el espectrómetro de masas

Espectrometría de Masas

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MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS

CURSO DE MÉTODOS

ESPECTROMETRÍA DE MASAS

PRESENTA:GERMÁN PLASCENCIA VILLA

JUNIO DE 2003CUERNAVACA, MORELOS

Instituto de BiotecnologíaUNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO


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INDICE

INDICE 2INTRODUCCIÓN 3HISTORIA DE LA ESPECTROMETRIA DE MASAS 4EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS 6ENTRADA DE LA MUESTRA 8MÉTODOS DE IONIZACIÓN 9Impacto Electrónico (Electron Impact EI) 9Ionización Química (Chemical Ionization CI) 10Ionización de Campo (Field Ionization FI) 11Desorción de Campo (Field Desorption FD) 11Bombardeo con Átomos Rápidos (Fast Atom Bombardment FAB) 13Ionización por Electrospray (Electrospray Ionization ESI) 14Matrix-Assited Laser Desorption/Ionization (MALDI) 16ANALIZADORES DE MASAS 19Efecto de campos magnéticos sobre los iones 19Principios de los analizadores de masas 19Espectrómetro de masas de sector magnético (Magnetic Sector Mass Spectrometer) 20Espectrómetros de masas de cuadrupolo (quadrupole) 21Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight TOF) 22Analizadores de trampa de iones (Ion-Trap) 24Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) 25DETECTORES DE IONES 27Copa Faraday 27Multiplicador de Electrones (Electron Multiplier) 27Detector Daly 28Detector de Microcanales 29ADQUISICIÓN Y PROCESAMIENTO DE DATOS 30Procesamiento de Datos 31APLICACIONES 32Análisis de estructura y masa 32Sistemas acoplados 33Análisis cuantitativos 34Análisis de péptidos 35Iones de péptidos 36Secuenciación de péptidos 36Identificación de proteínas 37HERRAMIENTAS PARA ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS 38DEFINICIÓN DE TÉRMINOS 39REFERENCIAS 40


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INTRODUCCIÓN

La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica microanalítica usada para identificar compuestosdesconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades químicas demoléculas. La detección de compuestos puede ser llevada a cabo con cantidades realmente pequeñas (algunospmoles) de muestra y obtener información característica como el peso y algunas veces la estructura del analito.En todos los casos, alguna forma de energía es transferida a las moléculas a analizar para afectar la ionización.En la técnica clásica de impacto electrónico (electron ionization EI), algunas de las moléculas ionizadas delanalito “explotan” en una variedad de fragmentos ionizados, el patrón de fragmentación resultante así como losiones residuales constituyen el espectro de masas. En principio, el espectro de masas de cada compuesto esúnico y puede ser usado como se “huella química” para caracterizar el analito.

El proceso de análisis por espectrometría de masas comienza en llevar el compuesto a analizar a fase gaseosa,la muestra debe tener una presión de vapor de que 10-2 mmHg, debido a que las moléculas deben migrar pordifusión desde el sistema de entrada hacia la cámara de ionización. Las muestras pueden ser introducidas alespectrómetro de masas usando una sonda directa o por entrada en lote (batch) para sólidos puros o líquidosvolátiles. Analitos purificados por diferentes técnicas de separación (cromatografía de gases, cromatografía delíquidos, electroforesis capilar, etc.) pueden entrar al espectrómetro de masas tan pronto como vayan saliendo.Ya que las moléculas neutras difunden en forma aleatoria por la fuente de ionización, solo una porción esionizada.

El proceso de ionización más común en análisis en fase gaseosa es el de ionización electrónica (EI), en el cualse transfiere energía a la molécula neutra en estado de vapor, dándole suficiente energía para expulsar uno desus electrones y de ese modo tener una carga residual positiva. Este proceso produce un ion con carga positivay un electrón suelto. La molécula ionizada puede tener energía excesiva que puede ser disipada a través de lafragmentación de ciertos enlaces químicos. El rompimiento de varios enlaces químicos permite la producción defragmentos de ion cuya masa es igual a la suma de las masas atómicas de un grupo de átomos que retienen lacarga positiva durante el proceso de fragmentación.

Para compuestos no volátiles, iones de la molécula intacta son producidos al pasar la solución por un campoeléctrico (electrospray ionization) o por bombardeo de partículas (fast atom bombardment) o por interacción conespecies fotoexcitadas (matrix-assisted laser desorption).

Después de producir los iones, el siguiente paso es su análisis en el analizador de iones de acuerdo a surelación masa/carga (m/z). Los iones tienen una carga eléctrica que les permite ser controlados por camposeléctricos; son separados por su valor m/z en el analizador de masas. Existen diferentes tipos de analizadoresde masas: magnéticos, de cuadrupolo, trampa de iones cuadrupolo, trampa de iones magnética, o tiempo devuelo (time-of-flight). Los iones son analizados de acuerdo a su abundancia a lo largo de la escala m/z. Duranteel proceso de adquisición de datos provenientes del detector, los datos pueden ser organizados en formatabular o en formato de gráfica de barras para dar finalmente el espectro de masas de la muestra analizada.


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HISTORIA DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS

La espectrometría de masas tiene su origen en los experimentos desarrollados en el Cavendish Laboratory dela Universidad de Cambridge en Inglaterra en 1897 por Joseph John Thomson, él descubrió que descargaseléctricas en gases producían iones y que estos rayos de iones podían adoptar diferentes trayectoriasparabólicas de acuerdo a su masa cuando pasaban a través de campos electromagnéticos. Thomson realizó laconstrucción del primer espectrómetro de masas, llamado parábola espectrográfica (Figura 1), para ladeterminación de la relación masa/carga de iones.

Uno de los estudiantes de Thomson, Francis William Aston fue quien diseño varios espectrómetros de masasen los cuales los iones eran dispersados por sus masas y enfocados de acuerdo a su velocidad. Esto permitiómejorar el poder de resolución de masas y el posterior descubrimiento de isótopos de diferentes elementos queestán presentes en la naturaleza. Thomson recibió el Premio Nobel de Física en 1906 y Aston el Premio Nobelde Química en 1922.

En la década de los 20´s, Arthur J. Dempster de la Universidad de Chicago, desarrolló un analizador magnéticoque enfocaba iones formados por impacto electrónico (electron impact) sobre un colector eléctrico. Este diseñofue adaptado por Josef Mattauch, Richard Herzog, Kenneth Bainbridge, Alfred Nier y otros, permitiendoimportantes descubrimientos en física atómica y nuclear en los 30´s. Pero fue hasta la década de los 40´s quelos primeros espectrómetros de masas comerciales aparecieron. Durante los 30´s y 40´s, Nier y algunos otrosincorporaron las tecnologías de vacío y electrónica para mejorar el desempeño de los primeros diseños deespectrómetros. Instrumentos de doble enfoque, que combinan analizadores magnéticos y electrostáticosfueron introducidos permitiendo incrementar la precisión. Estos instrumentos fueron originalmente desarrolladoscon el propósito de determinar en forma precisa los pesos atómicos de los elementos y sus isótopos.

En la década de los 40´s se construyeron los primeros espectrómetros de masas disponibles comercialmentepor medio de diferentes compañías de Europa y Estados Unidos. En esta década también se desarrolló elespectrómetro de masas de tiempo de vuelo (time-of-flight, TOF), un concepto propuesto como un analizadormas barato y simple en el cual los iones son separados en base a sus diferencias en velocidad cuando sonacelerados en un tubo de vuelo lineal.

A principios de los 50´s, los patrones de fragmentación de los iones comenzaron a ser entendidos, aunque losaparatos disponibles estaban limitados en el rango de masas. Otro tipo de instrumento desarrollado para elpropósito de acoplar el espectrómetro de masas a un cromatógrafo de gases fue el filtro de masas cuadrupolo,el cual usa un campo eléctrico cuadrupolar conteniendo componentes de radiofrecuencia y corriente directapara separar iones. En 1953 el analizador de masas cuadrupolo fue patentado. Este analizador fue reportadopor Wolfgang Paul de la Universidad de Bonn, quien después ganó el Premio Nobel de Física en 1989 por sutrabajo de trampa de iones (ion trapping). En 1956 las primeras muestras biológicas (esteroides) fueronexitosamente analizadas.

En los 60´s la espectrometría de masas se estableció como una técnica para caracterizar compuestosorgánicos. Este fue asistido con la introducción de una fuente de ionización química. Otros métodos deionización surgieron incluyendo desorción de campo, ionización secundaria (secondary ionization MS o SIMS),desorción de plasma y desorción láser. Aparecieron las primeras publicaciones científicas especializadasincluyendo Organic Mass Spectrometry. La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) surgió con eldesarrollo de procedimientos de disociación por inducción de colisión, permitiendo obtener informaciónestructural de componente de una mezcla usando dos etapas de análisis de masas.

Figura 1. Parábola espectrográfica construida por J.J. Thomson


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En 1974 se desarrollo la espectrometría de masas Fourier ICR (FT-ICR MS). Una importante ventaja de estesistema es que permite detectar simultáneamente varios iones y estos espectrómetros de masas también lograntener muy alta resolución de masas. En los 80´s se desarrollaron las técnicas de ionización capaces de ionizareficientemente moléculas biológicas. Michael Barber en Manchester desarrollo la técnica FAB (Fast AtomBombardment) la cual utiliza una fuente de átomos pesados neutrales para ionizar compuestos de unasuperficie de una matriz líquida. John Fenn de la Universidad Yale refinó la fuente de iones originalmentereportada por Malcolm Dole de la Universidad Northwertern casi dos décadas antes de la técnica de ionizaciónde electrospray (ESI).

Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) fue también desarrollada en los 80´s por Franz Hillenkamp yMichael Karas. En esta técnica, las moléculas son desorbidas por un láser de una superficie sólida o líquidaconteniendo una matriz de compuesto orgánico. Las técnicas ESI y MALDI han permitido la introducción demoléculas biológicas de más de 1 millón de Daltons en los espectrómetros de masas como iones estables enfase gaseosa.

Actualmente, los espectrómetros de masas son utilizados para el estudio de un amplio rango de sustancias ymateriales con alta precisión y sensibilidad. Los campos de aplicación son desde estudios astronómicos delsistema solar, geofísica y geoquímica, hasta análisis químicos y en forma fundamental en investigaciones dequímica, toxicología, ciencias ambientales, y en forma creciente en ciencias biológicas y biomédicas.


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EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS

Un Espectrómetro de Masas es un instrumento que mide las masas de moléculas individuales que han sidoconvertidas en iones. Un espectrómetro de masas no mide la masa molecular directamente, pero mide larelación masa/carga de los iones formados de las moléculas. Los espectrómetros de masas tienen sietecomponentes mayores: un sistema de entrada, una fuente de iones, un analizador de masas, un detector, unsistema de vacío, un sistema de control y un sistema de datos. El sistema de entrada, junto con la fuente deiones y el tipo de analizador de masas definen el tipo de espectrómetro y las capacidades del sistema.

Los instrumentos usados están compuestos de una combinación de sistemas de entrada, fuentes de iones, yanalizadores de masas (Tabla 1).

Tabla 1. Variantes de componentes del sistema de espectrometría de masasCOMPONENTE VARIANTES

Sistema de entrada 1. Directo.2. Columna capilar cromatografía líquida.

Fuente de iones 1. Impacto electrónico.2. Ionización Química.3. Ionización de campo.4. Deserción de campo.5. Bombardeo con Átomos Rápidos.6. Electrospray, incluyendo nanospray ymicrospray.7. Matrix-assisted laser desorption (MALDI)

Analizador de masas 1. Cuadrupolo.2. Trampa de iones (Ion-trap).3. Tiempo de vuelo (Time-of-flight TOF).4. Analizador FT-ICR

Los procesos básicos asociados con la espectrometría de masas abarcan desde la generación de iones en fasegaseosa de un analito, y la medición de las relaciones masa/carga (m/z) de estos iones. La formación de ionesde la muestra en fase gaseosa es un prerequisito esencial en el proceso del espectrómetro de masas en elproceso de verificación de masas moleculares o análisis. Aunque los primeros espectrómetros de masasrequerían que la muestra estuviera en forma gaseosa, nuevos desarrollos han permitido incluir muestras ensoluciones líquidas o en una matriz sólida. Dependiendo del tipo de entrada y técnica de ionización usada, lamuestra puede ya estar en forma de iones en solución, o puede ser ionizada en conjunto con su volatilizaciónpor otros métodos en la fuente de iones.

El estudiar el analito como un ion en fase gaseosa le dan dos características fundamentales. La primeracaracterística fundamental es que el movimiento de los iones en fase gaseosa puede ser controlado en formaprecisa en campos electromagnéticos que contienen los iones a estudiar y pueden ser manipulados para probarel movimiento del ion en el campo. Debido a que el movimiento de los iones es proporcional a la relación m/zdel ion, esto justifica la medición de la m/z y por lo tanto la masa del analito. Los detalles concernientes adiferentes tipos de técnicas de análisis de masas y técnicas de ionización utilizadas determinan factores talesque la precisión y exactitud de la medición de m/z, la resolución, y el rango de m/z del analizador. La segunda

Figura 2. Componentes básicos de un espectrómetro de masas


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característica fundamental es que el uso de iones en fase gaseosa incrementa la sensibilidad del espectrómetrode masas. El movimiento preciso de iones en campos electromagnéticos que permiten medir m/z también lesprovee contención y enfoque.

Durante el proceso de medida de m/z, los iones son transmitidos con gran eficiencia a los detectores departículas que registran la llegada de estos iones. Estas llegadas son detectadas con gran sensibilidad debido auna combinación de señales de bajo fondo y la eficiente generación de electrones secundarios que puedensubsecuentemente ser multiplicados por factores de 105 o mayores. El mantenimiento de la precisión yexactitud de estos movimientos y por lo tanto de la sensibilidad del análisis requiere operación experta delsistema de espectrometría de masas.

Algunas desventajas del uso de iones en fase gaseosa es la dificultad de generación de los iones y colocarlosen la fase gaseosa, además de la complejidad de los instrumentos utilizados en este tipo de experimentos. Eldesarrollo de la ionización por electrospray y MALDI han aportado dos importantes métodos para la producciónde iones de péptidos y proteínas en fase gaseosa. Otra consecuencia de la complejidad de los instrumentos esel alto precio de tales instrumentos en términos su adquisición y costos de mantenimiento. Sin embargo, engeneral y considerando la sofisticación, productividad y reproducibilidad de los experimentos desarrollados, sepuede justificar que el costo de la espectrometría de masas es proporcional con los costos asociados con otroscomponentes en los proyectos de investigación que requieren este tipo de análisis.


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ENTRADA DE LA MUESTRA

Para sólidos razonablemente puros, la muestra es colocada sobre la punta de una barra que es introducidadentro del espectrómetro a través de un sistema de vacío. La muestra es entonces evaporada o sublimada enuna fase gaseosa, usualmente por medio de calor. Gases y líquidos pueden ser introducidos a través desistemas de entrada diseñados especialmente con un control de flujo, llamados sondas directas (direct probes),estos dispositivos transfieren la muestra desde el exterior a través de un sistema de vacío hacia la fuente deionización que esta a alta presión (Figura 3). Estas sondas pueden ser diseñadas para soportar muestras paraser ionizadas por distintos métodos. Una vez que la muestra está es fase gaseosa es ionizada yfrecuentemente acompañado de fragmentación para proceder al análisis de masas. En algunas técnicasespecializadas, la volatilización y la ionización de la muestra ocurren al mismo tiempo.

Para obtener el espectro de masas de un compuesto simple de una mezcla, los componentes individualesdeben ser separados antes del análisis de espectrometría de masas. La separación de los compuestos esnecesaria para tener certeza de la identificación, ya que dos o más compuestos presentes en la muestrapueden crear espectros que se sobrelapen o mezclen ya que los iones generan fragmentos simples quedificultarían el análisis de los datos obtenidos.

Desde que en la década de los 60´s se acopló la cromatografía de gases (GC) a la espectrometría de masas,esta conexión permite separar compuestos ya en fase gaseosa para su entrada al espectrómetro al entrar lasdiferentes fracciones en diferentes tiempos en forma continua permite un análisis secuencial de las muestras.Recientemente, equipos de cromatografía de líquidos (LC), cromatografía de fluidos supercríticos, HPLC yelectroforesis capilar, utilizados para separar compuestos, se pueden acoplar a espectrómetros de masas paraanálisis de muestras complejas.

Figura 3. Sondas directas (direct probes)


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MÉTODOS DE IONIZACIÓN

Un reto fundamental en la espectrometría de masas de cualquier tipo de analitos es la producción de iones enfase gaseosa de estas especies, y dificultades en la producción de estos iones en fase gaseosa pueden impedirel análisis por espectrometría de masas de ciertas clases de moléculas. Esta situación fue el caso de proteínasy péptidos. Las primeras técnicas que fueron aplicadas, ionización electrónica (electron ionization EI) eionización química (chemical ionization CI), son procesos de dos etapas en los cuales los analitos sonvaporizados con calor y la ionización ocurre una vez que el analito esta en fase gaseosa. Esta etapa devaporización limitó los experimentos de análisis por espectrometría de pequeños péptidos, usualmente amáximo 4 o 5 aminoácidos. Adicionalmente, estos péptidos tenían que ser derivatizados para minimizar supolaridad y darles suficiente volatilidad. El análisis de proteínas no era simplemente posible, y problemassimilares se encontraban en otras clases de moléculas polares. La ionización por bombardeo con átomosrápidos (fast atom bombardment FAB) fue el primer método de ionización que hizo posible analizarrutinariamente por espectrometría de masas a moléculas polares, también fue fundamentalmente diferente deotros métodos de ionización tal como ionización electrónica (IE) debido a que los iones en fase gaseosa fuerongenerados directamente de una solución del analito en fase líquida. Como resultado, las diferentes formas devaporización y de ionización del analito se convirtieron en una etapa estrechamente ligada en el proceso totalde análisis por espectrometría de masas.

Impacto Electrónico (Electron Impact EI)

El Impacto Electrónico (Electron Impact EI) o comúnmente llamado Ionización Electrónica (Electron IonizationEI) es un método clásico de generación de iones en espectrometría de masas utilizado aún en muchasaplicaciones. El analito es introducido dentro de la fuente de ionización que esta al vacío (<10-6 mbar) ysebsecuentemente ionizado por colisiones con un flujo de electrones (a 70 eV).

M + e- _ M+. + 2 e-

Los electrones para este proceso son generados por emisión térmica de un filamento caliente. El filamento estatípicamente hecho de tungsteno o de renio. Los electrones son subsecuentemente acelerados al aplicar unpotencial entre el filamento y la muestra. El rayo de electrones cruza la fuente de iones, afectando las moléculasneutras que provienen de la muestra (Figura 4). La corriente típica del filamento es de 1x10-4 Amp.

La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) operada de 20 a 500°C o por medio deun cromatógrafo de gases. Las muestras deben ser de polaridad baja o media y con cierta estabilidad térmica,además de que deben ser evaporadas antes de su ionización. El proceso de EI causa mucha fragmentación delas moléculas lo cual puede tener ventajas en la deducción de su estructura.

El mecanismo de formación de iones para la especie AB es el siguiente:1. AB + e-* _ A+ + B- + e-

2. AB + e-* _ A+ + B° + 2e-

3. AB + e-* _ [AB+°*] + 2e- seguido de [AB+°*] _ AB+°

4. AB + e-* _ [AB2+*]" + 3e- seguido de [AB2+*]" _ A+ + B+ - (muy baja abundancia)5. AH + e-* _ AH* + e- seguido de AH* + AH _ [AH+H]+ + A-

Figura 4. Ionización por Impacto Electrónico (EI)


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Figura 5. Ionización Química (CI)

Donde:* = Especies de alta energía.° = Radicales." = Intermediarios de vida corta.

En 1 y 2 se indican las especias de mayor abundancia las cuales sufren de fragmentación instantánea.En 3 indica especias de abundancia media.En 4 indica especies de abundancia muy baja.En 5 son especies que pueden formarse a altas presiones

Ionización Química (Chemical Ionization CI)

La Ionización Química (Chemical Ionization CI) es un método de ionización relativamente suave, y es el primermétodo de ionización suave introducido a la espectrometría de masas. La ionización es afectada por reaccionessobre la molécula con iones de un reactivo gaseoso generados por medio de ionización de impacto electrónico(EI) con moléculas del analito neutras.

El reactivo gaseoso es empleado con un exceso de 103-104 veces la molaridad del. Esto puede ser logrado alusar volumen de iones bastante pequeño en comparación a las condiciones de EI. El volumen de reactivogaseoso se controla por medio de una válvula.

Entre los agentes gaseosos utilizados se incluyen el metano, el isobutano y al amoniaco, formando iones CH5+,

C4H9+, y NH4

+ respectivamente como especies predominantes. En caso del metano, el siguiente proceso es elque permite la formación de iones reactivos:

1. CH4 + e- _ CH4+. Y fragmentos tales como CH3

+

2. CH4+. + CH4 _ CH5

+ + CH3. (autoprotonación)

3. CH3+ + CH4 _ C2H5

+ + H2

La protonación de un analito es dependiente de la diferencia de afinidades por protones en las basescorrespondientes. Por ejemplo, el CH5

+ protona la mayoría de los analitos, mientras que el NH4+ es más

selectivo debido a que necesita un sitio ligeramente básico en las moléculas del analito.

M + CH5+ _ [M+H]+ + CH4

Los iones [M+H]+ son llamados iones cuasi-molecular.

La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) a una temperatura de operación de 20a 500°C (para sólidos y líquidos de baja volatilidad, así como líquidos y gases) o por medio de un cromatógrafode gases (mezclas). Los analitos deben tener polaridad baja o media, así como estabilidad térmica. Laionización química genera iones de energía interna relativamente baja, exhibiendo un bajo nivel defragmentación, la evaporación del analito antes de su ionización es el paso crítico.


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Figura 6. Fuente de FD

Tabla 2. Iones producidos por CI

Tipo de analitoIones positivosdominante // raramente detectado

Iones negativosdominante // raramente detectado

Polaridad baja [M+H]+ M-. // [M-H]-

Polaridad media [M+H]+ // [M+R]+ [2M+H]+ M-. [M-H]-

Polaridad alta [M+H]+ [M+R]+ // [2M+H]+ [M-H]- // [M+R]- M-.

Iones K+A- descomposición descomposición

Ionización de Campo (Field Ionization FI)

La Ionización de Campo (Field Ionization FI) es un método de ionización suave. La muestra es introducida porlas mismas técnicas que en EI y CI. La ionización de campo lleva el riesgo de descomposición térmica de lamuestra.

Las moléculas son ionizadas por medio de ionización de campo (FI) en los bordes del campo del ánodo emisor.El emisor consiste de un alambre de tungsteno de 10-13mm de diámetro que es activado por un procedimientoespecial creando miles de microagujas en su superficie. Un voltaje alto de 10-12 kV es aplicado al emisorcausando polarización y finalmente ionización de las moléculas que están cerca de las puntas de lasmicroagujas donde el campo eléctrico alcanza una gran fuerza. Este proceso tiene una eficiencia de ionizaciónmuy baja y por lo tanto, FI produce una corriente de iones muy baja. FI produce iones del tipo M+. y/o [M+H]+,dependiendo del analito. Aunque los iones generados pueden estar casi libres de fragmentación, se prefiere laionización CI en lugar de FI no puede ser utilizada debido a la volatilidad del analito.

La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) a una temperatura de operación de 20a 500°C (para sólidos y líquidos de baja volatilidad, así como líquidos y gases), el uso de un cromatógrafo degases acoplado al espectrómetro de masas es complicado ya que las condiciones son difíciles de estabilizar enlas corridas de las muestras. Mientras que FI genera iones con muy baja energía interna y casi nulafragmentación, la evaporación del analito antes de su ionización es la etapa crítica.

Tabla 3. Iones producidos por FITipo de analito Iones positivos

dominante // raramente detectadoIones negativosDominante // raramente detectado

Polaridad baja M+. // [M+H]+ -Polaridad media M+. [M+H]+ -

Polaridad alta [M+H]+ // M+. -

Desorción de Campo (Field Desorption FD)

La Desorción de Campo (Field Desorption FD) es un método de ionización muy suave utilizado enespectrometría de masas. Este método esta basado en el de Ionización de Campo (Field Ionization FI), FD hasido desarrollado al combinar la desorción y la ionización del analito, pero no hay necesidad de evaporaciónantes de la ionización, generando iones con muy baja energía interna y casi nula fragmentación. En la Figura 6se muestra un equipo de espectrometría de masas con una fuente de FD.


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Figura 8. Sonda y emisor de FD

Moléculas neutras son ionizadas principalmente por FI en el borde del campo del ánodo emisor, los cationesson desorbidos tal cual. Un alto voltaje de 10-12 kV es aplicado al emisor causando polarización y finalmenteionización de las moléculas que están cerca de las puntas de las microagujas donde el campo eléctrico alcanzauna enorme fuerza (Figura 7). Un ligero calentamiento de la muestra ayuda a mantener el equipo limpio al evitarsu acumulación.

Usualmente, se pasa una corriente de 50 mA sobre el emisor (un alambre de 10mm) o incluso hasta 80-100 mAen emisores de 13mm. Esto incrementa la movilidad de las moléculas sobre la superficie del emisor, ayudando ala migración hacia las puntas de las agujas. El emisor puede resistir hasta 800°C.

La muestra es introducida dentro de la fuente de iones por medio de una sonda directa que lleva el emisor decampo en su punta (Figura 8), el alambre activado entre las dos puntas de acero inoxidable es de 5mm delongitud. Este par de alfileres de acero están aislados eléctricamente mutuamente por medio de una pieza decerámica. La sonda transfiere el emisor FD dentro de la muestra y se suministra un alto voltaje para ladesorción/ionización y ocurre el calentamiento del emisor.

El emisor FD consiste de un alambre central de tungsteno de 10-13mm de diámetro. La activación a altatemperatura esta basada en una descomposición térmica de la superficie del alambre de tungsteno caliente alvacío. La activación crea miles de microagujas en la superficie del emisor (Figura 9).

La muestra es introducida como una solución (1 a 2 ml a 0.1-1.0 mg/ml en solventes volátiles) hacia el emisor.Durante este proceso una solo gota colgante en la punta de una jeringa de un microlitro puede tocar lasuperficie del emisor, de otra manera se rompería el emisor (Figura 10).

Figura 7. Esquema general de ionización por FD

Figura 9. Supericie del emisor (80x80mm)


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Es preferible que la muestra sea soluble en solventes volátiles, se pueden analizar compuestos de baja o altapolaridad, inclusive es posible analizar mezclas de compuestos, aunque solo se pueden cuantificar compuestospuros. Si la muestra esta contaminada con sales inorgánicas puede ocurrir daño en los componentes delsistema. Se pueden analizar muestras de 1-5000 amu.

Tabla 4. Iones producidos por FD



Polaridad baja M+. // [M+H]+ M2+ [2M]+. -Polaridad media M+. [M+H]+ // [M+Cat]+ M2+ [2M+H]+ [2M+Cat]+ -Polaridad alta [M+H]+ [M+Cat]+ [2M+H]+ [2M+Cat]+ // M+. M2+ [M-H]- // [M+An]-

Iones K+A- K+ [Kn+An-1]+ // [KA]+. A- [An+Kn-1]

-

Cat: cationización por Li+, Na+, K+, y otros iones metálicos.An: anionización por Cl-, Br-, I-, HSO4-, y otros aniones.

Bombardeo con Átomos Rápidos (Fast-Atom Bombardment FAB)

Los métodos de desorción de partículas fueron desarrollados en los 70´s y 80´s, y a diferencia del método dedesorción de campo (field desorption), evito complicaciones en diseño de equipo y preparación de la muestra.

FAB es un método de ionización suave, resulta de la combinación de desorción del analito desde una fasecondensada (mezcla de analito sólido+matriz) con su subsecuente ionización. La matriz esta formada demoléculas orgánicas (glicerol o 3-nitrobencil alcohol) que mantienen una superficie homogénea para elbombardeo. Ocurre el bombardeo de la muestra con átomos rápidos (Ar o Xe de 3-10 keV) o iones rápidos (Cs+

arriba de 35 keV) (Figura 11). Si se utilizan iones rápidos la técnica se conoce también como liquid secondaryion mass spectrometry (LSIMS o liquidSIMS). En la práctica, no hay una diferencia significativa entre losespectros obtenidos por FAB o LSIMS.

El rayo primario de átomos rápidos es librado por una pistola de átomos rápidos (FAB gun) (Figura 12) o poruna pistola de iones Cs+ que utiliza un horno conteniendo CsI como fuente de Cs+. La pistola FAB estalocalizada fuera de la fuente de iones, a través de ella pasa un flujo de Xe neutro, los iones Xe son generados

Figura 10. Proceso de montaje de una gota de 1.5ml sobre el emisor activado. La gotapermanece en el alambre donde el solvente se avaporará para permitir tener solo una delgadacapa de muestra.

Figura 11. Sistema general de FAB


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Figura 12. FAB gun

por EI. Los iones son acelerados, enfocados y neutralizados por intercambio de cargas con Xe neutro al habercolisión. El rayo de átomos pega con una gota de muestra y debido a colisiones y disrupciones se forman ionessecundarios que son expulsados de la superficie de la muestra, los iones generados son acelerados yenfocados al analizador.

La muestra es introducida por medio de una sonda directa. Básicamente la sonda FAB consiste de una simplebarra con un contenedor para la muestra donde se dirigen los átomos rápidos que soporta la gota de la soluciónde analito contenida en una matriz. Este contenedor de la muestra esta aislado eléctricamente.

La función de la matriz es absorber energía de las partículas primarias que la impactan, actuar como solventepara el analito, refrescar la superficie de la gota y ayudar en el proceso de ionización, ya que puede seraceptor/donador de protones o electrones. Para que una matriz lleve a cabo todas sus funciones es necesarioque la muestra sea 100% soluble en ella, solo aquellos solventes con baja presión de vapor pueden ser usadosfácilmente, el solvente debe tener una viscosidad suficientemente baja que permita la difusión de los solutos ala superficie, ser químicamente inerte.

Las muestra que pueden ser analizadas por FAB deben ser altamente solubles, e incluso altamente polares(péptidos, oligosacáridos), ionicos (sales), o apolares (compuestos neutros, oligomeros sintéticos). FAB puedeser utilizado para detección directa de iones positivos o negativos. El rango de masa es desde 300 amu hasta5000 amu, en compuestos de menor masa resultan algunas complicaciones en la detección de los picos delespectro y en moléculas mayores se presentan problemas en la desorción. Los iones secundarios generadospueden permanecer estables por varios minutos, ya que poseen baja energía interna y exhiben un bajo nivel defragmentación.

Tabla 5. Iones producidos por FAB



Polaridad baja M+. // [M+H]+ M-. // [M-H]-

Polaridad media M+. [M+H]+ // [M+Cat]+ M-. [M-H]-

Polaridad alta [M+H]+ [M+Cat]+ // M+. [M-H]- // [M+An]- M-.

Iones K+A- K+ [Kn+An-1]+ // [KA]+. A- [An+Kn-1]

- // [KA]-.

Cat: cationización por Li+, Na+, K+, y otros iones metálicos.An: anionización por Cl-, Br-, I-, HSO4-, y otros aniones.

Ionización por Electrospray (Electrospray Ionization ESI).

La Ionización por Electrospray (ESI) es uno de los métodos de ionización mas recientemente desarrollados enespectrometría de masas. El diseño y operación de fuentes de ionización por electrospray usadas comúnmenteen los espectrómetros de masas están basados en diseños descritos por Fenn y colaboradores en 1985. Estemétodo es llevado a cabo a presión atmosférica a diferencia de otros métodos, por lo que se le conoce tambiéncomo un método de ionización a temperatura ambiente (atmospheric pressure ionization API). ESI es


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ampliamente utilizado en aplicaciones de ciencias bioquímicas y biomédicas debido a su capacidad de analizarmoléculas altamente polares tales como péptidos, oligonucleótidos y oligosacáridos.

En el proceso general de electrospray, que ocurre en la punta del emisor (capilar o aguja), una solución acuosaácida o básica (dependiendo del la muestra) diluida del analito (10-4-10-5 molar) es rociada desde la punta delemisor en el cual se aplica un potencial de 3-4 kV, la solución debe proveer conductividad eléctrica que puedeser obtenida por el uso de analitos iónicos o aditivos iónicos tales como buffers o por algún grado de disociaciónelectrolítica del solvente. El líquido comienza a salir de la aguja, incrementa su carga y asume una formacónica, llamada cono de Taylor, en honor a G.I. Taylor quien describió este fenómeno en 1964 (Figura 13). Ellíquido asume esta forma cuando incrementa su carga ya que una forma cilíndrica puede retener mas carga queuna esfera. En la punta del cono, el líquido cambia de forma a una línea fina, que se vuelve inestable ya que esforzado a retener mas y más carga, y finalmente llega a un punto crítico donde no puede soportar mas cargaeléctrica y la solución entonces se dispersa en forma de niebla de pequeñas gotas (de menos de 10 mm dediámetro) altamente cargadas que vuelan buscando una superficie de carga opuesta. Debido a que las gotasestán altamente cargadas con la misma carga eléctrica se repelen fuertemente, las gotas vuelan y se dispersancubriendo un área cada vez mayor y se van reduciendo de tamaño ya que las moléculas de solvente seevaporan en su superficie, y la distancia entre las moléculas cargadas disminuye dramáticamente. Si la gota noencuentra donde disipar su carga, las cargas eléctricas llegan a un estado crítico y la gota explotaviolentamente (Figura 14). Este proceso fue originalmente observado por el físico John Zelany en 1914.

Aún no existe una explicación 100% aceptada de lo que le sucede a las gotas, pero algunas de las teorías son:1. Modelo de Residuo Cargado (charged residue model) de Dole. Las gotas sufren repentinamente de

explosiones coulombicas produciendo gotas más pequeñas y más pequeñas que finalmente contendránsolo una molécula cargada y quizá algunas moléculas de solvente.

2. Modelo de Evaporación Iónica (ion evaporation model) de Iribarne y Thomson. Ocurre la expulsión demoléculas cargadas para reducir la densidad de carga de la superficie.

3. La gota original sobrevive después de haber expulsado algunas micro gotas cargadas.

De cualquier forma, el proceso termina con moléculas cargadas que pueden todavía llevar moléculas desolvente. El proceso de evaporación y rompimiento de gotas se repite hasta que el tamaño y carga de las gotasdesorba moléculas protonadas dentro de la fase gaseosa, donde pueden ser dirigidas en el espectrómetro demasas por medio de campos eléctricos apropiados (Figura 15). El proceso de evaporación puede sersuplementado con un flujo de gas (típicamente nitrógeno) y calor.

Una característica de ESI es que debido a las condiciones ácidas usadas para producir las gotas cargadaspositivamente se tienden a protonar todos los sitios básicos en las moléculas de analito. Una segundacaracterística de ESI es la eficiencia del proceso de ionización y, como resultado, la sensibilidad de losexperimentos basados en esta forma de ionización, la eficiencia en la protonación de estos sitios básicos en

Figura 13. Cono de Taylor Figura 14. Reducción de tamaño de gota en ESI

Figura 15. Proceso general de Ionización por Electrospray (ESI)


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Figura 18. Proceso de Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)

Figura 17. ESI, microESI y nanoESI

ambientes ácidos parece contribuir a la sensibilidad. Una tercera característica es su compatibilidad con lossolventes de HPLC de fase reversa (reverse-phase high-performance liquid chromatography), ya que lasmezclas agua/solvente tienen excelentes propiedades compatibles con ESI.

La señal observada en el proceso ESI es proporcional a la concentración del analito en la solución que estasiendo rociada pero no a su velocidad de flujo. Esto es debido a que un incremento en la velocidad de flujosimplemente provoca tener que eliminar un mayor porcentaje de solvente, debido a que en muchas ocasionesse tienen muestras biológicas en un volumen pequeño y en poca cantidad, es preferible poder rociar unvolumen extremadamente pequeño, por lo que a partir de ESI que maneja flujos de 5-1000ml/min se handerivado el micro ESI que maneja una velocidad de flujo de 0.5-5ml/min y el nano ESI 0.02-0.5ml/min (Figura17).

En dirección contraria, se han diseñado ESI asistidos neumáticamente, llamados Ion Spray (ISP) donde unacorriente de gas inerte es aplicada en conjunto con un alto voltaje para ayudar al proceso de rociado devolúmenes grandes.

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)

Esta técnica de ionización, comúnmente llamada MALDI, fue descrita por Karas y Hillenkamp en 1988. En estemétodo de ionización los analitos son disueltos en una solución de un compuesto que absorbe UV, llamadomatriz (matrix), y colocado dentro del espectrómetro de masas. Debido a que los solventes se van secando, loscompuestos de la matriz cristalizan y los analitos quedan contenidos dentro de la matriz de cristales (Figura 18).

Figura 17. Rociador (sprayer) de ESI y el orificio del capilar (0.4mm de ancho).


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Pulsos de láser de luz UV (3-5 ns, 337 nm, 107 W/cm2) son utilizados para vaporizar pequeñas cantidades de lamatriz donde se incluyen los iones del analito y llevados a fase gaseosa en el proceso (Figura 19). La ionizaciónocurre por protonación en el ambiente ácido producido por los compuestos de la matriz y por la adición de ácidodiluido en la muestra. La protonación de péptidos es particularmente eficiente en ambientes ácidos, haciendo deMALDI, un método efectivo para producir péptidos protonados. Debido a que con la desorción por láser laproducción de iones es discreta y es pequeños paquetes, el MALDI esta comúnmente combinado con unanalizador de tipo time-of-flight (TOF) dando un sistema de alta sensibilidad.

Mientras que ESI es afectado por especies contaminantes, MALDI puede tolerar niveles variables de algunoscontaminantes.

Cada pulso láser genera una pequeña cantidad de plasma que se expande en vacío, del cual se extraen losiones (positivos o negativos) del analito que son acelerados por un potencial de 10-30 kV y controlados pormedio de campos electromagnéticos. Debido a diferencias de velocidades que resultan de sus diferencias enmasas los iones llegan al detector en diferentes tiempos. Los tiempos de vuelo son del rango de 10-100 ms.

Una muestra de 1 ml de la solución del analito o de la solución analito/matriz es aplicada en un contenedor y seseca, formando una capa delgada y cristalina. Los contenedores son de acero pulido, plata o cromo plateado(Figuras 20 y 21).

La función de la matriz es en primer lugar absorber la energía del láser. Por lo que las matrices para MALDIestán formadas de compuestos aromáticos (Figura). La ionización del analito puede ser afectada pordeprotonación, al aceptar o ceder un electrón, por unión de cationes o fotoionización, por lo que los ionesgenerados por MALDI son de una amplia variedad de moléculas, ya que dependiendo de la combinación entreel analito y la matriz será el tipo de iones predominantes en el espectro obtenido.

Figura 19. Laser UV

Figura 20. Contenedor de plata para10 muestras, cada pozo mide 23 mmde diámetro.

Figura 21. Detalle del pozo 10 del contenedor.El rectángulo muestra el lugar donde impactaráel láser. La línea blanca es un rasguño. Lamuestra aplicada es una solución en acetonaque formo una capa cristalina. Se necesitanentre 10-100 disparos del láser para evaporar lacapa completamente.


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Tabla 6. Iones producidos por MALDI



Polaridad baja M+. // [M+H]+ M-. // [M-H]-

Polaridad mediaM+. [M+H]+ // [M+Cat]+ [2M+H]+

MW > 3000: [M+nH]n+, n = 2, 3M-. [M-H]- // [2M-H]-

MW > 3000: [M-nH]n-, n = 2, 3

Polaridad alta[M+H]+ [M+Cat]+ // [2M+H]+ [2M+Cat]+

MW > 3000: [M+nH]n+, n = 2, 3[M-H]- // M-. [2M-H]-

MW > 3000: [M-nH]n-, n = 2, 3Iones K+A- K+ // [Kn+An-1]

+ [KA]+. A- // [An+Kn-1]- [KA]-.

Cat: cationización por Li+, Na+, K+, y otros iones metálicos.An: anionización por Cl-, Br-, I-, HSO4-, y otros aniones.Residuos de la matriz pueden formarse con todos los analitos dando: [M+H+matriz]+.

Figura 22. Compuestos utilizados en las matrices MALDI


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ANALIZADORES DE MASAS

Todos los espectrómetros de masas combinan la formación de iones, el análisis de masas, y la detección deiones. Los analizadores de masas llevan a cabo la separación de los iones producidos por diferentes métodosen una fuente de iones, de acuerdo a su relación masa/carga (m/z) para que puedan llegar al detector. Launidad para m/z es el Thomson (Th).

En los experimentos de espectrometría de masas aparecen dos clases principales de iones, el ion molecular,que es la molécula completa del analito, y fragmentos iónicos, los cuales contienen solo una parte de laestructura. El peso molecular de una molécula puede ser calculado de la m/z del ion molecular, si la carga (z) esconocida, la información estructural se obtiene a partir de las m/z de los fragmentos del ion. Una variedad deanalizadores de masas están disponibles para realizar estas mediciones, incluyendo cuadrupolo (quadrupole),trampa de iones (ion-trap), tiempo de vuelo (time-of-flight), sector magnético (magnetic sector), ciclotrón (ioncyclotron resonance) y otros.

Cada tipo de analizador posee características y aplicaciones especiales, así como beneficios y limitaciones. Laselección del tipo de analizador a utilizar es en base a que aplicación se le dará, el costo y el rendimientodeseado, ya que el analizador determina varias características del resultado del experimento, entre estas laresolución y el rango de m/z de los iones que pueden ser medidos.

Efecto de campos magnéticos sobre los iones

Todos los analizadores de masas comúnmente usados utilizan campos eléctricos y magnéticos para aplicar unafuerza a partículas cargadas (iones). La relación entre fuerza, masa y los campos aplicados puede verse através de la segunda ley de Newton y la ley de Lorentz.

Segunda ley de Newton F=maLey de Lorentz F=e(E+vB)

Donde,F= fuerza aplicada al ion,M= masa del ion,a= aceleración,e= carga iónica,E= campo eléctrico,vB= producto de la velocidad del ion y el campo magnético aplicado.

De la segunda ley de Newton se observa que la fuerza aplicada causa una aceleración que es dependiente dela masa del ion, y la Ley de Lorentz indica que la fuerza aplicada es también dependiente de la carga del ion.Por lo tanto, los espectrómetros de masas separan los iones de acuerdo a su relación masa/carga (m/z) y nosolo a partir de la masa únicamente.

Principios de los analizadores de masas

Un analizador de masas es análogo al equipo utilizado en espectroscopia óptica para el análisis del contenidode color de luz visible. En espectroscopia óptica, se inicia con luz visible que esta compuesta de coloresindividuales (a diferentes longitudes de onda) que están presentes en diferentes intensidades. Un prismasepara la luz es sus diferentes longitudes de onda, y pequeña salida es usada para seleccionar cual longitudalcanza el detector. Las diferentes longitudes de onda son barridas o escaneadas al otro lado de la salida deldetector y la intensidad de luz es registrada como una función del tiempo (longitud de onda) (Figura 23).

En espectrometría de masas, se inicia con una mezcla de iones que tienen diferentes relaciones masa/carga ydiferentes abundancias relativas. Campos electromagnéticos separan los iones de acuerdo a sus relacionesmasa/carga, y una hendidura es usada para seleccionar cuales iones llegan al detector. Las diferentesrelaciones masa/carga son entonces analizadas en la salida del detector y las corrientes de iones sonregistradas como una función del tiempo (figura 23).


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Figura 24. Espectrómetro de masas de sector magnético.

Espectrómetro de masas de sector magnético (Magnetic Sector MassSpectrometer)

En un espectrómetro de masas de deflección magnética, los iones que llegan de la fuente de iones sonacelerados a una gran velocidad. Los iones entonces pasan a través de un sector magnético (magnetic sector)en el cual se aplica un campo magnético en una dirección perpendicular al movimiento de los iones. Cuando seaplica aceleración perpendicular al movimiento de los iones, su velocidad permanece constante, pero semueven en dirección circular, es por esto que el sector magnético tiene forma de arco, el radio y el ángulo delarco varían de acuerdo a diferentes diseños.

Un sector magnético por si mismo es capaz de separar iones de acuerdo a su relación masa/carga, pero suresolución se ve limitada ya que no todos los iones que llegan de la fuente de iones tienen la misma energía nila misma velocidad. Para tener una mejor resolución se añade un sector eléctrico (electric sector) que enfocalos iones de acuerdo a su energía cinética, esto se realiza aplicando una fuerza perpendicular a la dirección delmovimiento de los iones, también en forma de arco.

La configuración de este aparato es también llamada de geometría reversa, ya que el sector magnético estaantes del sector eléctrico.

La operación del espectrómetro de masas se logra manteniendo constantes el potencial de aceleración y elpotencial del sector eléctrico y variando su campo magnético. Los iones que tienen una energía cinéticaconstante, pero una relación m/z diferente son captados por el detector a diferentes fuerzas de campomagnético.

La dependencia de la relación m/z sobre los campos eléctrico y magnético es deducida a partir de que todos losiones formados en la fuente de iones son acelerados a una energía cinética (T) de acuerdo a:

Figura 23. Comparación entre espectrofotómetro y espectrómetro de masas


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Despejando velocidad (v) tenemos:

De la Ley de Lorentz, el campo magnético aplicado a una fuerza evB debe ser igual a la fuerza centrípeta mv2/rya que los iones se mueven en un arco a través del sector:

Substituyendo velocidad (v), se llega a la ecuación de trabajo aplicable al espectrómetro de masas de sectormagnético:

El sector magnético se mantiene constante usualmente a un valor en el cual pasen solo los iones que tenganuna energía cinética específica, por lo que el parámetro que es variable es B, la fuerza del campo magnético. Elcampo magnético es generalmente analizado exponencialmente o linealmente para obtener el espectro demasas. El análisis de campo magnético puede ser usado para cubrir un amplio rango de m/z con unasensibilidad que es independiente de la relación masa/carga.

Una alternativa es mantener B constante y analizar V. El potencial del sector eléctrico rastrea el voltaje, estotiene la ventaja de que la relación m/z y el voltaje tienen una relación linear, pero una desventaja al analizar elvoltaje es que la sensibilidad es proporcional a la relación m/z.

El analizador de masas de sector magnético es un modelo clásico que posee varias ventajas: altareproducibilidad, alto desempeño en análisis cuantitativos, alta resolución, sensibilidad y rango dinámico.Algunas limitaciones son que no pueden adaptarse a algunos métodos de ionización (por ejemplo: MALDI),costos mayores que otros analizadores. Son ampliamente usados en análisis de compuestos orgánicos,realizan mediciones exactas de masas, en cuantificación y en mediciones de isótopos.

Espectrómetros de masas de cuadrupolo (quadrupole)

El analizador de masas de cuadrupolo (quadrupole) es probablemente el analizador de masas mas utilizado, yaque además de su alto desempeño analítico combina facilidad de uso. Este tipo de analizador esta compuestode cuatro barras organizadas paralelamente como dos grupos de dos barras conectadas eléctricamente (Figura25). Una combinación de voltajes de radiofrecuencia (rf) y corriente directa (dc) son aplicados a cada par debarras, este arreglo simétrico permite producir campos hiperbólicos. Superficies diagonalmente opuestas estánconectadas juntas a fuentes de voltajes rf y dc. Los iones se extraen de la fuente de iones y son acelerados (5-15 V) dentro del espacio central formado por el cuadrupolo a lo largo del eje longitudinal hacia el detector. Millery Denton describieron el concepto de filtro de masas cuadrupolo como la combinación o superposición de filtrosde pase bajo y pase alto. Al menos para iones relativamente ligeros (<300 Da), el análisis m/z no es afectadopor la estructura del ion.

El filtro cuadrupolo m/z es examinado al modificar la magnitud de la amplitud de voltaje de rf y manteniendo dca una proporción fija. El poder de resolución es establecido por la relación de los voltajes rf y dc . Lastrayectorias de los iones a través del espacio central de las barras es complicado, y para cada par de voltajes dcy rf solo iones de un valor m/z específico evitaran colisionar con las barras y pasaran el filtro cuadrupolo através del eje Z hasta alcanzar el detector, todos los demás iones chocarán con las superficies del cuadrupolo a

Figura 25. Analizador cuadrupolo (quadrupole)


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estos valores de rf y dc. El espectro de masas completo puede ser examinado ya que se hace un barrido desdeun valor de voltaje mínimo preestablecido hasta un máximo, pero manteniendo la relación dc/rf constante.

Una exploración rigurosa de la trayectoria de los iones a través del filtro cuadrupolo incluye un gran número devariables físicas que afectan los campos eléctricos instantáneos que afectan los iones. Para un filtro de masashiperbólico clásico, el potencial de distribución (F) a cualquier tiempo (t) es descrito por la siguiente ecuación:

F = [U+Vcos(wt)] x2 - y2

2r02

donde x y y son las distancias a lo largo de ejes de coordenadas, r02 es la distancia desde el eje z a cualquiera

de las superficies del cuadrupolo, w es la frecuencia angular (2p¶) de la corriente alterna aplicada (AC), V es lamagnitud de la señal rf aplicada, y U es la magnitud del potencial dc aplicado a las superficies.

El campo eléctrico instantáneo a lo largo de cualquiera de los tres ejes (x-y-z) puede ser calculado al derivarparcialmente la ecuación anterior en función de un eje particular, al realizar esto, se observa que los potencialesdc y AC aplicados a las superficies no afecta la aceleración de los iones en la dirección Z, es decir a través deleje entre la fuente de iones y el detector, ya que la formula no tiene dependencia de Z.

Desde un punto de inicio del espectrómetro de masas de cuadrupolo, una solución frontera para la ecuación deMathieu corresponde a un desplazamiento finito de los iones a lo largo de los ejes x y y, esto es que los ionessiguen una trayectoria para evitar colisiones con las superficies y llegar al detector. Otro tipo de solucióndescribe el desplazamiento radial de los iones que chocan con las superficies del cuadrupolo para excluirtransmisión al detector. Definición de los términos a y q de la ecuación de Mathieu, en la cual a se relaciona condc y q con rf.

ax = -ay = 4zeU/m2r02

qx = -qy = 2zeV/m2r02

Los valores a (proporcional a U/m) y q (proporcional a V/m) corresponden a trayectorias estables de los ionesen el filtro cuadrupolar. Estas trayectorias le permiten a los iones llegar a la superficie del detector sin chocar ocolisionar con las superficies del cuadrupolo. Estas transformaciones matemáticas permiten crear un diagramaa-q que simplifica los parámetros que afectan el movimiento de los iones en el cuadrupolo, estos diagramas sonbidireccionales (en a y en q) pero incluyen seis variables (e, w , r0, m, U, y V), este diagrama de estabilidad(Figura 26) relaciona el potencial dc aplicado (U) y el potencial rf aplicado (V).

El analizador cuadrupolo ofrece alta reproducibilidad, además de costos relativamente bajos de manejo ymantenimiento del sistema, pero puede llegar a tener una resolución limitada, puede no adaptarse a algunosmétodos de ionización. Este analizador esta frecuentemente acoplado a sistemas de cromatografía degases/espectrómetro de masas (GC/MS) y cromatografía líquida/espectrómetro de masas (LC/MS).

Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight TOF)

El principio de operación del analizador de tiempo de vuelo (time-of-flight TOF) involucra la medición del tiemporequerido por un ion para viajar desde la fuente de iones hasta el detector localizado a 1-2m de la fuente. Todoslos iones reciben la misma energía cinética durante la aceleración instantánea (3000 eV), pero debido a que

Figura 26. Diagrama de estabilidad a-q


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[ ]

Figura 28. Reflectron

tienen diferentes valores de m/z, se separan en grupos de acuerdo a su velocidad (por lo tanto m/z) como vanrecorriendo la región libre de campo entre la fuente de iones y el detector. Los iones chocan secuencialmenteen el detector en forma de un incremento de m/z. Los iones de baja m/z llegan al detector antes que aquelloscon m/z alta debido a que entre mas m/z tengan los iones tendrán una velocidad menor (Figura 27).

La energía cinética de un ion se define por:T = eV = mv2

2

La velocidad del ion:

v = 2zeV1/2

m

Debido a que es impráctico medir directamente la velocidad del ion, el tiempo de vuelo (time-of-flight tof) desdela fuente de iones hasta el detector (separados por una distancia L) provee la información necesaria:

tof = L = m _

v 2zeV

El valor de m/z para un ion es determinado por su tof al detector calibrado con los tof de al menos dos iones dem/z conocida. El tiempo de tránsito de un ion de 3000 eV de 800 m/z es aproximadamente 70 mseg a través deun tubo de 1m de vuelo, el ciclo de producción de iones, aceleración y detección es completado en un periodode aproximadamente 100mseg para un rango mayor de 1000 m/z.

Los iones que parten de la fuente de iones en un espectrómetro de masas TOF no tienen los mismos tiemposde partida ni exactamente la misma energía cinética, por lo que estos aparatos han sido diseñados paracompensar estas diferencias. Un reflectron es un aparato óptico en el cual los iones en un espectrómetro TOFpasan a través de un espejo o reflectron y su vuelo es invertido (Figura 28). Un campo de reflección linearpermite a los iones con mayores energías cinéticas penetrar más profundamente dentro del reflectron encomparación con iones de energías cinéticas menores. Los iones que estén más dentro del reflectron tardaránmás en llegar al detector. Si un paquete de iones de una m/z dada contiene iones con diferentes energíascinéticas, el reflectron disminuirá la dispersión de los tiempos de vuelo de los iones, mejorando la resolución delespectrómetro.

El analizador TOF es el analizador de masas más rápido, puede adaptarse a los métodos de ionización porpulsos (MALDI), tiene alta transmisión de iones y el rango de masas más grande de todos los analizadores demasas. Algunas limitantes son que en muchas ocasiones requieren exclusivamente de un método de ionizaciónpor pulsos y que la selectividad de los iones puede limitarse en algunos experimentos. Casi todos los sistemas

Figura 27. Analizador TOF


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Figura 29. Analizador de trampa de iones (ion-trap)

MALDI están en conjunto con un analizador de TOF, los sistemas GC/MS con TOF poseen una alta velocidadde análisis.

Analizador de trampa de iones (Ion-Trap)

El espectrómetro de masas de trampa de iones cuadrupolo (quadrupole ion-trap), así como el filtro cuadrupolo,utilizan campos eléctricos oscilantes para atrapar los iones en forma controlada. En la trampa de ionescuadrupolo, los iones son atrapados en un espacio tridimensional, mientras que en el filtro de masas cuadrupolosolo es en un espacio bidimensional.

La trampa de iones cuadrupolo atrapa los iones en un pequeño volumen entre tres electrodos, uno circular (ringelectrode) y dos electrodos hiperbólicos en los extremos (end-cap electrodes), por medio de campos eléctricososcilantes (Figura 29).

La trampa de iones es operada al aplicar un potencial sinusoidal (rf a una frecuencia determinada) al electrodocircular, mientras que los de los extremos se mantienen constantes (frecuentemente en cero), o mantenidos aun potencial oscilante. La variedad de potenciales posibles que pueden aplicarse a los electrodos de losextremos permite atrapar los iones dentro de un rango m/z específico, es decir atrapar iones por encima de unvalor m/z específico, atrapar iones solo de un valor m/z seleccionado, o expulsar iones de un valor m/zespecífico.

Como fue originalmente concebido, la trampa de iones puede ser ajustada para almacenar iones de un valorm/z dado. Al cambiar las condiciones de operación, iones de un valor m/z especificado podrán salir o serexpulsados de la trampa. Stafford y colaboradores establecieron el modo de operación de la trampa de iones,en el cual los iones los iones que tienen un valor m/z por encima de un valor predeterminado son almacenados,pero eventualmente son expulsados de acuerdo a valores secuenciales de m/z al cambiar los parámetros deoperación para permitir un examen analítico.

El movimiento dentro de la trampa de iones, al igual que en el filtro cuadrupolo, puede ser descrito por lasecuaciones de Mathieu. Debido a que potenciales dc pueden ser aplicados a la trampa, puedes usarsediagramas de estabilidad basados en a y q para indicar cuales iones de acuerdo a su valor m/z permanecenestables dentro de la trampa de iones y cuales serán expulsados bajo unas condiciones específicas.

Las condiciones para estabilidad de iones dentro de la trampa de iones pueden ser graficadas en función de a-qde Mathieu. Los valores de a y q de la ecuación de Mathieu dependen de las dimensiones de la trampa deacuerdo a las ecuaciones:

az = -2ar = -16 eU . mr0

2w2RF

qz = -2qr = -8 eV . mr0

2w2RF

Los subíndices z y r representan el movimiento axial y radial entre los electrodos de los extremos, U es elpotencial dc aplicado a cualquiera de los electrodos de los extremos, V es potencial rf aplicado al electrodo


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central, r02 es el radio del electrodo central, y wRF es la frecuencia angular. Iones cuyos valores a y q caen

dentro de la gráfica tendrán trayectorias estables en la trampa de iones (Figura 30).

Durante la operación del espectrómetro de trampa de iones, las oscilaciones de los iones atrapados sonreducidas por colisiones con helio a alta presión (10-3 torr). Durante el proceso de detección, los potenciales delos electrodos son alterados para producir una rampa de amplitud de radio frecuencia en las trayectorias de losiones y así expulsar los iones en dirección axial. Los iones son expulsados en orden de decrementos de m/z,enfocados a la salida de la trampa y detectados por el sistema de detección de iones.

Algunos investigadores han demostrado gran resolución y rango de masas en sistemas de trampas de ionesdiseñadas especialmente. Sin embargo, estas características no son aplicables a todos los sistemas de trampade iones disponibles comercialmente. Este sistema posee alta sensibilidad además de ser equiposrelativamente compactos, pero ofrecen poca capacidad en análisis cuantitativos, pueden sufrir de efectos porcargas y reacciones de los iones, muchos parámetros influyen la calidad del espectro obtenido por este método(excitación, atrapado y detección de los iones) por lo que debe contarse con sistemas de control sumamenteprecisos. Puede acoplarse a sistemas cromatográficos.

Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)

El analizador FT-ICR (Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance) es probablemente el método más complejode análisis de masas. Esta técnica fue desarrollada en los 50´s, es altamente sensible, pero tiene limitacionesde resolución de masas (>106 Da). Este tipo de espectrómetros consisten principalmente de tres secciones, laprimera es la fuente de iones (ESI y MALDI son las más comunes), después la región de transferencia de ionesdonde los iones producidos son captados, enfocados y transferidos a una región de alto vacío antes de entrar alanalizador, y finalmente el analizador.

El arreglo estándar para el analizador FT-ICR, es una trampa de iones localizada dentro de un campomagnético especialmente uniforma de una fuerza B0. El efecto del campo magnético es obligar a los ionesincidentes a circular en una órbita (Figura 31), la frecuencia es determinada por la masa (m), la carga (z) yvelocidad (v) del ion, por acción de la ley de Lorentz, ecuación. El ion es llevado a una trayectoria circular en unplano perpendicular al campo magnético. La frecuencia angular de los iones (wc) se define por la ecuación 2. Elsentido contrario de rotación es experimentado por iones de carga opuesta.

Ecuación 1.F = zivB0

Ecuación 2.wc = ziB0

2pmi

Ecuación 3.mi = B0 .

2zipwc

Figura 30. Diagrama de estabilidad a-q


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Donde,F = fuerza de lorentzB0 = campo magnéticomi = masa del ionzi = carga del ionv = velocidad incidente del ionwc = frecuencia rotacional inducida (ciclotrón)

La presencia de iones entre el par de electrodos (en trampa) no producirá ninguna señal medible, por lo que esnecesario excitar los iones de una m/z dada como un paquete a un radio orbital mayor al aplicar barrido depotencial rf de milisegundos. Una frecuencia excitará una m/z particular (la transformación de Fourier permitemedir simultáneamente todas las frecuencias). La medición de la frecuencia angular (wc) lleva a valores de m/zy al espectro de masas. Debido a que la frecuencia puede ser medida más exactamente que otras propiedadesfísicas, esta técnica de análisis tiene una gran resolución. Después de la excitación, los iones regresan a suestado normal.Este tipo de analizadores poseen la resolución de masas mas alta, alta capacidad, y acoplamiento a métodosde ionización por pulsos (MALDI), es un método no destructivo, pero posee un rango de masa limitado, puedesufrir de efectos por cargas y por reacciones entre los iones, se deben cuidar muchos parámetros para tenerbuenas mediciones. Se acopla bien a MALDI y ESI.

Figura 31. Analizador FT-ICR


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DETECTORES DE IONES

Sensibilidad, precisión, y tiempo de respuesta son criterios importantes que distinguen los diferentes sistemasde detección de iones. Alta precisión y rápido tiempo de respuesta son características mutuamente excluyentes.

Idealmente, la sensibilidad debe definir explícitamente la corriente de ion recibida por el detector. La definicióndebe incluir: (1) el nombre del compuesto de calibración, (2) el valor m/z del ion medido, (3) el poder deresolución del instrumento, (4) la cantidad de compuesto de calibración consumido por minuto, (5) la intensidadde la corriente de electrones y presión de la fuente de iones (para CI), (6) la corriente del ion que llego aldetector. Estas unidades de sensibilidad permiten comparar instrumentos, que en ocasiones es difícil ya que lasdiferentes compañías usan diferentes criterios.

Copa Faraday

Este es un detector eléctrico convencional, iones positivos que impactan sobre el colector son neutralizados porelectrones después de pasar a través de una resistencia. La caída de voltaje en la resistencia de acuerdo a unestándar es la medición de la corriente del ion. La señal del voltaje de la resistencia es entonces amplificada porun amplificador DC o por unn electrómetro. El pequeño electrodo de metal que intercepta los iones positivosesta montado en una jaula de Faraday (Figura 32).

La corriente del ion medida y amplificada es directamente proporcional al número de iones y al número decargas de los iones. La respuesta de la copa faraday es independiente de la energía, la masa, o la naturalezaquímica de los iones. Este tipo de detector es simple, barato, resistente y fiable. Posee alta precisión,sensibilidad y produce poco ruido de salida. La principal desventaja es que tiene un gran retraso inherente a lasimplificación del sistema. Por esto es que se utiliza para mediciones precisas o de corrientes de iones pococargados y no debe ser usado para realizar examinaciones rápidas (por ejemplo en sistemas GC/MS).

Multiplicador de Electrones (Electron Multiplier)

El multiplicador de electrones (electron multiplier) utiliza el principio de emisión secundaria de electrones paraafectar la amplificación. En el dinodo discreto (discrete-dynode) los iones provenientes del analizador de masasson enfocados sobre un dinodo que emite electrones en proporción directa al número de iones bombardeadoshacia él. Los electrones secundarios del dinodo (iones en electrones) son acelerados y enfocados hacia unsegundo dinodo, el cual también emite electrones secundarios (electrones en electrones). De este modo, laamplificación es llevada a cabo a través de un “efecto cascada” de electrones secundarios de dinodo a dinodo,ya que el número de electrones que llegan a un dinodo es menos al que sale del mismo (Figura 33). Cadaetapa es un dinodo de cobre-berilio conectado a un potencial sucesivamente mayor por un divisor de voltaje.Pueden llegar a tener de 10 a 20 etapas amplificando la señal en un orden de hasta 107.

Figura 32. Copa Faraday


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Figura 33. Multiplicador de electrones de dinodo discreto (discrete-dynodo)

Figura 34. Principio general y entrada de muestra de un dinodo continuo (channeltron)

Figura 35. Detector Daly

Este tipo de detectores son de amplio uso, ya que además de ser sistemas confiables, baratos y que puedencaptar casi todos los electrones poseen sistemas electrónicos y mecánicos simples, aunque pueden no ser tansensibles (al no tener amplificación de señal) y un tiempo de respuesta lento debido a alta impedancia en elamplificador.

Un diseño alternativo de multiplicador de electrones utiliza un dinodo continuo en forma de cuerno hecho devidrio cubierto con plomo. Este vidrio cubierto es eléctricamente resistente y provee un gradiente eléctrico queesta conectado a una fuente de poder. Hacia el final del cuerno se ajusta el ángulo para poder captar todos losiones y convertirlos en electrones secundarios. Estos electrones secundarios son atraídos a lo largo de ungradiente eléctrico positivo en el cuerno, estos electrones chocan con la pared y más electrones secundariosson expulsados, provocando amplificación (Figura 34). La forma de dinodo continuo (frecuentemente llamadochanneltron) es curva para prevenir que iones positivos causen señales de ruido debido a ionización secundariade moléculas residuales de gas.

La rápida respuesta y alta sensibilidad, con una ganancia de 106 hacen que el detector multiplicador deelectrones sea indispensable en sistemas como el GC/MS.

Detector Daly

Una corriente de iones positivos pasan por la hendidura del detector y son atraídos hacia un cátodo de aluminio(el botón Daly) teniendo un gran potencial negativo (-15000 V). Ocurre el impacto con el botón Daly, el cualesencialmente sirve como un dinodo de conversion que produce más de ocho veces electrones secundariosque son atraídos hacia un aparato centelleante, los electrones secundarios generan fotones que sonamplificados en un fotomultiplicador (Figura 35).


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Figura 36. Principio del detector de microcanales

El detector Daly tiene la ventaja de que no opera bajo vacío, puede detectar iones de masas grandes, y puededetectar iones estables y metaestables, pero solo es capaz de detectar iones de alguna m/z específica ya es undetector de canal simple.

Detector de Microcanales

Un arreglo de capilares de vidrio huecos (de 10-25mm de diámetro), unidos a un material emisor de electrones,formando un microcanales. Manteniendo estos microcanales a un alto voltaje permite a los iones golpear elmaterial y expulsar electrones, esto causa una avalancha, creando electrones secundarios con una ganancia de103-104 (Figura 36). Estos detectores son útiles en señales de baja intensidad.

Los microcanales pueden también emitir electrones a través de pantallas fosforescentes. Un detector de arreglode fotodiodo es usado para convertir los fotones liberados en señales eléctricas (Figura).

Figura 37. Detector de arreglo de fotodiodo.


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Figura 38. Diagrama de procesamiento de datos. ARRIBA: Señal analoga.EN MEDIO: Señal procesada. ABAJO: Datos procesados mediante softwarey produciendo el espectro de masas.

ADQUISICIÓN Y PROCESAMIENTO DE DATOS

En los 60´s y 70´s el oscilógrafo de rayo de luz fue el primer aparato de registro con suficiente respuesta de altafrecuencia para registrar en forma precisa los espectros de masas. Hasta el desarrollo de la minicomputadorafue posible hacer procesamiento de datos al tener algoritmos para su proceso e interpretación.

La salida análoga del detector es típicamente una señal de voltaje que varía en función del tiempo, esta esconvertida a una señal digital por medio de un convertidor análogo-digital. Los datos digitales son procesados yalmacenados en el CPU de una computadora. El sistema de datos almacena solo la información de los picosdel espectro de masas (valor de m/z y la intensidad) para cada análisis. Estos datos son entonces procesadospara producir diferentes representaciones al interpretar y procesar los datos por medio de la computadora. Losdatos procesados son entonces desplegados ya sea en el monitor o impresos en formato de gráfica de barras.

La calibración del espectrómetro de masas, en el eje de masa es llevado a cabo al introducir una muestra de uncompuesto cuyo espectro de masas es bien conocido. Dependiendo del tipo de algoritmo utilizado, el operadorpuede ingresar los valores conocidos de m/z a los picos en el espectro de masas del compuesto de calibración,la computadora realizará los ajustes necesarios en la escala de masa. En otros casos, el operador puedeajustar los parámetros de la escala de masa hasta que en la computadora se indiquen los valores apropiadosde m/z de los picos conocidos en el espectro de masas del compuesto de calibración.

Figura 37. Componentes esenciales de un sistema de adquisición de datos


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Procesamiento de datos

Debido a las grandes cantidades de información que son generadas y la gran cantidad de parámetros quecambian en un periodo de tiempo, las computadoras son una herramienta esencial en espectrometría demasas, tanto para control del equipo, adquisición, almacenamiento y presentación de datos. Los sistemas deprocesamiento de datos generalmente incluyen programas útiles en cuantificación, interpretación de losespectros de masas y comparación de compuestos a través de consulta de bases de datos vía internet.

La estrategia es utilizar un sistema de procesamiento datos que permita adquirir datos constantemente, yobtener los datos tan rápido como sea posible teniendo una buena relación señal-ruido sin abusar de losprincipios de operación del espectrómetro de masas. Esto usualmente es completado en un ciclo de examendel orden de 1 segundo, adquiriendo un nuevo espectro de masas cada segundo, esto tiene la ventaja de noperder datos importantes pero tiene la desventaja de que se deben adquirir grandes cantidades de datos. Elanálisis será realizado con el problema de tener que determinar cuales datos son útiles y necesarios para tenerel resultado final.

Los sistemas de procesamiento de datos emplean procedimientos de búsqueda hacia adelante o de búsquedareversa. En la búsqueda hacia adelante, un espectro no definido es comparado con cada miembro de unabiblioteca de espectros de referencia. Un resultado siempre será alcanzado, al calificar son cierta clase deparecido respecto a las referencias, esto tiene la ventaja de sugerir el tipo de compuestos presentes en lamuestra si el grado de parecido no es aceptable o suficiente. En la búsqueda reversa, un banco de datos escomparado con el espectro no definido para determinar si algunos picos de referencia están presentes en elespectro analizado. Un resultado puede lograrse si el espectro no definido tiene algunos picos “extras” quepueden ser comparables a los espectros de referencia. No se podrá identificar un compuesto si no se tiene unespectro de referencia que corresponda en la base de datos.

Las computadoras pueden realizar búsquedas en bases de datos de espectros de masas, para ello se basan enalgoritmos de probabilidad, llamados algoritmos PBM (probability-based-matching) y variantes del algoritmoINCOS, el cual busca parecido entre los picos más intensos del espectro (utiliza los 16 picos más intensos)contra una base de datos.


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APLICACIONES

Análisis de estructura y masa

En el análisis de estructura por medio de espectrometría de masas de la acetona (C3H6O) se observandiferentes fragmentos de iones y el ion molecular en m/z=58 (Figura 39).

Los iones más intensos han sido marcados con su m/z . Los fragmentos de ion son usados por losespectrometristas de masas para deducir las estructuras moleculares. Algunas veces los símbolos [+·] y [-·] sonusados para indicar los iones radicales, esta información es útil para determinar los patrones de fragmentación.Se observa que la pérdida de 15 Da del ion molecular de la acetona da un ion de m/z=43 indicando la presenciade un grupo metil (CH3) en la molécula original, la pérdida de 28 Da da un ion con m/z= 15 sugiriendo lapresencia de CO. Al analizar estas pérdidas y organizando las posibles estructuras a partir de los ionesobtenidos, se puede deducir la estructura del compuesto original. Algunas pérdidas comúnmente observadasson de agua (H2O 18 Da), amonio (NH3 17 Da) y grupo fenil (C6H5 77 Da).

Otra aplicación de la espectrometría de masas es la determinación de masas. Cada isótopo de cada elemento(excepto para carbono al cual se le asigno un valor de 12.00000 Da) tiene una masa no entera única. Ladeterminación de mediciones de masa permite determinar composición química. En el espectro de masas(Figura 40) es posible distinguir entre monóxido de carbono (CO, m/z=27.995) y nitrógeno (N2 m/z=28.006) pormediciones exactas de sus masas

Figura 39. Espectro de masas de la acetona (C3H6O)

Figura 40. Espectro de masas CO y N2.


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Sistemas Acoplados

La espectrometría de masas es un sistema de detección útil en técnicas de separación tales comocromatografía de gases (GC), cromatografía líquida (LC), electroforesis capilar y otras, debido a que esaltamente sensible y es capaz de identificar compuestos químicos en forma precisa. El reto al acoplar elespectrómetro de masas a un sistema de separación es el mantener el vacío necesario al introducir la muestradesde el cromatógrafo. Interfaces que restringen o reducen el flujo de gas de entrada al espectrómetro permitenacoplar el cromatógrafo de masas y el espectrómetro de masas (GC/MS) (Figura 41).

Al vaporizar el solvente de una cromatografía líquida este representaría un volumen de 100-100 veces másgrande que el gas usado en cromatografía de gases. Se han desarrollado interfaces que resuelven esteproblema al eliminar este exceso de gas usando calor y vacío, en algunos casos con ayuda de una corriente degas que ayuda a secar. Los sistemas acoplados LC/MS utilizan ionización química (CI) o electrospray (ESI)como métodos de ionización.

Tabla 7. Compuestos aptos para análisis LC/MSBajo peso molecular

< 1 kDaPeso molecular medio

1 -10 kDaPeso molecular alto

> 10 kDaDrogas, compuestos endógenos,vitaminas, pesticidas, toxinas,conjugados (glucoronidos, SO4)de compuestos con m/z > 50.

Polipéptidos sintéticos ypolisacáridos.

Polipéptidos, proteínas,oligonucleótidos, polisacáridos.

En GC/MS y LC/MS, los datos obtenidos consisten en una serie de espectros de masas que son adquiridossecuencialmente en tiempo. Para generar esta información, el espectrómetro de masas examina un rango demasas (por ejemplo m/z de 30 a 500) repetitivamente durante la corrida cromatográfica. Si se realiza un examencada segundo y se hace una corrida de 30 minutos, se obtendrán 1800 espectros.

La información obtenida puede ser analizada en diferentes formas. En primer lugar, las intensidades de todoslos iones en cada espectro son sumadas, y esta suma graficada como función del tiempo de retencióncromatográfico (TIC) cuya apariencia es similar a los datos de salida de un detector cromatográficoconvencional (Figura 43 parte superior). Otra forma es desplegar cualquiera de los espectros obtenidos (Figura43 parte central), cada pico en TIC representa un compuesto eluido que puede ser identificado al analizar suespectro de masas obtenido es ese punto. La intensidad a una m/z específica en el transcurso de la corrida

Figura 42. Sistema LC/MS

Figura 41. Sistema GC/MS


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cromatográfica puede ser desplegada para producir un perfil de corrientes de iones seleccionados o uncromatograma de masas (Figura 43 parte inferior). Esta técnica puede ser usada para encontrar componentesen una mezcla compleja sin tener que examinar cada espectro en forma individual.

Acoplando dos etapas de aná l is is de masas(MS/MS) puede ser muy útil en la identificación de compuestos en mezclas complejas y en la determinación desustancias no conocidas. El examen de iones producidos es el modo MS/MS mas frecuentemente usado, segeneran los espectros de masas de iones producidos de un valor m/z específico. De una mezcla de ionesgenerados o colectados, se seleccionan aquellos iones que tengan un valor m/z particular, esta es la primeraparte del análisis. Estos iones son fragmentados y los productos de la fragmentación de estos iones sonanalizados es una segunda etapa del análisis de masas (Figura). Si la muestra es un compuesto puro y serealiza fragmentación de los iones producidos, los espectros producidos de esta fragmentación proveeráninformación adicional respecto la estructura del analito. Si la muestra original es una mezcla y se usa ionizaciónsuave, la segunda etapa de MS puede usarse para obtener un espectro de masas para cada componente en lamezcla. MS/MS puede también usarse para eliminar interferencias en experimentos SIM donde se producenvarias señales de iones de una m/z específica.

Análisis cuantitativos

Cuando ya se conoce el espectro de masas de un compuesto específico, se puede confirmar la presencia desustancias específicas o medir la cantidad presente en la muestra. Este tipo de análisis son rutinarios enmediciones de contaminantes ambientales y estudios farmocinéticos donde se requiere cuantificar analitos enconcentraciones muy bajas y además en mezclas complejas. El espectrómetro de masas se ajusta paramonitorear solo valores específicos de m/z representativos de las moléculas a analizar. El tipo de ionizaciónutilizado puede favorecer la producción de ciertos tipos de iones, incrementando la sensibilidad y manteniendola señal de ion en su valor de m/z.

En la Figura 45, se muestra un espectro en el cual se monitorearon solo los valores de m/z=158 y m/z=160durante una corrida cromatográfica. Este proceso se conoce como monitoreo selectivo de iones (SIM).

Figura 44. Sistema MS/MS

Figura 43. Análisis de espectros en sistemas acoplados.


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Figura 45. Monitoreo selectivo de iones (SIM)

Este espectro es un análisis cuantitativo de un derivado de 5-fluorouracil en plasma, la respuesta de lasustancia de interés es medida relativamente en comparación con un estándar interno añadido a la muestra. Enla parte superior de la Figura se muestra el perfil SIM del ion a una m/z=158, el compuesto de interés produce elpico central, dos pequeños picos aparecen y corresponden a compuestos que también producen iones am/z=158. En la parte inferior de la Figura es el perfil SIM de la misma molécula teniendo el N15 sustituido porN14 normal en dos posiciones, debido a que ambos nitrógenos están sustituidos, la señal de este ion es am/z=160, 2 Da mas pesado. Aunque la muestra y es estándar tienen el mismo tiempo de retención, sondetectados en forma separada ya que tienen masas diferentes. Los estándares pueden ser sustanciasaltamente relacionadas o químicamente idénticas pero sintetizadas sustituyendo un isótopo de uno de loselementos como en este caso.

La medición de isótopos es útil en diferentes áreas tales como estudios metabólicos que utilizan sustanciasmarcadas isotópicamente, en estudios climáticos al usar isótopos de oxígeno y carbono que son temperaturadependientes, en cálculo de edades de materiales (por ejemplo rocas) al medir plomo, neodimio o estroncio. Larelación de isótopos de un elemento puede ser determinada en forma precisa y exacta por medio deespectrometría de masas, pero es necesario reducir los compuestos a moléculas simples antes de la medición,los compuestos orgánicos son reducidos a CO2, H2O y N2.

Análisis de péptidos

Para realizar análisis de péptidos, una vez obtenida la proteína o extracto de proteínas, se realiza una digestiónproteolítica para obtener péptidos, esta mezcla de péptidos son separados y purificados por medio decromatografía de gases (GC), HPLC u otras técnicas de separación (Figura 45). Los péptidos separados ypurificados son sometidos a espectrometría de masas para obtener los espectros de las diferentes fracciones.Se analizan los espectros obtenidos, la relación m/z y la intensidad de los iones obtenidos en los diferentesespectros son usados para identificar los péptidos de las muestras.

Figura 45. Análisis de péptidos por medio de espectrometría de masas.


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Iones de péptidos

Cuando un péptido es fragmentado por colisión con moléculas un de gas neutro, la fragmentación es inducidapor transferencia de energía cinética de las moléculas del gas al péptido. Cuando un péptido es fragmentado enun enlace peptídico particular entre carbonilo (-CO-) y nitrógeno (-NH-), se forman dos fragmentos, unfragmento del péptido retiene la carga positiva en el C terminal del péptido ionizado y es llamado ión-y, el otrofragmento retiene la carga positiva en el N terminal y es llamado ión-b. Un ión-b generalmente tiene un ión-ycomplementario. Cuando un péptido que tiene una sola carga es fragmentado, la carga se mantiene solo en unfragmento y solo aquel que tenga la carga podrá ser detectado mientras que el otro permanecerá comofragmento neutro no detectable. Péptidos doblemente cargados producirán dos iones cargados.

Durante la fragmentación de péptidos pueden formarse otros tipos de iones además de los iones-y y los iones-b. Los iones-a y los iones-x, los iones-c y los iones-z, siendo complementarios entre a-x y c-z. Los iones a-x seforman por rompimiento entre el péptido y el carbonilo en el extremo N terminal. Los iones c-z se forman alhaber un rompimiento entre el nitrógeno (-NH-) y el resto del péptido. Los iones a, x, c y z se forman encondiciones de alta energía y los b-y en baja energía.

Secuenciación de péptidos

La secuenciación de novo de péptidos es llevada a cabo al determinar la secuencia directamente del espectrode masas sin consulta de bases de datos. Las diferencias entre m/z sucesivas se usan para determinar lasecuencia aminoacídica del péptido. Se asume que solo ocurre formación de iones b-y durante el proceso defragmentación del péptido, se forman iones-b ascendentes desde el extremo N terminal mientras que se formaniones-y en forma descendente desde el C terminal. Se determinan las m/z de los fragmentos aminoacídicos. Alcomparar las diferencias entre masas sucesivas de cada serie y comparándolos con las masas conocidas deresiduos de aminoácidos, se puede determinar la secuencia de un péptido. Tanto los iones de la serie b comode la serie y indican la misma secuencia.

La precisión de la secuencia deducida es limitada por las características del equipo. La calidad de la reacciónde fragmentación, ya que en ocasiones no ocurre el corte y los fragmentos obtenidos diferirán en algúnaminoácido que no podrá deducirse, por ejemplo, en presencia de prolina la fragmentación puede no ocurrir ycausar errores en la secuencia.

Figura 46. Iones formados durante fragmentación de péptidos.

Figura 47. Secuenciación de novo de un péptido AVAGCAGAR


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Identificación de proteínas

Para identificar proteínas se utilizan las huellas de masas de péptidos (peptide mass fingerprinting) o huellaspeptídicas, este método utiliza los péptidos obtenidos de la digestión enzimática de la proteína para obtener susespectros de masas. Los péptidos son identificados por comparación contra una base de datos, ya que lasmasas de los péptidos forman en conjunto la huella peptídica de la proteína, es posible identificar la proteína deinterés. Factores importantes que deben ser considerados en este procedimiento es la pureza de la proteína yla precisión de los datos obtenidos, la precisión de los datos disponibles en las bases de datos y el tipo dealgoritmos usados al comparar las masas de los péptidos (Figura 48).

El resultado de este análisis puede sufrir algunos problemas al tener presencia de señales provenientes depéptidos que no están presentes en la proteína de interés debido a que la purificación dejo algunas proteínasque contaminaron la muestra o presencia de péptidos contaminantes. Es posible además obtener resultadosfalsos positivos al comparar los espectros obtenidos contra las bases de datos, o que la proteína de estudiotenga modificaciones postraduccionales desconocidas que podrían alterar el análisis, algunas veces es difícildistinguir entre proteínas que son muy similares o que podrían tener las mismas huellas peptídicas.

Se dispone de tres tipos de herramientas para al análisis de huellas peptídicas:1. Programas que asignan puntuaciones a las masas de los péptidos obtenidos que coinciden con las masas

de péptidos de las bases de datos. Por ejemplo:PepSea: http://www.unb.br/cbsp/paginiciais/pepseafingerprint.htmPeptldent: http://us.expasy.org/tools/peptident.html

2. Programas que asignan puntuaciones basados en la longitud del péptido y la proteína. Por ejemplo:MOWSE: http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowseMS-Fit: http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm

3. Programas que asignan puntuaciones probabilisticas para determinar la significancia de los resultadosobtenidos entre las muestras y las bases de datos. Esto es para evitar resultados no significativos. Porejemplo:PROWL: http://prowl.rockefeller.edu/MASCOT: http://www.matrixscience.com/cgi/index.pl?page=/search_form_select.html

Figura 48. Proceso de identificación de péptidos por medio de huellas peptídicas.


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HERRAMIENTAS PARA ANÁLISIS DE PROTEÍNAS PORESPECTROMETRÍA DE MASAS

Protein ProspectorColección de herramientas de la UCSF Mass Spectrometric Facility usadas para identificar proteínas usandodatos de espectrometría de masas y bases de datos.http://prospector.ucsf.edu/

ExPASy Proteomics ToolsProgramas del Expert Protein Analysis System (ExPASy) del Swiss Institute of Bioinformatics. Paraidentificación y caracterización de proteínas, predicción de modificaciones postraduccionales, topología yestructura de proteínas.http://us.expasy.org/tools/

MASCOTIdentificación de proteínas basado en bases de datos de pesos de péptidos, usa métodos probabilisticos paracalcular significancia entre datos.http://www.matrixscience.com/cgi/index.pl?page=/search_form_select.html

PeptideSearchIdentificación de proteínas en base a sus espectros de masas.http://www.mann.embl-heidelberg.de/GroupPages/PageLink/peptidesearchpage.html

MOWSEMOWSE (MOlecular Weight Search). Utiliza pesos moleculares obtenidos por digestión de proteínas con unaproteasa conocida y busca en bases de datos de péptidos para identificar proteínas, de 3 a 4 péptidos sonnecesarios para identificar una proteínas entre una base de datos de 50000 proteínas.http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowse

Mass Spec ToolsHerramientas de Scientific Information Services usadas para generar y graficar espectros de masas y calculardistribución de isótopos.http://www.chemsw.com/13057.htm


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DEFINICIÓN DE TÉRMINOS

Relación masa/cargaEsta expresión, abreviada m/z, es la relación del número de masa (m) de una partícula dada entre el número (z)de unidades cargadas electrostáticamente (e) que posee la partícula. Así, m/z es una relación adimensionalque es el parámetro medido por el analizador de masas. La masa de una partícula dada es igual a la suma desus masas atómicas (en Daltons) de todos los elementos que componen la partícula. El símbolo para las unidadde masa es u, y corresponde a 1/12 de la masa del 12C, al que se la ha asignado un valor de 12.000000 porconvención.

Iones doblemente cargadosEs posible para una molécula perder dos electrones durante el proceso de ionización. Estos iones que estándoblemente cargados producirán un pico en el espectro de masas en un valor m/z numéricamente igual a lamitad de la masa molecular del ion. Los iones doblemente cargados son insignificantes en el espectro de masapara la mayoría de los compuestos. Sin embargo, para aquellas moléculas que los produzcan en forma estable,los picos correspondientes en el espectro de masas pueden ser usados en la interpretación de datos.

Ion molecularEl ion molecular resulta de la ionización de la molécula a analizar. Este ion representa la molécula intacta y esel último precursor de todos los iones fragmentados que componen el espectro de masas. El pico del ionmolecular aparece a un valor m/z numéricamente igual al peso molecular del compuesto.

Pico baseEs el pico más intenso en el espectro de masas. Es usado como base para normalizar las intensidades de losotros picos. Al pico base se le asigna una intensidad relativa de 100%.

Intensidad relativaLa intensidad relativa de un pico representa su intensidad en comparación con el pico base. Se representacomo % respecto al pico base que es 100%. Por convención, este dato se indica en la izquierda del espectro demasas.

Porcentaje total de ionizaciónEste término expresa la abundancia de un ion individual comparado con la suma de las abundancias de todoslos iones en un rango de masa especifico. La escala de porcentaje total de ionización esta representada a laderecha del espectro de masas con el símbolo (%Sn), este dato puede ser utilizado para comparar diferentesespectros de masas de diferentes compuestos.

Espectro de masasUn espectro de masas es una gráfica de intensidad relativa del ion como función de la relación masa/carga(m/z). El espectro de masas es frecuentemente representado como un histograma simple. Esta forma deregistro de iones y sus intensidades sirven para establecer el peso molecular y estructura del compuesto a seranalizado. Debido a que ocurre la fragmentación del analito, las fracciones del ion aparecen en el espectro avalores m/z menores que la molécula completa ionizada (ion molecular) a partir de es tos datos se deduce laestructura y peso molecular de la molécula completa.


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REFERENCIAS

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el espectrómetro de masas

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