enzimoinmunoanálisis carolina imprimir

5/11/2018 Enzimoinmunoanálisis carolina imprimir - slidepdf.com

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Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar

Escuela de Ciencias de la Salud

“Dr. Francisco Battistini Casalta”

Dpto. de Bioanálisis

ENZIMOINMUNOANALISIS

Profesora: Lda. Alizar Abou Br. Carolina M. Hernández E.

C.I: 16572617

Ciudad Bolívar, septiembre 2011



INTRODUCCIÓN

El concepto de EIA lo presento por primera vez Miles (1968), quien describió el uso

de anticuerpos marcados con isótopos en los RIA y sugirió que las enzimas o coenzimas

podrían reemplazar el marcador isotópico.

En 1971, Engvall y Van Weemen describieron por primera vez el empleo de

enzimas como marcadores inmunoquímicos en sustitución de los radioisótopos.

Las variaciones más comunes de la técnica de enzimoinmunoanálisis son ELISA y

EMIT.



Enzimoinmunoanálisis

El enzimainmunoanálisis (EIA) es una metodología que permite cuantificar anticuerpos o

antígenos en muy baja concentración (menos de 1 ng/ml) en la mayoría de los líquidos

biológicos y sobrenadantes de cultivos celulares. Se ha usado ampliamente en el estudio de

la respuesta de anticuerpos frente antígenos complejos. En el laboratorio de inmunología se

utiliza corrientemente para detectar y cuantificar autoanticuerpos y diversas proteínas e

inmunoglobulinas en baja concentración en los líquidos biológicos.

Los EIA pueden ser clasificados en dos tipos: homogéneo y heterogéneo.

Enzimoinmunoanálisis heterogéneo.

Mediante la reacción indicadora la actividad enzimática asociada al complejo Antígeno-

Anticuerpo, para la cual es necesario eliminar previamente del medio de reacción la enzima

(unida al conjunto) no asociada al complejo, y en definitiva con la concentración del

componente en estudio.

En este sistema la reacción antígeno-anticuerpo no modifica la actividad del marcador

enzimático. Requiere la separación de las fracciones ligadas y libres resultantes de la

reacción inmunológica. En esta modalidad, los reactivos son los anticuerpos y el antigeno

marcado con la enzima.

Fundamento:

El antígeno de la muestra problema y el marcado compiten por el anticuerpo, de forma

que cuanto mayor sea la cantidad de antígeno presente en la muestra problema, mayor cantidad de antígeno marcado con él, la enzima quedara sin unirse al anticuerpo. En este

caso la actividad de la enzima no se anula por la unión de antígeno – anticuerpos.

Se separa los complejos antígeno-anticuerpo (marcado y no marcado), se añade el

sustrato de la enzima para que se produzca la reacción enzimática y se mide su actividad.



La actividad será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. De

esta forma al añadir el sustrato el producto formado está directamente relacionado.

Separación de conjugado unido y no unido en el complejo.

La separación del conjugado unido y no unido al complejo inmune solo tiene sentido en

enzimoinmunoanalisis heterogéneo. Puesto q la separación tiene una importante incidencia

en la calidad y en la practicabilidad de los procedimientos basados en esta técnica, tiene que

ser un proceso cuantitativo y reproducible que no altere el equilibrio de la reacción

inmunológica ni la actividad de la enzima marcadora y que permita una automatización

eficaz y rentable entre los principales métodos de separación se encuentra:

La precipitación fraccionada con solventes (polietilenglicol 6000, sulfato de amonio

o etanol frío).

La precipitación por la técnica de doble anticuerpo en la que una vez formado el

complejo principal se añaden anticuerpos contra las inmunoglobulinas de la especie

en la que se obtuvo el primer anticuerpo.

La absorción (con partículas de carbón recubiertas de dextrano o con proteína A

purificada e insolubilizada)

Los sistemas de separación en fase sólida, en las que uno de los componentes de la

reacción inmune se encuentra revistiendo una superficie sólida (paredes de tubos, bolitas o medios sólidos a base de pequeñas partículas magnéticas recubiertas con

agarosa o celulosa).



Las técnicas de separación en fase sólida se han acabado imponiendo al resto, debido a

que su bajo coste, a que su aplicación es independiente de la naturaleza del componente

problema y debido también a que se consigue la casi completa separación del complejo

formado, y a la posibilidad de la automatización.

La fase sólida tiene una capacidad limitada de unir proteínas, de forma que la

concentración de anticuerpos utilizada para la absorción a dicha fase no debe exceder

generalmente de 10mg/L. En caso contrario probablemente se originaran capas inestables

de anticuerpo, que efectivamente formaran complejos con el antígeno correspondiente

(marcado o no) pero que serán eliminadas durante el proceso de separación del conjugado

unido del no unido ya que no se encuentran suficientemente anclados en la fase sólida. Este

fenómeno dificultara la interpretación de resultados.

La unión del anticuerpo a la fase sólida reduce su coste de afinidad, y continúa

disminuyendo a medida que aumenta la densidad de anticuerpos fijados a la fase sólida

debido a impedimento estérico.

Enzimas más utilizadas en EIA heterogéneo:

Peroxidasa de rábano

Glucosa -6-P.

Glucoamilasa

Anhidrasa carbónica

Acetilcolinesterasa

Los sustratos van a depender del tipo de medida utilizada: espectrométrica,

fluorimétrica, luminométrica

Ventajas:

Menos interferencias, mas especificas y sensibles.

Instrumentación menos costosa.



Admite mayor tamaño de muestra, así disminuye el límite de detención.

Más versátiles en cuanto al tipo de analíto.

Desventajas:

Precipitación fraccionada con sulfato de amonio etanol en frío o PEG.

Unión de la forma unida a una fase sólida (EIA, partículas magnéticas).

Centrifugación.

Enzimoinmunoanálisis homogéneo.

Este ensayo no requiere la separación de las fracciones ligadas y libres resultantes de la

reacción inmunológica. Los reactivos necesarios son el anticuerpo y el antígeno marcado

con la enzima. Se basa en la competencia por el anticuerpo entre la sustancia problema y la

marcada por la enzima.

Cuando el antígeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso del sustrato al

centro activo de la enzima, por lo que anula su actividad.

A mayor concentración de la molécula problema, menor cantidad de antígeno marcado

se unirá al anticuerpo, quedando mayor cantidad de antígeno libre con la enzima activa

dando una mayor actividad.

En resumen, a mayor concentración mayor actividad, sin necesidad de separar las

fracciones.

Fundamento

Consiste en utilizar una enzima o conjugado tal que su propia incorporación al complejo

antígeno-anticuerpo lleve asociada una modificación (activación o inhibición) de la

actividad enzimática ya sea porque se produzca un impedimento físico para el posterior

acceso del sustrato al centro activo de la enzima, ya sea por un cambio conformacional en



esta. El caso es que la modificación sea proporcional a la cantidad de complejo formado y,

por tanto la medida de la actividad enzimática en el medio de reacción indicará la

concentración del componente problema sin necesidad de separar previamente el conjugado

no unido.

Normalmente el EIA homogéneo se utiliza principalmente para la medición de

componentes de baja masa molar (haptenos), ya que esta técnica, para que la unión del

Anticuerpo al conjugado impida el acceso del sustrato hasta el centro activo de la enzima,

es preciso que el hueco que quede entre el anticuerpo y la enzima sea pequeño, por lo cual

ocurre si esta se encuentra unida a una pequeña molécula de hapteno. Por este motivo el

sistema homogéneo ha sido tradicionalmente aplicado en el laboratorio clínico solo para

componentes de baja masa molar, tales como medicamentos y hormonas, si bien el avance

tecnológico ha permitido la aplicación de este principio a la medición de la concentración

de macromoléculas.

La ausencia de la etapa de separación en el EIA homogéneo presenta como principal

ventaja que los métodos pueden ser fácilmente adaptados a los analizadores habitualmente

utilizados en el laboratorio clínico que los métodos EIA heterogéneos que requieren

analizadores especiales para ellos.

La ausencia de la etapa de separación el en EIA homogéneo puede suponer también un

inconveniente, ya que los componentes de la matriz del espécimen estarán presentes

durante el proceso, pudiendo interferir en la reacción inmunológica o en le enzimática,

disminuyendo la detectabilidad. Este efecto puede producirse midiendo la actividad

enzimática mediante múltiples lecturas.

La mayoría de los EIA homogéneo son rápidos y sencillos de realizar y se adaptan muy

bien a la automatización; inicialmente fueron diseñados para la detención de moléculas de

bajo peso molecular como hormonas y drogas, en actualidad se utilizan para moléculas más

complejas como proteínas.

Enzimas más utilizadas:

Lisozima



Malato-deshidrogenasa

Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa

Fosfolipasa alcalina (FAL)

β-D-Galactosidasa

Ventajas:

Más preciso.

Son más rápido y sencillos de realizar.

Más utilizados en drogas de abuso y monitoreo de fármacos que se adaptan a la

automatización.

Sin pasos de separación no se requiere la separación del antigeno unido del no

unido.

Pueden desarrollarse análisis sensibles por el efecto de amplificación de las

enzimas.

Los reactivos son relativamente baratos y alcanzan una larga vida media de

conservación.

Pueden desarrollarse múltiples análisis simultáneamente

Se pueden realizar una amplia variedad de configuraciones analíticas.

El equipo utilizado es relativamente barato y accesible.

No hay riesgos de radiación durante el marcado ni en la eliminación de los

productos de desecho.

Desventajas:

Son mas costosos en reactivos.

En general solo sirven para fármacos.

Los análisis homogéneos alcanzan actualmente una sensibilidad no es tan elevada

con la que se consigue con los radioinmunoanálisis.



Aunque se han desarrollado EIA homogéneos para grandes moléculas proteicas, es

necesario emplear en ellos reactivos inmunoquímicos complejos.

Detención y Cuantificación:

Las medidas se pueden hacer:

Un simple espectrofotómetro.

Un analizador automático de química clínica.

Independientemente de que sean considerados homogéneos o heterogéneos los

métodos de EIA pueden clasificarse también en:

El componente problema se comporte como antígeno o como anticuerpo

En función de la reacción inmunológica es o no de tipo competitivo,

En función de si el componente marcado con la enzima es el antígeno o el

anticuerpo.

Técnicas de unión competitivas:

• EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique)

Fue el primer tipo de EIA homogéneo desarrollado, en esta técnica la unión del ligando

marcado con la enzima al anticuerpo origina un cambio en la actividad de la enzima, el cual

generalmente consiste en una disminución de la misma. Aunque se piensa q en la mayoría

de estos casos la inhibición de la enzima es debida a un impedimento estérico que bloquea

físicamente el acceso del sustrato al centro activo de la enzima, la inhibición de ciertas

enzimas puede ser debida a cambios conformacionales inducidos en esta por la unión de

anticuerpos.

Cuando mayor es la concentración del ligando problema en el espécimen, mayor es la

concentración del ligando marcado no unido al anticuerpo en el medio de reacción ,



aumentando simultáneamente la actividad catalítica en el mismo. La máxima activida

catalítica se alcanza cuando todo el ligando marcado se encuentra en forma libre (no unido

al anticuerpo), o todo el anticuerpo esta unido al ligando presente en el espécimen.

• ECIA

En esta técnica el producto de una reacción enzimática es canalizado o dirigido

directamente hacia una segunda enzima, para la que actúa como sustrato; y se basa

precisamente en que la velocidad de esta reacción ocupada es mayor si estas dos enzimas

están coinmovilizadas que si están separadas en la solución.

Técnicas de unión no competitivas:

• EEIA

Esta técnica es útil para medir anticuerpos y antígenos polivalentes y evita la necesidad

de disponer de antígenos marcados. Consiste básicamente en que una cantidad limitada de

anticuerpos marcados con una enzima (B -galactosidasa) y un exceso de anticuerpo

“sucinilado” (cargado negativamente) forma un complejo antígeno-anticuerpo con el

ligando antigénico polivalente presente en el espécimen la enzima unida al complejo

transforma un sustrato en producto que, en este ambiente cargado negativamente, queda

insolubilizado formando una segunda fase.



• EIA homogéneo con anticuerpos bioespecíficos.

En esta técnica se realizan anticuerpos bioespecíficos, en los cuales la parte de

anticuerpo específico contra el antígeno problema se combina con la parte específica contra

un inhibidor de la enzima. Así una vez unido el componente problema, el centro del

anticuerpo biespecífico donde se une el inhibidor de la enzima. Asi una vez unido el

componente problema, el centro del anticuerpo bioespecífico donde se une el inhibidor de

la enzima es entonces directamente proporcional ala concentración del antígeno en el

espécimen. El intervalo de medida y fexibilidad pueden aunmentarse reduciendo la

flexibilidad de los anticuerpos hibridos en la región bisgra por modificación química.

• EIA homogéneo con sustratos insolubles.

En esta técnica el anticuerpo específico contra el antígeno problema se une

covalentemente a la enzima (como la alfa- amilasa o dextrano) que actúan sobre sustratos

insolubles de masa molar muy elevada. De esta forma se ha conseguido detectar la

presencia de antígenos en el espécimen. Cuando estos antígenos se unen a su anticuerpo, se

impide el acceso del sustrato al centro activo de la enzima, por lo que la formación del

producyo es inversamente proporcional a la concentración del antígeno en el espécimen.

Para aumentar el impedimento estérico y eliminar las interferencias debidas a factores

reumatoides, en vez de unir a la enzima moléculas de IgG completas, se han unido

fragmentos Fab. Algunas proteínas no ferritinas y la alfa-fetoproteina, han sido medidas

con éxito mediante procedimientos basados en esta técnica, habiéndose detectado

concentraciones de hasta 8 y 20 ug/L respectivamente.

Enzimas y sustratos utilizados en EIA.

Puesto que la calidad de los métodos EIA dependen en gran medida de las enzimas

utilizadas, estas han de cumplir ciertos requisitos para que puedan ser utilizadas como

marcadores. La actividad catalítica es medida básicamente mediante la medida

espectrométrica, fluorimétrica o luminimetrica del producto formado. Aunque las fosfatasa

alcalina y la peroxidasa de rábano pueden ser medidas con mayor detectabilidad por



fluorimétria y luminométria que es espectrometría, el límite de detección global del EIA

disminuye solo de 2 a 10 veces como máximo. A pesar de ello, la medida espectrométrica

del producto es, salvo excepciones, el método de detección más frecuente para EIA.

Las sustancias cromógenas utilizadas para evaluar la actividad enzimática en el

EIA deben cumplir también ciertos requisitos:

Debe ser solubles en agua, incoloros, inodoros no mutagénicos ni tóxicos.

El producto formado debe tener coeficiente de absorción molar elevado con un

máximo de absorbancia situado de 340 y 600 nm aproximadamente.

Elevada constante de unión para la enzima.

Gran estabilidad del sustrato en las condiciones de almacenamiento, el producto

formado después de parar la reacción.

Linealidad de la función de medida en un amplio intervalo.

Ausencia del sustrato en el espécimen especialmente en el EIA homogéneo.

La medida de la actividad catalítica en el EIA homogéneo se lleva a cabo

preferentemente por un método de lectura múltiple, mientras que en el EIA heterogéneo se

usa generalmente un método a dos puntos. La enzima de detección para el EIA heterogéneo

es la peroxidasa.

Principales requisitos de las enzimas para ser utilizadas como marcadores:

Elevada actividad específica en forma conjugada o no conjugada.



Disponibilidad de la enzima soluble y purificada, a bajo coste y de calidad

reproducible.

Alta estabilidad de las formas conjugada y no conjugada en las condiciones

experimentales y de almacenamiento.

Presencia de grupos reactivos para su unión covalente.

Métodos de marcaje simples y suaves

No tóxicos estables y baratos que den lugar a productos cromogénicos estables.

Elevada actividad específica a las condiciones optimas para la formación de un

complejo antígeno-anticuerpo.

Interferencias comunes:

Interferencia exógenas:

En estas están interferencias debidas a la preparación, la recogida y la conservación del

espécimen

Las interferencias debidas a las diferentes matrices de los calibradores utiloizados y de

los especímenes problemas.



Las interferencias debidas a los cambios en las propiedades de la superficie de plástico

originados por la unión de proteínas u otras moléculas, puduedo alterarse el tipo, la

cantidad o estabilidad de estas uniones.

También son interferentes exógenos las ocasionadas por la saturación incompleta de los

centros de unión al anticuerpo (o el antígeno) específico en la fase sólida, lo que puedefavorecer la unión de otros reactivos que minimicen o eliminen tales uniones.

Interferencias endógenas:

Espécimen hiperlipídico: su efecto puede ser reducido o minimizado mediante la

dilución del mismo.

Presencia de anticuerpos heterófilos: (anticuerpos humanos contra inmunoglobulinas

animales utilizadas en la reacción) cuando en un método se utilizan anticuerpos

(heterófilos) contra inmunoglobulinas de ratón (tras la mordedura, o después del

tratamiento con anticuerpos monoclonales, por ejemplo), estos pueden reaccionan contra

anticuerpos monoclonales empleados en aquella técnica, originando una interferencia

endógena. Esta reacción puede ser minimizada añadiendo suero de la especie animal en

cuestión al medio de reacción. Así, puede observarse la composición de algunos reactivos

a base de anticuerpos monoclonales la presencia de una cantidad adicional de

inmunoglobulinas de ratón.

EIA puede aplicarse a una amplia gama de situaciones, entre las que destacan las

siguientes:

Apoyo diagnóstico a enfermedades autoinmunes.

Diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Diagnóstico de enfermedades alérgicas.

Estudio de marcadores tumorales.

Cuantificación de proteínas circulantes en baja concentración.

Niveles plasmáticos de drogas y hormonas.



CONCLUSIONES

El enzimoinmunoanálisis (EIA), está conformado por aquellas reacciones

serológicas que utilizan conjugados enzimáticos, para poder visualizar la reacción

Antígeno-Anticuerpo. Se basa en la detección de un antígeno o anticuerpo inmovilizado

sobre una fase sólida que mediante sus formas complementarias, directa o indirectamente



producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido

espectrofotométricamente.

La EIA utiliza las propiedades catalíticas de las enzimas para detectar y cuantificar

las reacciones inmunológicas. Una sola molécula de enzima puede catalizar la conversión

de millones de moléculas de sustrato en millones de moléculas en productos. Esta

capacidad de amplificación hace posible detectar la presencia de una pequeña cantidad de

enzimas y, como consecuencia, de pequeñas cantidades de los complejos marcados

formados. Consta de dos etapas: en la primera etapa se produce la reacción del antigeno y

el anticuerpo marcado. En la segunda etapa se añade el sustrato y se termina la actividad

enzimática de la enzima marcadora.

Para determinar las actividades de las enzimas marcadoras pueden utilizarse

diversos sustratos. Inicialmente, se utilizaron sustratos de las enzimas que producían

compuestos medibles fotométricamente. Sin embargo, en los últimos años se están

utilizando sustratos que dan compuestos fluorescentes o luminescentes, lo que a

incrementado la sensibilidad de prueba.

Esta técnica es de gran importancia ya que utiliza las propiedades catalíticas de las

enzimas para detectar y cuantificar las reacciones inmunológicas para el diagnóstico de

diversas enfermedades.

REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS

Fuentes, A. (1998). Bioquimica clínica y patología molecular [libro en línea]. Consultado

el 10 de septiembre de 2011en: http://books.google.com.mx/books?

id=cKGyh_81v-

oC&printsec=frontcover&hl=en&source=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=

onepage&q&f=false

http://books.google.com.mx/books?id=cKGyh_81v-%20%20%0D%20%20%20%20%20%20%20%20%20oC&printsec=frontcover&hl=en&source=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false










J. M. González de Buitrago. 1998. Bioquímica Clínica. Editorial McGraw-Hill.

Interpanamericana.

Grabar P. y Burton P. 1968 Immunoelectrophoresis. Toray S.A. Barcelona.

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