UNIVERSIDAD PRIVADA JOSE CARLOS MARIATEGUI

FACULTAD DE INGENIERIA AGRONMICA

MDULO DE TRABAJO MTODOS BIOTECNOLGICOS

CONSULTOR ING. HERNN ALBARRACIN MORE CIP 69179

MOQUEGUA - PER

INDICEI. INTRODUCCIN1.1. COMPETENCIAS 1.2. PRINCIPALES DEASAFOS 1.3. REAS RELEVANTES 1.4. DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES 1.5. GLOSARIO APLICADO EN BIOTECNOLOGIA

II. INTRODUCCIN AL CULTIVO IN VITRO2.1. GENERALIDADES 2.2. CULTIVO IN VITRO DE MATERIAL VEGETAL 2.3. BASES BIOLOGICAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS, TOTIPOTENCIALIDAD CELULAR 2.4. PASOS PARA GENERAR PLANTAS A PARTIR DE EXPLANTOS AISLADOS 2.5. ELEMENTOS NECESARIOS PARA HACER CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES 2.6. RELACIN DEL CULTIVO IN VITRO CON LA BIOTECNOLOGIA 2.6.1. La micropropagacin 2.6.2. Ventajas de la micropropagacin 2.6.3. Cultivo de meristemos 2.7. CULTIVO DE CLULAS Y ORGNOS VEGETALES EN BIORREACTORES 2.8. ASPECTOS RELEVANTES EN EL CULTIVO IN VITRO 2.8.1. Aplicaciones prcticas en el cultivo in vitro 2.8.2. Equipo y material necesario empleado en el cultivo in vitro 2.8.3. Condiciones del cultivo in vitro 2.8.4. Subcultivos o replicado 2.8.5. Fases del cultivo de meristemos 2.8.6. Fases del cultivo de embriones 2.8.7. Micropropagacin 2.8.8. Cultivo de callo in vitro 2.8.9. Obtencin de plantas haploides 2.8.10. Problemas en el cultivo in vitro 2.9. CONSIDERACIONES METODOLGICAS

III. OBTENCION DE SEMILLA CERTIFICADA3.1. INTRODUCCIN 3.2. OBTENCIN DE EMBRIONES SOMTICOS PARA PRODUCCIN DE SEMILLAS CERTIFICADAS 3.3. MULTIPLICACIN Y MANTENIMIENTO DE SEMILLAS 3.4. CONTROL DE CALIDAD DE SEMILLAS 3.5. ELEMENTOS DE UN PROGRAMA DE SEMILLAS

3.6. PRODUCCIN DE SEMILLA CERTIFICADA DE PAPA 3.6.1. Produccin de semilla prebsica 3.6.2. Tcnicas para la multiplicacin de semilla de papa 3.6.3. Uso de semilla de papa 3.7. PRODUCCIN DE SEMILLA CERTIFICADA DE ARROZ 3.7.1. Importancia del uso de semilla certificada de arroz 3.7.2. Fases de produccin para la obtencin de semilla de arroz 3.8. MICROPROPAGACIN DE LA YUCA 3.8.1. Produccin de estacas a partir de plantas obtenidas de embriones somticos 3.8.2. Sistema de inmersin temporal, una alternativa para la produccin de estacas

IV. EMASCULACIN MASCULINA4.1. INTRODUCCIN 4.2. EMASCULACIN 4.3. EMASCULACIN E HIBRIDACIN 4.4. TCNICAS DE EMASCULACIN Y POLINIZACIN 4.4.1. Tcnicas de emasculacin 4.4.2. Prcticas de polinizacin 4.5. EXPERIENCIAS EN EMASCULACIN 4.5.1. Experiencias en tomate 4.5.2. La construccin del promotor del gen end1 barnasa produce plantas transgnicas androestriles de tomate. 4.5.3. Potencial biotecnolgico del promotor del gen end1 se extiende a la produccin de frutos partenocrpicos en tomate.

V. CONTROL DE VIRUS, HONGOS Y BACTERIAS5.1. NUEVOS CONCEPTOS EN EL MANEJO INTEGRADO DE PLAGAS 5.1.1. Generalidades 5.1.2. Medidas de control convencional contra los virus 5.1.3. Enfermedades causadas por hongos 5.2. BIOTECNOLOGIA EN EL MANEJO INTEGRADO DE PLAGAS 5.2.1. Introduccin 5.2.2. Los plaguicidas qumicos 5.2.3. El manejo integrado de plagas como una opcin para la agricultura sustentable. 5.2.4. Manejo integrado de plagas y biotecnologa 5.2.5. Uso de agentes de control biolgico en el MIP 5.2.6. Control qumico (bioderivados) 5.2.7. Variedades resistentes

5.3. BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO DE PLANTAS 5.3.1. Biocontrol 5.3.2. Biofungicidas en el cultivo de papa 5.3.3. Prueba critica 5.3.4. Probacil 5.4. PRINCIPALES BACTERIAS Y HONGOS PATOGENOS PARA EL HOMBRE ASOCIADOS A LOS ALIMENTOS 5.4.1. Bacterias 5.4.2. Hongos

I. INTRODUCCINLas actividades de mejoramiento gentico vegetal y animal se han basado tradicionalmente en el acceso a los recursos genticos como fuente inicial de diversidad para el desarrollo de variedades y razas de plantas y animales adecuadas a las cambiantes necesidades del hombre. Numerosos materiales genticos son evaluados para la seleccin de progenitores a ser utilizados en cruzamientos dirigidos para incorporar en el genoma de las variedades modernas, genes de diferentes fuentes y orgenes. En este contexto, la biotecnologa y los recursos genticos como reas estratgicas complementarias tienen una importante aplicacin en la produccin primaria (el mejoramiento gentico, la sanidad vegetal y la salud animal), en la agroindustria (el desarrollo de productos y proteccin de alimentos y la trazabilidad), y en la diversidad biolgica y el ambiente (prospeccin de genes en recursos genticos, bioremediacin y bioseguridad).

El gran avance alcanzado por la biologa molecular y celular en los ltimos aos ha permitido el desarrollo de nuevas metodologas que se han ido integrando al mejoramiento tradicional. Al mismo tiempo estas herramientas de anlisis molecular han permitido aumentar el conocimiento de los mecanismos genticos bsicos, los que an son poco comprendidos. El desarrollo de estas tecnologas iniciadas en los 70 con el fenmeno tecnolgico del ADN recombinante, avanza en los 80 con el desarrollo de la PCR y en los 90 con el diseo de numerosas e ingeniosas metodologas de anlisis genmico, conocidas como los marcadores moleculares, estrechamente asociados a la gentica molecular. Ms recientemente el quiebre tecnolgico ha sido el establecimiento de sistemas de secuenciacin de genomas, que combinado al desarrollo de mtodos de anlisis de la informacin de secuencias (bioinformtica), microtecnologas de anlisis de ARN mensajeros (genmica funcional) y sus complementos proteicos (protemica), constituye un panel que ha acelerado tremendamente el conocimiento del genoma completo de numerosas especies. Este desarrollo se ha traducido en la existencia de numerosos proyectos de genmica estructural y funcional, observndose un inters creciente en la aplicacin de esos conocimientos para la descripcin sistemtica de la diversidad gentica, aplicable tanto para los programas de mejoramiento como para la caracterizacin minuciosa de patgenos y plagas.

La utilizacin de los nuevos recursos y herramientas biotecnolgicas ser clave para el estudio de los mecanismos biolgicos y el establecimiento de las relaciones entre estructuras (genes) y funcin biolgica (caracteres), en el contexto de estudios de genmica funcional, protemica y el manejo de la informacin mediante avanzados protocolos de bioinformtica. La intensa competencia en el

campo de la biotecnologa ha dado un gran impulso a la bsqueda, aislamiento, caracterizacin y manipulacin de genes. Este desarrollo ha ido aparejado con un aumento de las iniciativas de patentamiento y otras formas de proteccin de propiedad intelectual asociadas a estos genes y procesos que se vinculan a los ms diversos mecanismos biolgicos.

1.1. COMPETENCIAS

Con la excepcin del caso de Brasil, con su iniciativa genmica en el estado de San Paulo, hay escasos ejemplos en estudios de genmica. Por ejemplo, en Argentina se ha trabajado ltimamente en la secuenciacin de Brucella abortus, agente causal de la brucelosis bovina.

En Argentina se ha utilizado el desarrollo de marcadores de microsatlites de diversas variedades vegetales, como girasol (colaboracin de INTA-Argentina con empresas semilleras locales). En varios pases se han secuenciado fragmentos de genomas de virus y viroides (Argentina, Chile, Uruguay), contando con alguna capacidad de secuenciadores automticos del tipo capilar.

En Brasil se ha establecido una red de cooperacin (ONSA) que inicialmente secuenci completamente la bacteria Xylella fastidiosa y posteriormente ha incursionado en el estudio de genmica funcional de clulas cancerosas, a la vez que se ha abocado a la caracterizacin del genoma de Sacharum oficinales. Es evidente que frente al estado del desarrollo de estas reas en el mundo, en Sudamrica exceptuando a Brasil - existen serias carencias, tanto de recursos humanos bien entrenados, como de una particular infraestructura y equipamientos cuyo costo no es despreciable.

1.2. PRINCIPALES DESAFOS

La situacin indicada anteriormente plantea la necesidad de integrar las capacidades cientficas existentes, alcanzando economas de escala que hagan redituable la asociacin entre los sectores pblico y privado e inserten el avance tecnolgico. La integracin de los esfuerzos, a travs del fortalecimiento de redes cooperativas, permitir resolver problemas de productividad, sanidad, trazabilidad, sustentabilidad y agregacin de valor en productos agroindustriales de importancia estratgica para mejorar la competitividad e insercin del MERCOSUR ampliado en los mercados mundiales.

Los desafos especficos se centran en aumentar la productividad (por ejemplo, identificando QTLquantitative trait loci- asociados a rendimiento o tamao de plantas), mejorar la calidad de productos (por ejemplo, analizando la diversidad de poblaciones de patgenos e identificando genes de plantas o animales que aporten resistencia/tolerancia a ellos), as como, en disminuir la dependencia de variedades y genes desarrollados y aislados por pases del primer mundo.

Se deberan desarrollar las capacidades para identificar genes propios del germoplasma posedo, identificados por metodologas de anlisis genmico. Adems, se deberan concretar soluciones para

problemas propios de nuestra zona, que difcilmente pueden ser enfrentados por programas de mejoramiento gentico ajenos a la misma.

Otro aspecto estrechamente relacionado a la comercializacin y competitividad de los productos es la disponibilidad de sistemas de identificacin gentica y de trazabilidad que aseguren detectar el origen de problemas especficos, a lo largo de las distintas fases de la cadena de valor. El desarrollo de las capacidades especficas deber ser complementado por el fortalecimiento del sector de insumos y servicios que viabilicen el uso de los productos biotecnolgicos, acompaado por el establecimiento de apropiados mecanismos de bioseguridad y claras reglas de propiedad intelectual.

1.3. REAS RELEVANTES

Las reas de trabajo que debera orientar la organizacin de una plataforma de cooperacin entre los pases del MERCOSUR en Biotecnologa podran ser las siguientes:

Anlisis genmico funcional de plantas, animales y microorganismos de inters. Prospeccin gnica de patgenos, plagas y malezas para desarrollar mtodos de diagnstico y control en plantas y animales. Desarrollo de reactivos biolgicos para la prevencin de enfermedades de animales. Identificacin o diferenciacin gentica de cultivares o razas. Identificacin de genes o formas allicas asociados a caracteres de inters agropecuario y agroindustrial que puedan ser incorporados en programas de mejoramiento gentico. Caracterizacin molecular de la diversidad biolgica de colecciones de germoplasma de la zona que (i) faciliten su conservacin y utilizacin, (ii) apoyen el establecimiento de colecciones ncleo, y (iii) posibiliten la ampliacin del abanico de genes disponibles. Desarrollo del rea de la bioinformtica que respalde el proceso de identificacin y seleccin de genes de inters.

Se sugiere que el eje de la propuesta sea preparar y consensuar una estrategia regional para la aplicacin de informacin genmica, generada por sistemas de alta productividad disponibles a nivel local e internacional, en procesos productivos basados en la expresin funcional de diferentes recursos genticos (vegetales, animales y microbianos) en los agro-ecosistemas existentes. La armonizacin de procedimientos bioinformticos que faciliten la integracin de mltiples fuentes de informacin para la integracin de emprendimientos conjuntos con la participacin de socios de diferentes pases (de Sudamrica y del mundo) y origen sectorial (empresas, institutos pblicos de investigacin, universidades y centros de excelencia), articulados en una estructura de tipo consorcio.

Se podrn definir proyectos especficos de genmica funcional, pero a la par establecer un proyecto de bioinformtica y otro de insumos para ingeniera gentica que vincularn transversalmente a cada proyecto. Los expertos en bioinformtica debern definir la naturaleza y operatividad de las posibles bases de datos que se construyan para cada proyecto (es decir, para cada especie). Por tanto, hay dos planos que se deben desarrollar paralelamente. Por un lado, los sistemas de secuenciamiento, microarreglos y protemica y por el otro, la bioinformtica y los insumos para ingeniera gentica dedicados a desarrollar herramientas comunes que sirvan a los intereses de cada grupo o proyecto.

1.4. DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES

Actualmente, las pruebas de diagnstico se han mejorado con el desarrollo de la biologa molecular. Los mtodos basados en la amplificacin del ADN mediante la PCR, la identificacin de secuencias de ADN especficas dentro del genoma, las tcnicas de purificacin de ADN y el establecimiento de mapas de restriccin, permiten la deteccin sensible y especfica de microorganismos patgenos prcticamente a partir de cualquier muestra biolgica.

Este tipo de diagnstico est siendo utilizado en enfermedades de gran impacto econmico como la tuberculosis, la brucelosis, la babesiosis, la leptospirosis en los bovinos, la fiebre porcina clsica, la iletis, el sndrome respiratorio y reproductivo de los cerdos (PRRS) o la influenza aviar.

La tcnica utilizada fue una variante conocida como "anidada" (nested PCR), la cual permite detectar el equivalente del ADN de una micobacteria. Los resultados obtenidos mostraron que la PCR puede ser de gran utilidad en el diagnstico de la tuberculosis bovina y debera utilizarse junto con la prueba de la tuberculina, la observacin de lesiones y el cultivo para lograr un diagnstico ms preciso de la enfermedad.

Por otra parte, los estudios epidemiolgicos de las enfermedades infecciosas han tenido gran avance en los ltimos aos gracias al desarrollo de tcnicas de biologa molecular que permiten diferenciar entre s cepas o aislados de los distintos microorganismos. Una de estas tcnicas es el anlisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP), basado en la presencia en el genoma de secuencias especficas, las cuales pueden repetirse varias veces y localizarse en distintas regiones, lo que da origen al polimorfismo.

La identificacin de estas regiones se realiza mediante la hibridacin con sondas especficas que las reconocen. La diferenciacin de cepas tambin puede hacerse mediante la secuenciacin de regiones especficas del genoma. Estas tcnicas han sido utilizadas para establecer rboles

genticos de aislados de distintos microorganismos lo que facilita el realizar seguimientos epidemiolgicos.

1.5. GLOSARIO APLICADO EN BIOTECNOLOGIA

ADN (cido desoxirribonucleico): Material gentico de todas las clulas y de muchos virus; la molcula que codifica la informacin gentica. El ADN es una molcula de cadena doble unida por enlaces dbiles entre pares de bases de nucletidos. Los cuatro nucletidos del ADN contienen las bases adenina (A), guanina (G), citosina y tiamina (T). En estado natural, los pares de bases se forman slo entre A y T, y G y C, por tanto, la secuencia de las bases de una de las dos cadenas se puede deducir de la otra.

Aminocidos: Los bloques ms bsicos de construccin de todas las formas de vida. Los aminocidos son molculas que contienen grupos funcionales de amino y carboxilo.

Anticuerpo monoclonal: Anticuerpo que se produce en masa en el laboratorio a partir de un solo clon y que reconoce slo un antgeno. Los anticuerpos monoclonales se suelen producir mediante la fusin de una clula B, de corta vida, productora de anticuerpos, con una clula de crecimiento rpido, como una clula cancerosa. La clula hbrida resultante, o hibridoma, se multiplica rpidamente y crea un clon que produce gran cantidad de anticuerpos.

Antgeno: En general, protena que se halla en la superficie del virus y que estimula la respuesta inmunitaria, en particular, la produccin de anticuerpos.

Autoensamblaje molecular: Ensamblaje de molculas sin direccin o intervencin externa. El autoensamblaje puede producirse espontneamente en la naturaleza, por ejemplo en clulas (como el de la membrana de doble capa lipdica) y otros sistemas biolgicos, as como en sistemas modificados con intervencin humana. Muchos sistemas biolgicos se valen de este procedimiento para ensamblar varias molculas y estructuras. La imitacin de estas estrategias y la creacin de nuevas molculas capaces de autoensamblaje supramolecular, es una importante tcnica de la nanotecnologa.

Bioinformtica: El uso de las matemticas aplicadas, la estadstica y la ciencia de la informtica para estudiar sistemas biolgicos. Importantes sectores de investigacin incluyen alineacin de secuencias, bsqueda de genes, ensamblaje del genoma, alineacin de la estructura de las protenas, prediccin de la estructura de las protenas, prediccin de la expresin de genes e interacciones entre las protenas.

Bioplaguicidas: Determinados tipos de plaguicidas derivados de materiales naturales, como animales, plantas, bacterias, y algunos minerales. Por ejemplo, el aceite de canola y el bicarbonato sdico se consideran bioplaguicidas.

Biotecnologa: Serie de tcnicas biolgicas obtenidas mediante la investigacin bsica y aplicadas a la investigacin y elaboracin de productos. La biotecnologa se refiere al uso de ADN recombinante, la fusin de clulas y nuevas tcnicas de bioelaboracin.

Cartografa gentica: Proceso para determinar el lugar que ocupan los genes en un cromosoma.

Clula: Unidad estructural y funcional bsica de todos los organismos. Las clulas contienen ADN y otros muchos elementos que permiten su funcionamiento. Clula pluripotencial: Clula indiferenciada capaz de replicarse indefinidamente. Una clula pluripotencial puede tambin producir clulas especializadas para diversos tejidos del cuerpo, como msculo cardaco, tejido cerebral y tejido heptico. Los cientficos pueden mantener

indefinidamente clulas pluripotenciales al convertirlas en las clulas especializadas que necesiten. Existen dos tipos bsicos de clulas pluripotenciales. El primero es la clula pluripotencial embrionaria, que se obtiene de fetos abortados o de vulos fertilizados sobrantes de la fertilizacin in vitro. Las clulas pluripotenciales embrionarias se usan para fines mdicos y de investigacin porque pueden producir clulas para casi todos los tejidos del cuerpo. El segundo tipo es la clula pluripotencial adulta, que no es tan verstil para fines de investigacin porque slo puede producir clulas para determinados tipos de material somtico, como la sangre, los intestinos, la piel y los msculos.

Celulasa: Complejo de enzimas que descompone la celulosa en beta glucosa. Se produce principalmente gracias a la accin de bacterias simbiticas presentes en el aparato digestivo de los herbvoros. Con excepcin de los rumiantes, la mayor parte de los animales (incluidos los seres humanos) no produce celulasa, por lo que no pueden aprovechar gran parte de la energa contenida en el material vegetal.

Colgeno: La protena principal del tejido conjuntivo y la ms abundante en los mamferos. Es el componente principal de ligamentos y tendones.

Corte y empalme de genes: Aislamiento de un gen de un organismo y su introduccin posterior en otro organismo mediante tcnicas de biotecnologa.

Cosecha tolerante a los herbicidas: Plantas de cosecha creadas para sobrevivir a las aplicaciones de uno o ms herbicidas comerciales mediante la incorporacin de determinados genes

por medios biotecnolgicos, tales como la ingeniera gentica o mtodos tradicionales de seleccin, como la mutacin natural, qumica o por radiacin.

Cromosomas: Estructura gentica de las clulas que contiene el ADN celular capaz de replicarse a s misma. Los seres humanos tienen 23 pares de cromosomas. Cry1A: Protena derivada de la bacteria Bacillus Thuringiensis, txica para algunos insectos cuando la ingieren. Esta bacteria es muy comn en la naturaleza y se ha usado durante decenios como insecticida, aunque constituye menos de dos por ciento del total de los insecticidas usados.

Cultivar: En botnica, planta obtenida o seleccionada deliberadamente y mantenida mediante cultivo.

Cultivo de tejidos: Proceso de obtencin de una planta en el laboratorio a partir de clulas en vez de semillas. Esta tcnica se utiliza en el cultivo tradicional de plantas y en la biotecnologa agrcola.

Derivado de la biotecnologa: El uso de la biologa molecular o tecnologa de ADN recombinante, o transferencia de genes in vitro, para elaborar productos o dotar de caractersticas concretas a plantas u otros organismos vivos.

Doble hlice: Estructura en forma de escalera helicoidal que adoptan dos cadenas de ADN cuando nucletidos complementarios en cadenas opuestas se enlazan.

Estudio del perfil de la expresin gentica: Mtodo de anlisis de la expresin de miles de genes simultneamente en una placa de cristal llamada micromatriz.

Expresin gentica: Proceso por el cual la informacin de un gen se convierte en las estructuras y funciones de una clula.

Flujo de genes: Transferencia de genes de una poblacin a otra de la misma especie, por migracin o dispersin de semillas y polen.

Gen: Unidad fsica y funcional fundamental de la herencia. Un gen es una secuencia ordenada de nucletidos que ocupan una posicin determinada en un cromosoma que codifica un producto funcional concreto, como una protena o una molcula de ARN.

Gentica: Estudio de las leyes de la herencia de determinadas caractersticas.

Genoma: Todo el material gentico de los cromosomas de un organismo determinado.

Gestin de la resistencia: Estrategias que se pueden emplear para retrasar la aparicin de la resistencia. En el caso de los insectos, estas estrategias incluyen el uso de un "refugio" en el que el insecto no est sometido a los efectos del pesticida usado en el resto del campo.

Hlice alfa: Estructura comn de protena que se encuentra, en particular, en el pelo, la lana, las uas y los cuernos de los animales, y que se caracteriza por una cadena espiral nica de aminocidos estabilizados por enlaces de hidrgeno.

Hbrido: Semilla o planta producida como resultado de polinizacin cruzada controlada, a diferencia de la resultante de la polinizacin natural. Las semillas hbridas se seleccionan para que tengan caractersticas de mejor calidad (por ejemplo, mayor rendimiento o tolerancia a las plagas).

Ingeniera gentica: Tcnica para eliminar, modificar o agregar genes a una molcula de ADN con objeto de cambiar la informacin que contiene. Al cambiar esta informacin, la ingeniera gentica cambia el tipo o la cantidad de protenas que puede producir un organismo, y de este modo le permite hacer nuevas sustancias o realizar nuevas funciones.

Lnea germinal: Lnea (secuencia) de clulas germinales que contienen material gentico que se puede transmitir a un hijo.

Maz Bt: Planta de maz obtenida mediante biotecnologa para que sus tejidos expresen una protena txica para algunos insectos, pero inocua para los seres humanos y otros mamferos.

Mquina molecular: Ensamblaje de un nmero diferenciado de componentes moleculares destinados a realizar una funcin concreta. Cada componente molecular realiza un solo acto, mientras que la estructura supramolecular total realiza una funcin ms compleja, resultante de la cooperacin de diversos componentes moleculares.

Mejora gentica tradicional: Modificacin de plantas y animales mediante la mejora selectiva. Las prcticas usadas en la mejora gentica tradicional de plantas pueden incluir aspectos de biotecnologa tales como cultivo de tejidos y mejora por mutacin.

Mejora selectiva: El cruce o apareamiento deliberado de organismos con objeto de que la progenie tenga una caracterstica deseada derivada de uno de los progenitores.

Molculas de ADN recombinante (ADNr): Combinacin de molculas de ADN de origen diverso, enlazadas mediante tecnologas de ADN recombinante.

Mutacin: Todo cambio en la secuencia del ADN que se pueda heredar.

Nanomedicina: Campo mdico que est avanzando rpidamente, en el que los cientficos elaboran una gran variedad de nanopartculas y nanodispositivos, de apenas una millonsima de pulgada de dimetro, para mejorar la deteccin del cncer, fortalecer las respuestas inmunitarias, reparar tejidos daados y evitar la arteriosclerosis. A principios del 2005, la Administracin de Alimentos y Frmacos de Estados Unidos aprob una nanopartcula fusionada al medicamento contra el cncer Taxol, para el tratamiento del cncer de mama avanzado. En Estados Unidos se est usando con carcter experimental otra nanopartcula en pacientes cardacos, para mantener abiertas las arterias coronarias despus de una operacin de angioplastia.

Nanmetro: Milmillonsima parte de un metro.

Nanotecnologa: Sistema para transformar la materia, la energa y la informacin, basado en componentes a escala nanomtrica, con caractersticas moleculares definidas con precisin. Tambin, las tcnicas que producen o miden caractersticas de menos de 100 nanmetros de tamao.

Nucletido: Componente celular que es uno de los bloques fundamentales de los cidos ribonucleico (ARN) y desoxirribonucleico (ADN). En los sistemas biolgicos, los nucletidos se enlazan mediante enzimas para formar largos polinucletidos semejantes a cadenas de secuencia definida.

Organismo modificado genticamente (OMG): Con frecuencia, la etiqueta OMG y el trmino "transgnico" se emplean para referirse a organismos que han adquirido genes nuevos de otros organismos mediante mtodos de transferencia gentica en laboratorios.

Patgeno: Agente causante de enfermedades, en particular un microorganismo vivo, como una bacteria o un hongo.

Pptido: Fragmentos de una protena, de dos o ms aminocidos en una cadena, semejante a brazaletes de cuentas. Cuando se digieren las protenas de la carne animal, se descomponen primero en pptidos y luego en sus aminocidos constitutivos.

Plaguicidas microbianos: Plaguicidas cuyo ingrediente activo es un microorganismo, por ejemplo una bacteria, un hongo o un protozoo. Los plaguicidas microbianos pueden controlar muchos tipos de plagas distintas, aunque cada ingrediente activo est relativamente dirigido contra una plaga concreta. Por ejemplo, algunos hongos controlan determinados tipos de malas hierbas y otros matan a determinados insectos. Los plaguicidas bacterianos ms usados son subespecies y cepas del Bacillus thuringiensis, o Bt.

Polen: Clulas portadoras del ADN masculino de una planta de simiente.

Polimorfismos de nucletido nico (SNP): Relaciones entre genes y poblaciones de prueba para conseguir variaciones en el cdigo gentico que puedan aumentar el riesgo de una enfermedad o respuesta determinada a un medicamento.

Productos basados en la biologa: Combustibles, productos qumicos, materiales de construccin, energa elctrica o trmica, derivados de materiales biolgicos. El trmino puede incluir cualquier producto energtico, comercial o industrial, distinto de alimentos o piensos, que utilice material biolgico o materiales agrcolas (vegetales, animales y marinos) o forestales, domsticos renovables.

Protectores para las plantas (PIP): Anteriormente conocidas como plaguicidas vegetales, son sustancias que actan como plaguicidas producidos o usados por una planta para protegerse de plagas tales como insectos, virus y hongos.

Protena de la membrana celular: Molcula protenica adherida o asociada a la membrana de una clula.

Protena: Molcula de gran tamao, compuesta por una o ms cadenas de aminocidos en un orden concreto. El orden est determinado por la secuencia de bases de nucletidos en el gen que codifica la protena. Las protenas son necesarias para la estructura, funcin y regulacin de las clulas, los tejidos y los rganos del cuerpo, y cada protena desempea una funcin singular. Ejemplos de protenas son las hormonas, las enzimas y los anticuerpos.

Protemica: Uso de tecnologas como la espectrometra en masa para detectar marcadores biolgicos protenicos en la sangre que pueden indicar seales tempranas de enfermedades, incluso antes de que aparezcan los sntomas. Uno de estos marcadores es la protena C reactiva, indicadora de cambios inflamatorios en las paredes de los vasos sanguneos que presagian arteriosclerosis.

Reaccin en cadena de polimerasa (PCR): Tcnica para copiar y ampliar las cadenas complementarias de una molcula determinada de ADN. Es un mtodo in vitro que ampla en alto grado o hace millones de copias de secuencias de ADN que, de otro modo, no podran ser detectadas o estudiadas.

Recombinacin: Proceso por el cual la progenie hereda una combinacin de genes distinta de la de sus progenitores.

Resistencia a los plaguicidas: Cambio gentico en respuesta a la seleccin por un plaguicida que da por resultado la formacin de cadenas capaces de sobrevivir a una dosis letal a una mayora de individuos en una poblacin normal. La resistencia se puede producir en insectos, malas hierbas y patgenos.

Seleccin natural: Concepto ideado por Charles Darwin, segn el cual, los genes que producen las caractersticas ms favorables en un entorno determinado sern ms abundantes en la generacin siguiente.

Tecnologa de ADN recombinante: Procedimiento usado para unir segmentos de ADN en un sistema acelular (entorno situado fuera de una clula u organismo). En condiciones apropiadas, una molcula de ADN recombinante puede entrar en una clula y replicarse all, bien sea de manera autnoma o despus de haberse integrado en un cromosoma celular.

Terapia gentica: Tcnica mdica experimental consistente en la insercin de genes en las clulas y los tejidos de un individuo para tratar una enfermedad. Normalmente, un gen defectuoso se reemplaza por otro que funciona normalmente. En la mayora de los casos, el gen normal se introduce en los tejidos mediante un adenovirus alterado genticamente para asegurar su inocuidad.

Transferencia de genes: Tcnica comn en biologa molecular para provocar un cambio gentico mediante la toma y recombinacin de ADN.

Transgnico: Organismo que contiene genes modificados por la insercin de ADN de un organismo extrao. Se produce cuando genes extrados de una especie se insertan en otra especie para obtener una caracterstica determinada expresada en la progenie.

Variedad: Subdivisin de una especie para su clasificacin taxonmica. Usado como sinnimo del trmino "cultivar", designa a un grupo de individuos genticamente distinto de otros grupos de individuos de la misma especie. Una variedad agrcola es un grupo de plantas similares que, por sus caractersticas estructurales y comportamiento, pueden distinguirse de otras variedades de la misma especie.

Virus: Entidad biolgica no celular que slo puede reproducirse dentro de una clula husped. Los virus consisten en cido nucleico recubierto de protena. Algunos virus animales tambin estn recubiertos de una membrana. Dentro de la clula infectada, el virus se vale de la capacidad sinttica del husped para su replicacin.

II. INTRODUCCIN AL CULTIVO IN VITRO2.1. GENERALIDADES

El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una tcnica de reproduccin en condiciones totalmente aspticas, en la que a partir de un pequeo segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estmulo por medio de variables fsicas y qumicas controladas en un medio de cultivo.

A diferencia de las tcnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagacin de grandes volmenes de plantas en menor tiempo; as como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la tcnica es de gran utilidad en la obtencin de plantas libres de patgenos; plantas homocigotos, en la produccin de plantas en peligro de extincin, en estudios de ingeniera gentica, etc. El enorme potencial que posee esta metodologa ha propiciado que en los ltimos 25 aos se haya incrementado el nmero de laboratorios de cultivo de tejidos en el pas para la produccin comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estn utilizando como una alternativa viable en sus programas de produccin.

El cultivo in vitro (trmino que literalmente significa en vidrio), incluye muchas tcnicas destinadas a introducir, multiplicar y regenerar, entre otros recursos, material vegetal o animal en condiciones controladas y aspticas. El cultivo in vitro, constituye un paso fundamental en la obtencin y regeneracin de plantas genticamente modificadas o transgnicas, mediante tcnicas de ingeniera gentica. Es decir que existe una estrecha relacin entre el cultivo de tejidos vegetales y la

biotecnologa moderna. Normalmente se utilizan cultivos de tejidos, seguido de la regeneracin de la planta completa, y la subsiguiente expresin de los genes introducidos o transgenes.

2.2. CULTIVO IN VITRO DE MATERIAL VEGETAL

Cultivo de tejidos vegetales, es una descripcin genrica que involucra diferentes tcnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo las de protoplastos (clulas desprovistas de su pared celular), clulas, tejidos, rganos y plantas completas. Mediante stas y otras tcnicas de cultivo es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo asptico (estril) en condiciones ambientales controladas.

Las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recin en 1922 se logr el primer experimento exitoso: germinacin in vitro de semillas de orqudeas. Luego

de la germinacin, las plntulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones aspticas y as se mantuvieron protegidas del ataque de patgenos (hongos, virus y bacterias).

Esta tcnica tiene numerosas aplicaciones:

- Propagacin masiva de plantas, especialmente beneficiosa para especies de difcil propagacin por otros mtodos, o en vas de extincin. - Clonacin de individuos de caractersticas agronmicas muy deseables durante todo el ao - Obtencin de plantas libres de virus. - Produccin de semillas sintticas. - Conservacin de germoplasma: material de un conjunto de individuos que representa la variabilidad gentica de una poblacin vegetal. - Obtencin de metabolitos secundarios. - Produccin de nuevos hbridos. - Mejora gentica de plantas, incluyendo obtencin de plantas transgnicas. - Germinacin de semillas. - Produccin de haploides. - Estudios fisiolgicos diversos. Algunas de estas aplicaciones se ilustran en la Figura 1.

Figura 1. Aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. A la izquierda, micropropagacin de violeta africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de esterilidad. A la derecha, semillas sintticas formadas por embriones somticos, obtenidos por cultivo de clulas, encapsulados en una matriz inerte (como alginato de calcio). Fotografa tomada de http://www.sp.edu.sg/schools/cls/bioline_08.htm

2.3. BASES BIOLGICAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS, TOTIPOTENCIALIDAD CELULAR

Antes de comenzar con la descripcin del cultivo de tejidos vegetales y sus aplicaciones, se muestra la anatoma de una planta en la figura 2.

Figura 2: las partes de una planta angiosperma. Adaptado del Libro Biotecnologa, UNQ 2006.

Respecto del proceso de transformacin vegetal, existen distintas tcnicas para la transferencia de genes a las clulas vegetales, siendo las principales la interaccin con bacterias del gnero Agrobacterium y el mtodo de Biobalstica. Una vez realizada la transformacin gentica por alguno de estos dos mtodos, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de regenerar plntulas a partir del explanto inicial transformado, proceso que se sustenta en el principio de totipotencialidad celular. De aqu la importancia del cultivo in vitro como paso fundamental para la obtencin y regeneracin de plantas genticamente modificadas (ver figura 3).

Figura 3. Cultivo de tejidos y transformacin vegetal. En la figura se observan explantos que luego del proceso de seleccin han perdido coloracin y aquellas clulas transformadas exitosamente se han desdiferenciado y rediferenciado para dar origen a un brote.

La reproduccin asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las clulas de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningn tipo de fusin de clulas sexuales o gametos.

Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular y es caracterstica de un grupo de clulas vegetales conocidas como clulas meristemticas, presentes en distintos rganos de la planta. Bsicamente, la reproduccin asexual se puede realizar debido a que las clulas vegetales poseen un

mecanismo de divisin mittico, al igual que las clulas animales, mediante el cual cumplen sucesivas etapas de crecimiento y desarrollo. La divisin celular mittica implica una replicacin de los cromosomas de las clulas hijas, por lo que las mismas poseen un genotipo idntico al de la clula madre. La potencialidad de una clula diferenciada (una clula de conduccin, epidrmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciacin alcanzado por esa clula, pero puede revertirse parcial o completamente segn las condiciones de cultivo a las que se la someta.

As, las clulas vegetales crecidas en condiciones aspticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta:

- Una desdiferenciacin celular acompaada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de clulas indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar rganos o embriones somticos (llamados as porque son estructuras similares a un embrin pero que no se originaron por unin de gametos).

- Una respuesta morfogentica por la cual se forman directamente rganos (organognesis) o embriones (embriones somticos).

La primera respuesta se conoce como rgano gnesis o embriognesis indirecta (mediada por un estado de callo), mientras que la segunda respuesta se considera rgano gnesis o embriognesis directa.

Como se coment previamente, el cultivo in vitro consiste en tomar una porcin de una planta (a la que se denomina explanto, como por ejemplo el pice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrin, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estril (usualmente gelificado, semislido) donde se regenerar una o muchas plantas.

La formulacin del medio cambia segn se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y races u obtener embriones somticos para producir semillas artificiales. El xito en la propagacin de una planta depender de lograr la expresin de la potencialidad celular total, es decir, que algunas clulas recuperen su condicin meristemtica. Para lograrlo debe inducirse primero la desdiferenciacin y luego la rediferenciacin celular. Un proceso de este carcter sucede durante la formacin de las races adventicias en el enraizamiento de estacas, la formacin de yemas adventicias o cuando se busca la propagacin de begonias, violeta africana (ver figura 1) o peperonias mediante porciones de hojas. Entre los factores ms importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogentica deseada, es la composicin del medio de cultivo.

En todo intento de propagacin vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carcter del proceso de diferenciacin depende del genoma de la especie y est regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiolgico del rgano, tejido o clula puesta en cultivo. Sin embargo, tambin se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la accin de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagacin de una planta.

2.4. PASOS PARA GENERAR PLANTAS A PARTIR DE EXPLANTOS AISLADOS

En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro se pueden distinguir las siguientes etapas, sintetizadas en la figura 4: - Eleccin de la planta y/o tejido donante de explantos. - Establecimiento: desinfeccin de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su

posterior adaptacin al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raz o embrin somtico, segn se desee. - Multiplicacin: generar una masa vegetal suficiente para la regeneracin del nmero de plantas necesarias. - Enraizamiento: formacin de races con el fin de convertir los brotes o embriones somticos en plntulas completas. - Rusticacin: aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las condiciones medioambientales ex vitro (suelo o algn sustrato inerte) Figura 4. Etapas de la regeneracin in vitro de maz.

Fuentes: http://www.cid.csic.es/departaments/genetica/torne/indexC.html y http://www.biologie.unihamburg.de/b-online/e28_2/maize.html

El xito de la tcnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de regeneracin), el genotipo y las condiciones medioambientales. Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal se pueden incluir los tiempos ms cortos y la posibilidad de ocupar un espacio mucho ms pequeo que si se desea propagar material in vivo.

2.5. ELEMENTOS NECESARIOS PARA HACER CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Para llevar adelante este trabajo se necesitan equipamientos que generen las condiciones necesarias de esterilidad como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estril, protegiendo as a la muestra con la que se desea trabajar (figura 5).

Figura 5. Flujos laminares para el cultivo de tejidos. Se observa uno de los modelos de flujo laminar que puede usarse para preservar la esterilidad de las muestras. Imagen: www.jaelsa.com/laboratorio4.html

Adems, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser slido o lquido y que est conformado por algn agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales (ver Tabla 1), que ayudarn a obtener una planta completa o un rgano vegetal en particular, a partir del explanto elegido (en condiciones de esterilidad). Algunos de los elementos mencionados pueden ser reemplazados por mezclas poco definidas en su composicin (jugo de tomate, agua de coco, etc.), que pueden dar buenos resultados y generalmente resultan ms econmicas. La acidez de los medios de cultivo para plantas suele variar entre pH de 5 y 6,5. Luego, se regulan las condiciones de temperatura y de fotoperodo (relacin de horas luz y horas oscuridad). Segn sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo se puede propiciar la regeneracin de distintos rganos o formaciones vegetales. Por ejemplo, si el balance de citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es mayor a 1, se favorece la generacin de brotes, si es menor a 1, la generacin de races, si es igual a 1, la formacin de callos.

Tabla 1. Composicin de medios de cultivo para clulas vegetales.

COMPONENTES Agua destilada

CARACTERSTICAS Y EJEMPLOS Representa el 95% del medio nutriente

Fuente de carbono

Generalmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita porque los explantos no son completamente auttrofos y no pueden cubrir sus necesidades con la fotosntesis que pueden realizar in vitro.

Sustancias inorgnicas

Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporcin adecuada para la planta elegida.

Vitaminas

Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, cido flico, cido nicotnico, entre otras.

Hormonas y reguladores del crecimiento

Auxinas: promueven la elongacin celular, la formacin de callos y races adventicias, inhiben la formacin de brotes axilares adventicios y, a veces, inhiben la embriognesis. Citoquininas: promueven la divisin celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales Otras: giberalinas, cido abscico, etileno.

Mezclas de sustancias poco definidas

Ejemplos: extracto de levadura, extractos vegetales.

Materiales inertes

Usados como soporte. Incluyen agar, azarosa, otros polisacridos, lana de vidrio, papel de filtro, arena.

Adaptada del Libro Biotecnologa, UNQ 2006.

2.6. RELACIN DEL CULTIVO IN VITRO CON LA BIOTECNOLOGA

2.6.1. La Micropropagacin

La propagacin de plantas in vitro es una tcnica de la biotecnologa muy utilizada en cultivos de importancia econmica. Como fue mencionado anteriormente permite cultivar clulas, tejidos, rganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma rpida. Los cultivos son realizados por personal especializado, con agentes especficos (hormonas, minerales, vitaminas,

fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y en condiciones ambientales controladas

(temperatura, humedad y luz) (figura 6). Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de inters, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo a escala industrial.

La micropropagacin (propagacin clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los mtodos biotecnolgicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la produccin masiva de especies hortcolas, aromticas, medicinales, frutcolas, ornamentales y forestales.

2.6.2. Ventajas de la micropropagacin

- Posibilita incrementar rpidamente nuevos materiales. - Permite controlar las condiciones ambientales. - Permite estudiar diversos procesos fisiolgicos. - Evita el riesgo de que proliferen agentes patgenos (se realiza en medios esterilizados). - Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos. - Permite la obtencin de individuos uniformes. - Facilita el transporte del material.

Figura 6. La micropropagacin vegetal. A partir de una planta madre se obtienen numerosos explantos que sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darn lugar a nuevas plantas iguales o similares a la planta original, permitiendo su multiplicacin. Adaptado de Biotecnologa, UNQ 2006.

2.6.3. Cultivo de meristemos

En la yema apical se encuentra un grupo de clulas que conforman el meristemo apical (con un tamao entre 0,01 y 0,3 mm). Es un tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta y regenerar plantas completas (figura 7).

Figura 7. Cultivo de meristemos. A partir de un meristemo aislado se puede obtener una planta completa. Adaptado de Biotecnologa, UNQ 2006.

El cultivo de meristemos tiene numerosas aplicaciones. Una de las ms importantes es la obtencin de plantas libres de virus, ya que esta pequea zona de tejido generalmente no est afectada por estos patgenos vegetales. Otra aplicacin es la multiplicacin vegetal de enorme potencial. A partir de una yema apical se pueden obtener 4 millones de claveles en un ao. La tcnica permite multiplicar especies de plantas con reproduccin lenta o dificultosa (como las orqudeas) o acelerar la produccin de plantas bianuales.

2.7. CULTIVO DE CLULAS Y RGANOS VEGETALES EN BIORREACTORES

Una vez obtenidos los callos a partir de algn explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una suspensin de clulas. La misma puede utilizarse para generar embriones somticos (la base de las semillas sintticas) o puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que son compuestos qumicos sintetizados por las clulas vegetales en determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacutica y alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y las drogas anticancergenos vincristina y taxol, algunos edulcorantes, entre otros. Los cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad (de unos pocos a miles de litros) diseados para propiciar el crecimiento y/o la multiplicacin de distinto tipo de clulas y/u rganos (figura 8).

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Figura 8. Cultivo de clulas y rganos vegetales. A partir de un explanto se pueden establecer cultivos de clulas para producir compuestos de inters o para obtener embriones somticos y semillas artificiales, entre mltiples aplicaciones. Adaptado de Biotecnologa-UNQ, 2006.

Las races vegetales tambin pueden ser cultivadas en biorreactores, especialmente aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes, que producen un aumento abrupto en el tamao y ramificacin de la raz, aumentando as la biomasa, y por ende la cantidad de producto deseado. Un ejemplo de compuesto farmacolgico producido por cultivo de races es el paclitaxel o taxol, que es utilizado como anticancergeno.

2.8. ASPECTOS RELEVANTES EN EL CULTIVO IN VITRO

El cultivo in vitro es muy costoso, entre otros detalles porque no se puede mecanizar. Slo son rentables aquellos laboratorios grandes y con mercado. La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatacin en el laboratorio; en el invernadero y despus una segunda aclimatacin en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros slo se encargan del primer paso.

Figura 9. Fase de aclimatacin en invernadero

2.8.1. Aplicaciones prcticas en el cultivo in vitro Propagacin vegetativa. Esto es lo ms prctico. Dos tcnicas: - Micropropagacin de estaquillas - Organognesis de callos Produccin de plantas libres de virus mediante dos tcnicas: - Cultivo de meristemos - Microinjerto in vitro Permite hacer germinar semillas que son muy difcil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orqudeas tienen en los campos unos parsitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parsitos o in vitro. Eliminar la inhibicin de germinacin de las semillas. El cultivo in vitro es lo ms eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrin. Prevencin del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de inters cientfico o intergenticos, sobre todo en plantas herbceas. Los cruces incompatibles dan abortos.

Aplicacin en mejora gentica para obtener hbridos, para introducir material gentico, etc. Acortar los ciclos de mejora gentica. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del rbol para ver resultados.

Produccin de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Teniendo ventajas como la obtencin rpida de homocigotos y produccin de hbridos.

2.8.2. Equipo y material necesario empleado en el cultivo in vitro - Autoclave - Cmara de flujo laminar - Medio de cultivo - Planta - Cmara de cultivo

Figura 10. Autoclave

Para esterilizar todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. se utiliza la cmara de flujo laminar. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presin, pero de mayor tamao, donde se controla la presin y la temperatura (hasta 120).

Figura 11. Cmara de flujo laminar.

El medio de cultivo es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitculo con un operario en un ambiente estril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.

Figura 12. Medio de cultivo.

Se verte agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapn. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado.

Figura 13. Planta.

El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminacin, aunque se lave mucho y bien. Lo ms corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla menos infecciones. La cmara de cultivo es una habitacin de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variacin da-noche, etc.

Figura 14. Cmara de cultivo.

2.8.3. Condiciones del cultivo in vitro En la cmara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema ms importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones. En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibiticos, cido giberlico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas. El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias.

Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo.

El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Se necesita agar y medio slido 0,6-0,9%. El medio de cultivo realmente slo tiene que llevar agua, fuente de energa (azcares) y reguladores de crecimiento.

El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos aos en prepararlo. En la cmara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). Tambin existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas tambin varan. Lo normal son 22-26C, aunque en ocasiones se exigen fros de 4C y tambin 28-30C para plantas tropicales.

Igualmente, en el xito de esta tcnica de propagacin tambin influyen determinadas caractersticas de la planta, como el tipo, gentica e incluso el tipo de implante, parte ms juvenil o ms adulta.

En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la prdida de agua, lo que provocara un aumento de la concentracin de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ah la importancia del cierre.

2.8.4. Subcultivos o replicado Cuando sembramos microestaquillas en cultivo in vitro, no nos interesa que se emitan races ni hojas, sino que se produzca una proliferacin (crecimiento) para obtener nuevas microestaquillas. Son lo que se denominan subcultivos. No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal; tan slo se hace 8-10 veces. Ocurre entonces lo siguiente: - El medio nutritivo se agota y se seca. - El material vegetal ocupa todo el tubo. - Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias txicas). - El medio se hace lquido.

2.8.5. Fases del cultivo de meristemos 1. Toma un pice meristemtico (0,2-1 mm). 2. Siembra en el medio del tubo. 3. Fase de proliferacin: crecimiento de brotes. Subcultivos. 4. Fase de enraizamiento (cambiar el medio). 5. Primera fase de aclimatacin. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plstico, bandejas de vidrio, etc. 6. Segunda fase de aclimatacin. Siempre en invernadero. 7. Plantacin en el campo. 2.8.6. Fases del cultivo de embriones Se utiliza mucho en manzano. 1. Se desinfecta el fruto en alcohol. Se flamea. 2. Se coge el embrin de la semilla. 3. Se inocula en el tubo. 4. A las 1-2 semanas, la planta est ms o menos reconocible. 5. Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatacin. 2.8.7. Micropropagacin

Figura 15. Se parte de una yema, brctea o axilar y se empieza a desarrollar en el medio de cultivo

Entre la fase de proliferacin y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener ms plantas). El nmero de subcultivos depende del material vegetal. Ejemplo de micropropagacin de Kiwi: - Se parte de un trozo de tallo. - Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote. - En la fase de proliferacin intentamos obtener gran cantidad de brotes. - Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas vidrio. hasta llenar el

- Al aumentar la concentracin de auxinas se obtienen plantas enraizadas. - Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo. 2.8.8. Cultivo de callo in vitro Se parte de un trozo de hoja o de tallo, bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro. El medio puede ser slido o lquido.

Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o tambin proembriones, que al unirse forman una estructura similar al embrin. A partir de entonces se desarrolla normalmente. 2.8.9. Obtencin de plantas haploides Normalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. No se riega nunca por aspersin (riesgo de patgenos), siempre con regadera. De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriognesis u organognesis. - Embriognesis: se forman clulas (poliembriones). - Organognesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide).

2.8.10. Problemas en el cultivo in vitro

Figura 16. Contaminacin grave.

La vitrificacin, es una reaccin de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio. La nica solucin es hacer un subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estn bien.

2.9. CONSIDERACIONES METODOLGICAS

El tema desarrollado en este mdulo se vincula con conceptos previos que los alumnos poseen, probablemente de la vida cotidiana, como es la multiplicacin de plantas que pueden realizar en su propio jardn o huerta. Es importante retomar en clase estas ideas previas y trabajarlas a partir de los conceptos tericos que se presentan en el mdulo. Esto se ver favorecido con el anlisis de textos y con la realizacin de un trabajo prctico, el cual puede llevarse a cabo en la Universidad con materiales cotidianos y en forma sencilla.

Si estos temas se incluyen al trabajar el tema reproduccin, es interesante que los alumnos puedan establecer similitudes y diferencias entre los diferentes tipos y mecanismos de reproduccin que presentan las plantas y los animales. Se pueden incluir conceptos tales como: rganos reproductivos, clulas sexuales, meiosis, mitosis, fecundacin, gestacin, semilla, tero, etc.

Los temas vinculados con las plantas y su crecimiento se abordan habitualmente desde los niveles bsicos de la enseanza universitaria, particularmente a partir de experiencias de germinacin de semillas o del estudio de la fotosntesis. Sin embargo, los conceptos vinculados con el ciclo de vida de las plantas suelen ser temas complejos y que en ocasiones llevan a errores conceptuales. Entre ellos uno de los ms frecuentes entre los alumnos es la confusin entre los procesos de fotosntesis y respiracin en las plantas, o la poca claridad en cuanto a la relacin entre la flor, el fruto y la semilla.

Si bien este mdulo no est destinado especficamente a trabajar esos conceptos, es importante clarificarlos, y se pueden incorporar al estudiar la reproduccin en animales, en el ser humano, y comparar las estructuras y procesos que involucran. La comprensin de estos procesos permite interpretar cmo la biotecnologa podra intervenir en su modificacin.

Otro aspecto que es posible trabajar con los alumnos es el concepto mismo de la clonacin. Habitualmente se considera la clonacin una tcnica nueva debido fundamentalmente a la difusin que recibi en los medios de comunicacin la clonacin de la oveja dolly. Es interesante interpretar la clonacin de plantas como un procedimiento antiguo (que de hecho realizan en sus casas al cortar un gajo de una planta) y a su vez plantear las diferencias que presenta con la clonacin de animales, cuyas clulas difieren en cuanto a su totipotencialidad.

Este mdulo, a su vez, resulta una fuente interesante de informacin que se puede adaptar al aula en trabajos ms simples destinados a comprender cmo trabajan los investigadores, cmo se realiza un cultivo de clulas y cmo es posible observar clulas. Se sugiere introducir estas ideas a partir de conocimientos ms cotidianos que tienen los alumnos. Por ejemplo, es posible que a muchos alumnos se les haya practicado en alguna oportunidad un exudado de fauces, como consecuencia de una infeccin o dolor de garganta.

Se puede utilizar este caso para explicar, qu hace luego el mdico con esa muestra, cmo se hace el cultivo de clulas en el laboratorio de anlisis, la deteccin de bacterias y la realizacin de un antibiograma para determinar el antibitico a recetar. Esta sera una aplicacin prctica y ms

prxima a los alumnos que podra acercar el concepto de cultivo de clulas y su utilidad, ms all de su uso en la investigacin bsica. Para trabajar estas ideas se sugiere realizar una experiencia simple de cultivo de microorganismos.

Si se cuenta con microscopios se puede intentar hacer un preparado a partir de esas colonias y verlo al microscopio con la idea de detectar clulas individuales, y si en la escuela cuentan con preparados de clulas, vegetales o animales, es interesante realizar la observacin al microscopio, el registro de lo observado y su interpretacin.

III. OBTENCIN DE SEMILLA CERTIFICADA3.1. INTRODUCCIN Despus de la tierra, el clima y el hombre, el factor de mayor importancia para la produccin agropecuaria lo constituyen las semillas de las diferentes especies vegetales ya que, la semilla es el medio por el cual se lleva al agricultor todo el potencial gentico de un cultivar con caractersticas superiores.

Por ello para que una semilla realmente tenga impacto en la agricultura, es necesario que, adems de ser de alta calidad y de una variedad mejorada, sea usada largamente por los agricultores, de esta manera aumentar la produccin y productividad, ayudar a una utilizacin ms eficiente de insumos debido a una mayor uniformidad de emergencia y vigor de plantas. Si bien es cierto la forma de multiplicacin vegetativa es ventajosa por que permite mantener las caractersticas propias de la variedad por generaciones, no es menos cierto tambin que es una fuente eficaz para la diseminacin de plagas y enfermedades que afectan grandemente a los cultivos.

3.2. OBTENCIN DE EMBRIONES SOMTICOS PARA PRODUCCIN DE SEMILLAS CERTIFICADAS

Las averiguaciones que se realizan en diversos centros de investigacin, se orientan a obtener variedades con resistencia a determinadas enfermedades, utilizando suspensiones celulares que regeneran embriones somticos y sobre este material se aplican distintos mtodos de seleccin conteniendo extractos crudos de los patgenos responsables de dichas enfermedades. Las plantas inicialmente seleccionadas fueron inoculadas adicionalmente a nivel de vivero, siendo los primeros desarrollos muy promisorios.

Muy poco se ha hecho en embriognesis somtica en relacin con plantas ornamentales, debido a que el producto es costoso y el requisito de homogeneidad en la poblacin es alto. Estas especies

preferentemente son propagadas por mtodos menos costosos, como la proliferacin de brotes axilares, microesquejes, yemas, meristemos, etc.

Por otra parte, la embriognesis somtica tiene poco uso actualmente en plantas arbreas importantes en la agricultura, ya que se requieren estudios bsicos, pruebas de largo plazo para verificar la estabilidad gentica y la necesidad de optimizar los protocolos de germinacin de los embriones somticos.

3.3. MULTIPLICACIN Y MANTENIMIENTO DE SEMILLAS

Cuando un fitomejorador desarrolla una variedad puede asegurar que las caractersticas que ha mejorado son genticamente estables. Sin embargo, mantener las caractersticas genticas de la variedad mejorada mientras se multiplica la semilla, es una obligacin adicional de cualquier programa de semillas bien estructurado.

Durante la produccin de semilla, el control de calidad es la base central de la actividad. En todas las fases, desde la multiplicacin, acondicionamiento y almacenamiento hasta la distribucin y mercadeo, se deben realizar peridicamente pruebas e inspecciones que garanticen un control adecuado del proceso. Este control se realiza bajo dos esquemas: el primero consiste en un sistema de multiplicacin de generaciones y el segundo en la verificacin cualitativa de esas semillas.

En el primer esquema, el control de la pureza varietal se alcanza mediante la multiplicacin de un nmero limitado de generaciones, en el cual la semilla es incrementada a partir de la clase gentica, que luego pasa al Programa de Certificacin de Semilla para producir semilla de fundacin, preservando as la pureza.

Posteriormente, esta semilla se entrega a los productores autorizados para su multiplicacin y obtencin de semilla registrada y certificada. Bajo este sistema, la tercera generacin o semilla certificada es usualmente la semilla destinada a la produccin del cultivo comercial.

El segundo esquema se rige por dos fases sucesivas; la primera mediante inspecciones de campo y la segunda por verificaciones en el laboratorio, a travs de pruebas de anlisis de semillas, en donde las evaluaciones bsicas, certifican la idoneidad del material en cuanto a su pureza gentica o varietal, la humedad, la germinacin y la pureza fsica.

3.4. CONTROL DE CALIDAD DE SEMILLAS

La calidad de la semilla est determinada por la combinacin de diferentes indicadores: genticos (identidad varietal), fsicos (aspecto de la semilla), fisiolgicos (vigor, germinacin y longevidad) y sanitarios (libre de plagas y enfermedades) que pueden afectar de una u otra forma el desarrollo normal de la planta en el campo. La determinacin de la calidad mediante la utilizacin de diferentes tcnicas es importante en la produccin de cualquiera de las cuatro clases de semillas, evitando los efectos adversos que pueden presentarse en la introduccin de nuevos materiales que no cumplen con todos los requisitos.

La pureza varietal es la caracterstica que garantiza el alcance de la uniformidad comercial del producto, utilizando para ello plantas con el mismo grado de maduracin y resistencia a las situaciones desfavorables parasitarias y climticas. Por lo tanto, cualquier grado de contaminacin varietal presente en las semillas, puede ser debido a la mezcla ocasional con semillas de otras variedades, presencia de granos rojos, caripsides procedentes de fenotipos cuyas caractersticas morfofisiolgicas no son estables, y/o plantas que estn segregando. Esto es consecuencia de cruzamientos entre individuos genticamente diferentes o por mutaciones, que pueden ser verificadas en las fases reproductivas precedentes. Las empresas de semillas deben chequear rutinariamente la pureza de sus variedades para evitar vender lotes de semillas con niveles inaceptables de contaminacin, usando un control de calidad estricto para las dos primeras clases, gentica y

fundacin, donde cualquier falla en la obtencin de mezclas varietales o malezas, puede traer graves consecuencias en los pasos siguientes de multiplicacin. Cuando la semilla es multiplicada pueden ocurrir algunos cambios, bien sea debido a la

contaminacin con polen de otras variedades, o por contaminacin fsica o mecnicas debido a un manejo inadecuado durante las labores de campo, cosecha, procesamiento y almacenamiento. Es prcticamente imposible identificar una variedad con solo mirar la semilla o la plntula; para ello, se requerir una descripcin verdaderamente efectiva a travs de la observacin del crecimiento y desarrollo de la planta desde el estado de semilla hasta la maduracin. Sin embargo, la mayora de los mtodos comunes basados en el fenotipo requieren algunos meses para la obtencin de resultados y espacio para su ejecucin. Esto ha llevado a que, durante los ltimos 10 aos, se hayan desarrollado como alternativas ventajosas, diversos mtodos bioqumicos para la evaluacin de la pureza gentica, como parte de un programa de aseguramiento de la calidad de la semilla, las cuales son usados extensivamente por numerosas organizaciones en algunas hortalizas, maz, arroz, caraota, trigo, algodn y girasol.

3.5. ELEMENTOS DE UN PROGRAMA DE SEMILLAS

En un programa de semillas debidamente organizado desde la investigacin, hasta que el producto final sea consumido, la semilla tiene que pasar por la produccin de diferentes categoras, es decir, semilla prebsica, semilla bsica, semilla registrada, semilla certificada para finalmente llegar al agricultor quien producir y entregar el producto al consumidor final.

Siguiendo esta cadena, es misin del ente creador de las variedades producir las categoras altas, es decir prebsico, bsicas y registradas, y las empresas productoras de semillas son las encargadas de multiplicar la categora certificada. La fiscalizacin del comercio de semilla, la hace el Ministerio de Agricultura en las categoras bsica, registrada y certificada y, en el caso de que exista dficit de semillas certificadas la ley como en todos los pases, contempla que los productores autorizados puedan multiplicar la categora seleccionada o fiscalizada. Un programa de semillas debidamente

organizado proporcionar las semillas de las variedades mejoradas es decir aquellas que tienen caractersticas superiores de rendimiento, resistencia a plagas y enfermedades, precocidad, etc., y que estn a disposicin de los agricultores para sean ampliamente utilizadas por ellos.

Como se puede apreciar, los componentes de un programa de semillas estn ntimamente ligados, de tal forma que si uno de ellos no funciona el programa se tornar ineficiente. La nter ligacin armoniosa entre los diversos componentes requiere principalmente que exista un esfuerzo a todo nivel con la participacin del sector pblico y privado; que exista una efectiva coordinacin, colaboracin y confianza entre los participantes y, es claro que no habr una industria fuerte de semillas sin un eficiente mejoramiento vegetal ya que la semilla es el medio por el cual se lleva al agricultor todo el potencial gentico de una variedad con caractersticas superiores.

3.6. PRODUCCIN DE SEMILLA CERTIFICADA DE PAPA

En general, la papa se propaga en forma asexual, mediante la multiplicacin de los tubrculos o secciones de los mismos, que favorecen la diseminacin de ciertas enfermedades sistmicas, ocasionando disminucin de los rendimientos en las parcelas de los agricultores y de la calidad del producto ofertado a los consumidores.

Los tubrculos-semilla constituyen el insumo estratgico para la produccin comercial de papa, cuyo rol se refuerza con la percepcin por parte de pequeos agricultores sobre su importancia en la determinacin de los niveles de rendimiento. Es as como en muchos pases de Amrica Latina se definen los rendimientos en relacin con la cantidad de semilla plantada, constituyendo en muchos casos el factor restrictivo ms importante para la produccin de papa.

Cuando la semilla se importa desde pases productores, se genera y desarrolla circunstancias poco beneficiosas para el pas importador, como son:

- Introduccin de nuevas plagas y diseminacin de enfermedades en forma latente, con el consecuente impacto ambiental. - Subsidio a una agricultura extranjera por la fuga de divisas. - Aumento del costo de produccin por incremento de la devaluacin del bolvar y por el combate de plagas y enfermedades de importancia econmica. - Deterioro de la calidad de vida en las reas agrcolas por el desaprovechamiento de una fuente de trabajo y un campo de desarrollo hacia donde pueden dirigir su actividad nuestros agricultores.

3.6.1. Produccin de semilla prebsica

MULTIPLICACIN DE PLANTAS IN VITRO.

La tcnica del cultivo in vitro entre otras aplicaciones, est siendo usada para la produccin de plantas genticamente idnticas, multiplicacin rpida y para la obtencin y mantenimiento de material libre de virus y de otros patgenos.

Las plantas in vitro se multiplican en un laboratorio o unidad de replicacin, donde se aplican normas de bioseguridad "A", donde est prohibido almacenar alimentos, beber, comer y fumar, y es obligatorio el uso de batas limpias. Las plantas in vitro deben ser producto de un material in vitro procedente del CIP (Centro Internacional de la Papa). Se utiliza el medio de cultivo desarrollado y modificado por el CIP, el cual contiene sales minerales de diferentes nutrientes, vitaminas y hormonas. A cada tubo de vidrio se le aaden 5 mI del medio de cultivo mencionado y se esteriliza en autoclave a 15 libras de presin, a 121C, por 15 minutos.

Las plantas se multiplican bajo una cmara de flujo laminar en condiciones estrictas de asepsia, seccionando esquejes de tallos de aproximadamente 0,5 mm de largo y provistos de una yema axilar con su respectiva hoja. En cada tubo de vidrio con medio de cultivo fresco se colocan de dos a tres esquejes, dependiendo del cultivar, de tal manera que la parte basal quede introducida en el medio. Posteriormente los tubos son sellados con tapones de algodn y gasa para evitar la penetracin de esporas de hongos presentes en el aire y que contaminan el medio de cultivo.

El material vegetal se coloca en cmara de crecimiento con temperatura entre 20 y 40C, humedad relativa entre 60 y 80%, fotoperodo largo de 16 horas de luz y una intensidad luminosa de 2.000 a 3.000 lux. Este material puede ser conservado por un tiempo indefinido, cuando se toman suficientes precauciones para evitar contaminaciones y la transferencia a medio fresco es realizada a intervalos apropiados. Las plantas in vitro probadas contra patgenos se mantienen como colecciones bases para la propagacin de los programas de semillas.

PRODUCCIN DE MINITUBRCULOS.

La obtencin de los tubrculos de semilla prebsica se realiza en invernaderos protegidos con una malla especial para evitar la introduccin de insectos, especialmente fidos. Estos invernculos constan de una primera rea' para asepsia general, y la segunda donde estn ubicados los canteros.

En la primera rea se aplican normas de bioseguridad 118, donde el personal no autorizado no puede ingresar a los invernculos; las superficies de trabajo se descontaminan con jabn y alcohol al menos

dos veces por semana y donde es obligatorio para el personal utilizar ropa y bata de laboratorio limpias y lavarse las manos frecuentemente con solucin jabonosa y con solucin de hipoclorito de sodio. Los zapatos se desinfectan con cal viva cada vez que el personal ingrese a los invernculos. La mezcla o substrato de siembra se prepara con pulpa de caf, previamente descompuesta, tierra de campo y arena de ro lavada, aproximadamente 2 m m de dimetro, en proporciones de 2:1:1. La misma se desinfecta en un rea diseada para tal fin, en capas de 20 cm de profundidad por 12-14 das, se airea completamente y luego se coloca en los canteros.

Las plantas in vitro de aproximadamente 7 cm de altura se transfieren a los canteros, Para ello se extrae cuidadosamente del tubo de vidrio, su races se lavan con agua para eliminar el medio nutritivo y se colocan individualmente en hoyos de aproximadamente 5 cm de profundidad, tratando de cubrir dos o tres nudos. Las distancias de siembra utilizadas para la obtencin de minitubrculos de diferentes dimetros son: 10 x 10 cm; 10 x 15 cm y 10 x 20 centmetros.

La fertilizacin se realiza a los dos o tres das des pues de la siembra con 5 g de la frmula 12-24-12 (NPK) por litro de agua, aplicando unos 100 cc/ planta.

Sobre los canteros se coloca una cubierta de tela blanca durante diez das para proyectar sombra a las plantas y evitar su deshidratacin, dada las condiciones de temperatura dentro de los invernculos que alcanza hasta 29C en das normales soleados.

La frecuencia de riego inicial es diaria y se aplica dos veces durante los primeros diez das, utilizando despus una frecuencia de acuerdo con las necesidades de las plantas. El aporque se realiza entre los 20 y 25 das despus de la siembra para permitir un buen anclaje a la planta, para un buen almacenaje de agua alrededor de la misma y evitar que los futuros tubrculos queden expuestos al sol.

Diariamente se realiza una inspeccin en los invernculos y en condiciones normales de produccin, semanal o quincenalmente se realiza un control fitosanitario para cumplir con las normas establecidas, tanto al cultivo como al rea interna del invernculo, usando los siguientes productos en forma individual o en mezclas apropiadas: manco- zeb (Manzate 200), metalaxil + mancozeb (Ridomil), benomilo (Benlate), como fungicidas y metomilo (Lannate), metamidofos (Tamaron), deltametrina (Decis) o pirimicarb (Pirimor) como insecticidas, no excluyendo a otros productos que resulten eficaces. Adems, se colocan trampas amarillas para capturar fidos alados y otras con feromonas especficas para atraer machos de palomilla (Phthorimaea operculella), previendo la posible entrada de estas plagas. Estas trampas tambin son colocadas en las reas alrededor de los invernculos.

Aproximadamente 30 a 40 das despus de la siembra se realiza un chequeo serolgico para la deteccin de enfermedades virales, utilizando la tcnica biotecnolgica de conjugados enzimticos,

denominada ELISA, con la finalidad de garantizar la calidad fitosanitaria de las plantas. De ser necesario, se realiza otro chequeo serolgico en otro perodo del cultivo. La tcnica de ELISA permite normalmente detectar, en un mximo de 30 horas, con gran confiabilidad y especificidad pequeas cantidades de virus en las plantas y en los tubrculos, en un nmero grande de muestras, donde las que estn infectadas se diferencian claramente de las sanas y el costo por muestra probada es significativamente menor que el obtenido por otras pruebas serolgicas y biolgicas.

La cosecha se realiza a los 80 - 85 das despus de la siembra, previo quemado del follaje y se esperan 7 a 10 das para el ruberizado total de la piel, antes de iniciar el arranque manual. Los tubrculos son seleccionados y clasificados en tres categoras de peso: menores de 6 g, entre 6 y 20 g, y mayores de 20 g. Luego se desinfectan y almacenan por cada categora.

Los tubrculos ms pequeos se utilizan nuevamente para su multiplicacin en los invernculos para el incremento de semilla prebsica y los otros se llevan al campo para la obtencin de la semilla prebsica.

3.6.2. Tcnicas para la multiplicacin de semilla de papa

A pesar que el tubrculo-semilla de papa es un tipo de propagacin vegetativa, es un factor fundamental para garantizar la calidad y la productividad de un cultivo, la siembra de tubrculos de mala calidad puede perjudicar una siembra, an cuando las dems condiciones sean favorables al cultivo. As, la obtencin de tubrculos-semilla de calidad est directamente relacionada con la mejor aplicacin de las tcnicas de produccin.

La produccin de semillas de papa de alta calidad, solo es posible mediante la implementacin de tcnicas especializadas de produccin inicial como: termoterapia, cultivo de meristemas, multiplicacin de plntulas in-vitro, produccin de plntulas en el sistema autotrfico hidropnico (S.A.H) y, produccin de tubrculos prebsicos bajo condiciones ambientales controladas e inspeccionadas con estrictas normas tcnicas y de calidad.

Definitivamente la Biotecnologa, ha aportado grandemente a la produccin de semilla de papa de alta calidad, pues sta se ha insertado dentro de un gran proceso de produccin, que termina con la provisin de semillas categora certificada en beneficio de los agricultores. Por las caractersticas de multiplicacin asexual, la papa puede considerarse como una planta modelo para la investigacin y produccin mediante mtodos biotecnolgicos, por su excelente respuesta a una serie de tcnicas in vitro, ya que por ser un cultivo de propagacin vegetativa, ha sido uno de los pocos cultivos en que realmente se ha llegado a resultados relevantes y prcticos.

Los mejores tubrculos de las variedades mejoradas, son puestos a brotar, luego de que el brote tiene aproximadamente 3 cm de longitud, ste es separado del tubrculo madre y desinfectado en una solucin de alcohol al 70% por un minuto y luego en una solucin de cloro comercial al 75% por 15 minutos. El brote desinfectado es colocado en un medio de cultivo ms 3% de sucrosa y 0,6% de agar. Posteriormente es llevado a una cmara de termoterapia.

El tratamiento de aire caliente en esta cmara alterna temperaturas de 35C por 16 horas y 25C por 8 horas durante 6 semanas, tiempo que puede disminuir o aumentar dependiendo del grado de infeccin y de la variedad. Se a comprobado que las plantas tratadas con calor dan mejor respuesta si estn provistas con luz artificial con una intensidad luminosa de aproximadamente 10.000 luz. Con esta tecnologa se han eliminado principalmente virus de contacto como el Virus PVX y PVS.

A pesar de que una cantidad de mtodos han sido usados para eliminar patgenos de plantas propagadas asexualmente, la terapia de calor o termoterapia es la ms importante, incluso para virus que son estables a altas temperaturas, la tcnica de eliminacin de patgenos, combina termoterapia y cultivo de meristemas o yema apical.

Por la importancia que tiene ste material inicial en el proceso de produccin de tubrculo-semilla de papa, posterior a la termoterapia, se realiza cultivo de meristemos pues basados en que la mayora de patgenos vegetales como por ejemplo virus, hongos, nemtodos y bacterias, pueden ser transmitidos de plantas enfermas a plantas sanas, muchos estudios se han centrado en este tema y se ha determinado que no todas las clulas de las plantas se encuentran infectadas, observndose que los tejidos meristemticos por su gran actividad metablica, algunas veces se encuentran libres de enfermedades por lo que es posible recuperar plntulas sanas mediante tcnicas de cultivo de meristemas a partir de plntulas infectadas, esto asociado con la termoterapia se obtiene el 100% del material totalmente libre de cualquier agente contaminante, sin embrago es necesario descartar cualquier posibilidad y para verificacin se realiza el control de calidad incluido una prueba serolgica. Con sta combinacin se eliminan virus sistmicos como el PVY y el PLRV.

En la actualidad mediante micropropagacin, se genera cada seis semanas diez nuevas plantas por cada planta micropropagada, las mismas que son reforzadas por un mtodo mejorado de produccin acelerada de plantas llamado sistema autotrfico hidropnico (SAH), que consiste en utilizar contenedores desechables, turba y soluciones hidropnicas, sin agregar sucrosa ni reguladores de crecimiento, de esta manera se logra obtener plntulas autotrficas que tienen gran capacidad de adaptacin a condiciones de invernadero. Esta tcnica de multiplicacin se la realiza porque en la produccin in vitro a gran escala, el material vegetal obtenido siempre se ha considerado como plntulas con baja capacidad fotosinttica, ya que para su produccin se utiliza sucrosa como fuente de carbono, dando lugar a un crecimiento heteromixotrfico, adems el uso de sucrosa eventualmente conlleva a desarrollar contaminacin.

Mediante la tcnica de multiplicacin autotrfica hidropnica se ha establecido que las plntulas in vitro tienen habilidad sinttica y que se pueden desarrollar autotrficamente, si se les provee de factores fsicos adecuados como CO2, luz y recipientes amplios, con esto se logra bajar los costos y mantener alta calidad de plntulas que pasarn a la fase de multiplicacin en invernadero, reduciendo la mortalidad y contaminacin.

En el invernadero las plntulas provenientes de los recipientes, son colocadas en camas, que contienen sustrato estril y son alimentadas con fertirrigacin, el manejo del cultivo sigue un estrilo sistema de produccin y asepsia. Merece especial cuidado la preparacin de camas, preparacin de los sustratos, transplante, aporques, tutores y controles fitosanitarios. En cada una de las labores el control interno de calidad, juega un rol importantsimo para verificacin y correccin del proceso, para finalmente obtener tubrculossemilla categora pre-bsica de altsima calidad, que ser el insumo fundamental con el que se inicia el proceso de multiplicacin de las categoras siguientes, es decir bsica, registrada y certificada. La fase y procesos de un programa organizado de produccin de semillas de semillas de papa, se detalla en la siguiente figura:Figura 1. Flujograma de un programa organizado de produccin de semillas de papa.

FASESLaboratorio y Campos Experimentales

PROCESSOSINIAPInvestigacin y Desarrollo de Variedades Germoplasma: CIP Quito, CIP Lima, CNP.

____________________ C . I . C. (INIAP) ___________________

Limpeza: Termoterapia/Meristemas/Serologia Multiplicacin y propagacin in vitro

INIAP Minitubrculos(< de 5 gramos)

INIAP

Invernadero

Multiplicacin de Minitubrculos

INIAPSemilla pr-bsica

INIAP

_______________ C . E . C. (MAG)

Semilla bsica (I)

Lotes de Produccin

INIAPSemilla bsica (II)

INIAPSemilla registrada

PRODUTORES DE SEMENTE CERTIFICADA

3.6.3. Uso de semillas de papa

Actualmente el uso de semillas certificadas en el pas es bajo, como ejemplo podemos mencionar que aproximadamente del 1.5% del rea sembrada con papa, est cubierta con semilla certificada, Sin embargo de este bajo ndice de utilizacin de semilla, se ha podido observar en varias regiones que existe una reaccin positiva de los agricultores al uso de semilla de calidad, porque han comprendido que la utilizacin de semilla de variedades mejoradas, conjuntamente con una aplicacin adecuada de tecnologa, les permite elevar los rendimientos por unidad de superficie, logrando consecuentemente una mayor rentabilidad.

Con el propsito de avanzar en un proceso concertado que fortalezca el sector semillerista y permita la modernizacin de la Legislacin, los servicios de certificacin y produccin de semillas en el pas se proponen una serie de acciones prioritarias que han sido identificadas por los sectores pblico y privado, entre los que se destacan fuertes programas de informacin y difusin del uso de semillas. Se ha logrado la formacin de la Asociacin de Productores de Semilla de Papa (ASEPAE). El objeto es generar una nueva imagen del sector semillerista con la participacin de las empresas productoras de semillas, mejorando sus reas de comercializacin, estableciendo sistemas adecuados de transporte, almacenamiento y distribucin.

3.7. PRODUCCIN DE SEMILLA CERTIFICADA DE ARROZ

Durante la ltima dcada los avances tecnolgicos en el cultivo de arroz han permitido que este cereal se establezca como un producto bsico de la economa del pas, representando la base principal de alimentacin de los grupos de menos recursos y materia prima para la agroindustria, requerida de ofertar productos de alta calidad. En consecuencia, la utilizacin por parte del productor de semilla de variedades que posean tales atributos es de imperativa necesidad.

Una vez obtenidos los cultivares de arroz a travs de los programas de mejoramiento, por parte de organizaciones pblicas y privadas, stos son evaluados por las entidades competentes durante tres ciclos de siembra en las principales zonas de produccin del cultivo en el pas. El objetivo es determinar su comportamiento en cuanto a tres caractersticas fundamentales: rendimiento, enfermedades y calidad del grano. Los cultivares que aprueban los tres ciclos de prueba en estos ensayos son declarados elegibles y pueden ser utilizados para la produccin y comercializacin de semilla.

La certificacin de semillas de arroz es un proceso que tiene como objetivo multiplicar la variedad mejorada, manteniendo su identidad gentica y pureza varietal mediante un sistema integral de calidad, basado en normas establecidas.

La semilla Certificada es actualmente producida por agricultores independientes, sin embargo, a pesar de las recomendaciones para su uso, existe un porcentaje importante de productores, entre 30 y 40% que no la emplean, debido a la poca confianza en el producto que no satisface adecuadamente las exigencias de calidad. Por lo tanto, para que las semillas constituyan un elemento bsico de prosperidad, la agricultura moderna debe contar con un sistema de certificacin de semillas que garantice el mantenimiento de la pureza e identidad gentica de las variedades mejoradas, as como tambin de estrategias que permitan hacer llegar esas semillas a los agricultores con una alta calidad, en las cantidades necesarias y en forma oportuna. En aos recientes, los mtodos de mejoramiento gentico han tenido una marcada evolucin, incluyendo las herramientas biotecnolgicas como los marcadores moleculares, de uso

progresivamente generalizado. Su empleo aporta informacin valiosa a los programas de mejoramiento varietal y certificacin de semillas, ya que asocia caractersticas fenotpicas con regiones especficas del ADN, que permiten establecer la identidad gentica de los cultivares y determinar el nivel de pureza de las semillas. Tal identificacin tradicionalmente se ha basado en la caracterizacin agronmica y morfolgica de las semillas y plantas obtenidas de ellas, proceso altamente laborioso. En la ltima dcada, se ha incluido el uso de diversos tipos de marcadores moleculares, tales como isoenzimas, microsatlites, RAPDs, entre otros, los cuales permiten identificar polimorfismos a nivel de secuencias de ADN, y la comparacin de clones, cultivares, razas, especies, o cualquier nivel de organizacin taxonmica tanto en plantas como en animales y microorganismos. El conocimiento y seguimiento del proceso de produccin de semilla de arroz certificada representa una parte primordial del sistema arrocero, ya que la obtencin de semilla de alta calidad permite disminuir riesgos en campo, y garantiza la disminucin de malezas nocivas como el arroz rojo, el principal problema en los campos de produccin de arroz.

3.7.1. Importancia del uso de semilla certificada de arroz Para los grupos de menores recursos, el arroz es la base de la dieta diaria y representa la principal fuente de caloras y protenas. Uno de los fa