escuela nacional de ciencias biolÓgicas, ipn
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ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS, IPN
Efecto del diazepam sobre el potencial del dorso de la médula en la
rata Wistar desnutrida crónicamente.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
PRESENTA: Cintia Velázquez Delgado
DIRECTOR DE TESIS:
M. en C. Mitzi Gisela Carreón Hernández 2016
Cd. De México
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A mis padres, Tina y Héctor, que me han brindado lo necesario y más para poder
alcanzar cada uno de mis sueños, a mi hermano y mi abuela, que siempre me han
brindado su cariño incondicional.
A todos mis tíos y primos, que siempre me alientan y me ofrecen su apoyo para perseguir
mis metas, en especial a mis tías Edith y Paty que siempre me brindaron sus consejos.
A Mau, Monse, Magali, Gaby, Adri, Brenda, Elena, Abi, Ana Laura, Itzel, Aza, Kika, Serch,
Lalo y Carlos, que me ofrecieron su amistad y compañía durante la realización de este
trabajo.
A la M en C. Mitzi Gisela Carreón Hernández con la cual realice un excelente equipo, por
enseñarme lo que es la investigación científica, y por brindarme su valiosa amistad.
Al Dr. Ismael Jiménez Estrada, por su apoyo incondicional y por enseñarme el
compromiso hacia la ciencia.
A mi Co-asesor Dr. Ricardo Pérez-Pastén Borja por sus consejos y su orientación
académica.
A mis sinodales Dr. Sergio Zamudio Hernández, Dr. Jorge Pacheco Rosado y Dra. Norma
Paniagua Castro por su valioso apoyo en la revisión de la presente tesis, observaciones y
sugerencias.
A todos los profesores de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas por su incansable
esfuerzo por hacer de nosotros los mejores profesionistas.
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RESUMEN ......................................................................................................................................... 5
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 6
¿QUÉ ES LA DESNUTRICIÓN? .................................................................................... 6
LA DESNUTRICIÓN EN EL MUNDO ............................................................................. 7
LA DESNUTRICIÓN EN MÉXICO ................................................................................. 8
DESNUTRICIÓN EN MODELOS ANIMALES ................................................................ 8
DESNUTRICIÓN Y EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL ............................................. 9
MÉDULA ESPINAL ..................................................................................................... 12
GABA Y SUS RECEPTORES ..................................................................................... 13
DIAZEPAM UNA BENZODIACEPINA ......................................................................... 16
CDP (POTENCIAL DEL DORSO DE LA MÉDULA) .................................................... 19
ANTECEDENTES .......................................................................................................................... 20
FUNDAMENTO .............................................................................................................................. 21
HIPÓTESIS ..................................................................................................................................... 21
OBJETIVOS .................................................................................................................................... 21
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 21
OBJETIVOS PARTICULARES .................................................................................... 21
Técnica quirúrgica ..................................................................................................... 23
Estimulación eléctrica ............................................................................................... 24
Registro del PDM........................................................................................................ 24
Procesamiento de datos ............................................................................................ 24
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Análisis de datos ........................................................................................................ 25
RESULTADOS ............................................................................................................................... 26
Desarrollo físico: ........................................................................................................ 26
Efecto de la desnutrición sobre el peso corporal .................................................... 26
Efecto de la desnutrición sobre los componentes del potencial del dorso de la
médula (CDP), posterior a la administración de diazepam. .................................... 27
Efecto de la desnutrición crónica sobre la amplitud, duración y área de la onda N1
posterior a la administración de diazepam. ............................................................. 28
Efecto de la desnutrición crónica sobre amplitud, duración y área sobre la onda P
posterior a la administración de diazepam. ............................................................. 31
Correlación entre las amplitudes de los componentes N1 y P ............................... 33
DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 34
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 40
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 41
INDICE DE FIGURAS ................................................................................................................... 48
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RESUMEN
En diversos estudios se ha mostrado que el Diazepam (DZP; compuesto ansiolítico) que
actúa a nivel de los receptores GABAa incrementa la duración del componente positivo
(onda P) del potencial del dorso de la médula (CDPs, por sus siglas en inglés), así como la
de los potenciales de la raíz dorsal (DRPs, por sus siglas en inglés), los cuales son
representativos de la despolarización de aferentes primarios (DAP) y de la inhibición
presináptica (Rudomin et al, 1994). Por otra parte, en un estudio reciente (Quiroz et al., 2012)
mostramos que los CDPs y DRPs registrados en ratas desnutridas crónicamente eran de
menor amplitud y área que los registrados en animales control. En este estudio analizamos
el efecto que provoca la aplicación de DZP sobre los CDPs y DRPs registrados en ratas
Wistar normoalimentadas (grupo control; GC) o desnutridas crónicamente (alimentadas con
el 50% del alimento proporcionado a las ratas GC desde la gestación hasta los 60 días de
edad; GD). En ambos grupos de ratas (GC y GD), los CDPs fueron provocados por la
estimulación eléctrica del nervio sural (con una intensidad 3 veces umbral) y registrados en
el segmento L6, mientras que los DRPs en una raicilla del mismo segmento L6. Los CDPs
registrados presentaron 4 componentes: una salva aferente (AV), causada por la activación
de fibras aferentes de bajo umbral, seguido de dos componentes negativos (denominados
N1 y N2) que se generan por la acción mono y di-sináptica de fibras aferentes Aβ y Aδ
sobre grupos de neuronas localizadas en el cuerno dorsal de la médula, y por último un
componente positivo (onda P), que se genera por la DAP.
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INTRODUCCIÓN
Todos los animales requieren de una cantidad adecuada y suficiente de nutrientes para
poder llevar a cabo sus funciones orgánicas de manera apropiada. Si se mantiene constante
el peso corporal, indica que la energía provista por los nutrientes en la dieta es suficiente
para cubrir las necesidades de los organismos. La energía metabólica es aportada por los
nutrientes que contienen los carbohidratos, las grasas y las proteínas en la dieta, siendo
éstas últimas las que por lo general suministran el requerimiento corporal de nitrógeno y
aminoácidos específicos (Murray et al.,2001). Los lípidos además de incrementar la
sensibilidad del paladar y producir sensación de saciedad, llevan a cabo dos papeles de
suma importancia: el actuar como vehículo dietético de las vitaminas liposolubles y el
proporcionar ácidos grados poliinsaturados esenciales (Murray et al., 2001).
Una dieta inadecuada en cantidad o calidad puede conducir a estados patológicos de salud
de consideración, entre los que destaca la malnutrición, la cual se define como un
desequilibrio en la ingesta diaria de energía debida a la carencia o exceso del consumo de
proteínas, grasas y/o otros nutrientes. Esta patología incluye tanto a la obesidad como a la
desnutrición (WFP, 2016b).
MARCO TEORICO
¿QUÉ ES LA DESNUTRICIÓN?
La desnutrición es un estado patológico que resulta de una ingesta pobre de alimentos la
cual es insuficiente para satisfacer las necesidades biológicas del organismo, o bien, surge
de una deficiente absorción y/o de un uso biológico inadecuado de los nutrientes
consumidos por el organismo, lo que le genera un estado catabólico sistémico y una pérdida
importante de peso corporal (Morgane et al., 1978; OMS 2016).
DESNUTRICIÓN EN LA INFANCIA
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La desnutrición provoca alteraciones de consideración en el desarrollo cognitivo y físico de
niños menores de cinco años, lo que les afecta por el resto de sus vidas, llegando incluso
a tener el riesgo de fallecer(Ortiz-Andrellucchi et al., 2006).
Como se describe en el informe de la UNICEF 2006, los principales factores que influyen
en la ocurrencia de desnutrición en la infancia son: insalubridad; pobreza; desastres
naturales; padres con poca educación; estado nutricional materno deficiente y ausencia o
insuficiencia de leche materna. Entre las principales consecuencias de la desnutrición se
encuentran: muerte neonatal o durante la infancia, problemas de aprendizaje y patologías
crónicas (Uauy et. al, 2001).
LA DESNUTRICIÓN EN EL MUNDO
En el año 2005, la OMS señala que en el mundo había 30 millones de niños que nacían
con notorias deficiencias de peso (el 23.8% de los nacidos). En cambio, la UNICEF en el
2009 reporta que en países en vías de desarrollo existían 146 millones de niños con bajo
peso para la talla. Así mismo, en el 2013 la OMS reporta que 161,5 millones de niños
menores de cinco años presentaban retraso de crecimiento y 50,8 millones un bajo peso
para la talla.
En lo que va del 2016, se reporta que han nacido 17 millones de niños con bajo peso, como
resultado de una nutrición inadecuada antes y durante el embarazo (WFP, 2016, b). La
desnutrición es uno de los factores que más contribuyen a la carga mundial de morbilidad,
representa el 53% de todas las muertes de recién nacidos o de lactantes (OMS, 2005). La
desnutrición y las enfermedades están estrechamente relacionadas, en ocasiones, algunas
enfermedades surgen por la desnutrición, otras por factores contribuyentes, tales como
infecciones por insalubridad o métodos incorrectos de alimentación (WFP, 2016a).
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La emaciación y el edema bilateral son formas graves de malnutrición,las cuales son
causadas por una carencia aguda de alimentos y agravadas por enfermedades. Según la
OMS (2005), cada año fallecen 1,5 millones de niños por emaciación(OMS, 2016). La FAO
ha reportado que en el año 2013 había 842 millones de personas que padecían de hambre
en el mundo, de los cuales un 98% vivían en países en vías de desarrollo Y de estás, 75%
de personas con hambre vivían en zonas rurales.
LA DESNUTRICIÓN EN MÉXICO
A pesar de que en los últimos 20 años se ha observado en México una disminución en los
diferentes tipos de desnutrición infantil, la prevalencia de talla baja, que es el reflejo de la
desnutrición crónica infantil, lo padecen en México 1.5 millones de niños, lo que representa
el 13.6% de la población (Gutiérrez et al., 2012). El peso bajo de niños es uno de los
indicadores de una desnutrición aguda. En México, 280,000 niños la padecen (2.8%) y
evaluada de acuerdo al indicador de peso para la talla, aproximadamente 174,000 niños la
presentan (Rivera et al., 2013). Lo cual refleja que más del 15% de la población menor de
cinco años sufren de algún tipo de desnutrición en México (Figura 1).
Las prevalencias de desnutrición crónica entre la cuatro grandes regiones (norte, centro,
sur y Ciudad de México) y zonas urbanas y rurales son sumamente heterogéneas, lo mismo
que su disminución a lo largo del tiempo (Gutiérrez et al., 2012).
DESNUTRICIÓN EN MODELOS ANIMALES
Como se ha mencionado previamente, los factores que generan la malnutrición y en
particular, la desnutrición en los individuos humanos son muy variados, lo que ha dificultado
al extremo la valoración de las alteraciones de las funciones de los distintos órganos y
sistemas de los individuos, en particular del Sistema Nervioso Central. Ejemplo de ello, es
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la imposibilidad de separar en el humano, las variables que involucran los aspectos
nutricionales con aquellas relacionadas con las de insalubridad y/o privación psicosocial
(ignorancia o condiciones sociales adversas). Es por ello de la necesidad de utilizar modelos
animales en donde se puedan controlar los distintos factores que generan la desnutrición
(Dobbing, 1972). La rata es una de las especies animales que se ha utilizado con mayor
frecuencia en estudios experimentales para evaluar los posibles efectos que ejerce la
desnutrición sobre los distintos sistemas y órganos corporales (Laus et al., 2011).
Figura 1. Prevalencia de bajo peso, baja talla, emaciación y sobrepeso en población menor de 5 años. (Encuesta Nacionalde Salud y Nutrición de 1988, 1999, 2006 y 2012, México) (Imagen tomada de Gutiérrez et al., 2012)
DESNUTRICIÓN Y EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
El Sistema Nervioso Central (SNC) es uno de los sistemas más afectados por las
deficiencias alimenticias que ocurren en diversos períodos del desarrollo del individuo,
preferentemente durante etapas tempranas de desarrollo perinatal (Morgane et al., 1978).
El desarrollo cerebral postnatal está influenciado por el estado nutricional del individuo
durante la etapa prenatal, mientras que el desarrollo gestacional está regulado por el estado
nutricional de la madre, antes y durante la gestación (Morgane et al., 1978). Se ha
determinado en la rata que durante la gestación ocurren la mayoría de los procesos de
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neurogénesis, gliogénesis, migración, todos los procesos de diferenciación celular y la
formación de los grandes conglomerados neuronales presentes en el SNC, tales como la
conformación de centros y núcleos neuronales, mientras que en periodos prenatales y
posnatales tempranos se presenta la mielinización, la proliferación dendrítica y la
sinaptogenésis (Figura 2) (Morgane et al., 1978).
Se conoce que la desnutrición induce la reducción de la cantidad de mielina en el cerebro
de ratas durante los primeros 21 días de vida (Bass et al. 1970) y el grosor de la vaina de
mielina en los nervios ópticos (Bedi, 1994), motores (Cornblath y Brown, 1988) y de las
raíces dorsales (Sima, 1974). De igual manera, las proyecciones tálamo-corticales se ven
afectadas por la malnutrición, tanto en las proyecciones específicas o no específicas (Cintra
y Salas, 1973).
La malnutrición y la desnutrición afectan la síntesis y la estructura de proteínas, esto es
de gran importancia porque muchos aminoácidos son precursores de diversos
neurotransmisores (Tabla 1), afectando los procesos de la neurotransmisión
catecolaminérgica, serotonérgica (Wiggins., 1984), glutamatérgica (Rotta et al., 2008) y
GABAérgica (Steiger et al., 2002, 2003).
La desnutrición también altera la incorporación de lípidos a las estructuras cerebrales, lo
que puede alterar la producción secuencial de algunas clases de proteínas, afectando
varios circuitos inhibitorios que modulan la actividad excitadora de las células piramidales
(Morgane et al., 2002).
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Tabla 1. Cuadro de las consecuencias de la desnutrición y malnutrición en diferentes sistemas de neurotransmisión.
Durante el desarrollo embrionario y fetal, las neuronas y las células gliales se originan de
células embrionarias, requiriéndose para ello de diversos factores de crecimiento, tales
como el BDNF (factor neurotrófico cerebral, por sus siglas en inglés). Se ha determinado
que por la desnutrición maternal prenatal, se ve afectada la cronología de producción del
BNDF (Lee et al., 2002) lo que altera la gliogénesis, la neurogénesis y la maduración
neuronal (Coupé et al., 2008).
La génesis temprana de la astroglia y las células piramidales en los humanos, resulta
cuando se tiene el aproximadamente el 27% del peso del cerebro, comparado con el de la
rata que sucede cuando tiene el 12% del peso cerebral. La curva del crecimiento del cerebro
de la rata esta desplazada hacia la derecha, comparada con la del humano (Figura
2)(Morgane, et al., 2002).
Los procesos apoptóticos están fuertemente relacionados con el estado nutricional del
organismo. Se ha reportado que de presentarse desnutrición durante la gestación y la
lactancia, se incrementa el número de células apoptóticas en el giro dentado del hipocampo,
de acuerdo a esto, la desnutrición puede inducir muerte celular, la cual está relacionada
con falta de factores neurotróficos (Jahnke y Bedi, 2007).
Sistema de neurotransmisión
Consecuencia de la desnutrición o malnutrición
Referencia
Serotonérgico Disminución en el crecimiento y arborización de las neuronas serotonérgicas en el núcleo de raphe.
Cintra et al., 1990; 1997
Dopaminérgico Disminución en la concentración de la concentración de DA en hipotálamo e hipocampo.
Kehoe et al., 2001
Glutamatérgico Hay menor unión de glutamato a receptores Na+ independientes en la membrana de la corteza cerebral.
Rotta et al., 2008
GABAérgico Los mRNA´s de las subunidades α1 y β2 disminuyen en el hipocampo, mientras que la α3
aumenta. Hay disminución de mRNA´s de β2, β3 y γ2 en el sptum medial.
Steiger et al., 2002; 2003
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Figura 2. Diagrama del desarrollo prenatal y posnatal de los procesos de neurogénesis que ocurren en el Sistema Nervioso Central de la rata (gráfica superior) y del humano (gráfica inferior). Modificada de Morgane, et al., 2002.
MÉDULA ESPINAL
La médula espinal se extiende desde el extremo caudal del bulbo raquídeo hasta las
vértebras lumbares inferiores. Dentro de la médula espinal se presenta un cúmulo de
células y vías nerviosas, en las que se coordina la información sensitiva proveniente de la
piel, músculos, articulaciones y vísceras. La médula espinal se divide en segmentos
anatómicos (cervical, torácico, lumbar y sacro), que corresponden a las divisiones de los
nervios periféricos y de la columna vertebral. Las vías ascendentes y descendentes
espinales se encuentran localizados dentro de la sustancia blanca, en el perímetro de la
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médula, en tanto que las conexiones intersegmentarias y los contactos sinápticos entre las
neuronas se encuentran dentro de la sustancia gris, la cual está en forma de “H”.
La información sensitiva fluye hacia la región dorsal de la médula y los comandos motores
surgen por la porción ventral (Brunton et al., 2006).
GABA Y SUS RECEPTORES
El ácido gamma-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibidor del sistema
nervioso central, incluida la médula espinal (Guyton y Hall, 2006). Es segregado de
terminales nerviosas en la médula espinal, el cerebelo, los ganglios basales y en muchas
áreas de la corteza cerebral. El GABA se sintetiza por la descarboxilación del ácido
glutámico mediante la actividad de la enzima glutamato descarboxilasa (GAD), la cual se
ha demostrado, con técnicas de inmunocitoquímica, se encuentra presente en las
terminales nerviosas de muchas regiones del cerebro. Este aminoácido es segregado de
las terminales de neuronas en la médula espinal, el cerebelo, los ganglios basales y de
muchas áreas de la corteza (Guyton y Hall, 2006).
El GABA participa en la generación de la mayor parte de la neurotransmisión inhibidora en
el SNC (Olsen, 2014; Farrant y Nusser, 2015) y su acción resulta de la activación de
receptores sinápticos ionotrópicos (tipo A) y/o metabotrópicos (tipo B) acoplados a canales
de cloro (Cl-) o a cationes (Ca´++ y K+)(Bormann, 2000). Se considera que existen diversos
tipos de inhibiciones mediadas por GABA, entre las que se pueden señalar a la generada
a nivel sináptico en el soma de las neuronas, otra de índole extrasináptica, que ocurre por
la activación de receptores a GABA fuera de las regiones sinápticas del soma de las
neuronas (Olsen, 2014). También se presentan dos tipos de inhibiciones de índole
presináptico, las cuales reducen la liberación del neurotransmisor de los contactos
sinápticos, de fibras aferentes, mediante mecanismos de acción que reducen las corrientes
de Calcio (Ca++), ya sea por una acción directa sobre los canales de Ca++, mediante la
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activación de un tipo de receptor denominado GABA tipo B o GABAB; (Bormann, 2000) y
otro, por la despolarización de la terminal presináptica, la cual induce una reducción en la
magnitud de los potenciales de acción que llegan a la terminal sináptica (Hochman et al.,
2010) y es mediada por un tipo de receptor denominado GABA tipo A o GABAA. Cabe
mencionar que la mayoría de las inhibiciones GABA-érgicas son mediadas por receptores
GABAA.
El receptor GABAA es un miembro de la familia de los canales pentámericos ionotrópicos
Cys-loop, los cuales contienen un dominio extracelular que incluye el sitio de unión para el
ligando y un dominio intracelular, que forma el canal iónico. Los receptores colinérgicos,
nicotínicos, los de glicina y 5HT3 pertenecen a esta familia (Rossokhin et al., 2010).
Los receptores GABAA ionotrópicos están compuestos por cinco subunidades que se co-
ensamblan para formar un canal de cloruro integral. Hasta ahora, se han identificado 16
subunidades diferentes que pueden formar parte del receptor GABAA, los cuales se han
clasificado en siete familias de subunidades: seis α, tres β, tres ɣ, subunidades ɵ, ԑ, δ y π
únicas. La multiplicidad de subunidades genera heterogeneidad de los receptores GABAA y
es la causa, al menos en parte, de la diversidad farmacológica de los receptores de
benzodiacepina detectados por medio de estudios conductuales bioquímicos y funcionales
(Korpi y Sinkkonen, 2006, Sigel et al., 1990).
La mayoría de los receptores GABAA están compuestos por las subunidades α, β y γ
(Rudolph et al., 2001). El receptor GABAA es modulado intracelularmente por proteínas
cinasas A y C, poseen sitios de unión para benzodiacepinas, barbitúricos y neuroesteroides,
y son bloqueados competitivamente por la bicuculina y no competitivamente por la
picrotoxina (Figura 4).
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Figura 3. El receptor GABAA es un canal de Cl con 5 Å de diámetro. Cada subunidad está compuesta por cuatro dominios transmembranales (TM1-TM4). Modificado de Bormann, 2000.
Los receptores GABAA son abundantes en el SNC, y se ha reportado que la reducción de
la liberación de GABA en el SNC modifica la excitabilidad de las neuronas y por ende, de
los circuitos nerviosos, provocando en éstos hiperexcitabilidad, tal como ocurre en la
fisiopatología de la epilepsia, la ansiedad, los desórdenes del sueño, por abuso de
substancias, así como en problemas de aprendizaje, memoria y problemas en el
procesamiento sensorimotor (Olsen, 2015).
Los receptores GABAB son receptores asociados a proteínas G, los cuales a través de
segundos mensajeros modulan la actividad de los canales de Ca´++ y K+ y son resistentes a
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las sustancias que antagonizan la actividad de los receptores GABAA. Estos receptores
tienen al baclofeno como agonista (Bormann, 2000).
DIAZEPAM UNA BENZODIACEPINA
El término benzodiacepina se refiere a la parte de la estructura de la molécula, compuesta
por un anillo benceno fusionado con un anillo de diazepina de siete miembros (Figura 4)
(Brunton et al., 2007). Las benzodiacepinas ejercen diversos efectos sobre el SNC, siendo
los más relevantes: la sedación, hipnosis, disminución de la ansiedad, relajación muscular,
amnesia anterógrada y actividad anticonvulsionante (Brunton et al., 2007). Las
benzodiacepinas actúan en receptores GABAA, pero no en los GABAB, y se unen a un sitio
específico del receptor que se localiza entre las subunidades α y ɣ (Figura 3), el cual difiere
del que se utiliza para la unión del GABA. Las benzodiacepinas no activan de manera
directa a receptores GABAA, pero requieren de GABA para expresar sus efectos, por lo que
actúan como moduladores alostéricos positivos sobre los receptores GABAA (Olsen, 2014).
La acción de las benzodiacepinas se basa en potenciar la interacción del GABA a su sitio
de unión en el receptor (Brunton et al., 2007). Las subunidades α y β en los receptores a
GABA son necesarias para su activación y la subunidad ɣ es la que contiene el sitio de
unión de las benzodiazepinas (Olsen, 2014).
Figura 4. Estructura molecular del diazepam. Imagen tomada deOlsen, 2014.
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Aunque existen muchos fármacos que actúan sobre los receptores ionotrópicos para
GABAA, las benzodiacepinas han sido utilizadas en la clínica para el tratamiento de la
ansiedad, la epilepsia, trastornos del sueño, la abstinencia para el alcohol y la inducción y
mantenimiento de la anestesia. Sin embargo, los efectos sedantes y el desarrollo de
tolerancia a los agonistas de GABAA en el tratamiento de la epilepsia, ha limitado su uso
(Korpi y Sinkkonen, 2006).
INHIBICIÓN PRESINÁPTICA Y DESPOLARIZACIÓN DE AFERENTES PRIMARIAS
La inhibición presináptica es uno de los principales mecanismos que regulan la liberación
de neurotransmisores de las fibras aferentes en la médula espinal de los vertebrados
(Quiroz et al., 2010). Esta inhibición fue descrita por primera vez por Frank y Fuortes (1961),
quienes observaron que los potenciales postsinápticos excitadores (PPSEs), generados por
la estimulación de fibras aferentes de origen muscular eran deprimidos por la activación
previa de otras fibras aferentes motoras (Fuortes et al., 1961). Subsecuentemente, Eide
(1993) mostró que la depresión de los PPSE´s ocurría sin presentarse cambios en el
potencial de membrana o en la excitabilidad de las motoneuronas, por lo que concluyeron
que era de origen presináptico. Posteriormente, Eccles y colaboradores (1963) muestran
que la depresión de los PPSEs se encuentra relacionada estrechamente con una
despolarización que se registra en las fibras aferentes primarias (PAD, por sus siglas en
inglés), así como de un potencial positivo lento que se registra en las raíces dorsales (DRP,
por sus siglas en inglés). En base a que los potenciales señalados poseen una duración
similar a la depresión de los PPSEs (~200-300 ms) y son deprimidos por la bicuculina y la
picrotoxina, antagonistas del GABA, tales autores consideraron que la PAD es la causa de
la inhibición presináptica. Así mismo, postulan que tanto la inhibición presináptica y la
despolarización son generadas por la activación de un circuito neuronal, consistente de
cuando menos dos interneuronas interpuestas, siendo la última de ellas la que hace
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contacto axo-axónico con las fibras aferentes y de la cual se libera GABA (Figura 5)(Eccles
et al., 1963; Kittler et al., 2002; Rudomin et al, 1994).
Figura 5. Representación de un contacto sináptico entre una fibra aferente y una motoneurona, así como una sinapsis axo-axoanicaGABAérgica (Imagen modificada de: Willis W.D., 1998).
Diversos estudios han mostrado que las neuronas GABAérgicas que median la
despolarización de fibras aferentes propioceptivas (de origen muscular) se encuentran
localizadas en el núcleo intermedio y en el cuerno ventral de la médula espinal, mientras
que las que median la PAD de fibras aferentes de origen cutáneo se localizan en el cuerno
dorsal (Dougherty et al., 2005; Goulding et al., 2014; Levi, 1977).
De estas interneuronas se libera el GABA, quién al interactuar con su receptor en las
terminales axonales induce la apertura de un canal a Cloro (Cl-), lo que provoca se genere
un eflujo de tal anión, del interior de las aferentes primarias hacia el exterior de las mismas
(Kittler et al., 2002).
Al contrario de lo que ocurre en los somas de las neuronas del sistema nervioso central, el
Cl- se encuentra en mayor concentración dentro de los axones periféricos con respecto a
su medio externo y el movimiento del Cl- provoca que el interior de las fibras sea menos
negativo y por ende éstas se despolaricen. En la mayoría de las neuronas el Cl- se
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encuentra más concentrado en el exterior de las células que en su interior, y el GABA o los
neurotransmisores inhibidores (tales como el GABA o la glicina) inducen una entrada
masiva de tales aniones, provocando la hiperpolarización de la membrana y la generación
del potencial postsináptico inhibidor (PPSI)(Willis, 2006). La despolarización presináptica
de las aferentes a su vez, provoca una reducción en la amplitud de los potenciales de acción
que alcanzan las terminales lo que disminuye la entrada de iones Ca++ y en consecuencia,
la reducción de la liberación del glutamato (neurotransmisor excitador) de las fibras
aferentes (Bardoni et al., 2013).
CDP (POTENCIAL DEL DORSO DE LA MÉDULA)
La activación eléctrica de las fibras cutáneas provoca usualmente potenciales en la
superficie de la médula espinal que se les conoce como potenciales del dorso de la médula
(CDP´s), los cuales contienen varios componentes (Figura 6): el primer componente es la
salva aferente (AV), que es generada por los potenciales de acción que viajan por las fibras
aferentes de bajo umbral, seguido por dos componentes negativos, denominados N1 y N2.
El primer componente es generado por la activación monosináptica de neuronas en el
cuerno dorsal de la médula que responden predominantemente a aferentes sensoriales de
bajo umbral, mientras que el segundo se genera por la activación monosináptica, o
disináptica de neuronas espinales por fibras aferentes Aβ o Aδ, respectivamente. Por último,
se observa un componente positivo, la onda P, cuyo curso temporal es prolongado
(~200ms) y se considera que es generado por la despolarización presináptica de las fibras
aferentes (Quiroz et al., 2011).
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Figura 6. Registro del CDP y sus componentes. a) Diagrama de registro electrofisiológico. b) Registro del potencial del dorso de la médula del grupo control y del grupo desnutrido. Imagen modificada de Quiroz, 2012.
ANTECEDENTES
La desnutrición es un problema de salud, social, económico y de educación, tanto a nivel
nacional como mundial. Por lo tanto, es necesario contar con líneas de investigación que
nos permitan contar con las herramientas para prevenir, desarrollar un tratamiento clínico y
por lo tanto mitigar este problema.
Muchos investigadores han puesto interés en los efectos de la desnutrición a nivel
sistémico; esta tesis se enfoca en el Sistema Nervioso Central. En este trabajo se
mencionan las consecuencias que se relacionan con los efectos que tiene la desnutrición
sobre los potenciales del dorso de la médula (CDP).
En 2004, Segura y colaboradores muestran que la desnutrición crónica genera una
importante reducción en la amplitud del potencial de acción compuesto (CAP) provocado
en el nervio cutáneo sural. Posteriormente, Quiroz y colaboradores (2011) muestran que el
componente AV de los CDPs también se ve reducido de amplitud por efecto de la
desnutrición crónica. Los mismos autores señalan que la desnutrición crónica ejerce un
notable efecto depresivo sobre los componentes del CDP producido en ratas desnutridas
por la estimulación del nervio sural, particularmente sobre la onda P del CDP (Quiroz et al.,
2011).
21
FUNDAMENTO
Diferentes sistemas de neurotransmisión se ven afectados por la desnutrición crónica, tales
como el: catelominérgico, serotonérgico y el GABAérgico. Debido a que las alteraciones
neuronales mencionadas pueden producir cambios en las respuestas de diferentes
agonistas en animales desnutridos, nos enfocaremos a determinar el efecto del diazepam
sobre los potenciales del dorso de la médula en un modelo de desnutrición crónica en la
rata Wistar.
HIPÓTESIS
La desnutrición crónica altera la expresión de las subunidades que conforman al receptor
GABAA en la médula espinal, modificando el efecto que ejerce el diazepam sobre la
despolarización de las fibras aferentes primarias y de los componentes de los potenciales
del dorso de la médula en la rata Wistar.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto de la aplicación de diazepam intraperitoneal sobre los potenciales del
dorso de la médula espinal (PDM´s) y los potenciales de raíz dorsal producidos por la
estimulación eléctrica del nervio sural de la rata desnutrida crónicamente.
OBJETIVOS PARTICULARES
1) Aprender a realizar la técnica quirúrgica de laminectomía, desde el 13avo segmento
torácico T13 hasta el 5º segmento sacro de la rata.
2) Registrar y medir la amplitud de los componentes negativos y positivo del potencial
del dorso de la médula (PDM´s) en ratas control y desnutridas.
22
3) Determinar el efecto del diazepam sobre los distintos componentes de los
potenciales del dorso de la médula (PDM), en particular de la onda P. generados
por la estimulación del nervio sural de ratas controles y desnutridas con 60 días de
edad postnatal.
MATERIALES Y MÉTODOS
El paradigma de desnutrición perinatal y el protocolo que se utilizaron en este estudio fueron
revisados y aprobados por el Comité de Bioetica Institucional para el cuidado y manejo de
animales de laboratorio (UPEAL-Protocolo 013-02, CINVESTAV) y están de acuerdo con
los lineamientos observados en la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO-1999) sobre los
principios para el Cuidado de Animales de Laboratorio, SAGARPA y con los de los Institutos
Nacionales de la Salud de los E.U.A. (publicación 8023 revisada en 1996).
El estudio se realizó en ratas macho de la cepa Wistar (Rattus norvergicus), mantenidos en
un cuarto con control automático de temperatura (22 ±2ºC) y con un ciclo luz/oscuridad
regulado (luz a las 07:00 h), así como con alimento (dieta para roedores 5001 de Purina
Inc.) y agua ad libitum. Los animales experimentales fueron obtenidos al colocar a dos
grupos de ratas hembras, con un peso inicial de 250 g bajo diferentes regímenes de
alimentación, uno control y otro desnutrido, tres semanas previas al apareamiento y durante
el periodo perinatal. Para la cruza de las ratas, se colocaron ratas macho en cajas de
plástico transparente (50 x 60 x 20 cm3) con ratas hembras (2 por macho), cuyo peso era
entre 300-400 g. El día que las hembras que mediante visualización presentaban tapón
vaginal, se fijó como día 0 de gestación y se procedió a colocarlas en cajas de plástico de
maternidad individuales (25 x 45 x 20 cm3), con piso de aserrín (3 cm) para construir el nido.
Al día siguiente del nacimiento, las crías fueron pesadas, se separaron por sexo y se
23
ajustaron las camadas a 4 hembras y 5 machos distribuidos al azar con una rata madre,
continuándose con el tratamiento neonatal correspondiente a cada grupo.
Grupo de animales control (GC): A un grupo de ratas hembra y sus crías se les
proporcionó agua y alimento ad libitum hasta el día del experimento (dieta para roedores
5001 de Purina Inc.) durante el apareamiento, la gestación y lactancia. A las crías
mantenidas junto a la madre desde el nacimiento hasta el destete (21 días postnatales) y
posteriormente, se les proporcionó agua y alimento ad libitum.
Grupo de animales desnutridos (GD): A ratas hembras se les proporcionó el equivalente
al 50% del alimento ingerido por el grupo control, en sus periodos prenatales y post-natales
2 a 3 semanas antes del apareamiento, la gestación y la lactancia (Bedi y Tolley, 1994).
Posterior al destete (21 días de edad post-natal), se mantuvo a las crías con el mismo
régimen alimenticio hasta el día del experimento (60 ±5 días de edad post-natal) y con agua
ad libitum.
En el día del parto todas las crías se ajustaron a 8 por camada y se registró su peso corporal
hasta el día del experimento.
Técnica quirúrgica
El día del experimento se determinó el peso corporal, con ese dato se calcula la cantidad
de anestesia, que es una mezcla de Ketamina (100 mg/kg) y Xilasina (3 mg/kg), y se
administra por vía intraperitoneal. Se rasura el dorso de la rata, así como la pata derecha
para facilitar el procedimiento. Se realiza una incisión en el dorso y mediante una
laminectomía bilateral amplia se expone la médula espinal de los animales desde el
segmento torácico 13 al sacro 5. Posteriormente se disecó el nervio sural (SU) de la pata
posterior derecha para su estimulación (se escogió este nervio porque está formado en su
mayoría por axones sensitivos).
24
Estimulación eléctrica
La estimulación del nervio sural se llevó a cabo mediante un par de alambres de plata, cuya
punta estaba en forma de gancho y que sostenían al nervio. Tales electrodos fueron
conectados a un generador de estímulos eléctricos (Digitimer D 4030) con el que se
aplicaron pulsos únicos de voltaje, de 0.05 ms de duración e intensidad graduada (1-3 xU),
a una frecuencia de 1 Hz.
Registro del PDM
Para el registro de los potenciales generados por la estimulación del nerviol sural Se
colocaron 2 electrodos de plata, uno con la punta en forma de esfera, directamente sobre
el dorso del 5 segmento lumbar de la médula espinal y el otro (de referencia) se insertó en
el músculo paravertebral. Los electrodos fueron conectados a un amplificador de alta
ganancia, el que a su vez fue conectado, mediante una interfase analógica-digital a un
osciloscopio (Gould DSO 1624) y a una computadora, en donde los resultados fueron
almacenados. Subsecuentemente se determinó el umbral del PDM, el cual se determinó al
establecer la intensidad del estímulo necesaria para generar PDM´s de mínima amplitud
(1xU) y se procedió a dar estímulos de intensidad 2-3xU. Después de obtener los registros
basales, se administró intraperitonealmente una dosis de diazepam (Dosis: 0.05mg/Kg de
peso) y se registró la actividad bajo los efectos del diazepam durante las 2 horas
subsecuentes (30 min, 60 min, 90 min y 120 min).
Procesamiento de datos
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante un programa de computadora en
ambiente LabView. El programa nos permite valorar la amplitud de los potenciales, y está
constituido por dos pares de cursores, uno para determinar el nivel basal de ruido en el
registro y el segundo par de cursores se utilizó para determinar la amplitud de los diferentes
componentes del PDM. Uno de los cursores del segundo par se colocó poco después del
25
artefacto del estímulo, pero antes de la respuesta y el segundo cursor fue situado en el pico
de cada uno de los componentes del PDM.
Análisis de datos
Los datos fueron analizados usando el programa estadístico Graphpad PRISM versión 4,
se calculó el promedio, desviación estándar y el coeficiente de variación. La relación entre
el peso corporal y el estado nutricional de los animales se determinó mediante la Prueba
de U Mann-Whitney, que es una prueba no paramétrica para dos variables independientes,
para comparar las diferencias obtenidas en el peso corporal de los dos grupos.
Para establecer las diferencias en la amplitud, área y la duración de los componentes N1 y
onda P de los CDP´s registrados en nervios sural de ratas control o desnutridas, antes y
después de la aplicación de Diazepam se utilizó un análisis de varianza ANDEVA de dos
medidas repetidas: tratamiento (control y desnutrición) y tiempo (antes y a los 30 min, 60
min, 90 min y 120 min de la aplicación del Diazepam ). Para establecer las diferencias
significativas entre el grupo control y el desnutrido se utilizó una prueba de post hoc de
Bonferrroni y se estableció como nivel significativo p<0.05.
26
RESULTADOS
Desarrollo físico:
Efecto de la desnutrición sobre el peso corporal
El peso corporal de ambos grupos se incrementó de manera gradual, sin embargo la
restricción del alimento al 50% prenatal y posnatalmente provocó una reducción significativa
en el peso corporal en el GD en comparación del GC (≈58%; p<0.005)(Figura 7). El
porcentaje de reducción en el peso corporal es similar a reportes previos que utilizan el
modelo de desnutrición crónica (Quiroz et al., 2011; Segura et al., 2004).
Figura 7. Peso corporal del grupo control (GC) y el desnutrido (GD).** p= <0.005. n=6.
27
Efecto de la desnutrición sobre los componentes del potencial del dorso de la médula
(CDP), posterior a la administración de diazepam.
La estimulación eléctrica del nervio sural (3xU) en los animales control produjo CDP´s, estos
potenciales están compuestos de diferentes componentes (Figura 8), el primero es la
salva aferente (SA), el cual es un componente trifásico, la SA representa el potencial de
acción que resulta de la estimulación de las fibras aferentes de bajo umbral del nervio sural;
en la Figura 8B se puede observar que la salva aferente es de menor amplitud en el GD
(grupo desnutrido).
a) Componente N1
El componente N1 es producido por la excitación monosináptica de neuronas del asta dorsal
por la estimulación de fibras aferentes cutáneas de bajo umbral (Coombs et al., 1956. Este
componente se ve disminuido en el grupo de animales desnutridos en comparación con el
grupo control, se observa una facilitación del componente N1, en el GC posterior a la
administración del diazepam (FIGURA 8B, a 90 y 120 minutos), mientras que en el GD no
se observa dicha facilitación.
b) Componente N2
El componente N2 que resultan de la excitación mono y di-sináptica de neuronas
localizadas en el dorso de la médula espinal por la activación de aferentes Aβ y Aδ,
(Commbs, 1956), se ve afectado al igual que el componente N1. (FIGURA 8B).
c) Onda P
Por último, la onda P, está asociada a la despolarización de las fibras aferentes primarias
(PAD) y se relaciona directamente con la inhibición presináptica (Rudomin y Schmidt, 1999.
En el GC se observa una facilitación de la onda P, tras la administración del diazepam,
28
mientras que en el GD, no se observa una facilitación de la onda P, se pone de manifiesto
la falta del efecto del fármaco (Figura 8B, a los 90 y 120 min.).
Figura 8. Registros del CDP sobre la médula del grupo control GC (A) y desnutrido GD (B) con la administración de diazepam.
Efecto de la desnutrición crónica sobre la amplitud, duración y área de la onda N1
posterior a la administración de diazepam.
1.1) Amplitud de la onda N1
En el caso de la amplitud de la onda N1, se observó reducción significativa debida a la
condición de nutrición F(1,40)=12.42, p<0.0055). También hubo diferencia significativa por
la tiempo en GC se observó un aumento en la amplitud, mientras que no se observó ningún
cambio en este parámetro en el GD (F(4,40)=6.164, p<0.0006), con una interacción entre
los factores F(4,40)=7.496, p<0.0001. En el análisis post hoc, los animales del GD tuvieron
29
una disminución significativa con respecto al GC a los 30 min (p<0.05), 60 min (p<0.05); 90
min (p<0.001); 120 min (p<0.001) posteriores a la administración del diazepam (Figura 9A).
1.2) Área de la onda N1
Al analizar el área de la onda N1, se observó reducción significativa debida a la condición
de nutrición, F(1,40)=8.324, p<0.0162. También hubo diferencia significativa con respecto
al tiempo de aplicación del Diazepam en el GC se observó un aumento en el área, mientras
que no se observó ningún cambio en este parámetro en el GD F(4,40)=4.634, p<0.0036,
con una interacción entre los factores F(4,40)=7.362, p=0.0002. En el análisis post hoc, los
animales del GD tuvieron una disminución significativa con respecto al GC a los 90 min
(p<0.01); 120 min (p<0.01) posteriores a la administración del diazepam (Figura 9B).
1.3) Duración de la onda N1
30
En cuanto al parámetro de la duración de la onda N1, se observó reducción significativa
debida a la condición de nutrición, F(1,40)=0.9995, p=0.3410. Sin diferencia significativa
por la tiempo F(4,40)=1.498, p=0.2212, sin interacción entre los factores. En el análisis post
hoc, no hay diferencias significativas del GD con respecto al GC. (Figura 9C).
Figura 9. Efecto del diazepam sobre duración, amplitud y área de la onda N1 contra tiempo (min). Los asteriscos indican que los valores de los parámetros de los animales desnutridos fueron significativamente menores en comparación con los animales control. Amplitud (A), Área (B) y Duración (C).* p = <0.05 ** p= <0.005 *** p= <0.001
31
Efecto de la desnutrición crónica sobre amplitud, duración y área sobre la onda P
posterior a la administración de diazepam.
2.1) Amplitud de la onda P
En el caso de la amplitud de la onda P, se observó reducción significativa debida a la
condición de nutrición (F(1,40)=14.81, p=0.0032). Sin diferencia significativa entre los
tiempos de aplicación del farmaco en GC se observó un aumento en la amplitud, mientras
que no se observó ningún cambio en este parámetro en el GD (F(4,40)=2.571, p=0.0524),
sin una interacción entre los factores. En el análisis post hoc, los animales del GD tuvieron
una disminución significativa con respecto al GC a los 90 min (p<0.01) posteriores a la
administración del diazepam (Figura 10A).
2.2) Área de la onda P
Al analizar el área de la onda P, se observó reducción significativa debida a la condición de
nutrición (F(1,40)=24.89, p=0.0005). También hubo diferencia significativa por la tiempo en
el GC se observó un aumento en el área, mientras que no se observó ningún cambio en
este parámetro en el GD (F(4,40)=6.035, p=0.0007), con una interacción entre los factores
F(4,40)=3.834, p=0.0099. En el análisis post hoc, los animales del GD tuvieron una
disminución significativa con respecto al GC a los 30 min (p<0.01), 60 min (p<0.001); 90
min (p<0.001); 120 min (p<0.01) posteriores a la administración del diazepam (Figura 10B).
2.3) Duración de la onda P
En cuanto al parámetro de la duración de la onda P, no se observó reducción significativa
debida a la condición de nutrición (F(1,40)=289.5, p<0.0001). Con diferencia significativa
en el parámetro de tiempo de aplicación (F(4,40)=5.442, p=0.0014), con interacción entre
32
los factores F(4,40)= 3.597, p=0.0135. En el análisis post hoc, hay diferencias significativas
del GD con respecto al GC previa administración del diazepam (p<0.001), a los 30 min
(p<0.001), 60 min (p<0.001); 90 min (p<0.001); 120 min (p<0.001) posteriores a la
administración del diazepam (Figura 10C).
Figura 10. Efecto del diazepam sobre duración, amplitud y área de la onda P contra tiempo (min). Los asteriscos indican que los valores de los parámetros de los animales desnutridos fueron significativamente menores diferentes en comparación con los animales control. Amplitud (A), Área (B) y Duración (C). * p = <0.05 ** p= <0.005 *** p= <0.001
33
Correlación entre las amplitudes de los componentes N1 y P
Se presenta una baja correlación entre la amplitud del componente N1 y la onda P, en el
GC r=0.3634 p= 0.0484, y en el GD r=0.4751 p= 0.0080. (FIGURA 11).
Figura 11. Correlación entre amplitud onda N1 y P. Para el GC r=0.3634 (p=0.0484), y para el GD r=0.4751 (p=0.0080).
DISCUSIÓN
En este trabajo se analizó el efecto de la aplicación intraperitoneal de Diazepam sobre los
potenciales del dorso de la médula espinal de ratas control o desnutridas crónicamente,
encontrándose alteraciones significativas en el peso corporal de los animales como en los
distintos componentes de los potenciales del dorso de la médula.
Con respecto a las reducciones significativas en el peso corporal de los sujetos del GD, los
resultados son congruentes con estudios anteriores en los que se utilizó el paradigma de
desnutrición empelado en el presente estudio, ya que se requieren efectos acumulativos a
lo largo de varios días postparto para que los efectos alcancen un nivel de significación
(Figura 8) (Quiroz, 2011, Segura 2004). Este hallazgo concuerda también con trabajos
previos que describen retrasos significativos en el crecimiento físico asociados a la
desnutrición y a la malnutrición perinatal (Morgane, 1978; Firmansyah et al., 1989; Woodall
et al., 1996; Nuñez et al., 2008; Pires de Mélo, 2009). Por otro lado, los resultados confirman
que el paradigma de desnutrición que se utilizó en este proyecto fue efectivo para interferir
con el desarrollo físico de la progenie de la rata, al restringirse de manera crónica la ingesta
de los diferentes componentes de la dieta.
En adición, se ha observado que los animales sometidos a desnutrición presentan
hiperactividad ante situaciones adversas por lo que se considera que pueden estar
involucrados cambios neuroquímicos (Scrimshaw, 1998; Levitsky y Srupp, 1995). A pesar
de que no se ha evaluado completamente, se sabe que la desnutrición induce cambios en
el sistema GABAérgico (Steiger et al., 2003), como sabemos la PAD es provocado a través
de la activación de receptores GABA. Se han evidenciado que por cambios en los
receptores GABAA de ratas desnutridas, éstas presentan una disminución en el efecto
ansiolítico del etanol, pentobarbital y diazepam, todos ellos agonistas con sitios de unión en
receptores GABAA (Orsingher et al., 1988). Existe evidencia experimental que indica que
35
una malnutrición proteica postnatal causa resistencia a los efectos ansiolíticos del diazepam
evaluados por el “FPS test”. (Françolin-Silva et al., 2013). La respuesta alterada del
diazepam en los “test conflict” soporta la idea de que el sistema GABAérgico está
relacionado con las anormalidades en el comportamiento como la hiperactividad o
respuestas exageradas a situaciones estresantes presentes en las ratas desnutridas
(Orsingher et al., 1988). También se disminuye la liberación de 5-HT cuando se administra
clordiazepoxido (benzodiacepina) en animales desnutridos (Tonkiss et al., 2000).
Los resultados obtenidos con respecto a los componentes de los CDP´s muestran que la
amplitud y el área del componente N1 y de la onda P se manifiestan de menor magnitud en
los animales desnutridos con respecto a los animales control (Figuras 9 y 10). Esto coincide
con experimentos de Quiroz y colaboradores en donde indican que la desnutrición tiene
consecuencias sobre los elementos neuronales envueltos en la generación de los CDP
(Quiroz et al., 2011).
En estudios previos también se ha demostrado que la salva aferente y el componente N1
en el CDP generado por la estimulación eléctrica de los nervios cutáneos, en animales
desnutridos se ve reducida (Bernhard, 1953). En la presente tesis, el componente N1
registrado sobre la médula espinal y generado por la estimulación del nervio sural de los
animales desnutridos presenta menor amplitud, lo que nos permite establecer que la
desnutrición altera la propagación de los impulsos nerviosos desde los nervios hasta la
médula espinal, lo que a su vez también puede afectar el sistema GABAérgico y la
activación de las interneuronas involucradas en la generación de los CDP´s. Esta evidencia
es importante debido a que refuerza las observaciones acerca de que la desnutrición está
afectando a la despolarización de las fibras aferentes, tal vez por una integración deficiente
del sistema neuronal de acuerdo con Quiroz y colaboradores (Quiroz et al., 2011).
36
Segura y colaboradores (2001) muestran que el potencial de acción compuesto (CAP) en
el nervio sural de ratas desnutridas es de menor área, pero de similar umbral eléctrico y
velocidad de conducción, del que se registra en ratas control. Los autores proponen que
debido a los efectos de la desnutrición, la propagación y generación del potencial de acción
compuesto se reduce hasta en un 70%. Posteriormente, Quiroz y colaboradores (2011,
2014) mostraron que la entrada aferente y la inhibición pre- y post-sináptica, así como el
contenido y liberación de GABA en la médula espinal de la rata se ven reducidas por efecto
de la desnutrición. Las evidencias anteriores permitieron proponen que la disminución en el
contenido y liberación de GABA en la médula espinal de animales desnutridos estaban
estrechamente relacionadas con la disminución de la PAD y de la inhibición pre- y post-
sináptica, sin embargo, no permiten excluir la posibilidad de que los receptores a GABA
tambien puedan verse afectados por la desnutrición.
En la presente investigación se corroboro la participación de los receptores GABAA, a través
del diazepam como agonista de este receptor en la inhibición presináptica, incrementándola
en amplitud y prolongándola en duración (Schmidt et al., 1967), así como también su
participación sobre el incremento de la despolarización de las fibras aferentes primarias
donde tiene una influencia inhibidora en la liberación del neurotransmisor. La transmisión
sináptica inhibidora medida después de la estimulación de fibras aferentes es potenciada
por las benzodiacepinas, en concentraciones de importancia para la terapéutica (Brunton
et al., 2007). Es importante recordar y tener en consideración que la influencia del diazepam
a nivel espinal no es mediada ni alterada por estructuras superiores del SNC (Stratten y
Barnes, 1971).
Las subunidades que conforman al receptor GABAA presente en la médula espinal dorsal y
que participan en la integración sensorimotora, son las subunidades alfa 3 y 5
predominantemente, teniendo éstas una alta afinidad por el diazepam, así tambien se
encuentran expresadas las subunidades alfa 1, 2 mientras que la subunidad alfa 4 no se
37
encuentra expresada en la médula espinal (Zeilhofer et al., 2009). La subunidad alfa es la
responsable de mediar la mayoria de los efectos de las benzodiazepinas debido a que
conforma el sitio de acción. La afinidad del diazepam es distinta con las diferentes
subunidades, presenta una alta afinidad hacia las subunidades alfa 2, alfa 3; una afinidad
moderada por la subunidad gamma 2, una afinidad baja hacia las subunidades alfa 1,
mientras que la subunidad beta 3 tiene una afinidad moderada a baja, dependiendo la
conformación del receptor. (Clayton et al., 2007). Cabe recordar que dependiendo de la
conformación del receptor esta tiene diferentes propiedades farmacodinámicas.
Se han obtenido más conocimientos de las subunidades del receptor GABAA que originan
los efectos particulares de las benzodiacepinas in vivo a partir de mutuaciones puntuales
(Brunton et al., 2007).
Por otra parte, existe evidencia que indica que el sistema GABAérgico es muy sensible a la
desnutrición, ya que se ha mostrado que la desnutrición induce deterioro en la población de
las neuronas GABAérgicas en el giro dentado del hipocampo(Cintra y Salas, 1973). Asi
mismo, Steiger y colaboradores mostraron que la malnutrición prenatal altera los niveles del
mRNA de los receptores GABAA en el hipocampo de la rata y el septum (Steiger et al., 2002;
2003). Hay varias investigaciones acerca de los cambios que presentan diferentes
moléculas como el alcohol (Borghese et al., 1998) y las benzodiacepinas sobre los
receptores GABAA, debido a los efectos de la desnutrición. (Brioni et al., 1989; Almeida et
al., 1996)
En el presente trabajo se ha puesto en evidencia que en el GD el diazepam no ejerce el
efecto agonista habitual, sino que no ejerce efecto alguno, ello podría deberse a la probable
ocurrencia de cambios en la población de los receptores GABAA o bien, a modificaciones
en la composición de subunidades de los receptores, ya que como sabemos estos
receptores están compuestos por diferentes subunidades. Steiger y colaboradores (2002,
38
2003) investigaron que la malnutrición tiene efectos sobre las subunidades α1, α2, α3, β2 y
γ.
Los resultados obtenidos en la presente tesís permiten sugerir que la desnutrición pre- y
post-natal, provoca cambios importantes en la transmisión GABAérgica, ya sea en la
confomación o número de receptores y que se acompaña de una disminución en el
contenido y en la liberación de GABA de la médula espinal. La probable alteración en la
composición de subunidades de los receptores GABAA, en particular de las subunidades
podría ser la causa de la ausencia de efecto del Diazepam sobre la despolarización de
aferentes primarios y en la inhibición presináptica.
En este caso, el empleo de otras técnicas como el Western Blot, PCR, inmunohistoquímica,
entre otras, serían de gran ayuda para la caracterización de posibles cambios
conformacionales o disminución en la densidad de receptores GABAérgicos en la médula
espinal. Hasta ahora podemos evidenciar que la desnutrición causa que el efecto del
diazepam sobre los componentes del CDP generado en la médula espinal de la rata
desnutrida sea prácticamente nula. Estos resultados podrían ser el resultado de que la
desnutrición induzca menor liberación de GABA de las interneuronas involuradas en la
generación de PAD y la inhibición presináptica, también se podría proponer que las fibras
aferentes posean un menor número de receptores a GABAA, o que las subunidades que se
encuentran presentes en los receptores GABAA se encuentren alteradas genéticamente o
el tipo y orden de las subnunidades sea diferente al que se presenta en los animales control.
Sería interesante seguir estudiando como afecta la desnutricion a este sistema
neurotransmisor, con otros enfoques experimentales, ya que se ha puesto en evidencia que
la desnutrición puede ser una de las causas de padecimientos como trastornos de ansiedad,
trastornos convulsivos y estados epilépticos (OMS, 2005); y en la presente tesis se
demostro que el diazepam no ejerce efecto alguno sobre el grupo desnutrido y representa
39
una interrogante si esta falta de efecto del diazepam tambien esta presente en personas
con desnutrición. En este sentido es importante mencionar que se han reportado estudios
donde se ha observado que los animales sometidos a desnutrición presentan hiperactividad
ante situaciones adversas, por lo que se considera que pueden estar involucrados
alteraciones neuroquímicas en el sistema nervioso central (Scrimshaw, 1998; Levitsky y
Srupp, 1995). Por cambios en los receptores GABAA de ratas desnutridas, éstas presentan
una disminución en el efecto ansiolítico del etanol, pentobarbital y diazepam, todos ellos
agonistas con sitios de unión en receptores GABAA (Orsingher et al., 1988). Existe evidencia
experimental que indica que una malnutrición proteica postnatal causa resistencia a los
efectos ansiolíticos del diazepam evaluados por el “FPS test”. (Françolin-Silva et al., 2013).
La respuesta alterada del diazepam en los “test conflict” soporta la idea de que el sistema
GABAérgico está relacionado con las anormalidades en el comportamiento como la
hiperactividad o respuestas exageradas a situaciones estresantes presentes en las ratas
desnutridas (Orsingher et al., 1988). También se disminuye la liberación de 5-HT cuando
se administra clordiazepoxido (benzodiacepina) en animales desnutridos (Tonkiss et al.,
2000).
40
CONCLUSIONES
La desnutrición durante los periodos pre- y post-natal, reduce de manera
considerable los potenciales del dorso de la médula espinal, generados por la
estimulación del nervio sural.
La amplitud de los componentes del CDP registrados en animales desnutridos, N1,
N2 y onda P, es menor comparado con la amplitud del grupo control.
No hay efecto del diazepam sobre la duración y área los componentes del CDP.
BIBLIOGRAFÍA
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48
INDICE DE FIGURAS
Figura Título Página
1 Prevalencia de bajo peso, baja talla, emaciación y sobrepeso en una población 9 menor de 5 años.
2 Diagrama del desarrollo prenatal y postnatal de los procesos de neurogénesis que ocurren en 12 el sistema nervioso central de la rata y del humano.
3 El receptor GABAA es un canal de Cl 15
4 Estructura molecular del diazepam. 16
5 Representación de un contacto sináptico entre una fibra aferente y una motoneurona, así como 18 una sinapsis axo-axónica GABAérgica.
6 Registro de CDP y sus componentes en GC y GD. 20
7 Peso corporal del grupo control GC y GD. 26
8 Registros del CDP sobre la médula del GC y GD 38 con la administración de diazepam.
9 Efecto el diazepam sobre duración, amplitud y 30 área de la onda N1en función del tiempo (min) en GC y GD.
10 Efecto del diazepam sobre duración, amplitud y 32 área de la onda P en función del tiempo (min) en GC y GD.
11 Correlación entre amplitud N1 y onda P en GC y GD. 33
Tabla Título Página
12 Cuadro de las consecuencias de la desnutrición y malnutrición sobre diferentes sistemas 11 de neurotransmisión.