Electroforesis

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en

un campo eléctrico

Factores de los que depende la velocidad de migración

la intensidad del campo eléctrico

la carga neta de la molécula

tamaño

fuerza iónica

viscosidad

temperatura del medio en el cual las moléculas se están moviendo.

Existen numerosas variaciones de esta técnica

Electroforesis capilar. Electroforesis en papel.

Electroforesis en gel de agarosa. Electroforesis en gel de

poliacrilamida. Isoelectroenfoque.

Electroforesis bidimensional.

La electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) presentan ventajas como:

ser químicamente inertes

estables en un amplio intervalo de pH, temperatura y fuerza iónica

fáciles de generar mediante la polimerización de acrilamida.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

CH3 CH3 N CH2CH2 NCH3 CH3 TEMED

N,N,N',N'-Tetrametiletilenediamina

S2O82– + e– SO42– + SO42– Iniciapolimerizac

ión

(NH4)2S2

O8

PSA Persulfato Amónico

SDS-PAGE

Permite determinanr el peso molecular de las proteínas

La separación es función del tamaño (masa molecular)

Para ello se compara la movilidad electroforética (Rf) de la proteína de peso molecular desconocido con el de proteínas de referencia de peso molecular conocido.

5-10 % acrilamida

2-4% acrilamida

Desnaturalización de proteína

SDS

Se une una molécula de SDS por cada dos residuos de aminoácidos

Cátodo(-)

Ánodo(+)

Agente reductor 2-mercaptoetanol que reduce los puentes disulfuro (Cys-S-S-Cys) a grupos tioles (Cys-SH),

Agentes caótropos, que como la urea, rompen puentes de hidrógeno.

Métodos de tinción

Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE pueden ser visualizadas en el gel mediante diversos métodos de tinción:

fluorescencia

plata

azul coomassie (mas empleado, sensiblidad de 50 ng de proteína)

Determinación del peso molecular

Dp=48mm

Df=84 mm

Rf24= 48mm/84 mm

Rf=Distancia que migra una determinada proteína/Distancia que migra el frente del gel