bomba rotatoria

El usuario podrá comprobar el nivel de aceite con la bomba en funcionamiento. Se deberá facilitar la salida de gases del instrumento y apagar éste antes de añadir aceite.

El nivel de aceite de la bomba rotatoria aparece en el indicador de nivel de la bomba. Se recomienda consultar la Figura 6-1.

Se debe comprobar el nivel del aceite semanalmente. Siempre deberá estar en el nivel MAX (MÁX.), marcado junto al indicador de nivel, o cerca de éste. Cuando se deba añadir aceite, habrá que permitir la salida de gases y apagar Quattro micro API antes de retirar el tapón del depósito de aceite.

150 Mantenimiento

También se debe examinar el aceite cada vez que se compruebe su nivel. Debería ser incoloro, sin contaminantes visibles. Si ha cambiado de color, se deberá cambiar, siguiendo el procedimiento que se detalla en la Sección 6.3.3.

6.3.3 Cambio de aceite de la bomba rotatoria

Se debe cambiar el aceite de la bomba rotatoria cada 3 ó 4 meses o cuando haya cambiado de color de forma significativa.

6.3.3.1 Material necesario

• Guantes de goma.

• Destornillador plano.

• Recipiente para recoger el aceite viejo.

• Embudo.

• Aceite para bombas de vacío (sólo aceite para bombas de vacío Ultragrade 19 o Inland Q45 [Edwards 45]).

6.3.3.2 Procedimiento

Para cambiar el aceite de la bomba rotatoria:

1. Poner en funcionamiento la bomba para calentar el aceite antes de drenarlo.

2. Realizar el “gas-ballast” de la bomba rotatoria tal como se describe en la Sección 6.3.1.

3. Permitir la salida de gases del instrumento y apagarlo mediante el interruptor de encendido/apagado.

4. Levantar la bomba de 150 a 200 mm (6 a 8 in) del suelo, en caso necesario.

5. Colocar un objeto debajo del motor para poder inclinar la bomba hacia el lado donde se encuentra el tapón de drenaje de aceite. Se recomienda consultar la Figura 6-1.

6. Retirar el tapón del depósito de aceite para permitir el drenaje.

7. Retirar el tapón de drenaje con ayuda del destornillador plano.

8. Drenar el aceite por completo y volver a colocar el tapón de drenaje.

9. Llenar el depósito hasta que el nivel de aceite alcance la marca MAX (MÁX.).

10. Dejar unos minutos para que el aceite drene en la bomba.

11. Volver a comprobar el nivel de aceite y añadir más aceite, en caso necesario.


12. Volver a colocar el tapón del depósito y, en caso necesario, bajar la bomba al suelo.

13. Colocar el interruptor de la bomba en la posición de encendido.

6.3.4 Limpieza del conjunto de la fuente

6.3.4.1 Descripción general

El cono de muestra, el cono de gas y la placa difusora se deben limpiar si se da una de las condiciones siguientes:

• Están visiblemente sucios.

O bien:

• Se han descartado causas relativas a la cromatografía líquida (LC) y a las muestras que expliquen la disminución de la intensidad de señal.

Si la limpieza de estos componentes no mejora la intensidad de la señal, limpiar las lentes de extracción, el hexapolo y el bloque de ionización.

El procedimiento de limpieza de la fuente es el siguiente:

1. Desmontar las piezas de la fuente, que se describen con detalle más adelante en este capítulo.

2. Limpiar las piezas.

3. Retirar y limpiar el conjunto del hexapolo.

4. Volver a encajar el conjunto del hexapolo.

5. Volver a montar las piezas de la fuente.


Para limpiar los componentes de la fuente se necesitan los materiales siguientes:

• Guantes de algodón sin pelusa o de nitrilo sin talco.

• Alicates de puntas redondas o de 150 mm (6 in).

• Llave hexagonal de 2,5 mm.

• Llave hexagonal de 6 mm.

• Destornillador plano pequeño.

• Destornillador plano grande.

• Vaso de precipitados de 1000 mL de capacidad limpio.

152 Mantenimiento

• Probeta graduada de 500 mL de capacidad limpia.

Se deberán utilizar solamente utensilios de vidrio que no hayan estado en contacto previamente con surfactantes.

• Metanol de calidad HPLC.

• Agua de calidad HPLC.

• Ácido fórmico.

• Baño ultrasónico.

• Gas inerte sin aceite (nitrógeno o helio) para secar (el secado con aire es optativo).

• Toallitas de papel que no suelten pelusa.

6.3.4.3 Recambios

Las piezas de recambio siguientes pueden ser necesarias durante la limpieza de los componentes de la fuente:

• Arandela en D del bloque de ionización (AS035).

• Arandela Viton (AS214).

• Arandela del cono de extracción.

• Arandela del cono de muestra.

6.3.4.4 Desensamblado de los componentes de la fuente

Para desmontar los componentes de la fuente:

1. Establecer la temperatura de la fuente y la temperatura de la sonda de APcI o el tiempo de desolvatación en 20 ºC para apagar los calefactores.

.

2. Para reducir el tiempo de enfriamiento significativamente, no detenga el flujo de gas de API.

3. Cuando la sonda se haya enfriado, detenga el flujo de nitrógeno cancelando la

selección de en la barra de herramientas o seleccionando Gas en el menú Gas.

4. Retirar la sonda de APcI o de ESI.

Precaución: La sonda debe enfriarse a menos de 100 ºC y la fuente a menos de 50 ºC antes de la extracción. De lo contrario, se reducirá la vida útil del calefactor de la sonda.


5. Detener el flujo de líquido y desconectar el tubo de cromatografía líquida (LC) de la sonda.

6. Hacer clic en Press For Standby (Pulsar para espera) en la página de ajuste de MassLynx.

7. El icono pasará del color verde al rojo. Esto significa que se han apagado los altos voltajes, así como el calefactor de la sonda de desolvatación en ESI / APcI.

8. En la página de ajuste, abrir el menú Options (Opciones) y hacer clic en OK (Aceptar) cuando aparezca el cuadro de mensaje. Si sólo se están limpiando los conos de muestra y de gas, no es necesario facilitar la salida de gases del sistema.

Cuando se permite la salida de gases del sistema, se interrumpe la alimentación de la bomba turbomolecular. Sin embargo, la bomba no se detiene inmediatamente. La salida de gases es un proceso controlador y seguro que dura varios minutos, cuya finalidad es evitar daños en el instrumento. Cuando se detiene la bomba turbomolecular, se abre una válvula de forma automática que permite la salida de gases de la cámara de vacío a la atmósfera. La bomba rotatoria se detiene durante unos 3 minutos después de que comience el ciclo de salida de gases.

9. Desconectar las conexiones de gas y eléctricas del panel frontal (Figura 6-2).

10. Desenroscar los dos tornillos de mariposa de cabeza estriada de la sonda (Figura 6-2) y retirarla de la fuente.

Advertencia: Manipular la sonda cuidadosamente. Es posible que siga estando caliente.

154 Mantenimiento

Figura 6-2 Conexiones de la fuente y de la sonda

11. Retirar el panel de la sección central de la parte frontal del instrumento tirando de él (Figura 6-3).


Figura 6-3 Panel central extraíble

12. Desenroscar los cuatro tornillos de mariposa y retirar la cubierta de la carcasa de la fuente (Figura 6-2).

13. Si se utiliza una sonda APcI, retirar con cuidado el electrodo de descarga en corona. Consultar Figura 6-4.

Precaución: Para el resto de la limpieza, se recomienda ponerse unos guantes de algodón que no dejen pelusa o de nitrilo sin talco.

Precaución: Se debe proceder con cuidado para no rayar la superficie pulida del cono.

156 Mantenimiento

Figura 6-4 Carcasa de la fuente

14. Retirar el tubo de teflón (PTFE) conectado al cono de gas.

15. Con ayuda del destornillador plano pequeño, retirar los dos tornillos que sujetan el retén del cono (Figura 6-5).


Figura 6-5 Bloque de ionización

16. Retirar el cono de gas, la arandela y el cono de muestra del bloque de ionización (Figura 6-6).

Figura 6-6 Extracción del cono de la muestra

17. Separar con cuidado el cono de la muestra del cono del gas y extraer la arandela del cono de la muestra.

158 Mantenimiento

18. Retirar la placa difusora y colocar todas las piezas a un lado.

19. Con ayuda de la llave hexagonal de 6 mm, retirar los dos tornillos que sujetan el bloque de ionización.

20. Separar el bloque de ionización de su soporte.

Figura 6-7 Diagrama ampliado

21. Colocar el bloque de ionización sobre una superficie plana y extraer todas las arandelas.

22. Desenroscar el tornillo que sujeta el retén del cono de extracción PEEK con ayuda del destornillador (Figura 6-8).


Figura 6-8 Extracción del cono de extracción

23. Hacer palanca con el destornillador plano pequeño bajo el borde de la arandela hermética y sacarla del bloque de ionización con cuidado.

24. Se recomienda proceder con cuidado para no estropear la superficie ni la arandela hermética del bloque de ionización.

25. Sacar el cono de extracción del bloque de ionización agarrando la clavija mediante los alicates de puntas redondas.

26. Hacer palanca con el destornillador plano pequeño bajo el borde interno de la arandela hermética de plástico duro y sacarla, junto a la otra arandela, del bloque de ionización con cuidado.

27. Se debe proceder con cuidado para no estropear el sellado y las arandelas del bloque de ionización.

28. Retirar del bloque de ionización la arandela en D.

29. Retirar el conector y el sellado del bloque de ionización mediante un destornillador plano.

30. Retirar la arandela del orificio del cono de muestra, con cuidado para no estropear la superficie del bloque de ionización.

160 Mantenimiento

6.3.4.5 Limpieza de los componentes de la fuente

Para limpiar los componentes de la fuente:

1. Sumergir el bloque de ionización en un vaso de precipitados con una solución de metanol y agua (concentración 1:1).

2. Colocar el vaso de precipitados con el bloque de ionización y la solución metanol:agua en un baño ultrasónico durante 20 minutos.

3. Retirar el bloque de ionización de la solución de metanol:agua y sumergirlo en un vaso de precipitados que contenga metanol puro.

4. Si hay residuos en el cono de la muestra, agregar una gota de ácido fórmico al orificio.

5. Sumergir el cono de la muestra, el cono de gas y el cono de extracción en un vaso de precipitados con una solución de metanol:agua (concentración 1:1).

6. Si las piezas están sucias, se recomienda utilizar una solución del 45 % de metanol, 45 % de agua y 10 % de ácido fórmico.

7. Exponer todas las piezas a los ultrasonidos durante unos 30 minutos.

8. Si se ha utilizado ácido fórmico en la solución de limpieza:

a. Aclarar todas las partes, sumergiéndolas en un vaso de precipitados con agua y colocando dicho vaso de precipitados en un baño ultrasónico durante, al menos, 20 minutos para eliminar el ácido fórmico.

b. Sumergir las piezas en un vaso de precipitados con metanol y colocar éste en el baño ultrasónico durante 10 minutos para eliminar el agua.

9. Extraer las piezas del vaso de precipitados con cuidado y secarlas con gas inerte libre de aceites.

También se pueden dejar secar al aire sobre una toalla que no deje pelusa. Secar cualquier resto de humedad con otra toalla que no deje pelusa.

Advertencia: Extremar las precauciones al utilizar ácido fórmico. Se debe trabajar bajo una campana extractora y utilizar el equipo protector adecuado.


6.3.4.6 Extracción y limpieza del hexapolo

Para extraer y limpiar el hexapolo:

1. Desenroscar los tornillos que sujetan el soporte del bloque de ionización con ayuda de la llave hexagonal de 3 mm y extraerlo de la cámara de bombeo (Figura 6-9).

Figura 6-9 Extracción del hexapolo

2. Retirar cualquier arandela que pueda quedar en la superficie de la cámara de bombeo.

3. Sujetar el hexapolo con la mano y sacarlo con cuidado.

4. Curvar un trozo de tubo de acero inoxidable en forma de gancho e insertarlo en uno de los orificios de la arandela de sujeción trasera (Figura 6-10).

Precaución: Al extraer el hexapolo, no se deben apretar nunca las barras, ya que su orientación es esencial para el buen funcionamiento del instrumento Quattro micro API. Se debe proceder con cuidado para no rayar las superficies pulidas de la cámara de bombeo durante la extracción del hexapolo.

162 Mantenimiento

Figura 6-10 Hexapolo

5. Colgar el hexapolo con cuidado en una probeta graduada y añadir metanol hasta cubrir por completo el hexapolo.

6. Colocar la probeta en un baño ultrasónico durante 30 minutos.

7. Sacar el hexapolo de la probeta y colocarlo sobre una toalla que no deje pelusa. Dejar que se seque al aire o secarlo con nitrógeno.

8. Insertar el hexapolo, alineando las muescas de la apertura diferencial de la parte posterior del hexapolo con las dos guías de soporte del analizador y volver a colocarlo en su sitio. Verificar que se ha insertado por completo.

9. Comprobar el estado de las tres arandelas de la parte posterior del soporte del bloque de ionización y sustituirlas por otras nuevas, si fuera necesario. Comprobar que estén bien instaladas antes de volver a fijar el soporte del bloque de ionización en su sitio. Comprobar también que la clavija del soporte del bloque de ionización está alineada con la muesca del bloque de ionización.

10. Volver a colocar los tornillos de sujeción de forma alternada y apretarlos bien.

6.3.4.7 Montaje de los componentes de la fuente

Para volver a montar los componentes de la fuente:

1. Comprobar el estado de las dos arandelas frontales del soporte del bloque de ionización. Sustituirlas por unas nuevas en caso necesario. Antes de continuar, comprobar que están bien colocadas.

2. Volver a colocar la arandela hermética Vespel® y la otra arandela en el soporte del bloque de ionización.

3. Volver a colocar el cono de extracción en el soporte del bloque de ionización y fijarlo con el retén PEEK y el tornillo.


4. Colocar el cono de muestra y su arandela, y el cono de gas, fijándolo con el resorte de retén y dos tornillos. De igual modo, colocar el conector del bloque de ionización y su sellado.

5. Colocar el bloque de ionización en su bloque de soporte PEEK y el cono de gas, y asegurar el conjunto con dos tornillos hexagonales de 6 mm. No apretar demasiado.

6. Si solamente se ha limpiado el cono de la muestra y el de gas, abrir la válvula de aislamiento.

7. Si se utiliza la APcI, volver a colocar el electrodo de descarga en corona (consultar la Sección 6.3.4.6, Extracción y limpieza del hexapolo).

8. Volver a conectar el tubo de teflón (PTFE) al cono de gas.

9. Volver a colocar la carcasa de la fuente y la cubierta de la carcasa de la fuente.

10. Vaciar el instrumento y abrir el gas de API.

6.3.5 Limpieza y sustitución del electrodo de descarga en corona

Se recomienda limpiar el electrodo de descarga en corona si está negro o corroído, o si se debilita la intensidad de la señal.


Para limpiar el electrodo de descarga en corona se necesita el material siguiente:

• Guantes de algodón sin pelusa o de nitrilo sin talco.

• Papel de lija.


• Papel que no deje pelusa.


Para extraer, limpiar y sustituir el electrodo de descarga en corona:

1. Establecer la temperatura de la fuente y la temperatura de la sonda de APcI en 20 ºC para apagar los calefactores.

Para reducir el tiempo de enfriamiento significativamente, no se debe detener el flujo de gas de API.

164 Mantenimiento

2. Cuando la sonda se haya enfriado, detener el flujo de nitrógeno cancelando la

selección de en la barra de herramientas o seleccionando Gas en el menú Gas.

3. Hacer clic en Press For Standby (Pulsar para espera) en la página de ajuste de MassLynx.

4. Comprobar que el icono pasa del color verde al rojo. Esto significa que se han apagado los altos voltajes, así como el calefactor de la sonda de APcI.

5. Retirar el panel central de la parte frontal del instrumento.

6. Cerrar el gas de nebulización y desconectar la conexión eléctrica de la sonda (Figura 6-11).

Figura 6-11 Conexiones de la fuente y de la sonda

Precaución: No extraer nunca la sonda antes de que se enfríe por debajo de los 100 °C y de que el calefactor de la fuente se enfríe por debajo de los 50 °C, pues de lo contrario se acortará la vida útil del calefactor de la sonda.


7. Desenroscar los dos tornillos estriados de la parte superior de la sonda.

8. Extraer la sonda de APcI.

9. Retirar la cubierta de la carcasa de la fuente.

10. Extraer el electrodo de descarga en corona de la fuente tirando de él (Figura 6-12).

Figura 6-12 Carcasa de la fuente

Advertencia: Las superficies del interior de la carcasa de la fuente y las piezas componentes están calientes.

Precaución: Para el resto de la limpieza, se recomienda utilizar unos guantes de algodón que no dejen pelusa o de nitrilo sin talco.

166 Mantenimiento

11. Limpiar y afilar el extremo del electrodo con el papel de lija y limpiarlo con papel empapado en metanol. Sustituir el electrodo si está deformado o estropeado.

12. Volver a colocar el electrodo con el extremo apuntando hacia el ápice del cono de la muestra.

13. Volver a fijar la cubierta de la carcasa de la fuente.

14. Insertar la sonda y volver a conectar el tubo de LC.

15. Volver a fijar la sección media del panel.

16. Restablecer las conexiones de gas y eléctricas del panel frontal.

6.3.6 Limpieza del extremo de la sonda APcILimpiar el extremo de la sonda APcI cuando se haya detectado una acumulación de tampón en él o cuando la intensidad de la señal se debilite. Para limpiar el extremo de la sonda de APcI:

1. Cortar el flujo de líquido.

2. Hacer clic en o seleccionar Gas en el menú Gas para abrir el flujo de nitrógeno.

3. En el caudalímetro del gas de desolvatación de la página de ajuste, ajustar el caudal de nitrógeno a aproximadamente 650 L/h.

4. Fijar la temperatura del calefactor de la sonda de APcI en 650 °C y pulsar la tecla Entrar.

5. Hacer clic en Operate (Funcionamiento) y esperar unos 10 minutos con el calefactor de la sonda de APcI a 650 °C. Esto eliminará cualquier residuo químico del extremo de la sonda.

6.4 Sustitución de piezas

6.4.1 Sustitución del calefactor del cartucho del bloque de ionización

Si el calefactor del cartucho no calienta debe sustituirse.


• Llave hexagonal de 3 mm.



• Alicates de puntas redondas.

Sustitución de piezas 167


Para cambiar el calefactor del cartucho del bloque de ionización:

1. Facilitar la salida de gases del instrumento, como se describe en la Sección 6.3.4, Limpieza del conjunto de la fuente.

2. Desenroscar los dos tornillos que sujetan los alambres del cartucho calefactor al bloque de bornes PEEK.

3. Sacar los bornes anulares del bloque de bornes con cuidado (Figura 6-13).

Figura 6-13 Calefactor del bloque de ionización

4. Aflojar los dos tornillos de ajuste que sujetan los cartuchos calefactores al bloque de ionización mediante la llave hexagonal de 1,5 mm.

168 Mantenimiento

5. Sacar los cartuchos calefactores del bloque de ionización despacio mediante los alicates de puntas redondas.

6. Deslizar los cartuchos calefactores de recambio hacia el interior del bloque de ionización con los alicates de puntas redondas. Asegurarlos mediante dos tornillos de ajuste de cabeza hexagonal y la llave hexagonal de 1,5 mm.

7. Colocar los dos bornes anulares de los cartuchos calefactores en el bloque de bornes PEEK con la parte doblada de sus ejes extendida hacia la cámara de bombeo.

8. Asegurar los dos tornillos del bloque de bornes con un destornillador plano.

9. Volver a colocar la placa de la cubierta del bloque de ionización y asegurarla con cuatro tornillos de cabeza hexagonal.

10. Volver a instalar la cubierta de la carcasa de la fuente y la sonda.

6.4.2 Sustitución del capilar de acero inoxidable de la sonda de ESI

Sustituir el capilar de la muestra de acero inoxidable de la sonda de ESI (Figura 6-14) si se obstruye y no se puede desatascar o si se ensucia o se estropea.

Figura 6-14 Capilar de la muestra de la sonda de ESI





• Llave de 6 mm (¼ in).

• Llave de 8 mm (5/16 in).

• Llave de 11 mm (7/16 in).

• Lupa (lente de aumento).

• Alicates de puntas redondas.


Para cambiar el capilar de acero inoxidable:

1. Pasar el instrumento al modo “en espera” y extraer la sonda de la fuente.

2. Desenroscar los dos tornillos que sujetan la cubierta del extremo de la sonda de ESI con ayuda del destornillador plano.

3. Aflojar el tornillo de ajuste de la conexión de LC PEEK con la llave hexagonal de 1,5 mm y retirar la cubierta del extremo de la sonda.

4. Destornillar el extremo de la sonda con la llave hexagonal de 6 mm (¼ in) y sacarla.

5. Extraer la conexión de LC con las llaves de 8 mm (5/16 in) y 11 mm (7/16 in).

6. Extraer el capilar de la tuerca acopladora mediante la llave de 11 mm (7/16 in). Desechar el conjunto del capilar, la protección de teflón (PTFE) y la férula.

7. Sacar el manguito conductor del diámetro interno de la conexión de la sonda.

8. Deslizar una férula nueva sobre un tubo de protección con la ayuda de los alicates de puntas redondas.

9. Colocar la tuerca acopladora sobre el capilar, la protección de teflón (PTFE) y la férula.

10. Conectar un trozo de tubo PEEK de 0,1778 mm (0,007 in) mediante una tuerca de apriete manual y una férula en el lado contrario de la conexión de LC, para ajustar la longitud del capilar.

Precaución: Todo el trabajo realizado en la sonda debe llevarse a cabo sobre una mesa de laboratorio limpia.

170 Mantenimiento

11. Empujar el capilar en la conexión hasta que encaje y apretar la tuerca doble hasta que esté sujeto, pero no demasiado apretado.

12. Tirar suavemente del capilar para comprobar que no se mueve.

13. Sacar el tubo PEEK de la conexión.

14. Deslizar el manguito conductor sobre el capilar e insertar el capilar en la sonda.

15. Conectar la tuerca acopladora a la sonda y ajustarla suavemente con la llave de 11 mm (7/16 in).

16. Volver a colocar el extremo de la sonda y enroscarlo hasta que sobresalga una sección de capilar de 0,5 mm. Utilizar la lupa, suministrada con el kit de inicio, para comprobar la longitud del capilar que sobresale del extremo de la sonda.

17. Volver a conectar el tubo de LC, abrir la llave de flujo del líquido y comprobar que no haya fugas en la sonda.

18. Si se encontrara alguna, desmontar la sonda y apretar la conexión de LC.

19. Fijar la conexión del gas de nebulización y abrir la llave del nitrógeno haciendo clic

en , en la barra de herramientas (o seleccionando Gas en el menú Gas) de la página de ajuste.

20. Comprobar que no haya fugas de nitrógeno en el extremo de la sonda. Si se encontrara una fuga, sustituir el conjunto del extremo de la sonda y su arandela.

21. Volver a colocar la cubierta del extremo de la sonda y asegurarla con sus dos tornillos de cabeza ranurada. Apretar el tornillo de ajuste para fijar la conexión de LC en su sitio.

6.4.3 Sustitución del extremo de la sonda de ESI

El extremo de la sonda de ESI debe sustituirse si surgen los problemas siguientes:

• Obstrucción en la protección de metal interna que atraviesa el capilar de acero inoxidable.

• Deterioro del soporte de los cables.

Sustituir la arandela en caso de que haya una fuga de gas en ésta.

Precaución: Es necesario comprobar que no haya fugas, puesto que podrían dañar irremediablemente la sonda.



• Llave fija de 6 mm (¼ in).



Para cambiar el extremo de la sonda de ESI:


2. Destornillar y extraer el extremo de la sonda con la llave fija de 6 mm (¼ in).

3. Instalar el extremo de recambio y atornillarlo hasta que el capilar sobresalga unos 0,5 mm del extremo. Usar la lupa, proporcionada en el kit de inicio, para comprobar la posición del capilar.

6.4.4 Sustitución del calefactor de la sonda de APcI

Si el calefactor de la sonda de APcI no calienta debe sustituirse.


• Llave hexagonal de 1 mm o destornillador plano, en función del tipo de tornillo que sujeta el extremo de la sonda.


Para cambiar el calefactor de la sonda:


2. Aflojar los dos tornillos de ajuste de la base del extremo de la sonda y extraer el extremo de la sonda.

3. Separar el calefactor del conjunto de la sonda, manteniéndolo paralelo al eje de ésta.

4. Instalar cuidadosamente el nuevo calefactor en la sonda. Proceder con cuidado para no dañar el capilar de sílice fundida.

5. Volver a colocar el extremo de la sonda y asegurar los dos tornillos de ajuste.



172 Mantenimiento

6.4.5 Sustitución del capilar de sílice fundida de APcI y del filtro

Sustituir el capilar de sílice fundida o el filtro cuando la intensidad de la señal disminuye y la presión de trabajo aumenta.



• Llave fija de 8 mm (5/16 in).

• Dos llaves fijas de 11 mm (7/16 in).

• Cuchilla de cerámica para cortar capilares (del kit de herramientas).

• Encendedor de gas butano o cerillas.



• Toallitas de papel que no suelten pelusa.


6.4.5.2 Recambios

• Dos férulas GVF004.

• Sílice fundido.

• Filtro.


Para cambiar el capilar de sílice fundida y el filtro:


2. Extraer el extremo de la sonda y el calefactor de la sonda.

3. Retirar los dos tornillos de cabeza con ranuras con ayuda del destornillador plano.

4. Aflojar los dos tornillos de ajuste del filtro de LC con la llave hexagonal de 1,5 mm y extraer el extremo de la sonda.



5. Extraer el cartucho del filtro de la tuerca doble mediante una llave de 8 mm (5/16 in) y otra de 11 mm (7/16 in). Si la férula sigue dentro del cartucho, debe extraerse.

6. Separar las dos mitades del cartucho del filtro con dos llaves de 11 mm (7/16 in).

7. Sacar el filtro viejo y sustituirlo por uno nuevo.

8. Desenroscar la tuerca doble de la sonda con una llave de 8 mm (5/16 in). Desechar el capilar de sílice fundida.

9. Mediante la cuchilla de cerámica para cortar capilares, cortar una nueva sección de sílice fundida de 161,5 mm de largo. Cortar el capilar en ángulo recto. Comprobar que los nuevos cortes sean perpendiculares mediante una lupa.

10. Quemar aproximadamente 20 mm del extremo de la capa de poliamida que recubre el capilar y limpiar éste con papel empapado en metanol.

11. Insertar una férula GVF004, la tuerca doble y, a continuación, otra férula GVF004 en el capilar.

12. Colocar el filtro con la flecha indicadora de la dirección del flujo apuntando hacia la tuerca doble y enroscar ésta al filtro. Comprobar que el capilar sea perpendicular al interior del cartucho del filtro.

13. Apretar la tuerca hasta que el capilar esté bien sujeto y tirar de él con suavidad para comprobar que no se mueve.

14. Insertar el capilar de la muestra en la sonda y apretar la tuerca doble de la sonda con cuidado mediante la llave de 8 mm (5/16 in). El capilar debe sobresalir 1,0 mm del tubo de nebulización.

15. Volver a colocar la cubierta del extremo de la sonda y los tornillos de ajuste.

16. Asegurar los tornillos de la cubierta del extremo de la sonda mediante la llave hexagonal de 1,5 mm para fijar el filtro en su sitio.

17. Volver a fijar el extremo de la sonda y el calefactor.

Precaución: Si se aprieta demasiado la tuerca doble se podría dañar el capilar.

174 Mantenimiento

Capítulo 7Diagnóstico y corrección de anomalías

En este capítulo se describe el diagnóstico de las anomalías que Quattro micro API puede presentar y los procedimientos recomendados para su corrección. Este capítulo incluye:

• Seguridad y manejo.

• Diagnóstico general.

• Diagnóstico y corrección de anomalías en los componentes.

7.1 Recambios

Las piezas que no aparecen en este documento no deben ser sustituidas por el cliente.

7.2 Seguridad y manejo

A la hora de diagnosticar y corregir las anomalías de Quattro micro API, se deberán tener en cuenta las siguientes consideraciones de seguridad:

Advertencia: Para evitar el riesgo de descargas eléctricas, no se debe desconectar ningún componente eléctrico cuando Quattro micro API esté conectado a la alimentación. Antes de desconectar cualquier pieza, se debe apagar el instrumento y esperar unos 10 segundos aproximadamente.

Advertencia: Para evitar el riesgo de descargas eléctricas, no se deben retirar los paneles del instrumento. Este dispositivo no contiene ninguna pieza cuyo mantenimiento pueda ser realizado por el usuario.

Recambios 175

7.3 Diagnóstico y corrección de anomalías del sistema

Los pasos básicos para diagnosticar y corregir las anomalías del sistema son los siguientes:

• En primer lugar, examinar el sistema comprobando las cuestiones más básicas. Es necesario comprobar que la causa del problema no sea una cuestión obvia (por ejemplo, que el instrumento y los cables no estén conectados adecuadamente o que exista una fuga de líquido, vacío o gas).

• Comparar el funcionamiento actual del sistema con el funcionamiento anterior a la aparición de la anomalía. Para poder identificar fácilmente las condiciones de funcionamiento normales se debe realizar lo siguiente:

– Registrar un diagrama del sistema de cromatografía líquida (LC) (conexiones fluídicas y eléctricas).

– Mantener un registro diario de sus operaciones.

– Realizar análisis de muestras de prueba regularmente. Verificar el rendimiento del instrumento con muestras conocidas, preferiblemente las utilizadas para la aceptación del instrumento.

Esto muestra la importancia de realizar un seguimiento de los parámetros del sistema y del rendimiento cuando el sistema funciona con normalidad. Resulta mucho más fácil detectar y corregir cualquier anomalía si se conocen las condiciones de funcionamiento normales del sistema.

Por ejemplo, se debe comprobar que los parámetros de ajuste del sistema sean similares a los utilizados con la muestra de prueba. Para obtener una sensibilidad óptima, se debe comprobar si se requieren parámetros de la lente con valores superiores a los configurados anteriormente. Si se tienen que utilizar valores extremos para conseguir buenos resultados, alguna parte del sistema necesita una mayor atención.

Advertencia: Para evitar accidentes, se deberán cumplir las buenas prácticas del laboratorio al manejar los disolventes, cambiar los tubos o trabajar con Quattro micro API. Se deben conocer las propiedades fisicoquímicas de los disolventes utilizados. Se recomienda leer atentamente las hojas de datos sobre seguridad de materiales de éstos.

Precaución: Para evitar deteriorar los circuitos por la electricidad estática, no se deben tocar los chips de los circuitos integrados ni otros componentes, a menos que requieran específicamente un ajuste manual.

176 Diagnóstico y corrección de anomalías

• Verificar una por una y descartar posibles causas para detectar el parámetro del sistema que es atípico.

• Se debe consultar la información sobre detección y corrección de anomalías que aparece en secciones posteriores. Estas tablas permiten identificar las causas posibles de un problema y sugieren las acciones correctivas que se deben aplicar.

Si se llega a la conclusión de que el problema viene causado por un componente de otro sistema, (por ejemplo, HPLC, inyector automático, detector UV, etc.), se deberá consultar el manual de funcionamiento correspondiente.

7.4 Detección y corrección de anomalías del hardware

En las siguientes tablas se proponen sugerencias para la resolución de problemas de hardware.

Detección y corrección de anomalías del hardware 177

7.4.1 No aparecen picos en la pantalla de ajuste (no hay haz de iones)

Causa posible Acción correctiva

Los parámetros de funcionamiento asignados en la página de ajuste no son correctos. Por ejemplo: Capillary/Corona (Capilar /Corona), Cone (Cono), Extractor, RF Lens (Lente RF), Ion Energy (Energía iónica), Gas Nitrogen (Nitrógeno gas) y Heaters (Calefactores).

Optimizar parámetros. Consultar la Sección 2.4.2 en la página 30.

Una vez obtenido el haz de iones, verificar que el funcionamiento de todas las lentes es el apropiado y razonable para el haz.

Los cables no están bien conectados. Comprobar que todos los cables necesarios estén conectados correctamente a la fuente y a la sonda.

El instrumento no está en modo operativo. Poner el instrumento en funcionamiento haciendo clic en Operate (Funcionamiento).

Una en modo operativo, el icono se volverá verde y la luz verde del LED de funcionamiento (Operate) del panel frontal estará encendida.

Fallo de comunicación. Reinicializar seleccionando Options (Opciones) en la página de ajuste. Reinicie el PC incorporado.

No hay muestra. Comprobar que la muestra está correctamente cargada en el inyector automático o en la jeringa de la bomba de jeringa.

La válvula de aislamiento está cerrada. Abrir la válvula de aislamiento.

Los componentes de la fuente están sucios. Limpiar los componentes. Consultar la Sección 6.3.4 en la página 152.

Flujo de nitrógeno insuficiente. Verificar que la presión de nitrógeno es de 6 a 7 bares (de 90 a 105 psi) y que el caudal del gas de la pantalla de ajuste es de >100 L/h.

Los calefactores de desolvatación y de la sonda se apagan cuando el flujo de nitrógeno desciende a menos de 50 L/h.


No hay flujo en el sistema de cromatografía líquida (LC).

Comprobar el flujo de eluyente del inyector automático o la bomba de jeringa.

Fuga de líquido en el sistema de HPLC. Sustituir los capilares de sílice fundida de ionización a presión atmosférica (APcI).

Consultar la Sección 6.4.5 en la página 173.

Los componentes de la fuente no se han montado correctamente.

Comprobar que las lecturas del voltaje de la fuente y de la sonda varían según los valores adjudicados en la página de ajuste.

Si no aparece alguno de estos voltajes, desmontar y volver a montar correctamente las lentes de la fuente y del hexapolo. Consultar la Sección 6.3.4 en la página 152 y la Sección 6.3.4.6 en la página 162.

Capilar de ESI o APcI obstruido. Sustituir capilar.

Consultar la Sección 6.4.2 en la página 169 y la Sección 6.4.5 en la página 173.



7.4.2 Picos inestables o de baja intensidad (haz de iones)


Mala nebulización. Comprobar que las temperaturas de desolvatación y de la fuente, y los parámetros de caudal del gas son los apropiados.

La presencia de líquido dentro de la carcasa de la fuente indica que la temperatura es demasiado baja.

Verificar que la presión de nitrógeno es de 6 a 7 bares (de 90 a 100 psi) y que el caudal del nitrógeno de desolvatación es superior a 100 L/h.

Comprobar la estabilidad del flujo de nitrógeno (con un regulador de buena calidad de dos fases).

Problema con la inyección de la muestra (inyector automático, bomba de jeringa o sistema HPLC).

Realizar una detección y corrección de anomalías del inyector automático.

Comprobar la jeringa de la bomba de jeringa en busca de pérdidas y de fallos de la conexión a tierra.

Comprobar que haya suficiente muestra en los viales.

Buscar variaciones de la presión en la inyección.

Fuga de líquido en el sistema de HPLC. Buscar fugas en el sistema de HPLC y repararlas.

Es necesario limpiar los componentes de la fuente.

Limpiar los componentes. Consultar la Sección 6.3.4 en la página 152.

Los parámetros de las lentes son erróneos o atípicos.

Comprobar que todos los ajustes son los correctos.

Comprobar que las lecturas son las correctas.

Comprobar que los parámetros de las lentes son correctos para el haz.


Rampa de voltaje de la cámara de colisión o el cono activada.

Apagar la rampa de voltaje.

Capilar ESI o APCI instalado incorrectamente.

Comprobar que la sonda está en la posición correcta.

Comprobar que el capilar de acero inoxidable de la sonda de ESI sobresale 0,5 mm (consultar la Sección 6.4.2 en la página 169).

Comprobar que la altura del capilar de APcI sea 1,0 mm. Consultar la Sección 6.4.5 en la página 173.

Electrodo de descarga en corona incorrectamente alineado.

Comprobar la alineación que se describe en Sección 6.3.5 en la página 164.

Presión del gas de CID incorrecta. Inyectar la muestra y optimizar la presión del gas.

Comprobar que el valor del regulador del gas de CID sea 0,5 bares y que no haya fugas.

Parámetros de la cámara de colisión incorrectos.

Comprobar que los parámetros Entrance (Entrada), Exit (Salida) y Collision (Colisión) están optimizados, con lecturas correctas.

Parámetros de analizador y multiplicador incorrectos.

Comprobar que el valor del parámetro Multiplier (Multiplicador) es 650 V y que los parámetros de la energía iónica y la resolución son los correctos para la adquisición.



7.4.3 Presión de trabajo del sistema de cromatografía líquida (LC) anormalmente elevada

7.4.4 Presión de trabajo del sistema de cromatografía líquida (LC) anormalmente baja


Bloqueo en el capilar o en el bucle de inyección debido a la presencia de partículas de la muestra.

Retirar la sonda de la fuente y aumentar el caudal de disolvente a 500 µL/min para desobstruir el capilar.

Filtro de la sonda de ionización a presión atmosférica (APcI) obstruido.

Sustituir el filtro. Consultar la Sección 6.4.5 en la página 173.

Tubo del sistema de cromatografía líquida (LC) obstruido.

Desenroscar la tuerca y retirar el tubo de la parte posterior de la sonda.

Si la presión de trabajo sigue siendo alta, sustituir el tubo.

Capilar de la muestra de acero inoxidable de ESI ubicado dentro de la sonda obstruido.

Sustituir el capilar. Consultar Sección 6.4.2 en la página 169).

El capilar de ESI no está bien asentado en la conexión al sistema de cromatografía líquida (LC) o el capilar de APcI no está bien conectado al filtro.

Extraer la sonda, desmontarla y colocar bien el capilar en la conexión.

Conector con fugas. Comprobar todas las conexiones y apretarlas si fuera necesario.

Problema en el flujo del eluyente del cromatógrafo líquido (LC).

Comprobar si hay algún problema en el sistema de cromatografía líquida (LC).

Célula de flujo del detector UV rota. Cambiar la celda de flujo.


7.4.5 Vacío insuficiente

Cualquier lectura superior a 5 × 10-4 mbar en el medidor Pirani, cuando el gas de CID está cerrado.

7.4.6 Fuga de nitrógeno

Sonido sibilante u olor a disolvente.


Fugas en las arandelas del bloque de ionización.

Desmontar la fuente y comprobar el estado de las arandelas del bloque de ionización.

Consultar la Sección 6.3.4 en la página 152.

Mal funcionamiento de la bomba rotatoria. Realizar el “gas-ballast” de la bomba rotatoria para devolver el aceite acumulado del filtro de vapores del aceite.

Comprobar el aceite de la bomba de vacío. Si está sucio, aclarar la bomba con aceite limpio y llenarla de nuevo.

Repetir en caso necesario.

Fuga en los conductos internos o externos de la bomba de vacío.

Comprobar que no haya fugas ni fisuras en los conductos.

Tubo de evacuación de la bomba de vacío doblado o torcido.

Comprobar que no haya obstáculos en el tubo de evacuación.

Funcionamiento de la bomba turbomolecular incorrecto.

Comprobar la velocidad de la bomba turbomolecular en la página de ajuste de Diagnostics (Diagnósticos).


Carcasa de la fuente mal sellada. Inspeccionar visualmente las superficies de sellado de la carcasa de la fuente para comprobar la inexistencia de imperfecciones o fisuras.

Revisar también el estado de las arandelas revestidas.


7.4.7 Aceite de vacío depositado en el tubo de evacuación

7.4.8 Funcionamiento incorrecto del calefactor de fuente y de desolvatación

7.4.9 Funcionamiento incorrecto del calefactor de APcI


Se debe cambiar el filtro de vapores del aceite.

Cambiar el filtro del aceite y el filtro de olores.


Error en el calefactor de la fuente. Comprobar lectura. Sustituirlo si es necesario.

Error del fusible de la tarjeta de circuitos impresos del sistema principal.

Comprobar la lectura de la temperatura de desolvatación. Ponerse en contacto con Micromass en caso de que no sea la correcta.


Si el calefactor de desolvatación funciona bien en el modo de ESI, habrá que cambiar el calefactor de APcI.

Sustituir el calefactor de APcI. Consultar la Sección 6.4.4 en la página 172.


7.4.10 Error del fusible de la bomba rotatoria

7.4.11 Fallo en el modo de ionización

Las opciones del menú desplegable están desactivadas o el instrumento cambia el tipo de sonda de forma espontánea.


Filtro de vapores del aceite saturado.

También es posible que el aceite se esté acumulando en el tubo de evacuación.

Cambiar el filtro de vapores del aceite y el filtro de olores.

Sustituir el fusible.

Se debe realizar un “gas-ballast” del sistema.

Realizar un “gas-ballast” en la bomba durante 20 ó 30 minutos. Consultar la Sección 6.3.1 en la página 149.

Voltaje de la CA inferior a 208 V. Verificar el voltaje de CA al que está conectado el instrumento (un electricista cualificado).

Aceite de la bomba muy sucio. Cambiar el aceite. Consultar la Sección 6.3.3 en la página 151.


Una o dos de las clavijas de identificación de la sonda encasquilladas y sin contacto con la plataforma de soporte de la sonda.

Retirar la cubierta de la sonda, sacar la clavija de contacto y comprobar que las dos clavijas y sus muelles se mueven libremente en su soporte.


7.4.12 Error al reconocer un tipo de sonda en concreto

7.4.13 Fluctuaciones

Los picos y la línea de base varían de intensidad cíclicamente.


Problema en la sonda. Retirar la sonda defectuosa e insertar otra de la misma clase.

Comprobar que el voltaje de Source Recognition ID (ID de reconocimiento de fuente) de la página Diagnostics (Diagnósticos) es <2 V para la ESI y >2 V para la APcI.


Flujo irregular de eluyente del cromatógrafo líquido (LC).

Comprobar si hay algún problema en el sistema de cromatografía líquida (LC).

Mala nebulización debida a una temperatura y parámetros de flujo de gas incorrectos.

Ajustar la temperatura y los parámetros de flujo del gas. La presencia de líquido dentro de la carcasa de la fuente indica que la temperatura es demasiado baja.

Vibraciones causadas por la bomba rotatoria o por otros equipos presentes en el edificio.

Buscar y eliminar las vibraciones excesivas en la parte superior del banco y en el instrumento.


7.4.14 Pérdida de comunicación con el instrumento

7.4.15 Errores en la comunicación IEEE


Error en el sistema de comunicación entre el ordenador principal de MassLynx y el instrumento.

Restablecer la estación de trabajo y reiniciar el PC integrado desde el panel frontal mediante un pequeño trozo del tubo PEEK para conectar el botón de reinicio. Consultar la Figura 1-10 en la página 12.

Esperar 3 minutos a oír la señal que indica que el PC integrado se ha iniciado procedente de Quattro micro API antes de iniciar MassLynx.


Secuencia de encendido de los instrumentos incorrecta.

Apagar los componentes del sistema y volverlos a encender en el orden correcto, es decir:

1. Estación de trabajo.

2. Quattro micro API.

3. Módulos de admisión.

Esperar 3 minutos a oír la señal que indica que el PC integrado se ha iniciado procedente de Quattro micro API antes de iniciar MassLynx.

Dirección IEEE incorrecta o contradictoria.

Comprobar los parámetros IEEE del sistema y escribir las direcciones correctas.

Cable IEEE defectuoso en la secuencia IEEE.

Cambiar los cables IEEE uno por uno hasta localizar el cable defectuoso.

Cables de red confundidos con la red local. Comprobar que el cable de red del instrumento está conectado a la tarjeta de red correcta del PC.

Comprobar que la tarjeta de red con el conector BNC está configurada para la red local.


7.5 Niveles de ruido elevados en análisis MRM

El ruido de fondo del análisis de MRM puede ser electrónico o químico. Para distinguir entre ellos, se deberá:

1. Iniciar una adquisición.

2. Durante la adquisición, asignar valores negativos a Ion Energy 1 (Energía iónica 1) e Ion Energy 2 (Energía iónica 2) en la pantalla de ajuste.

Una disminución significativa de la señal cuando los valores de las energías iónicas son negativos significará que la principal contribución al ruido general es química.

Cualquier ruido residual será electrónico.

7.5.1 Ruido químico


Ruido de fondo elevado debido a contaminación cruzada tras el ajuste con concentraciones elevadas.

Repetir inyecciones de ácido fórmico al 10 % o isopropanol.

Inyector contaminado. (Se observa señal al inyectar fase móvil.)

Repetir inyecciones de ácido fórmico al 10 % o isopropanol.

Tubo contaminado. Sustituir el tubo.

Sonda contaminada. Aclarar con metanol a 0,5 mL/min hasta que el nivel de ruido de fondo descienda.

Sustituir el capilar de acero inoxidable de ESI. Consultar la Sección 6.4.2 en la página 169.Sustituir el capilar de sílice fundida de ionización a presión atmosférica (APcI). Consultar Sección 6.4.5 en la página 173.

Sistema de HPLC contaminado. Bombear fase móvil con la bomba de jeringa. Comparar los niveles de ruido de fondo de MRM. Comprobar la pureza de los disolventes. Sustituir en caso necesario. Comprobar que todos los disolventes sean de calidad de HPLC.

Material de vidrio contaminado. Verificar que el material de vidrio no se ha limpiado con tensioactivos comerciales.


7.6 Ruido electrónico

7.7 Teléfono de contacto de Waters

El usuario puede corregir muchos de los problemas de Quattro micro API. Sin embargo, si éste no fuera el caso, se debe llamar al servicio técnico de Waters, al número 902 254 254.

Para optimizar el proceso de solicitud de servicio técnico a Waters, es conveniente tener la siguiente información a mano:

• Naturaleza del problema.

• Número de serie de Quattro micro API.

• Datos del caudal, las fases móviles y las concentraciones de la muestra.

• Datos de la presión de la cámara de gas.

• Ajustes de la página de ajuste.

• Referencia de actualización de la versión del software.

Acción correctiva

Verificar que los valles del ruido pico a pico (con valores negativos de las energías iónicas) apenas tocan la línea de base. Aumentar Ion Counting Threshold (Umbral de recuento de iones) para ajustarlo.

Ruido electrónico 189

Capítulo 8Información de referencia


Los archivos de referencia del calibrado constan de dos columnas de números separadas por un número cualquiera de espacios o caracteres de tabulación. En la primera columna se encuentran las masas de picos de referencia y en la segunda las intensidades de picos de referencia.

En los archivos de referencia de este capítulo la intensidad de los iones se ha establecido en 100 %. Si bien no todas las intensidades de los iones son de 100 %, el software de calibrado no las tiene en cuenta y este método resulta muy apropiado para almacenar los archivos de referencia en el formato seleccionado. No obstante, en caso necesario, se pueden introducir los valores de intensidad reales para mejorar el aspecto de los espectros de referencia.

Casi todas las muestras se pueden adquirir en la empresa Sigma. Para realizar un pedido, se recomienda ponerse en contacto con Sigma en la dirección http://www.sigma.sial.com. En la página Web aparece un listado de todas sus oficinas, muchas de ellas con números locales gratuitos.

8.2 Modificación de un archivo de referencia

Se pueden crear o modificar archivos de referencia del calibrado mediante cualquier editor de textos de Windows®. Para leer el archivo de referencia seleccionado, se deben realizar las acciones siguientes en el editor de textos del Bloc de notas:

Pulsar o seleccionar Reference File (Archivo de referencia) en el menú Calibration, Edit (Calibrado, Modificar).

Para guardar el archivo de referencia después de la modificación, existen dos opciones:

Seleccionar Save (Guardar) en el menú Notepad File (Archivo de bloc de notas) para guardar el archivo con su nombre actual.


O bien:

Seleccionar Save As (Guardar como) en el menú Notepad File (Archivo de bloc de notas) para guardar el archivo como un archivo de referencia nuevo con un nombre nuevo.

El archivo de referencia puede contener información en forma de texto o comentarios. Las filas con información de texto o comentarios deberán empezar con un punto y coma (;).

8.3 Ionización positiva

Nombre arch. ref.

Nombre químico[n.º código Sigma]

Masa molecular

masa/carga Usos

UBQ Ubicuitina bovina [U6253] 8 564,85 De 650 a 1500

General

HBA α globina humana [H753] 15 126,36 De 700 a 1500

Análisis Hb

SOD Superóxido dismutasa [S2515] 15 591,35 De 900 a 1500

Hb (calibrado interno)

HBB β globina humana [H7379] 15 867,22 De 800 a 1500

Análisis Hb

MYO Mioglobina de corazón de caballo [M1882]

16 951,48 De 700 a 1600

General

PEGH1000 Mezcla de polietilenglicol + acetato amónico

PEG 200+400+600+1000

De 80 a 1000 Calibrado ES+ y APCI+

PEGH2000 Mezcla de polietilenglicol + acetato amónico

PEG 200+400+600+1000+1450

De 80 a 2000 Calibrado ES+

NAICS Mezcla de yoduro de sodio y yoduro de cesio

De 20 a 4000 Calibrado ES+, general

NAIRB Mezcla de yoduro de sodio y yoduro de rubidio

De 20 a 4000 Calibrado ES+

192 Información de referencia

8.3.1 Mioglobina de corazón de caballo

Archivo de referencia: MYO.REF

Peso molecular: 16 951,48

8.3.2 Polietilenglicol

PEG + NH4+

Archivos de referencia: PEGH1000.REF, PEGH2000.REF

Estado de

carga

Valor de relación

masa/carga calculado

Estado de

carga

Valor de relación


Estado de

carga

Valor de relación


28+ 606,419 21+ 808,222 13+ 1304,969

616,177 20+ 848,583 12+ 1413,633

27+ 628,841 19+ 893,192 11+ 1542,053

26+ 652,989 18+ 942,758 10+ 1696,158

25+ 679,068 17+ 998,155 9+ 1884,508

24+ 707,320 16+ 1060,477 8+ 2119,945

23+ 738,030 15+ 1131,108 7+ 2422,651

22+ 771,531 14+ 1211,829

Valor de relación masa/carga calculado

63,04 459,28 855,52 1251,75 1647,99

107,07 503,31 899,54 1295,78 1692,01

151,10 547,33 943,57 1339,80 1736,04

195,12 591,36 987,60 1383,83 1780,07

239,15 635,39 1031,62 1427,86 1824,09

283,18 679,41 1075,65 1471,88 1868,12

327,20 723,44 1119,67 1515,91 1912,15

371,23 767,46 1163,70 1559,94 1956,17

415,25 811,49 1207,73 1603,96 2000,20

Ionización positiva 193

8.3.3 Mezcla de yoduro de sodio y yoduro de cesio

Archivo de referencia: NAICS.REF

8.3.4 Yoduro de sodio y yoduro de rubidio

Archivo de referencia: NAIRB.REF


22,9898 772,4610 1671,8264 2571,1918 3470,5572

132,9054 922,3552 1821,7206 2721,0861 3620,4515

172,8840 1072,2494 1971,6149 2870,9803 3770,3457

322,7782 1222,1437 2121,5091 3020,8745 3920,2400

472,6725 1372,0379 2271,4033 3170,7688

622,5667 1521,9321 2421,2976 3320,6630


22,9898 772,4610 1671,8264 2571,1918 3470,5572

84,9118 922,3552 1821,7206 2721,0861 3620,4515

172,8840 1072,2494 1971,6149 2870,9803 3770,3457

322,7782 1222,1437 2121,5091 3020,8745 3920,2400

472,6725 1372,0379 2271,4033 3170,7688

622,5667 1521,9321 2421,2976 3320,6630


8.4 Ionización negativa

El objetivo de utilizar yoduro de rubidio consiste en obtener un pico con una relación masa/carga de 85 (85Rb+) con una intensidad cercana al 10 % del pico base con una masa/carga de 173. El yoduro de rubidio tiene la ventaja de que no forma agregados de rubidio que pueden complicar el espectro. Obsérvese que el rubidio tiene dos isótopos (85Rb y 87Rb) en la proporción 2,59:1, que generan picos con unas relaciones masa/carga de 85 y 87.

Se deberá utilizar el archivo de referencia NAIRB.REF.

8.4.1 Solución de yoduro de sodio para la ionización por electrospray negativa

Se puede utilizar cualquiera de las soluciones anteriores para el calibrado en el modo de ionización negativa. En ambos casos el primer pico de referencia negativo aparece con una relación masa/carga de 127 (I-) y el resto de los picos se deben a agregados de NaI.

Se debe utilizar el archivo de referencia NAINEG.REF.

Nombre arch. ref.

Nombre químico[n.º código Sigma]

Masa molecular

masa/carga Usos

MYONEG Mioglobina de corazón de caballo [M1882]

16 951,48 De 700 a 2400

General

SUGNEG Mezcla de azúcares: maltosa [M5885]rafinosa [R0250]maltotetrosa [M8253]sirope de maíz [M3639]

De 100 a 1500

Rango de masas bajo

NAINEG Mezcla de yoduro de sodio/yoduro de cesio (o yoduro de rubidio)

200 a 3900 ES- calibrado

Ionización negativa 195

Apéndice ACaracterísticas del entorno

A.1 Acceso

Si se va a transportar el instrumento y es necesario cruzar el umbral de una puerta, éste deberá ser de 0,6 m (24 in) de ancho como mínimo. Los ascensores y los pasillos deben tener una anchura suficiente como para permitir que se sorteen las esquinas. Es posible que se deban tomar medidas especiales si el acceso al laboratorio se realiza a través de una escalera.

A.2 Ubicación

A.2.1 Quattro micro API

El instrumento Quattro micro API se puede instalar sobre cualquier mesa de laboratorio plana.

No debe situarse cerca de maquinaria pesada (compresores, generadores, etc.), ya que los dispositivos de este tipo provocan una vibración excesiva del suelo.

No debe ubicarse dentro de un campo de radiofrecuencia superior al especificado en IEC 801-3 nivel de gravedad 2.

Las posibles fuentes de radiofrecuencias son, entre otras: sistemas de alarma o redes LAN conectados mediante radiofrecuencia, teléfonos portátiles y transmisores portátiles.

El instrumento debe situarse alejado de campos magnéticos fuertes, como los generados por sistemas de resonancia magnética nuclear (NMR) y espectrómetros de masas de sector magnético.

Se entrega con un cable de alimentación de 2,5 m (8 pies) que debe conectarse a la parte posterior del chasis. El interruptor de encendido/apagado está ubicado en el panel frontal.

Se recomienda ubicar el instrumento Quattro micro API en el extremo derecho de una mesa con la finalidad de dejar espacio para los componentes electrónicos.

Acceso 197

A.2.2 Bomba rotatoria de vacío

La bomba rotatoria debe instalarse debajo o detrás del instrumento Quattro micro API, a una distancia de 1,5 m (5 pies) como máximo de la parte posterior del chasis. La bomba rotatoria se acompaña de un cable de alimentación de 2 m (6,5 pies) que se conecta a la parte posterior del chasis del instrumento. Se recomienda que la bomba rotatoria se eleve entre 15 y 20 cm (de 6 a 8 in) del suelo para facilitar el mantenimiento sistemático, como el cambio del aceite de la bomba.

Si la bomba rotatoria está ubicada bajo la mesa del instrumento, es posible que se deba realizar una ranura de acceso en la parte superior de la mesa para los tubos de vacío procedentes del instrumento (se recomienda consultar la Figura A-1 para conocer las especificaciones). La ranura de acceso de los tubos de vacío debe estar en el espacio ocupado por el instrumento y a 800 mm (31,3 in) de la ubicación propuesta para la parte frontal del instrumento.

A.2.3 Sistema de tratamiento de datos

El sistema de tratamiento de datos debe estar situado a 5 m (16 pies) como máximo del espectrómetro de masas para permitir la conexión de los cables de comunicación. Los cables de alimentación del sistema de tratamiento de datos son de, aproximadamente, 2 m (6,5 pies) de longitud. En la Figura A-2 se muestra una disposición habitual del sistema de tratamiento de datos.

A.2.4 Sistema de cromatografía líquida (LC)

Se recomienda comprobar que se deja el espacio apropiado a la izquierda del instrumento para el sistema de HPLC. Para obtener información sobre los requisitos de espacio individuales, se aconseja consultar los manuales de usuario asociados.

198 Características del entorno

A.3 Dimensiones y espacios libres

Figura A-1 Espacios libres horizontales

Dimensiones y espacios libres 199

Figura A-2 Sistema de tratamiento de datos

Figura A-3 Espacios libres verticales


Se aconseja dejar los espacios libres mínimos siguientes para facilitar el mantenimiento y la ventilación:

• 20 cm (8 in) a la derecha (nota: se necesitan 0,5 m [20 in] para el mantenimiento periódico de la tarjeta de circuitos impresos principal; se aconseja consultar la Figura A-3)

• 28 cm (11 in) en la parte superior.

El instrumento puede estar de espaldas a una pared con un espacio libre para la ventilación de 10 cm (4 in) como mínimo entre la pared y la parte posterior del instrumento.

A.3.1 Altura

572 mm (23 in)

A.3.2 Longitud

880 mm (34,6 in)

A.3.3 Anchura

390 mm (15,4 in)

A.4 Peso

La mesa de laboratorio debe poder soportar el peso total del sistema.

Instrumento: 115 kg (253 lb).

Sistema de tratamiento de datos (ordenador, monitor e impresora opcional): 50 kg (110 lb).

Peso total: 165 kg (363 lb).

A.4.1 Elevación y transporte

Debido a que el instrumento pesa 115 kg (253 lb), se recomienda utilizar un equipo de elevación adecuado o un número apropiado de personas físicamente capaces de levantar una unidad de este peso, colocadas de forma que haya una distribución igualada de la carga. El personal de Waters no está autorizado para levantar manualmente el instrumento sin la ayuda apropiada.

Peso 201

Como norma general antes de levantar, bajar o trasladar el instrumento:

• Comprobar el riesgo de daños personales.

• Realizar las acciones necesarias para eliminar el riesgo.

Si todavía existe algún riesgo:

• Planificar la operación con antelación con el técnico de Waters.

• Utilizar personal cualificado, cuando sea necesario.

• Cumplir las normativas aplicables locales o de la empresa.

A.5 Temperatura de trabajo

La temperatura ambiente debe situarse entre los 15 y los 28 ºC (de 59 a 82 ºF) con una variación a corto plazo (1,5 h) de 2 ºC (4 ºF) como máximo. La temperatura ambiente de funcionamiento de la bomba rotatoria debe estar entre 15 y 40 ºC (de 59 a 104 ºF).

La disipación de calor general máxima en el interior de una sala es de 3,0 kW. Esta cifra no tiene en cuenta el equipo auxiliar, como los sistemas de cromatografía líquida (LC). Es posible que se deba instalar un equipo de aire acondicionado o, en caso de que ya exista, que se deba ampliar para compensar la carga calorífica adicional de la sala.

A.6 Humedad

La humedad relativa no debe exceder el 70 %. Se recomienda que el instrumento se sitúe en una posición no expuesta a corrientes, en un laboratorio con aire acondicionado que no presente acumulaciones excesivas de polvo.

A.7 Temperatura de transporte y almacenamiento

De –20 a 60 °C (de –4 a 140 °F).


Apéndice BEspecificaciones eléctricas

B.1 Instalación

Se recomienda que la instalación eléctrica en el laboratorio incluya un disyuntor de emergencia de pared de la intensidad nominal adecuada, protegido mediante un interruptor ajustado a la intensidad nominal correcta. El disyuntor debe estar claramente etiquetado como “Espectrómetro de masas” y debe ser fácilmente accesible durante una desconexión de emergencia, sin riesgo de tropiezos o resbalones. Es preferible que el disyuntor se pueda bloquear en la posición de apagado para evitar que personal no autorizado lo conecte. El instrumento Quattro micro API debe disponer de una alimentación con conexión a tierra que cumpla las especificaciones de voltaje y corriente del país, recogidas a continuación:

Canadá:

El usuario debe proporcionar una alimentación protegida por fusible, a una intensidad nominal de 14 A.

Reino Unido:

El cable está protegido a 13 A.

Quattro micro API (incluida la bomba rotatoria de vacío)

Voltaje y frecuencia 230 V, 50/60 Hz (+8 %, -14 %)

Corriente mínima 13 A

Corriente máxima 16 A

Consumo 2,0 kW

Cable de alimentación suministrado

2,5 m (8 pies), con enchufes locales, como se indica a continuación.

Instalación 203

Japón:

Se debe proporcionar una alimentación neutro-fase de 200 V al 5 %, de 3 cables, monofásica, de intensidad nominal entre 13 y 16 A. Asimismo, se debe solicitar un transformador a Waters para aumentar el voltaje de entrada.

Australia y Nueva Zelanda:

Este equipo se ha diseñado de acuerdo con el estándar de seguridad internacional IEC1010-1 (EN61010-1). Para que sea completamente efectivo, la instalación del edificio debe cumplir la norma AS 3000: instalaciones eléctricas de Australia y Nueva Zelanda.

Resto del mundo:

El usuario debe proporcionar una alimentación protegida por fusible, a una intensidad nominal de entre 13 y 16 A.

Figura B-1 Conectores suministrados

Para países con una alimentación de CA de 60 Hz (como EE.UU.), si el voltaje de alimentación es inferior a 208 V CA, se recomienda utilizar un transformador elevador para aumentar el voltaje a entre 208 y 230 V CA.

EE.UU.NEMA L6-15P, 15 A

EUROPAEnchufe para Europa de 2 clavijas, de conformidad con los estándares CEE7

REINO UNIDOEnchufe para el R.U. de 3

clavijas, protegido por fusible a 13 A, BS1633

204 Especificaciones eléctricas

La alimentación de la red eléctrica dispone de una capacidad de apagón parcial del ±10 %, es decir, el 10 % durante 0,3 segundos y una oscilación transitoria de ≤20 ms a la mitad del voltaje de la red eléctrica.

Nota: Se deben proporcionar los zócalos apropiados para los conectores mostrados.

Si se necesita un conector distinto a los mostrados, el usuario deberá obtener el conector y el zócalo apropiados.

El instrumento se entrega con un cable de alimentación de 2,5 m (8 pies) que debe conectarse a la parte posterior del chasis. El interruptor de encendido/apagado de Quattro micro API está ubicado en el panel frontal.

B.1.1 Frecuencia de la línea

50 Hz, de 47 a 53 Hz.

60 Hz, de 57 a 63 Hz.

B.1.2 Fusibles

10 A, 250 V CA.

B.2 Seguridad eléctrica

El instrumento Quattro micro API cumple la directiva europea sobre seguridad eléctrica definida en IEC 1010 y el estándar internacional IEC 1010-1 (EN61010-1).

IEC 1010 Sección 1 Enmienda 2. El instrumento está clasificado como Grado de polución 1 y Categoría de la instalación 2.

Para Australia y Nueva Zelanda: la instalación del edificio debe cumplir la norma AS 3000.

Seguridad eléctrica 205

206 Especificaciones eléctricas

Apéndice CEspecificaciones de funcionamiento

C.1 Ionización positiva por electrospray

La relación señal/ruido medida obtenida mediante el control de cromatograma de la transición de la relación masa/carga de 609 a 195 en una inyección de 10 pg (16 fmol) de reserpina será >20:1.

10 µL de una solución de reserpina de 1 pg/µL en acetonitrilo/agua 50/50 (sin aditivos) se inyectarán a un caudal de 200 µL/min, en modo MRM, con una residencia de 1 segundo y un intervalo de medida de 0 Da. La resolución del ión a una relación de masa/carga de 609 será una anchura de pico de ≤1 Da a media altura (MS1 y MS2).

C.2 Ionización negativa por electrospray

La relación señal/ruido medida en el pico [M-H]- en una relación masa/carga de 503 de un consumo de muestra de 10 ng de rafinosa será >100:1.

Se introducirá una solución de 5 ng/µL de rafinosa en acetonitrilo/agua 50/50 (sin aditivos) a un caudal de 10 µL/min y la suma de dos barridos de 6 segundos en el rango de masas de la relación de masa/carga de 100 a 600 representa un consumo de muestra total de 10 ng.

C.3 Ionización APcI positiva

La relación de señal/ruido medida obtenida del cromatograma de masas de relación masa/carga de 609 en modo de SIR en inyección directa de 10 pg (16 fmol) de reserpina (inyección de 10 µL de una solución de 1 pg/µL) a una velocidad de flujo de 1 mL/min será >10:1.

Ionización positiva por electrospray 207

208 Especificaciones de funcionamiento

Apéndice DMantenimiento y suministros

D.1 Salida de gases

D.1.1 Bomba rotatoria

La salida de gases de la bomba rotatoria debe dar a la atmósfera (al exterior del laboratorio) a través de una campana extractora o un extractor industrial proporcionados por el usuario. Los gases de salida pueden estar conectados a una salida de gases existente del laboratorio que puede, a su vez, estar conectada a otras fuentes de gases.

Se suministra un tubo de 5 m (16 pies) de 12,7 mm (0,5 in) como estándar. Si esta longitud no es suficiente, el usuario deberá proporcionar un adaptador y un tubo con un diámetro interno de, al menos, 51 mm (2 in) hasta la salida de gases.

D.1.2 Nitrógeno

El conducto de salida de gases de nitrógeno debe desembocar en la atmósfera (al exterior del edificio que alberga el instrumento) a través de un conducto completamente independiente de cualquier gas procedente de la bomba rotatoria. El punto en el que este conducto abandona el edificio debe estar a, al menos, 0,5 m (20 in) de cualquier otra salida de gases.

Si la normativa medioambiental prohíbe la salida de gases de nitrógeno directamente a la atmósfera, tal y como se describía anteriormente, se recomienda que la salida de gases de nitrógeno a la atmósfera se realice a través de una campana extractora de laboratorio.

Si el conducto de salida de gases de nitrógeno procedentes de ESI/APCI se conecta al conducto de salida de gases de la bomba rotatoria puede producirse una contaminación grave del instrumento. Este daño se produce si el suministro de nitrógeno está cerrado (o si se ha agotado), ya que ya no existe caudal de gas procedente del instrumento a través del

Precaución: Si el conducto de salida de gases de nitrógeno procedentes de ESI/APcI se conecta al conducto de salida de gases de la bomba rotatoria puede producirse una contaminación grave del instrumento.

Salida de gases 209

conducto de salida de gases de nitrógeno. Una presión ligeramente positiva en el conducto de gases de salida de la bomba rotatoria puede provocar una migración del vapor del aceite de ésta a la fuente de ESI, a través de la línea de salida de gases de nitrógeno. El vapor de aceite puede pasar a la cámara de vacío a través de un cono de la muestra, lo que puede provocar una contaminación grave de la fuente y los cuadrupolos. Aunque no exista presión positiva en el conducto de salida de gases, el vapor de aceite puede pasar a la fuente debido al flujo de gas, a través del cono de la muestra mientras que la máquina se encuentra en vacío. Este efecto es más intenso si la sonda ESI/APCI se deja en la fuente con el gas de nitrógeno cerrado.

La garantía no cubre los daños causados al aparato debido a una mala conexión de los conductos de salida de gases.

Se proporciona una manguera de 5 m (16 pies) de largo y 10 mm (3/8 in) de diámetro externo como estándar para la salida de gases de nitrógeno. Si esta longitud es insuficiente, el usuario deberá proporcionar un adaptador y un tubo con un diámetro interno de, al menos, 12,7 mm (1/2 in) al puerto de salida de gases.

D.2 Drenaje del disolvente

En caso de que el gas de nitrógeno esté cortado (o se haya agotado) y el sistema de cromatografía líquida (LC) siga funcionando, el disolvente no podrá acumularse en la fuente gracias a un mecanismo que conducirá el disolvente a un sumidero que se puede dirigir a un recipiente de desecho. Asimismo, el sistema dispone de un software que puede detectar que el gas de nitrógeno está cerrado o fluye muy despacio y provocar la parada del sistema de HPLC.

D.3 Gases y reguladores

Se necesita nitrógeno seco libre de aceites, filtrado a, al menos, 5 micras y regulado a entre 6 y 7 bares (de 90 a 100 psi). Los gases deben conectarse mediante tubos de teflón (PTFE) con un diámetro externo de 6 mm (1/4 in) (se proporcionan 5 m [16 pies] como estándar) y se debe comprobar que no existan pérdidas bajo presión. Existen varios filtros de nitrógeno disponibles que pueden servir para este fin, por ejemplo, Swagelok SS6FWMM2, un filtro de 2 micras.

210 Mantenimiento y suministros

Durante el funcionamiento, el uso habitual del nitrógeno es de aproximadamente 600 L/h (a presión atmosférica), pero en situaciones de caudal alto (APCI), es posible que se deba aumentar a, aproximadamente, 1.100 L/h. Debido a que el consumo de nitrógeno es elevado en las técnicas de API, es aconsejable consultar a un proveedor de gas local para establecer la configuración óptima.

D.3.1 Experimentos de CID

Se necesita argón seco y de una pureza elevada (99,9 %) como gas de colisión. El gas debe conectarse mediante un tubo limpio de acero inoxidable de 3 mm (1/8 in; no proporcionado) y se debe comprobar que no existan pérdidas bajo presión. Se recomienda utilizar un regulador de presión de dos etapas para regular el gas a 0,5 bares (7 psi).

D.4 Sistemas de suministro de eluyente

D.4.1 Electrospray

La bomba de jeringa que incorpora el instrumento está diseñada para las inyecciones directas. Para un mayor caudal de electrospray, se necesita una bomba de HPLC que proporcione un caudal estable y sin pulso de entre 0,05 y 1,00 mL/minuto.

D.4.2 Ionización química a presión atmosférica

Se necesita una bomba de HPLC que proporcione un caudal estable y sin pulso de entre 0,2 y 2,0 mL/minuto.

Los disolventes no deben colocarse sobre el instrumento.

D.5 Bucles de la muestra e inyectores

El instrumento se suministra con una válvula de desviación/inyección Rheodyne RV700-100 eléctrica como estándar. Se conecta un bucle de 10 µL.

Sistemas de suministro de eluyente 211

D.6 Reactivos

Se necesitarán suministros de agua de calidad HPLC, metanol, acetonitrilo, acetato amónico y ácido fórmico para hacer soluciones estándar y para limpiar componentes del instrumento. También deben existir instalaciones para realizar muestra de prueba.

D.7 Aceite de bomba de vacío

Los tipos de aceite de bomba de vacío Ultragrade 19 o Inland Q45 sólo se deben utilizar para la bomba rotatoria de vacío. Otro tipo de aceites podrían dañar la bomba y anular la garantía.

El instrumento Quattro micro API se entrega con 1 L de aceite Ultragrade 19. Esto debería bastar para un cambio de aceite.

D.8 Muestras de prueba

El técnico de instalación proporcionará muestras para realizar comprobaciones del sistema durante la instalación o puesta en marcha.

Waters no puede proporcionar números de referencia ni ningún otro certificado como fuente de estas muestras de prueba.

Si esta información es necesaria para los procesos de validación, el usuario deberá adquirir las muestras antes de que el técnico acuda a las instalaciones.

Las muestras necesarias para las especificaciones de aceptación aparecen en la Tabla D-1.

Advertencia: Las muestras peligrosas deberán manipularse de acuerdo con las directrices del fabricante, definidas en la hoja de datos sobre peligros de la muestra.


D.9 Equipo de mantenimiento

Se necesita un baño ultrasónico para la limpieza sistemática de las piezas.

Lo ideal sería un baño pequeño, como un tamaño de cámara de, aproximadamente, 300 mm × 150 mm y 100 mm de altura.

Se debe disponer de recipientes de vidrio en los que colocar los componentes durante la limpieza. Éstos deberían tener 100 mm de diámetro y unos 120 mm de alto. Se necesita una probeta graduada de 500 mL para la limpieza del hexapolo. No se deben utilizar surfactantes durante el proceso de limpieza del material de vidrio.

D.10 Resumen de elementos que debe proporcionar el usuario

D.10.1 Salida de gases de la bomba rotatoria

Conectado al instrumento/sistema: placa KF 25.

Elementos proporcionados con el instrumento: 5 m (16 pies) de tubo de 12,7 mm (½ in) de diámetro interno × 19,2 mm (¾ in) de diámetro externo.

Elemento o elementos que debe proporcionar el cliente: campana extractora o extractor industrial.

Tabla D-1 Muestras necesarias para especificaciones de aceptación

Muestra Proveedor Código

Rafinosa Sigma R-0250

PPG 2000 Aldrich 20,233-9

Ácido fórmico Sigma F-0507

Acetato amónico Sigma A-7262

PEG 1500 Sigma P-5402

PEG 1000 Sigma P-3515

Reserpina Sigma R-0875

Equipo de mantenimiento 213

D.10.2 Salida de gases de (N2) de API

Seca y sin aceites.

Conectado al instrumento/sistema: conexiones de encajar tipo Legris de 10 mm (3/8 in).

Elementos proporcionados con el instrumento: 5 m (16 pies) de tubo de 8 mm (5/16 in) de diámetro interno × 10 mm (3/8 in) de diámetro externo.

Elemento o elementos que debe proporcionar el cliente: campana extractora o extractor industrial independiente a 5 m como máximo del instrumento Quattro micro API.

D.10.3 Suministro de (N2) de API

Conectado al instrumento/sistema: conexiones de encaje tipo Legris de 6 mm (¼ in).

Elementos proporcionados con el instrumento: 5 m (16 pies) de tubo de 4 mm (5/32 in) de diámetro interno × 6 mm (¼ in) de diámetro externo.

Elemento o elementos que debe proporcionar el cliente: suministro de N2, filtrado a

5 micras y regulado a entre 90 y 100 psi a través de un conector de 6 mm (¼ in).

D.10.4 Conexión de gas de CID

Conectado al instrumento/sistema: Swagelok® de 1/8 in.

Elementos proporcionados con el instrumento: Swagelok de 1/8 in.

Elemento o elementos que debe proporcionar el cliente: tubo de acero inoxidable con un diámetro externo de 1/8 in conectado a un suministro de gas regulado. El adaptador del regulador debería ser de 1/8 in.

D.10.5 Sistema de desviación/inyección

Conectado al instrumento/sistema: Rheodyne RV700-100.

Elementos proporcionados con el instrumento: tubos y férulas y tuercas Rheodyne.

Elemento o elementos que debe proporcionar el cliente: tubos y férulas y tuercas Rheodyne.

Precaución: La fuente del suministro del laboratorio no debe estar conectada mediante conductos de gas de cobre soldados mediante polipropileno o acetileno, debido al gran efecto contaminante del nitrógeno.


D.10.6 Fuente de alimentación de Quattro micro API

Conectado al instrumento/sistema: receptáculo IEC con filtro de red.

Elementos proporcionados con el instrumento: juego de cables de 2 m (8 pies) para EE.UU., Europa y Reino Unido.

Elemento o elementos que debe proporcionar el cliente: Un receptáculo adecuado para los enchufes mostrados o un cable, enchufe y receptáculo en caso de incompatibilidad con los proporcionados.

D.10.7 Alimentación del sistema de tratamiento de datos

Conectado al instrumento/sistema: receptáculo IEC.

Elementos proporcionados con el instrumento: cables de alimentación de 3 m (9,5 pies) para EE.UU. con enchufes de alimentación de 10 A para la CPU, el monitor y la impresora opcional.

Elemento o elementos que debe proporcionar el cliente: tres receptáculos de 110/230 V, 13 A como mínimo adecuados.

Resumen de elementos que debe proporcionar el usuario 215

Índice
AAceite de la bomba rotatoria: cambio 151Aceite de la bomba rotatoria: comprobación
150Administrador del sistema 74Adquisición de datos: detención 74Adquisición de datos: inicio 59Ajuste 39Ajuste automático 49Análisis medioambientales 10

BBarra de herramientas del editor de la lista de

funciones 77Bloque de ionización 158Bloqueo de electroforesis capilar 17Bomba de jeringa 23Bomba rotatoria: "gas-ballast" 149Bomba turbomolecular 2

CCalefactor de ESI 13Calefactor de la APcI 13Calibrado de barrido 101Calibrado de la compensación de la

velocidad de barrido 101Calibrado de masas 99Calibrado estático 101Calibrado, comprobación 116Calibrado, eliminación 106Calibrado, fallos 118Calibrado, inicio 115Calibrado, salvaguarda 121

Canales analógicos de entrada 17Canales de datos analógicos 80Carcasa de la fuente 157Ciencia forense 10Comprobación del calibrado automático 106Conector de contacto 17Conexión al PC 18Conexiones del panel posterior 16Configuración de los parámetros de ajuste:

cambio 56Conjunto de la fuente: limpieza 152Conmutación de MS a MS/MS 93Conmutación de MS/MS a MS 95Cono de extracción 160Cono de la muestra 158Control de FractionLynx 18Controles del caudal de masas 12Cromatograma: actualización en tiempo real

66Cuadrícula 48Cuantificación automática 64

DDatos centroides 69Datos de perfil: supresión de los aumentos

bruscos de ruido (spikes) 72Datos del perfil 69Datos SIR 70Desfase del eluyente 79Detector de UV 17

EEditor de lista de funciones 74Electrodo de descarga en corona 164

Índice 217

Entrada de la muestra 2Espectro: actualización en tiempo real 66Estudios farmacocinéticos 10Extremo de la sonda de APcI 167

FFallo de gas 17Función de estudio 91Función de rango de masas completo 82Función MRM 91Función SIR 85Funciones de barrido MS/MS 88

GGas de cono 12Gas de desolvatación 12Gas de nebulización 12

HHerbicidas 10Hexapolo 163

IIndicador LED de funcionamiento (Operate)

16Indicador LED de vacío (Vacuum) 15Inicio 19Intensidad 48Interfaz multiplexada 17Interruptor de encendido/apagado 19Ión hijo 6Ión negativo 195Ión precursor 8Ionización por electrospray 4

Ionización química a presión atmosférica 5

LLectura de datos 55Lecturas 55Línea de base 54

MMantenimiento 147Mantenimiento sistemático 149MassLynx 4Maxent 69Medidor de Pirani 2Metabolito en fármaco 10Modo 51Modo MS1 5Modo MS2 5Modos de funcionamiento de la MS 5Modos de funcionamiento MS/MS 6Monitorización de adquisiciones 98Monitorización de múltiples reacciones 9MRM 9Multiconector de ESI / APcI 13

NNivel cero 54

OObjetivo del análisis 52

PPágina Ajuste 39Panel frontal 12

218 Índice

Parámetros de calibrado 107Parámetros de medida de las masas 109PC integrado 3Péptidos 7Pérdida constante de fragmentos neutros 11Pesticidas 10Programa de mantenimiento 147

RRampa de energía de colisión 53Rampa de voltaje del cono 53Reserpina 7, 8, 9, 10

SSistema de tratamiento de datos 3Sistema de vacío 2Software 4Sonda de ESI 22

TToxicología 10Traza 48

UUmbral de recuento de iones 70Umbrales de datos del instrumento 68Uso del electrospray: preparación para 24

VVálvula de desviación o de inyección 14Válvula de gas de CID 13Ventana de informe del barrido 65Ventana de progreso de la adquisición 65

I

Visualización del estado 15Voltajes de la fuente 56

YYoduro de cesio 194Yoduro de rubidio 194Yoduro de sodio 194

Índice 219

220 Índice

espectrómetro de masas quattro micro api de waters · el espectrómetro de masas quattro micro api...

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