escuela acadÉmico profesional de ciencias biolÓgicas

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL

DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Inducción de callos embriogénicos en tallos

de Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte

utilizando diferentes concentraciones de 2,4-

Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina.

TESIS

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE

BIÓLOGO

AUTOR: Br. Karen Jannet Hostia Rodriguez

ASESOR: Dr. Julio Roger Chico Ruiz

Trujillo-Perú

2017

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.

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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Dr. Orlando Gonzáles Nieves

RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Dr. Rubén Vera Véliz

VICERRECTOR ACADÉMICO

Dr. Weider Portocarrero Cárdenas

VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN

Dr. Esteban Ilich Zerpa

SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO



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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Dr. Freddy Roger Mejía Coico

DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. William Elmer Zelada Estraver

SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Fredy Peláez Peláez

DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

Dr. Segundo Eloy López Medina

JEFE DE DEPARTAMENTO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS



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PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado dictaminador:

Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el reglamento de grados y títulos

de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, me es

honroso presentar y someter a vuestra consideración y elevado criterio, el presente

informe de tesis titulado “Inducción de callos embriogénicos en tallos de Persea

americana Mill. “palto” cultivar fuerte utilizando diferentes concentraciones de 2,4-

Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina”, con el cual pretendo obtener el título de

Biólogo.

Invocando su comprensión señores miembros del jurado dictaminador, a los errores u

omisiones que involuntariamente haya cometido, espero su veredicto en la calificación

del presente trabajo, esperando ser merecedor de su aprobación.

Trujillo, abril del 2017.

______________________________________

Karen Jannet Hostia Rodriguez

BACHILLER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS



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MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR

____________________________________________

Dra. Marlene Rene Rodriguez Espejo

PRESIDENTE

____________________________________________

Dr. Roger Veneros Terrones

SECRETARIO

____________________________________________

Dr. Julio Roger Chico Ruiz

VOCAL



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V°B° DEL ASESOR

El que suscribe, profesor asesor de la presente tesis “Inducción de callos embriogénicos

en tallos de Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte utilizando diferentes

concentraciones de 2,4-Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina”; para optar el

Título Profesional de Biólogo, certifica que la presente ha sido ejecutada de acuerdo al

reglamento establecido por la Facultad de Ciencias Biológicas estando en conformidad

con su correspondiente proyecto y con las debidas orientaciones brindadas y sugerencias

correspondientes.

_________________________________

Dr. Julio R. Chico Ruiz.

ASESOR



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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Dictaminador, declaran que la

presente tesis titulada “Inducción de callos embriogénicos en tallos de Persea americana

Mill. “palto” cultivar fuerte utilizando diferentes concentraciones de 2,4-

Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina”, ha cumplido con los requisitos formales

y fundamentales, siendo aprobado por UNANIMIDAD.

____________________________________________

Dra. Marlene Rene Rodriguez Espejo

PRESIDENTE

____________________________________________

Dr. Roger Veneros Terrones

SECRETARIO

____________________________________________

Dr. Julio Roger Chico Ruiz

VOCAL



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DEDICATORIA

A mis padres, Rut Rodriguez y Carlos Hostia, quien con su amor, esfuerzo, consejos,

motivación y paciencia, son el motor y fortaleza que impulsa mis logros; a mi hermana

Sor Teresa, quien con sus oraciones y aliento de fe, permitió que no desfallezca en

ninguna circunstancia de la vida.



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AGRADECIMIENTOS

A Dios, por permitirme seguir adelante en toda adversidad, lograr mis objetivos y llegar

a esta meta.

A la Universidad Nacional de Trujillo, en especial a la Facultad de Ciencias Biológicas

por permitirme en estos 5 años ser parte de una generación de triunfadores y gente

productiva para el país.

A mi asesor el Dr. Julio Chico Ruiz, por su apoyo desinteresado en la revisión y

realización de la presente tesis, al Dr. Roger Veneros Terrones y Dra. Marlene Rodriguez

Espejo, por su apoyo desinteresado quienes contribuyeron en ultimar detalles en la

revisión de la presente tesis.



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ÍNDICE

CONTENIDO

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS .............. ii

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ............. iii

PRESENTACIÓN ..................................................................................................... iv

MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR ................................................... v

V°B° DEL ASESOR .................................................................................................. vi

APROBACIÓN ......................................................................................................... vii

DEDICATORIA ...................................................................................................... viii

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................ ix

ÍNDICE ........................................................................................................................ x

INDICE DE TABLAS ............................................................................................... xi

INDICE DE ANEXOS ............................................................................................. xii

RESUMEN ..... ……………………………………………………………………….1

ABSTRACT ……………………………………………………………………….....2

I. INTRODUCCION ……………………….………………………………...........…3

II. MATERIAL Y MÉTODOS ………………………………..……………………11

III.RESULTADOS ..................................................................................................... 15

IV.DISCUSIÓN .......................................................................................................... 19

V.CONCLUSIONES .................................................................................................. 23

VI.RECOMENDACIONES ....................................................................................... 24

VII.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 25

ANEXOS…………………………………………………………………………….32



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INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Diferentes factorial de las diferentes concentraciones de 2,4-D y BAP por

tratamientos, a partir de tallo de P. americana “palto” cultivar

fuerte.……………………………………………………………..……......13

Tabla 2. Porcentaje del número de callos por explante viable de tallo de P. americana

“palto” cultivar fuerte evaluados en los diferentes

tratamientos...…………………………………..………………………….….15

Tabla 3. Morfología y peso ganado de los callos in vitro de P. americana Mill. “palto”

cultivar fuerte tratados con 2,4-D y BAP. La evaluación se realizó cada 15

días………………………………………………………………………….…16

Tabla 4. ANAVA factorial 4x2 para la variable número de callos in vitro de P. americana

“palto” cultivar fuerte obtenidos de los tallo en los diferentes tratamientos con

2,4-D y BAP a los 120 días.………………………………………………...….17

Tabla 5. Comparación de medias de Tukey para los diferentes tratamientos evaluados

con los reguladores de crecimiento 2,4-D y BAP…………...………...……….17

Tabla 6. ANAVA factorial 4x2 para la variable ganancia de peso de P. americana “palto”

cultivar fuerte obtenidos de los tallo en los diferentes tratamientos con 2,4-D y

BAP a los 120 días…………………………………………………………….18

Tabla 7. Comparación de medias de Tukey para los diferentes tratamientos evaluados

con los reguladores de crecimiento 2,4-D y BAP …………………………….18



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INDICE DE ANEXOS

Fig 1. Callo embriogénico de P. americana Mill. Cultivar fuerte, formado en

T2…………………………………………………………………………………….…33

Fig 2. Vista frontal del callo embriogénico de P. americana Mill. Cultivar fuerte, vista al

esteroscopio binocular Olympus………………………………………………………..33

Fig 3. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. cultivar fuerte, formado

en T2. Callo cóncavo con borde sinuoso, de color verde………………………………..33

Fig 4. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. cultivar fuerte, formado en T2.

Callo cóncavo con borde sinuoso, a los 120 días.

Fig 5. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. Cultivar fuerte, formado

en T7. Callo de forma insignificante, color blanco……………………………….……..34

Fig 6. Meristemoides en el cilindro central del tallo de P. americana Mill. Las células son

más pequeñas y citoplasma denso. Tratamiento 5, a los 30 días de edad. Coloración

hematoxilina eosina, aumento 400x……………………………………………...……..34

Fig 7. Corte transversal de un callo emergiendo desde la corteza y rompiendo la capa

epidérmica. Tratamiento T1 a los 35 dias de edad. Coloración hematoxilina eosina,

aumento 400x……………………………………………………………………..…….35

Fig 8. Epidermis rota por la presión de nuevas células en formación y crecimiento.

Observe que estas células son más pequeñas y de forma cuadrada (flecha celeste) y las

células de la corteza son oblongas y más grandes. Tratamiento T2 a los 25 días de edad,

coloración hematoxilina eosina, aumento 400x…………………………………….…..35

Fig 9. Meristemoides en formación de P. americana Mill. “palto” cultivar fuerte.

Sometido a tratamiento T2, a los 15 días. Coloración hematoxilina eosina,

aumento…………………………………………………………………………...……35



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Tabla 1. Muestra experimental para los diferentes tratamientos empleados con los

fitorreguladores 2, 4-D y BAP para la variable número de callos en tallo de Persea

americana Mill. “palto” cultivar fuerte…………………………………………………36


fitorreguladores 2, 4-D y BAP para la variable ganancia de peso (g) de callos en tallo de

Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte………………………………..………..37

Fotografías…………………………………..……………………………………..38-39



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RESUMEN

A partir del 2011 la región La Libertad es la más importante productora de paltas en el

país, lo cual, combinado con una elevada producción y exportación de sus frutos,

convierten a esta especie en un recurso agronómico de alto interés económico para el

desarrollo de la región. El cultivo in vitro, constituye un paso fundamental en la obtención

y regeneración de plantas genéticamente modificadas, o transgénicas, mediante técnicas

de biotecnología, es así que la propagación clonal por embriogénesis somática se ha

convertido en un método esencial para la mejora de la mayoría de las plantas

económicamente importantes, reduciendo el tiempo requerido para la propagación de

plantas. Por ello, el objetivo del trabajo fue inducir callos embriogénicos en tallos de

Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte, utilizando diferentes concentraciones de

2,4-Diclorofenoxiacético (0 y 0.1mg/L) y 6-Bencil Amino Purina (0, 1, 5 y 10mg/L). Se

utilizaron 10 plantas de 120 días de edad del cultivar fuerte y se emplearon 150 explantes,

las evaluaciones por tratamientos fue cada 15 días. Se concluyó que el mayor porcentaje

de inducción de callos embriogénicos fue del 94% a 0 mg/L de2, 4-Diclorofenoxiacético

y 5 mg/L de 6-Bencil Amino Purina, así mismo los callos obtenidos en este tratamiento

presentaron en su morfología coloración verde con forma cóncava sinuosa y una tasa de

crecimiento de 0.20%.

Palabras claves: callos embriogénicos, Persea americana, 2,4-D, BAP.



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ABSTRACT

Since 2011, region La Libertad is the most important avocado producer of the country,

which, combined with a high production and exports of their fruits, makes this species in

a high interest agro-economic resource for the region development. In vitro culture is a

fundamental step in the production and regeneration of genetically modified plants, or

transgenic, through biotechnology techniques, so that the clonal propagation through

embryogenesis has become an essential method for the improvement of most

economically important plants, reducing the time required for the propagation of plants.

Therefore, the objective of the work was to induce embryogenic callus on steams of

Persea Americana Mill. "palto" fuerte culture, using different concentrations of 2,4-

Dichlorophenoxyacetic (0 and 0.1mg/L) y 6-Benzyl Amino Purine (0, 1, 5 and 10mg/L).

Ten 120-day-old fuerte culture plants and 150 explants were used. The evaluations per

treatment were every 15 days. It was found that the highest percentage of induction of

embryogenic callus was 94% at 0 mg/L of 2,4-Dichlorophenoxyacetic and 5 mg/L of 6-

Benzyl Amino Purine, moreover the callus obtained in this treatment presented in its

morphology green coloration with sinuous concave shape and a growth rate of 0.20 %.

Key words: embryogenic callus, Persea americana, 2,4-D, BAP.



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I. INTRODUCCIÓN

El palto (Persea americana Mill.) es un árbol perteneciente a la familia Lauraceae,

la cual comprende poco más de 50 Géneros entre los que se encuentra Persea (Luz

Sánchez, 1999; Rodríguez, 2003; Perea, et. al, 2010), hoja perenne (Perea y col.,

2010), de 6 a 20m de altura, tronco generalmente retorcido y de ramas bajas, con

corteza áspera y a veces surcado longitudinalmente, la corona es ovoide globosa,

irregular y densamente foliada (Rodríguez, 2003).

Se distribuye principalmente en áreas tropicales y subtropicales, originario de

América Central cuyo cultivo comercial se ha incrementado notablemente en los

últimos años hasta llegar a establecerse en países como Estados Unidos, Brasil,

Sudáfrica, Indonesia, Israel, Chile o España (Ray, 2008).

El fruto es una baya con una sola semilla y su tamaño puede variar entre 50 y 2g,

presenta formas, tamaño y colores variables como redonda, oval y piriforme

(Scora, et. al., 2002) y el color que va desde el verde amarillento hasta el morado

o casi negro y de superficie lisa y brillante hasta corrugada y opacas (Mostacero,

et. al, 2009).

El valor nutritivo de la palta es muy alto por su contenido en ácidos grasos, fibra,

vitamina B6, potasio, calorías, agua (67.9%), así mismo presentes en menor

medida vitamina B, B2, B3, B9, C, E, magnesio, ácidos grasos saturados,

carotenoides, fósforo, hierro, proteínas, calcio, yodo, vitamina A, hidratos de

carbono, selenio y sodio (Knight, 2002; Mostacero, et. al, 2009; MINAGRI,

2015). Elimina ácido úrico, anti anémico, diurético, antiinflamatorio para el



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hígado, cálculos renales, fortalece músculos débiles, contra la disentería y como

moderado afrodisiaco; así también es muy utilizado en la industria cosmética

(Mostacero, et. al, 2009; Sierra Exportadora, s.f.).

El incremento de la producción y exportación del Perú es notable, lo que hace

pensar que el país va por un excelente camino hacia la obtención de mejores

oportunidades de desarrollo. La palta, en especial la variedad Hass, tiene una gran

demanda mundial, tanto por sus propiedades nutritivas como por la preferencia

que tienen los consumidores, siendo Estados Unidos el principal importador desde

hace varios años, con una demanda que va creciendo a pasos agigantados.

En el 2013, el Perú destinó más de un millón de dólares a la promoción del

consumo de palta peruana en los mercados estadounidenses, en el 2013 se

exportaron 110 mil toneladas de paltas Hass, superándose al 2012 con 95 mil

toneladas. Solo entre enero y octubre del 2013, los envíos de paltas crecieron en

volumen un 36%, y en términos de valor un 34% (Berckemeyer, 2014a).

En los últimos 6 años el principal destino de esta fruta ha sido Países

Bajos (Holanda) (Vidal, 2010), que en el primer trimestre concentró el 61% del

total de los envíos. Al 2013 las exportaciones anuales de palta registraron US$

184.3 millones y llegaron a 29 destinos entre los que figuran algunos lejanos como

Hong Kong, Rusia, Marruecos y Bélgica (Berckemeyer, 2014b).

Por otra parte, es de resaltar la evolución de las exportaciones de Perú, que en el

año 2000 se ubicaba en el 13° lugar y en el 2013 ha pasado a ocupar el tercer lugar

después de la Unión Europea, que según refiere MINAGRI (2015) es en realidad



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un re exportador de fruta, de ahí que Perú se constituiría en el segundo exportador

más importante del mundo, con un crecimiento realmente impresionante, en 5

100% entre el año 2000 y el año 2013, dejando atrás a países como Chile,

Sudáfrica, Estados Unidos, República Dominicana y Nueva Zelandia, entre los

más importantes (Berckemeyer, 2015).

Respecto a las áreas cosechadas, el Perú actualmente se ubica en el 6° lugar del

ranking mundial de países con mayores áreas cosechadas de palta (20 mil

hectáreas en el 2012) (MINAGRI, 2015) y de acuerdo con el balance del sector

agroexportador 2013 presentado en el marco del XV Almuerzo Agroexportador

realizado en marzo último (Berckemeyer, 2015).

Los más elevados niveles de producción y exportación de Perú son en abril y

agosto, los cuales salen especialmente de los cultivos desarrollados entre La

Libertad, Lima y recientemente una mayor producción de Ica y algunos valles

interandinos. Sin embargo, el Perú produce palta durante todo el año,

representando una ventaja competitiva frente al resto de productores (MINAGRI,

2015).

Existen más de 20 empresas exportadoras de palta en el Perú, lideradas por

Camposol, Consorcio de Productores de Fruta, Agroindustrias Verde Sol,

Procesadora Larán, Agrícola Copacabana de Chincha (Vidal, 2010). Durante la

temporada 2014, Camposol, se convirtió en la empresa privada con la mayor

exportación de palta Hass a nivel mundial. En total, comercializó 38.000 toneladas

de palta (El Camposolino, 2015).



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La Libertad es la más importante región productora de paltas en el país, a partir

del 2011 se convierte en el primer productor nacional de palta, superando a

Lima, registrando 52,409 mil toneladas de producción y en el 2013 alcanza la cifra

record de 74,7 mil toneladas (26% de participación) (Sierra Exportadora. (s.f.);

MINAGRI, 2015).

La posibilidad de regenerar plantas en virtud de la totipotencia celular a partir de

células de plantas seleccionadas, fue el elemento central de la biotecnología

vegetal. Las técnicas de cultivo in vitro de tejidos hicieron posible la regeneración

de la mayor parte de las especies vegetales que presentaban interés económico.

Un cultivo in vitro consiste en la proliferación de células a partir de un fragmento

vegetal llamado explante que, colocado en un medio nutritivo adecuado y bajo las

condiciones apropiadas, dará lugar a una masa desorganizada de células

indiferenciadas llamada callo.

Un callo consiste de una masa amorfa surgida de la proliferación de células del

parénquima. Frecuentemente es el resultado de una herida, un callo se forma en el

corte de un tallo o raíz. Los callos no tienen patrones predecibles de organización,

están presentes en centros localizados de actividad meristemática y a menudo

aparecen en regiones cambiales rudimentarios con zonas de diferenciación

vascular. Una de las características importantes de callo, desde un punto de vista

funcional, es su irregular crecimiento, teniendo el potencial para desarrollar raíces

normales, brotes y embriones que forman plántulas.



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El callo, una vez organizado, puede originar órganos (organogénesis) (Medina et

al., 1998; Prakash et al., 2002; Schween y Schwenkel, 2002; Singh et al., 2003;

Ganesh et al., 2008) o embriones (embriogénesis somática) (Hita et al., 1997;

Gallego et al., 2001; Wang y Balla, 2004; Capelo et al., 2010).

La organogénesis indirecta a menudo induce la variación somaclonal y permite

exponer características diferentes que no están expresadas normalmente en la

naturaleza o bien eliminar alguna indeseable (Sala y Labra 2003).

La característica general del crecimiento de callos, abarca una compleja relación

entre el material usado para iniciar los callos, la composición del medio, y las

condiciones experimentales durante el período de incubación. Algunos desarrollos

de callos son fuertemente lignificados y duros en textura, los que no se pueden

separar fácilmente en pequeños fragmentos. Por el contrario los callos frágiles se

separan fácilmente y se los denomina cultivos friables, frágiles (“frieble

cultures”). Los callos pueden ser amarillentos, blancos, verdes, o coloreados con

antocianinas. La pigmentación será en todo el callo, o en algunas regiones sin

pigmentar. Su anatomía, es de variación considerable a lo largo de la

diferenciación celular.

Después que el callo ha crecido asociado al tejido original por un tiempo, se vuelve

necesario pasarlo a un medio fresco. El crecimiento en un mismo medio por un

período extenso, provocará el agotamiento de nutrientes y una desecación gradual

del agar por la pérdida del agua. Los metabolitos secretados por los callos, se

pueden acumular en niveles tóxicos en el medio. La transferencia del fragmento



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del callo debe ser suficiente para asegurar el nuevo crecimiento en el medio fresco.

Si el inóculo transferido es muy pequeño, va a exhibir una tasa de crecimiento

muy baja, o no va a crecer. Dodd y Lorin (1982) recomiendan que el inóculo debe

tener 5-10 mm de diámetro y pesar 20-100 mg. Los repiques sucesivos se realizan

cada 28 días en tubos de cultivo que tienen 30 cm3 de medio. El tiempo entre

repiques es variable y depende de la tasa de crecimiento del callo.

El cultivo de callos puede ser utilizado para diferentes propósitos, tales como la

micropropagación y el mejoramiento vegetal. La producción de callo requiere de

un explante inicial, el que puede tener una alta diferenciación de sus tejidos, como

un trozo de raíz, tallo u hoja, o bien la utilización de tejidos menos diferenciados

como hipocótilos y cotiledones de plántulas recién germinadas e incluso

embriones cigóticos maduros e inmaduros (Correia y Canhoto 2010). Es así que

la inducción de callo representa un proceso de desdiferenciación y división celular

intensiva, el cual depende principalmente del explante, genotipo, medio de

cultivo, tipo de regulador de crecimiento como también su concentración y

combinación (Larson et al. 2006, Feeney et al. 2007, Rashmi y Trivedi 2014).

El explante es una porción de tejido escindida, u órgano tomado de la planta, para

iniciar un cultivo. Para el establecimiento y desarrollo de cada cultivo se debe

seleccionar el explante adecuado (Pierik, 1976). Generalmente se seleccionan

explantes provenientes de plantas juveniles, ya que en plantas viejas su capacidad

regenerativa suele disminuir, especialmente en árboles y arbustos. Así mismo,

tejidos jóvenes son apropiados para el cultivo debido a su mayor capacidad de

regeneración y número de divisiones celulares (Geier, 1990).



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Las auxinas producen elongación celular y expansión de los tejidos, división

celular (formación de callo); también está relacionado con el proceso de inducción

de raíces adventicias, inhibición en la formación de vástagos axilares y

adventicios, y frecuentemente embriogénesis en los cultivos de suspensión; la

concentración de estás es relativamente amplia sin causar efectos fitotóxicos en el

material tratado. A bajas concentraciones de auxina predomina la formación de

raíces adventicias y a altas concentraciones se da la formación de callo en lugar

de raíces (Pierik, 1990).

Las citocininas son sustancias químicas que se utilizan frecuentemente para

estimular el crecimiento y desarrollo, promoviendo la formación de vástagos

axilares, porque disminuyen la dominancia apical. Retrasan la senescencia,

activan yemas laterales en dormancia, estimulan la división celular sobre todo si

van en compañía de una auxina. Según Kunisaki (1980) la adición de las hormonas

(auxinas y citocininas) es esencial para la inducción y formación de callo, y

crecimiento del cultivo. Entre las más conocidas está la 6-bencilaminopurina

(BAP).

En la actualidad hay escasa información sobre la inducción de callos en palto y

utilizando en conjunto esta auxina y citocinina en el Perú, dicha información se

sustenta en evaluaciones de otros frutales, en Caesalpinia spinosa se obtuvieron

callos a partir de cotiledones, en Uncaria tomentosa “uña de gato” (Sánchez y

Alvarenga, 2014) se obtuvieron callos a partir de segmentos foliares de plantas in

vitro, en Phaseolus vulgaris L. (García et al., 2008) el mayor porcentaje (86%) de



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explantes que formaron callo se observó en los cotiledones, en Borojoa

patinoi“borojó” se obtuvieron callos friables a partir de explantes de hojas jóvenes

generadas in vitro a partir de semilla (Martínez et al., 2007), en Ugni molinae se

obtuvieron callos a partir de explantes de cotiledón, hipocótilo y hoja (Rodríguez

et al., 2014).

Hasta la fecha no existe un protocolo establecido para la obtención de callos

mediante organogénesis indirecta en el cultivo de palto en la región La Libertad,

por lo que infiere un paso significativo en cuanto a la propagación masiva de este

cultivo, tanto por su importancia económica y por su capacidad de generar plantas

libres de enfermedades, con menos tiempo de periodo de cultivo y en condiciones

in vitro. Por ello el objetivo del trabajo es inducir callos embriogénicos a partir de

tallo de Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte utilizando diferentes

concentraciones de 2,4-Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina. Esta

investigación permite sentar las bases para estudios similares en la obtención de

callos en cultivares de importancia económica, contribuyendo al avance científico

de nuestra región y diferentes zonas del Perú.



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II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1.Material biológico

Se utilizó 10 plantas de 120 días de edad de “palto” del cultivar fuerte. Las

semillas fueron procedentes de un centro de abastos de la ciudad de Trujillo, las

cuales posteriormente se desinfectó por inmersión con alcohol comercial de 70°

por 10 minutos, luego se sembró en macetas con tierra y musgo en la proporción

de 2:1 respectivamente, el riego fue interdiario a condiciones de capacidad de

campo y la temperatura e iluminación en condiciones de laboratorio.

2.2. Preparación y desinfección de los explantes

La desinfección de los explantes se realizó en condiciones asépticas por

inmersión, en alcohol comercial de 70° por 60 segundos seguido por una

inmersión de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1% durante 10 minutos.

Finalmente, se realizan 5 enjuagues de 2 min cada uno con agua destilada

esterilizada.

2.3. Medio basal

Se utilizó como medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962) para todos los

tratamientos a mitad de su concentración, suplementando con sacarosa (3%), mio-

inositol (0.3%), agar (1%) y reguladores de crecimiento (2,4-D y BAP). Así

mismo para evitar la fenolización u oxidación del material vegetal, se añadió

carbón activado al 0.5% (Montes et al., 2007). El pH del medio se ajustó a 5.6 -

6.5 con NaOH 1N ó HCl 1N. Luego el medio basal se autoclavó durante 30

minutos a 15 libras de presión y 121°C.



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2.4. Inducción de callos

Se emplearon como explantes tallos de 1cm2, a los cuales se les realizó cortes

longitudinales, se desinfectaron previamente con alcohol de 70° por 60 segundos

seguido por una inmersión de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1% durante 10

minutos. Para la inducción de callos, se utilizó un medio inductor de callos (MI)

el cual contenía 2,4-D (4,52 uM) como regulador del crecimiento. Los explantes

fueron sembrados en frascos de penicilina (un explante por frasco) conteniendo

como medio inductor a MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementando 2,4-D a 2

ppm y carbón activado 0.5%. Se utilizaron 150 explantes, los cuales se man-

tuvieron en oscuridad continua por 15 días. Al cabo de este tiempo, se evaluó el

número de callos formados por explante, el peso, color y forma de los callos

obtenidos.

2.5. Desarrollo del callo embriogénico

Posterior a la inducción, los callos obtenidos de la primera etapa fueron

transferidos a un medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) en la cual se

combinaban diferentes concentraciones de ácido 2,4-Diclorofenoxiacético y 6-

bencilaminopurina (BAP) como regulador de crecimiento (Tabla 1), cada frasco

de penicilina tuvo 1 explante, para cada tratamiento se utilizaron 35 unidades

experimentales con una repetición por tratamiento, los mismos que permanecieron

durante 60 días en cámara de incubación, con un fotoperiodo de 16 h luz. Se

evaluó cada 15 días la sobrevivencia de callos y se clasificaron en blanco, verde,

con morfología insignificante o cóncavo con bordes sinuosos, peso y tasa de

crecimiento.



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Tabla 1. Diseño factorial de las diferentes concentraciones de 2,4-D y BAP por

tratamientos, a partir de tallo de P. americana “palto” cultivar fuerte.

2,4 – D

(ppm)

BAP

(ppm)

0 1 5 10

0 T0 T1 T2 T3

0.1 T4 T5 T6 T7

T0 = testigo

2.5.1. Condiciones de incubación

Los frascos de penicilina se llevaron a incubación en un ambiente

controlado a temperatura entre 25± 2 °, y en oscuridad total por 15 días.

Transcurrido este tiempo, los explantes fueron introducidos a los

diferentes tratamientos establecidos y colocados en fuentes luminosas

(cuatro fluorescentes de luz blanca, 40 watts, cada uno) con fotoperiodo

de 16:8 y a temperatura ambiente ± 21°C.

2.6. Evaluación

La evaluación cualitativa se realizó cada 15 días y la cuantitativa a los 40 días; se

anotó lo siguiente:

A. Callo:

A.1. Peso: Se extrajeron los explantes con una pinza de disección punta fina

de acero inoxidable estéril y se procedió a medir el peso del explante con una

balanza digital de precisión 0.1g de la marca Bsuper Mart® y se anotaron los

datos obtenidos.

A.2. Color: Cada 15 días se evaluó la coloración que tornaban los explantes y

se anotaron los datos obtenidos.

A.3. Forma: Se evaluó el aspecto morfológico de los explantes cada 15 días

y se anotaron los resultados obtenidos según Chico et al. (2005).



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La Tasa de crecimiento (TC) se determinó con la siguiente fórmula:

𝑇𝐶 =𝑊₂ − 𝑊₁

𝑡₂ − 𝑡₁𝑥 100

donde: W2= peso final; W1= peso inicial; t2= tiempo final; t1= tiempo inicial.

2.7. Análisis Estadísticos

Este experimento se estableció bajo un diseño Factorial 4x2 (con el testigo

incluido en dicho factorial). Para observar las diferencias significativas en los

porcentajes de callogénesis en el medio de inducción se utilizó el análisis de

varianza (ANAVA) y la prueba de comparación de medias HSD Tukey (p < 0.05).

Para el procesamiento de los datos se utilizó el software de analítica

predictiva IBM SPSS 22.0.



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III. RESULTADOS

Los explantes que fueron sometidos a los tratamientos que contenían reguladores de

crecimiento 2,4-D y BAP, indujeron callos in vitro en el explante evaluado pero con

diferentes proporciones. Así, los explantes de tallo sembrados en medio sin regulador de

crecimiento (T0) no generaron callos embriogénicos y los T4 y T5 resultaron menos

viables. El mayor número y porcentaje de callos embriogénicos obtenidos, se indujo en

los tratamientos T2 inducido con 2,4-D (0mg/L) y BAP (5mg/L) con 410 callos

representado con un 94%, y el T1 inducido con 2,4-D (0mg/L) y BAP (1mg/L) con 176

callos y un 92% (Tabla 2).

Tabla 2. Porcentaje del número de callos por explante viable de tallo de P. americana “palto”

cultivar fuerte evaluados en los diferentes tratamientos.

Tratamiento N° Explante viable N° Callo % N° Callo/explante

T0 0 0 0 0

T1 23 176 92 5.7

T2 33 410 94 11.7

T3 7 52 64 1.5

T4 1 1 3 1.0

T5 1 8 17 0.4

T6 2 20 22 0.8

T7 3 25 38 0.8

Las hormonas 2,4-D y BAP, indujeron la formación de callos embriogénicos en tallos de

Persea americana Mill. “palto” cultivar fuerte, los cuales presentaron características

peculiares. Los callos obtenidos de T4, T5, T6 y T7 expuestos a luz, no presentaron

diferencia en el color blanco ni en su forma (reducido), a contraposición de los

tratamientos T1, T2, T3 que presentaron callos con coloración verde y forma definida,

así mismo se registró ganancia de peso de 0.2, 0.15, 0.17 respectivamente y obteniéndose

la mayor tasa de crecimiento de 0.20% en T2 (Tabla 3). La evaluación fue cada 15 días.



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Tabla 3. Morfología y peso ganado de los callos in vitro de P. americana Mill. per“palto” cultivar

fuerte tratados con 2,4-D y BAP. La evaluación se realizó cada 15 días.

MI: medio inductor: MS+2,4-D 2ppm

Según los resultados obtenidos en el número de callos in vitro por tratamiento, se encontró

que las hormonas 2,4-D y BAP influyen en la inducción de callos embriogénico

existiendo diferencias significativas en ANAVA (Tabla 4), así mismo se realizó la prueba

Tukey, con significancia de 0.05 evidenciando que existe efecto en la interacción (Tabla

5).

Días

Luz

Tratamientos

Callo

Color Forma Ganancia

de peso (g)

Tasa de

crecimiento

(%)

15 Ausente MI blanco Insignificante 0.01 0.00

30 Presente T1 verde Cóncavo con bordes sinuosos 0.2 0.13



75 Presente T4 blanco Insignificante 0.03 0.07






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Tabla 4. ANAVA factorial 4x2 para la variable número de callos in vitro de P. americana “palto”

cultivar fuerte obtenidos de los tallo en los diferentes tratamientos con 2,4-D y BAP a los 120

días.

Origen SC GL CM F Sig.

Entre

Tratamientos

990.608 7 141.515 15.671 **0.000

2,4-D 164.654 1 164.654 18.233 **0.000

BAP 231.756 3 77.252 8.555 **0.000

2,4-D * BAP 183.040 3 61.013 6.756 **0.000

Error 1381.653 153 9.030

Total corregido 2372.261 160

p<0.05

Tabla 5. Comparación de medias de Tukey para los diferentes tratamientos evaluados con los

reguladores de crecimiento 2,4-D y BAP.

Tratamientos

N

Subconjunto para alfa = 0.05

1 2 3

T0 35 0.0000

T4 32 0.0625

T5 6 0.1667

T6 9 0.5556

T7 8 0.6250

T3 11 1.1818 1.1818

T1 4.5200 4.5200

T2 5.8286

Sig. 0.974 0.098 0.955

Los resultados obtenidos en ganancia peso (g) en los callos in vitro por tratamiento, se

encontró los fitorreguladores de crecimiento 2, 4-D y BAP influyen en el peso de callos

embriogénicos, existiendo diferencias significativas en ANAVA (Tabla 6), así mismo se

realizó la prueba Tukey, con significancia de 0.05 evidenciando que existe efecto en la

interacción (Tabla 7).



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Tabla 6. ANAVA factorial 4x2 para la variable ganancia de peso de P. americana “palto” cultivar

fuerte obtenidos de los tallo en los diferentes tratamientos con 2,4-D y BAP a los 120 días.

Origen SC GL CM F Sig.

Entre tratamientos 1.055 7 0.151 5.612 **0.000

2,4-D 0.305 1 0.305 11.334 **0.001

BAP 0.114 3 0.038 1.415 0.240

2,4-D * BAP 0.260 3 0.087 3.227 0.024

Error 4.111 153 0.027

Total corregido 5.166 160

p<0.05

Tabla 7. Comparación de medias de Tukey para los diferentes tratamientos evaluados con los

reguladores de crecimiento 2,4-D y BAP.

Tratamientos N

Subconjunto para alfa = 0.05

1 2

T0 35 0.00

T4 32 0.00

T6 9 0.01 0.01

T5 6 0.02 0.02

T7 8 0.04 0.04

T2 35 0.14 0.14

T3 11 0.17 0.17

T1 25 0.20

Sig. 0.158 0.084



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IV. DISCUSIÓN

El explante de tallo en P. americana Mill. “palto” cultivar fuerte, fue capaz de generar

callo embriogénico debido a la influencia de los fitorreguladores 2,4-D y BAP, así mismo

la formación de callo es estimulada por el corte de los tejidos y la concentración exógena

del regulador de crecimiento utilizado. Los callos se generan a partir de la zona de corte

en todos los explantes, los tallos lo hacen en ambos extremos lo que sugiere una

acumulación de auxinas en las zonas de corte y en consecuencia una estimulación de la

mitosis permitiendo la formación de tejido calloso (Smith, 2012).

En el tallo se ve un claro incremento de la callogénesis cuando se aumenta la

concentración de BAP y se suprime la del 2,4-D (Tabla 2). Entre los tratamientos que

utilizaron las auxinas con BAP la mejor combinación es 0 ppm 2,4-D + 5 ppm BAP para

la formación de callos embriogénicos, encontrando 92% de formación de callos. Según

Bhau (1999), Llamoca et al. (1999), Medeiros et al. (2006), Angulo y Paredes (2011) el

Ácido 2,4–diclorofenoxiacético (2,4–D) es un herbicida que actúa como auxina y

favorece la formación de callos en tejidos vegetales; ha sido usado en algunas especies

de cactáceas, con distintas concentraciones o combinado con otros reguladores de

crecimiento, actuando en diferentes explantes o tejidos. Estos autores coinciden con

Zhao et al. (2005) en que la formación de callos se produce cuando la misma

concentración de auxina y citoquinina se añade al medio de cultivo; por tanto, la relación

entre ambos reguladores de crecimiento constituye el factor crítico que desencadena las

reacciones de desarrollo in vitro.



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El Medio Inductor enriquecido con 2,4-D estimuló el crecimiento en regiones polares de

los explantes de P. americana Mill., mientras que al utilizar BAP se observó crecimiento

de callo tanto en regiones polares como en las regiones laterales. En el presente trabajo,

con Persea americana Mill., no se observó una respuesta favorable de diferentes

concentraciones de 2,4–D ó 2,4–D + BAP, ya que no indujeron el desarrollo de callos

embriogénicos en condición de luz. Los callos formados, presentaron características

variables en color y textura.

A diferencia de esto Pinto et al. (2002) lograron incrementar el porcentaje de callos au-

mentando la concentración hormonal de 2,4-D y de BAP en E. globulus. Por otra parte,

Suksa-Ard et al. (1999) consideraron que la formación y las características de los callos

dependen, considerablemente, del órgano usado como explante. Shu et al. (2005)

mostraron los mejores resultados en la obtención de callos embriogénicos, al utilizar

como explante segmentos de tallos de Dioscorea zingiberensis e incluir en el medio de

cultivo 0,5 ppm de BAP y 2,0 ppm de 2,4- D, con lo que lograron una frecuencia de

formación de callos del 87%.

La inducción de la callogénesis se atribuye a los múltiples mecanismos de acción de los

reguladores de crecimiento empleados. Para que las auxinas induzcan el efecto fisiológico

estas deben ser transportadas desde el medio de cultivo hasta las células blanco como

mencionan Taiz y Zieger (1998). Estos investigadores propusieron el modelo

quimiosmótico de transporte polar de las auxinas. En este proceso las bombas de H+

mantienen una gradiente electroquímica entre el citoplasma y la pared celular. Para que

las auxinas induzcan el crecimiento celular estas deben unirse a receptores externos e

internos, los que a la vez inducen la expresión de genes que codifican factores proteicos



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que aumentan la plasticidad y ablandan la pared celular. Esto tiene como efecto la

dilatación de la célula, debido a la presión del agua dentro de su vacuola (presión de

turgencia), de este modo continúa agrandándose hasta que la pared opone resistencia

(Azcón-Bieto y Talón 2008).

Muchos investigadores han relacionado el tipo de callo con la respuesta organogénica y

embriogénica que se pueda presentar, siendo altamente dependiente de la especie. Por lo

tanto, el tipo de callo puede ser un indicador importante de la ruta morfogénica a seguir

(Smith 2012). El cambio de aspecto de los callos conforme se cultivan en el tiempo ha

sido reportado por Larson et al. (2006). La apariencia en su forma cóncava con bordes

sinuosos de Persea americana cultivar fuerte, se relaciona a los explantes de tallo

inducidos con BAP (1, 5 y 10 ppm) y 0 ppm de 2,4-D. Al respecto Shiram et al. (2008)

señalan que altas concentraciones de auxina o citoquininas estimulan la producción de

callo y que su aspecto está relacionado al tipo de hormona utilizada durante su inducción.

No se reportó que exista mayor influencia de inducción de callos in vitro cuando se

aplicaba mayor concentración de la auxina, ni en combinación con las citocininas, sino

que se obtuvieron resultados significantes al incremento del BAP, así también para la tasa

de crecimiento en función al peso de los explantes con callo por tratamiento, siendo el

más óptimo el T2 al encontrarse un 0.20%. No obstante, en otras investigaciones la

inducción de callos con una alta relación auxina/citoquinina o sólo auxinas favorece la

presencia de callos caulogénicos, como lo dejan en evidencia los reportes de Tang y

Newton (2005) en Pinus strobus L. y de Hajari et al. (2006) en híbridos de Eucalyptus



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grandis x Eucalyptus urophylla. En otros casos, como en Eucaliptus nitens, E. globulus

y E. camaldulensis, la inducción basada en auxinas ha promovido callos embriogénicos

(Bandyopadhyay et al. 1999, Prakash et al. 2002). Este estudio, pionero para la especie,

abre expectativas para el uso potencial de callos de P. americana cultivar fuerte en otras

aplicaciones como embriones somáticos.



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V. CONCLUSIONES

- El mayor porcentaje de inducción de callos embriogénicos en tallos de Persea

americana Mill. “palto” cultivar fuerte, fue del 94% que se obtuvo con 0 mg/L de

ácido 2,4-Diclorofenoxiacético y 6-Bencil Amino Purina (5 mg/L).

- Los callos embriogénicos inducidos del tratamiento de 0 mg/L de ácido 2,4-

Diclorofenoxiacético y 5 mg/L de 6-Bencil Amino Purina (T2), expuestos a luz

presentaron coloración verde, con forma cóncava sinuosa y una tasa de

crecimiento de 0.20%.



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VI. RECOMENDACIONES

- Se recomienda para evaluar la inducción de callos embriogénicos en Persea

americana Mill. “palto” cultivar fuerte, las concentraciones comprendidos entre

0 mg/L de ácido 2,4-Diclorofenoxiacético y 1mg/L y 5mg/L de 6-Bencil Amino

Purina y hallar un equilibrio en cuanto a ahorro de materia prima.

- Se recomienda emplear el material biológico a partir de los 3 meses de edad para

evitar fenolización y/o muerte del explante cuando es muy joven.



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ANEXOS



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Fig 1. Callo embriogénico de P. americana

Mill. Cultivar fuerte, formado en T2.

Fig 2. Vista frontal del callo embriogénico de

P. americana Mill. Cultivar fuerte, vista al

esteroscopio binocular Olympus.

Fig 3. Morfología de callo embriogénico de P.

americana Mill. cultivar fuerte, formado en T2.

Callo cóncavo con borde sinuoso, de color verde.



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Fig 5. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. Cultivar fuerte,

formado en T7. Callo de forma insignificante, color blanco.

Fig 4. Morfología de callo embriogénico de P. americana Mill. cultivar fuerte,

formado en T2. Callo cóncavo con borde sinuoso, a los 120 días.



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Fig 6. Meristemoides en el cilindro central del tallo de P.

americana Mill. Las células son más pequeñas y citoplasma

denso. Tratamiento 5, a los 30 días de edad. Coloración

hematoxilina eosina, aumento 400x.

Fig 7. Corte transversal de un callo

emergiendo desde la corteza y rompiendo

la capa epidérmica. Tratamiento T1 a los

35 días de edad. Coloración hematoxilina

eosina, aumento 400x

Fig 8. Epidermis rota por la presión de nuevas

células en formación y crecimiento. Observe que

estas células son más pequeñas y de forma

cuadrada (flecha celeste) y las células de la corteza

son oblongas y más grandes (flecha roja).

Tratamiento T2 a los 25 días de edad, coloración

hematoxilina eosina, aumento 400x.



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Fig 9. Meristemoides en formación de P. americana

Mill. “palto” cultivar fuerte. Sometido a tratamiento

T2, a los 15 días. Coloración hematoxilina eosina,

aumento 400x.



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fitorreguladores 2, 4-D y BAP para la variable número de callos en tallo de Persea americana

Mill. “palto” cultivar fuerte.

N

Tratamientos

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7

1 0 0 14 1 0 0 5 0

2 0 0 12 1 0 2 0 0

3 0 0 10 1 0 0 0 2

4 0 0 8 0 0 0 2 0

5 0 4 13 0 0 0 0 3

6 0 0 13 0 0 0 0 0

7 0 1 26 0 0 0 2 0

8 0 0 11 3 0 0 0 2

9 0 0 11 7 0 0 2 0

10 0 9 17 0 0 0 0 0

11 0 3 22 0 0 0 3 0

12 0 0 19 0 1 0 0 3

13 0 0 13 4 0 0 0 0

14 0 0 17 1 0 3 2 0

15 0 8 9 1 0 1 0 0

16 0 17 7 1 0 0 0 2

17 0 0 5 1 0 0 0 0

18 0 19 3 3 0 0 0 0

19 0 9 15 3 0 0 0 0

20 0 2 10 3 0 0 2 0

21 0 13 12 2 0 0 0 0

22 0 13 9 0 0 0 0 2

23 0 10 5 1 0 2 0 0

24 0 0 12 1 0 0 0 0

25 0 34 17 1 0 0 2 0

26 0 10 11 4 0 0 0 0

27 0 0 8 3 0 0 0 3

28 0 11 5 2 0 0 0 0

29 0 5 12 0 0 0 0 0

30 0 0 18 0 0 0 0 0

31 0 0 5 2 0 0 0 0

32 0 3 9 1 0 0 0 0

33 0 2 9 1 0 0 0 2

34 0 0 12 2 0 0 0 3

35 0 3 11 2 0 0 0 3



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fitorreguladores 2, 4-D y BAP para la variable ganancia de peso (g) de callos en tallo de Persea

americana Mill. “palto” cultivar fuerte.

N Tratamientos

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7

1 0 0.06 0.06 0.12 0 0.1 0.04 0

2 0 0 0.16 1.1 0 0 0.08 0

3 0 0.22 0.13 0.14 0 0 0 0.13

4 0 0.14 0.08 0 0 0 0 0.11

5 0 0.12 0.12 0 0 0 0 0

6 0 0.06 0.2 0 0 0 0 0

7 0 0 0.23 0 0.03 0 0 0.09

8 0 0.09 0.14 0.12 0 0 0 0

9 0 0.14 0.11 0.06 0 0 0 0

10 0 0.18 0.12 0.04 0 0 0 0

11 0 0.25 0.04 0.28 0 0 0 0

12 0 0.16 0.16 0 0 0 0 0

13 0 0.19 0.13 0 0 0 0 0

14 0 0.11 0.12 0 0 0 0 0

15 0 0.04 0.22 0 0 0 0 0

16 0 0.18 0.04 0 0 0 0 0

17 0 0.18 0.03 0 0 0 0 0

18 0 0.22 0.26 0 0 0 0 0

19 0 0.02 0.08 0 0 0 0 0

20 0 0.9 0.04 0 0 0 0 0

21 0 1.2 0.15 0 0 0 0 0

22 0 0.12 0.12 0 0 0 0 0

23 0 0.12 0.08 0 0 0 0 0

24 0 0.17 0.08 0 0 0 0 0

25 0 0.12 0.08 0 0 0 0 0

26 0 0 0.28 0 0 0 0 0

27 0 0 1.19 0 0 0 0 0

28 0 0 0.15 0 0 0 0 0

29 0 0 0.03 0 0 0 0 0

30 0 0 0.06 0 0 0 0 0

31 0 0 0.05 0 0 0 0 0

32 0 0 0.03 0 0 0 0 0

33 0 0 0.02 0 0 0 0 0

34 0 0 0 0 0 0 0 0

35 0 0 0 0 0 0 0 0



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FOTOGRAFÍAS

A. Vista de la investigadora realizando la siembra de los explantes de tallo de

Persea americana Mill. “palto” variedad fuerte.

B. Vista de la investigadora luego de realizada la siembra de los explantes de

tallo de Persea americana Mill. “palto” variedad fuerte.



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40

C. Frascos de penicilina con los explantes sembrados en los diferentes

tratamientos.

D. Cámara de siembra con el material con MS, mecheros y material utilizado en

la siembra de los explantes a investigar.



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escuela acadÉmico profesional de ciencias biolÓgicas

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