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Avances en el controlbiológico dela verticilosis del olivo

La verticilosis del olivo causada por elhongo V.dahliae es sin lugar a dudasel problema sanitario más importan-te del olivar español en la actualidad.

Esta enfermedad era desconocida en Espa-ña hace treinta años y durante casi dos dé-cadas desde que fuera primeramente diag-nosticada se la había considerado comouna enfermedad menor del cultivo. Sin em-bargo, en la actualidad la verticilosis estáampliamente distribuida en todas las zonasolivareras andaluzas (incluyendo las provin-cias de Cádiz, Córdoba, Granada, Huelva,Jaén y Sevilla) (Jiménez-Díaz et al., 2008a;Rodríguez et al.,2008; Sánchez-Hernándezet al.,1998; Jiménez Díaz,datos no publica-dos) afectando de forma particularmentesevera a árboles jóvenes en nuevas planta-ciones de regadío (figura 1a); y ha sido asi-mismo diagnosticada en plantaciones en

otras comunidades autónomas (Ej., Aragón,Castilla-La Mancha, Cataluña, Extremadura yValencia) (Comunicación personal: J. Armen-gol; A.Azpilicueta; J.Tous; S.Triviño; R.M. Jimé-nez Díaz,datos no publicados)

El incremento en la extensión y severidadde los ataques de verticilosis del olivo en An-dalucía ha coincidido con la expansión de laproducción oleícola y las notables innovacio-nes tecnológicas auspiciadas por la ‘Nueva oli-vicultura’(ejemplo: establecimiento de nuevasplantaciones intensivas o superintensivas,propagación viverista del material de planta-ción, extensión e intensificación del regadío,mínimo o no laboreo,etc.; Rallo,1998a; b; Vi-llalobos et al., 2006), junto con la disemina-

ción de un patotipo defoliante (D) y letal delhongo que es el predominante en las pobla-ciones de V. dahliae que infectan olivo en An-dalucía. El patotipo D es mucho más virulentoque el no-defoliante (ND) (Mercado-Blanco etal., 2001; 2002), de manera que puede cau-sar síntomas de severidad moderada en varie-dades resistentes a este último y originar en-fermedad severa en olivo Picual con una can-tidad del hongo en el suelo (3 a 10 microescle-rocios/g suelo seco) que,en el caso de ser delpatotipo ND, no da lugar a enfermedad o siésta se desarrolla lo hace con escasa inciden-cia y gravedad (López-Escudero y Blanco-Ló-pez, 2007; López-Escudero et al., 2004). Elpatotipo D fue diagnosticado originariamenteen la zona de cultivo intensivo de algodón enlas Marismas del Guadalquivir (Bejarano etal., 1996), pero se ha extendido progresiva-mente hacia zonas olivareras en las provinciasde Córdoba, Jaén y Sevilla, y ha sido diagnos-ticado en menor extensión en Granada y Huel-va (figura 2) (Jiménez-Díaz et al.,2008a).

La extensión y severidad de los ataquespor el patotipo D ha creado honda y justifica-da preocupación al olivicultor y auspiciado ex-pectativas de que la verticilosis puede ser con-trolada eficientemente mediante intervencio-nes simples e individuales. Por el contrario, elconocimiento derivado de la investigacióncientífico-técnica sobre la etiología y epide-

Rafael M. Jiménez Díaz1,2,José L. Trapero Casas2, Javier Boned3,Blanca B. Landa del Castillo2 yJuan A. Navas Cortés2

1 Departamento de Agronomía, ETSIAM, Universidad deCórdoba

2 Departamento de Protección de Cultivos, Instituto deAgricultura Sostenible, CSIC; Alameda del Obispo.Córdoba.

3 Isagro España. Madrid.

La utilización de plantones certificados libre de V.dahliae y tratados con agentes de biocontrol, ysubsiguientes aplicaciones de dichos agentes enla proximidad del sistema radical de la planta,pueden reducir el desarrollo de infecciones seve-ras por el patotipo D.En este artículo presentamos

resultados de experimentos realizados para con-trastar dicha hipótesis mediante el tratamientodel sistema radical de plantones de olivo Picualcon el formulado fúngico Bioten, en condicionescontroladas y de campo óptimas para las infeccio-nes por el patotipo D y el desarrollo de verticilosis.

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EFICACIA DE TRATAMIENTOS CON BIOTEN CONTRA LAS INFECCIONES DEL PATOTIPO DEFOLIANTE DE VERTICILLIUM DAHLIAE

El tratamiento del sistemaradical de plantones deolivo Picual con elformulado fúngico Biotenantes de la inoculación conel patotipo defoliante deV. dahliae redujo laseveridad de verticilosisen condiciones controladasy de campo

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ducir el potencial de enfermedad severa tras laprimera infección y proteger contra subsi-guientes infecciones al sistema radical del ár-bol recuperado de los síntomas,son opcionesútiles para el control de la verticilosis del olivo.

Bioten WP es un formulado fitosanitariogranulado de Isagro registrado en la Unión Eu-ropea y el Ministerio de Medio Ambiente,Ruraly Marino (Nº de registro 25.234) para su utili-zación contra V. dahliae en olivo, compuestopor estirpes de los hongos no fitopatógenos Tri-choderma asperellum (2%) (ICC012, Nº deregistro 25.212) y Trichoderma gamsii (2%)(ICC080, Nº de registro 25.211), con unadensidad de inóculo de cada estirpe de 4,8 x108 unidades formadoras de colonias (ufc)/g.Ambas estirpes han sido caracterizadas mole-

cularmente mediante la amplificación y se-cuenciación de la región ITS1-5.8S-ITS2 delADN ribosómico y del gen tef1 (factor de elon-gación), y subsiguiente análisis filogenéticoscon diferentes especies de Trichoderma; di-chas secuencias han sido depositadas en elGenBank (GQ351595, GQ351596,GQ351597,GQ351598).

Efectos del tratamientoen condicionescontroladasDesarrollo experimental

Se han realizado cuatro experimentos (I-IV) utilizando plantones certificados libre deV.dahliae de cuatro a seis meses de edad de lavariedad Picual,autoenraizados de estaquillassemileñosas (Viveros Aulaga,Córdoba) (expe-rimentos I y III) o micropropagados (Cotevisa,Alicante) (experimentos II y IV). En los experi-mentos I y II se empleó Bioten al 1% en unamezcla de limo:turba (2:1 v/v) pasteurizada,ylos plantones se trataron primero distribuyen-do 100 g de la mezcla infestada sobre el siste-ma radical desnudo de la planta. Los planto-nes tratados y testigos (i.e., sin Bioten) setransplantaron a la mezcla pasteurizada enmacetas de arcilla esterilizadas (0,75 l) (1plantón/maceta) y se incubaron durante ca-torce días una cámara de crecimiento ajusta-da a 25±1ºC,60-90% HR,y un fotoperiodo de14 h/día de luz fluorescente de 360 µE m-2s-1.La población de T.asperellum y T.gamsii esta-blecida en la rizosfera de los plantones tras di-cha incubación se determinó mediante diluciónen serie del sonicado de 1 g de raíces en 10 mlde agua estéril incubada en un medio selectivopara Trichoderma spp. (Elad et al., 1981; Ne-mec et al. 1996) a 25±1º C y 12 h/día de luzfluorescente y NUV de 180 µEm-2s-1, y conteníauna densidad de inóculo media de 3,2 x 106

ufc/g de raíz.Para la inoculación con V.dahliae se utilizó

el aislado monoconídico V138I del patotipo D,altamente virulento sobre algodón y olivo (Be-jarano-Alcázar et al., 1996; Mercado-Blancoet al., 2002; 2003). El inóculo consistió enuna suspensión de conidias en agua desioni-zada estéril obtenidas de cultivos del patóge-no en caldo de patata dextrosa en agitación(130 rpm, a 25±1ºC en oscuridad, durantesiete días). En los experimentos I y II, los plan-tones tratados y no tratados con Bioten se re-tiraron de las macetas y se inocularon por:

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miológica de la enfermedad, indi-can convincentemente que sucontrol ha de basarse en una es-trategia de manejo integrado queincluya medidas de carácter pre-ventivo aplicadas antes de laplantación y medidas posterioresa ésta que mitiguen la gravedad yrepercusión de los ataques sobreel árbol (Jiménez Díaz et al.,2003;Tjamos y Jiménez Díaz, 1998). Esmás, la dispersión del patógenoen el agua de riego (Rodríguez Ju-rado y Bejarano Alcázar; 2007;Thanassolopoulos et al., 1980) yel papel de las hojas infectadascaídas de olivos infectados por elpatotipo D como fuente de inócu-lo secundario (Jiménez Díaz,2008b; Navas-Cortés et al.,;2008;), cuestionan la eficienciade un sistema de manejo basadosolamente en las fuentes de in-óculo primario (i.e., suelo infesta-do y plantón infectado) como úni-ca estrategia para el control de laverticilosis del olivo, y aconsejanla conveniencia de proteger el sis-tema radical de la planta contrainfecciones secundarias duranteel ciclo anual del cultivo.

Una característica de la pato-génesis de la verticilosis del olivo,relevante para su manejo integra-do, es la reducción progresiva delos síntomas en el árbol infectadoen el curso de los años si la prime-ra infección no origina enferme-dad severa en aquél (lo cual sedenomina recuperación sintomática de laplanta enferma). Este fenómeno fue descritopor Wilhelm y Taylor (1965) en California, ob-servado más tarde en Andalucía (Blanco Ló-pez et al.,1990) e Israel (Levin et al., 2003), yconfirmado experimentalmente mediante ino-culaciones artificiales de plantones de olivo encondiciones controladas (López-Escudero yBlanco-López, 2005; Mercado Blanco et al.,2001; Rodríguez Jurado, 1993). Hipotética-mente, dicha recuperación es consecuenciade la incapacidad de V.dahliae de crecer des-de los tejidos enfermos para colonizar nuevoxilema,de manera que son necesarias nuevasinfecciones a través del sistema radical de laplanta antes afectada para que la enfermedadse desarrolle de nuevo. En consecuencia, re-

FIGURA 1.Síntomas de verticilosis causados por el patotipodefoliante de V. dahliae en cultivares de olivo.

Defoliación completa

Testigo Vd Vd+Bioten ®Bioten ®

A) Olivo Arbequina de 1,5 años de edad plantado en un suelo con historia deverticilosis de algodonero en Écija (Sevilla).Nótese la defoliación completa delas ramas del árbol. B) Plantones autoenraizados de Picual, de seis meses deedad, ocho semanas después de la inoculación por inmersión radical en unasuspensión de conidias de V. dahliae defoliante (Vd) e incubación a 25±1ºCen cámara de crecimiento.

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1. Inmersión de su sistemaradical desnudo e intacto en unasuspensión de 107 conidias de V.dahliae/ml durante 20 min ysubsiguiente transplante a ma-cetas de arcilla de 0,75 l esterili-zadas (1 plantón/maceta) con-teniendo la mezcla de limo: turbaesterilizada.

2. Transplante a dichas ma-cetas con la dicha mezcla estérilinfestada con 2 x 106 conidias deV. dahliae/g de suelo.

Como controles sir vieronplantones tratados similarmentea los inoculados, excepto por laausencia de inóculo de V. dah-liae.

Para confirmar los resultadosobtenidos, los experimentos I y IIse repitieron con ligeras modifi-caciones (experimentos III y IV) afin de explorar procedimientosque eventualmente podrían serempleados para tratamientos encondiciones naturales. En el ex-perimento III se utilizaron planto-nes autoenraizados similares alos utilizados en el experimento I,mientras que para el experimen-to IV se emplearon plantones mi-cropropagados de cuatro mesesde edad. En ambos casos, el tra-tamiento con Bioten se realizódurante el transplante de losplantones desde el substrato deenraizamiento a la mezcla desuelo pasteurizada en macetas,mediante riego del sistema radi-cal en el cepellón del plantóncon 100 ml de una suspensióndel formulado al 5% (p/v) enagua desionizada estéril. Comotestigo sirvieron plantones cuyosistema radical fue similarmen-te tratado con agua estéril. Losplantones tratados y testigos seincubaron durante 14 días enlas condiciones anteriormente descritas yla población rizosférica de T. asperellum yT. gamsii estimada por el procedimientoanterior alcanzó una densidad media de1,6 x 106 ufc/g de raíz en los plantones mi-cropropagados y 1,9 x 106 ufc/g de raíz enlos autoenraizados.Los plantones tratadosy no tratados con Bioten se inocularon con

V. dahliae mediante: • Inmersión de su sistema radical intac-

to–previamente sacudido ligeramente hastaretener el cepellón de substrato de enraiza-miento- en una suspensión de 107 conidias deV. dahliae /ml durante 20 min y subsiguientetransplante a la mezcla de suelo esterilizada.

• O bien mediante transplante de los

plantones a la mezcla de suelo esté-ril infestada con 5 x 106 conidias deV. dahliae/g de suelo. Como contro-les sirvieron plantones tratados si-milarmente a los inoculados, excep-to por la ausencia de inóculo de V.dahliae. Todos los plantones crecie-ron en macetas de arcilla de 0,75 lesterilizadas (1 plantón/maceta).

En los cuatro experimentos, losplantones se incubaron en cámarasde crecimiento a 25±1ºC, 60-90%HR, y un fotoperiodo de 14 h/día deluz fluorescente de 360 µE m-2s-1 du-rante dos meses, momento en queaquéllos se dieron por finalizados.Adicionalmente, la incubación de losplantones autoenraizados del experi-mento I se prolongó durante otrasveinticinco semanas en el periodo dediciembre a principios de junio de2006 en condiciones naturales bajoumbráculo, con lo que el periodo ex-perimental se extendió aproximada-mente hasta los ocho meses tras lainoculación con V. dahliae. En todoslos experimentos,los plantones se re-garon de forma regular,según necesi-dad, y se fertilizaron con la soluciónnutritiva de Hoagland.

Los experimentos tuvieron un di-seño factorial de tratamientos contres repeticiones completamente alazar, cada una de las cuales constóde cinco plantones (i.e., 15 planto-nes por combinación experimental,eigual número de plantones tratados yno tratados con Bioten pero no ino-culados con V. dahliae. El desarrollode verticilosis durante los experimen-tos se evaluó por:

(i) El periodo de incubación (i.e.,tiempo transcurrido desde la inocu-lación hasta la aparición de los pri-meros síntomas.

(ii) La severidad de los síntomasen plantas individuales (estimada enuna escala 0-4 según el porcentaje

de parte aérea afectada; 0 = sin síntomas,1 =1-33%, 2 = 34-66%, 3 = 67-100%, 4 = plan-ta muerta) (Mercado-Blanco et al., 2001;2002) determinada a intervalos semanales.

(iii) La incidencia final de plantas enfer-mas (expresada en porcentaje).

(iv) El área bajo la curva de progreso de laenfermedad estandarizada por el tiempo de

FIGURA 2.Efecto de Bioten sobre el desarrollo de verticilosis en plantonesautoenraizados de Picual de seis meses de edad inoculados conVerticillium dahliae defoliante (Vd) e incubados a 25±1ºC encámara de crecimiento en los experimentos I (A) y III (B).

A) El sistema radical del plantón se trató con Bioten 1% en una mezcla de suelo pasteu-rizado (Bioten), o no se trató. B) El cepellón radical del plantón se trató con una suspen-sión de Bioten al 5% en agua desionizada estéril (Bioten), o sólo con ésta. En ambos ex-perimentos, los plantones se inocularon por inmersión del sistema radical en una sus-pensión de conidias o por transplante a suelo infestado con ella. Periodo de incubación= Tiempo transcurrido desde la inoculación hasta la aparición de los primeros síntomas;Incidencia = Proporción de plantas afectadas; Severidad = Proporción de tejido aéreoafectado estimada en una escala 0-4 (0 = sin síntomas, 4 = planta muerta). AUDPC =Área bajo la curva de progreso de la severidad de enfermedad estandarizada por el tiem-po de desarrollo de ésta. Letras distintas en las barras de un histograma correspondien-te a un método de inoculación indican diferencias significativas entre plantones tratadosy no tratados, según el contraste de la mínima diferencia significativa protegida de Fisher(LSD) a P ≤ 0,05.*= Diferencias significativas entre valores correspondientes a métodosde inoculación para un tratamiento indicados por las barras de un histograma según elcontraste LSD a P ≤ 0,05. (Véase el texto para más detalles).

desarrollo de ésta en días (ABCPE) calculada(Madden et al., 2007).

En el experimento I se evaluó además eldesarrollo de enfermedad durante la incuba-ción adicional en umbráculo a intervalos dedos a cuatro semanas.Asimismo, tres mesesdespués de la inoculación se determinó la in-fluencia del tratamiento con Bioten y la infec-ción por V.dahliae sobre el crecimiento de losplantones, estimada por la variación porcen-tual en la longitud total del tallo y brotes decada planta desde el momento de la inocula-ción con el patógeno.Los datos se sometierona análisis de varianza previa transformaciónde valores porcentuales a arcsen (Y/100)1/2, ylas medias de tratamientos se compararonentre sí mediante el contraste de la mínima di-ferencia significativa protegida de Fisher (LSD)a P ≤ 0,05. Finalizados los experimentos, seconfirmó la infección de las plantas por V.dah-liae mediante aislamientos del patógeno enagar patata dextrosa (PDA) de todos los plan-tones inoculados, así como de cuatro planto-nes de los testigos no tratados ni inoculados,otratados sólo con Bioten, seleccionados alea-

toriamente. Asimismo, finalizados los experi-mentos I, III y IV se estimó la densidad de po-blación de T.asperellum yT.gamsii que persis-tió en el sistema radical de tres plantones tes-tigos o inoculados muestreados aleatoria-mente.

ResultadosEn todos los casos, los plantones de Pi-

cual tratados con Bioten 1% crecieron sin sín-tomas y de forma satisfactoria; y la inocula-ción con V. dahliae dio lugar al desarrollo desíntomas de verticilosis característicos de lainfección por el patotipo D deV.dahliae, inclu-yendo clorosis de las hojas y defoliación delplantón (figura 1b). Por razones de brevedady espacio, en lo que sigue se presentan los re-sultados de los experimentos I y III en los quese utilizaron plantones autoenraizados; los re-sultados con plantones micropropagados (ex-perimentos II y IV) fueron similares.

En el experimento I, el método de inocula-ción con V. dahliae influyó significativamentesobre el desarrollo de enfermedad en los plan-tones autoenraizados no tratados y ello deter-

minó que los efectos del tratamiento del siste-ma radical del plantón con Bioten 1% variaransignificativamente (P < 0,05) con el procedi-miento utilizado para aquélla. La inoculaciónpor inmersión radical determinó el desarrollomás temprano,extenso y severo de verticilosis(figura 2a). Comparativamente, la inocula-ción por transplante originó valores de inci-dencia, severidad, y ABCPE significativamente(P < 0,05) inferiores, y un periodo de incuba-ción significativamente (P < 0,05) superior, in-dependientemente del tratamiento. El trata-miento con Bioten 1% no influyó sobre el pe-riodo de incubación en los plantones inocula-dos por inmersión (31 y 42 días en las planto-nes testigo y tratados, respectivamente), peroredujo significativamente (P < 0,05) el desa-rrollo de verticilosis con una disminución del18% en la incidencia de verticilosis,43% en elABCPE, y de 3,9 a 1,4 (en la escala 0 a 4) enla severidad media de los síntomas en losplantones tratados respecto de los no tratados(figura 2a).

El tratamiento con Bioten 1% también re-dujo el desarrollo de verticilosis en los planto-

nes transplantados a suelo infestado,con un patrón similar al descrito paralos plantones inoculados por inmer-sión de las raíces en el inóculo, perotal reducción no fue estadísticamentesignificativa (P ≥ 0,05). No obstante,dicho tratamiento incrementó de 49a 54 días el periodo de incubación yredujo la incidencia de enfermedadde 73 a 50%,el ABCPE de 32 a 18%y la severidad media de síntomas de1,7 a 0,7 (en la escala 0 a 4) (figura2a).

El tratamiento con Bioten 1% noinfluyó significativamente sobre elcrecimiento aéreo de los plantonesque sirvieron como control en la ino-culación por inmersión radical otransplante, tras tres meses de incu-bación a 25±1ºC (figura 3d). Por elcontrario, la infección por el V.dahliaeredujo acentuadamente el crecimien-to de los plantones inoculados por in-mersión radical,pero dicha reducciónno fue contrarrestada significativa-mente (P ≥ 0,05) por el tratamientocon Bioten 1% (figura 3d).Compara-tivamente, el transplante a suelo in-festado con conidias de V.dahliae in-fluyó menos sobre el desarrollo de losplantones que la inmersión de raícesen una suspensión de aquéllas, demanera que el crecimiento medio deestos últimos fue significativamenteinferior (P < 0,05) al de los planto-nes inoculados por transplante.Además, el crecimiento de los plan-tones inoculados mediante trans-plante a suelo infestado fue compa-rable al de los controles no inocula-dos, pero el tratamiento con Bioten1% no repercutió significativamentesobre el crecimiento de las plantasenfermas (P ≥ 0,05) (figura 3d).Ta-les diferencias en los efectos del for-mulado podrían ser debidas a lamenor cantidad de enfermedad quese desarrolló en la inoculación por trans-plante comparada con la alcanzada por in-mersión de raíces (figura 3b y 3c).

La incubación durante veinticinco se-manas adicionales bajo umbráculo de losplantones inoculados por inmersión del sis-tema radical en una suspensión de conidiasde V. dahliae D, no modificó la reducción deincidencia y severidad de verticilosis conferi-

da por el tratamiento con Bioten 1% durantelas ocho semanas en que habían sido incuba-das previamente a 25±1ºC en cámara de cre-cimiento (figura 3a). De hecho,en los planto-nes tratados se produjo una moderada reduc-ción de la enfermedad (‘recuperación’), cuyaincidencia disminuyó de 82 a 55% con unaseveridad media de síntomas de 1,5 compa-rada con 3,9 en los plantones no tratados con

Bioten 1% (figura 3b y 3c). Similar-mente,la incubación bajo umbráculo delos plantones que habían sido trasplan-tados a suelo infestado con V. dahliaeno modificó la ausencia de efecto signi-ficativo (P ≥ 0,05) de Bioten 1% sobre eldesarrollo de la enfermedad que habíasido observada tras ocho semanas deincubación en cámara de crecimiento(figura 3a). Sin embargo, tanto en losplantones control como en los tratadoscon Bioten 1% se produjo un ligero in-cremento de la severidad media de lossíntomas de 0,4 y 0,5 puntos, respecti-vamente, respecto de los valores obser-vados tras dicho periodo, aunque la di-ferencia de severidad entre dichos trata-mientos a las veinticinco semanas nofue estadísticamente significativa (P ≥0,05) (figura 3b y 3c).

Al final del experimento, el patógenose aisló en cultivo puro del tallo del 100%de los plantones control afectados y del30% de los tratados con Bioten 1% einoculados por inmersión del sistemaradical.Por el contrario,V.dahliae se ais-ló del 22% de los plantones no tratadose inoculados por transplante a suelo in-festado, pero de ninguno de los planto-nes similarmente inoculados y tratadoscon Bioten 1%. Asimismo, finalizado elexperimento,35 semanas después de lainoculación, la densidad de población ri-zosférica de T.asperellum yT.gamsii fuede 4,3 x 104 ufc/g de raíz en los planto-nes tratados no inoculados, y de 8,9 x104 ufc/g de raíz en los plantones trata-dos e inoculados con V.dahliae.Dichaspoblaciones fueron aproximadamente1-2 órdenes de magnitud inferior a lasestablecidas inicialmente tras dos se-manas de incubación después del trata-miento con Bioten 1% previo a la inocu-lación con V.dahliae.

La repetición del experimento I conla modificación del tratamiento del sis-tema radical de los plantones (i.e., me-

diante riego con una suspensión acuosa deBioten 5% previo a la inoculación con V. dah-liae) (experimento III) reprodujo los efectos so-bre el desarrollo de enfermedad que se handescrito anteriormente, pero acentuó la reduc-ción de verticilosis observada en el experimen-to I (figura 2b).Así, la incidencia y severidad deverticilosis en los plantones no tratados e ino-culados por inmersión radical o transplante a

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FIGURA 3.Duración del efecto de Bioten 1% sobre el desarrollo deverticilosis en plantones de Picual autoenraizados einoculados con V. dahliae defoliante (Vd).

Los plantones se incubaron primero a 25±1ºC en cámara de crecimiento durante3 meses (experimento II; A, B), y 25 semanas adicionales en condiciones natura-les bajo umbráculo (A, C). Incidencia = Proporción de plantas afectadas; Severi-dad = Proporción de tejido aéreo afectado estimada en una escala 0-4 (0 = sinsíntomas, 4 = planta muerta). D) Variación porcentual en la longitud total del talloy brotes de cada planta desde el momento de la inoculación con V.dahliae (Vd) deplantones de 6 meses de edad tratados con Bioten® 1% en una mezcla de suelopasteurizado (Bioten®), o no tratados. Las plantas se inocularon por inmersión delsistema radical en una suspensión de conidias o por transplante a suelo infesta-do con ella y se incubaron a 25±1ºC en cámara de crecimiento. Control = Planto-nes no tratados ni inoculados. Letras distintas en las barras de un histograma co-rrespondiente a un método de inoculación indican diferencias significativas entreplantones tratados y no tratados, según el contraste de la mínima diferencia signi-ficativa protegida de Fisher (LSD) a P≤0,05.*= Diferencias significativas entre va-lores correspondientes a métodos de inoculación para un tratamiento indicadospor las barras de un histograma según el contraste LSD a P ≤ 0,05. (Véase el tex-to para más detalles).

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Continúa en pág. 56 t

suelo infestado fueron comparables alos del experimento anterior; pero eltratamiento con Bioten 5% en el expe-rimento III redujo significativamente (P< 0,05) en 66% la incidencia de enfer-medad y de 3,2 a 0,5 (en la escala 0a 4) la severidad media de los sínto-mas en los plantones inoculados porinmersión radical en la suspensión deconidias de V. dahliae, y en 53% y de2,3 a 0,6 los valores de éstos en losplantones transplantados a suelo in-festado con éstas (figura 2a y 2b).

Al finalizar el experimento III, diezsemanas después del tratamientocon Bioten 5%, la población de T. as-perellum y T. gamsii en la rizosfera delos plantones tratados no inoculadosalcanzó una densidad media de 2,5 x105 ufc/g de raíz,que es aproximada-mente un orden de magnitud inferior ala establecidas inicialmente tras dossemanas de incubación después deltratamiento con Bioten.En este casono se estimó la densidad de pobla-ción rizosférica en los plantones tra-tados e inoculados con V.dahliae.

Efectos deltratamiento encondiciones decampoDesarrollo experimental

El efecto de Bioten sobre eldesarrollo de verticilosis en condicio-nes de campo se estudió durante elperiodo 2007 a 2009 utilizandoplantones de Picual autoenraizados (ViverosAulaga, Córdoba) de nueve meses de edad,en microparcelas (1,25 x 1,25 m2, 0,5 m deprofundidad) con suelo areno limoso (pH8,5, 1,4% de materia orgánica) sin historiade verticilosis situadas en la Finca Alamedadel Obispo del IFAPA, (Córdoba, 37,5°N,4,8°W,altitud 110 m).El suelo de las micro-parcelas humectado a la capacidad de reten-ción se solarizó cubriéndolo con una láminade polietileno transparente (50 µm de gro-sor) durante el periodo de 11 de julio a 30 deseptiembre,2006.El experimento se planteópara simular la eventual utilización del formu-lado Bioten en un esquema de producción vi-verista de plantones autoenraizados de olivo.Para ello, el cepellón de plantones Picual de

seis meses se trató con 100 ml de una suspen-sión de Bioten al 5% (p/v) en agua desionizadaestéril como se ha descrito en el experimento IIIanterior,y los plantones tratados y testigos se in-cubaron durante tres meses en las mismas con-diciones descritas para los experimentos ante-riores. Después, los plantones se transplanta-ron en las microparcelas (2 plantones/micro-parcela) el 6 de marzo de 2007 y la inoculacióncon V.dahliae D se realizó durante el transplan-te.Como inóculo se empleó una mezcla de sue-lo solarizado y de AMA (arena: harina de maíz:agua (9:1:2, p/p) infestado con V. dahliae D(5%, v/v), que en el momento del transplantecontenía 1,4 x 107 propágulos del patógeno/gestimados por el método de tamizado húmedo.El potencial de dichos propágulos como inócu-

lo se había determinado previamentemediante bioensayos preliminares de pa-togenicidad en condiciones controladasutilizando plantones de olivo Picual auto-enraizados de seis meses de edad y plán-tulas de sandía cv. Dulce Maravilla. Parala inoculación,se distribuyeron 2 kg de lamezcla infestada sobre el fondo del hoyode plantación y otros 2 kg alrededor delcepellón del plantón depositado enaquél. Como controles no infestados sir-vieron microparcelas similares en las quese aportó mezcla de suelo solarizado yAMA no infestado. Seis meses despuésde la inoculación, la densidad de inóculode V.dahliaeen el suelo de dos micropar-celas no tratadas con Bioten se estimó enuna media de 650 propágulos/g sueloseco mediante tamizado húmedo.

Coincidentemente con el transplantey la inoculación con V. dahliae se realizóun tratamiento adicional con Bioten 2%en los plantones ya tratados e incubadosen cámara de crecimiento.El formuladose hidrató durante 24 h a temperaturaambiente en agua desionizada (20 g/l)y sobre cada plantón se distribuyó 1 litrode la suspensión aportando un tercio dedicho volumen sobre el inóculo de V.dahliae depositado en el fondo del hoyo(o la mezcla que sirvió como testigo),otro tercio sobre el cepellón de trans-plante cubierto parcialmente por dichosinóculo o mezcla, y el tercio restante so-bre el suelo solarizado que cubrió de for-ma completa el plantón transplantado.Los plantones que sirvieron como testigorecibieron agua en igual volumen al de lasuspensión de Bioten. La aplicación de

Bioten se repitió aproximadamente un año des-pués de la plantación, mediante riego de losplantones tratados con 1 litro de suspensión delformulado hidratado al 1%, después de retirarla capa superficial de suelo en la microparcela.Tras la aplicación de Bioten, las microparcelasse regaron con agua para facilitar la percolacióndel inóculo de T.asperellum y T.gamsii hacia lasraíces de los plantones y se cubrieron con elsuelo antes retirado.Las microparcelas que sir-vieron como testigos recibieron agua solamen-te.Las microparcelas se fertilizaron con un com-plejo NPKS después del t ransplante(15:15:15:15) y un año después con un com-plejo similar (NPKS 12:12:17:15), se regaronpor goteo a satisfacción de demanda con aguade río (dos goteros de 4 l/h por plantón), y los

DOSSIER OLIVAR

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FIGURA 4.Efecto del tratamiento con Bioten sobre el desarrollo de laverticilosis del olivo en condiciones de campo.

Plantones de Picual de seis meses de edad cuyo cepellón radical se trató con unasuspensión de Bioten al 5% en agua desionizada estéril (Bioten), o sólo con ésta,se incubaron 3 meses a 25±1º C, se transplantaron a microparcelas solarizadasinfestadas o no conV. dahliae defoliante (Vd), y se trataron o no con Bioten® al 2%en el momento del transplante, y de nuevo con Bioten al 1% aproximadamente 1año después de éste.A) Curvas de progreso de severidad de síntomas de Verticilo-sis (estimada por la proporción de tejido aéreo afectado en una escala 0-4; 0 = sinsíntomas, 4 = planta muerta) en plantas control (Vd) y tratadas con Bioten (Vd+Bioten®). La flecha señala el segundo tratamiento con Bioten. Cada valor es me-dia de 12 plantas. B) Incidencia (proporción de plantas afectadas) y severidad deVerticilosis en plantas control y tratadas con Bioten® a los 4, 10, 16, y 22 mesestras el transplante e inoculación con V.dahliae en el mes de marzo de 2007.C) Pe-riodo de incubación = tiempo transcurrido desde la inoculación hasta la apariciónde los primeros síntomas; Incidencia = Proporción de plantas afectadas; Severi-dad = Proporción de tejido aéreo afectado estimada en una escala 0-4 (0 = sinsíntomas, 4 = planta muerta).AUDPC = Área bajo la curva de progreso de la seve-ridad de enfermedad estandarizada por el tiempo de desarrollo de ésta.Letras dis-tintas en las barras de un histograma correspondiente a un método de inoculaciónindican diferencias significativas entre plantones tratados y no tratados, según elcontraste de la mínima diferencia significativa protegida de Fisher (LSD) a P ≤0,05. (Véase el texto para más detalles).

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plantones se trataron con clorpirifos al 0,2% yabamectina 1,8 al 0,2%. Las plantas arvensesse retiraron de las microparcelas manualmente.

El experimento tuvo un diseño en parcelassub-subdivididas,siendo la infestación del sue-lo con V. dahliae el factor principal y el trata-miento con Bioten el factor subordinado, conseis repeticiones (microparcelas) completa-mente al azar.El desarrollo de verticilosis en lasmicroparcelas se evaluó por la incidencia deplantas sintomáticas, la severidad de los sínto-mas en plantas individuales y el ABCPE,que seestimaron y analizaron estadísticamente segúnlo descrito para los experimentos en cámara decrecimiento. La infección de los plantones porV. dahliae se confirmó mediante aislamientodel patógeno de ramas afectadas y hojas caí-das de plantas enfermas en PDA.Dichas hojasse mantuvieron sobre el suelo de las micropar-celas durante el curso del experimento.El expe-rimento se finalizó a principio del mes de juliode 2009 por lo que tuvo una duración de vein-tiocho meses tras el trasplante.

ResultadosLos plantones no inoculados con V.

dahliae crecieron sin síntomas y no seapreció efecto alguno del tratamiento conBioten. Además, aislamientos microbioló-gicos de hojas y ramitas asintomáticas deplantones tratados, realizados ocasional-mente durante el experimento, resultaronconsistentemente negativos tanto respec-to de V.dahliae como de Trichoderma spp.En los plantones inoculados, los primerossíntomas de verticilosis se desarrollaron aprincipios del mes de junio de 2007,apro-ximadamente tres meses después deltransplante,tanto en plantones control (se-veridad media 1,1 en la escala 0-4) comoen los tratados con Bioten (severidad me-dia 0,6) (figura 4a),y correspondieron fiel-mente a las característicos del síndromedefoliante de V.dahliae (i.e., caída profusade hojas cloróticas o asintomáticas).La en-fermedad afectó al 75% de los plantonesno tratados 4 meses después de la inocu-lación, al 92% de ellos a los 10 meses deaquélla, en enero de 2008, y a todos losplantones 6 meses más tarde, en julio de2008 (figura 4b).Al final del experimento,veintiocho meses después del transplante,cuatro de los doce olivos no tratados habí-an muerto como consecuencia de la infec-ción por V.dahliae (figura 5a).

Comparativamente, la incidencia de

verticilosis en los plantones tratados con Biotenfue inferior en 17% y 33% a la de los controlesno tratados a los cuatro y diez meses de la ino-culación, respectivamente; si bien dicha inci-dencia aumentó hasta 83% seis meses mástarde, y a 92% a los veintidós meses de la ino-culación, en enero de 2009 (figura 4b). Noobstante, la incidencia de enfermedad en losplantones tratados se mantuvo siempre ligera-mente inferior a la de los controles no tratados,y ninguno de los plantones tratados con Biotenmurió como resultado de la infección porV.dah-liae. El efecto más notable del tratamiento conBioten fue la reducción de la severidad de sín-tomas de verticilosis en los plantones tratadoscomparada con los controles no tratados. Di-cha reducción fue claramente discernible des-de los cuatro meses del transplante e inocula-ción y se acentuó desde entonces con el creci-miento de la planta (figura 5b). Así, la severi-dad media en los plantones no tratados au-mentó de 1,1 a los cuatro meses de la inocula-ción a 2,2 y 2,4 a los dieciséis y veintidós me-ses de ésta, respectivamente; mientras que en

los plantones tratados con Bioten dicha severi-dad aumentó de 0,7 a 0,8 y 1,0 en los mismosperiodos,pero fue significativamente (P< 0,05)inferior en 1,4 unidades a la severidad de sínto-mas en los plantones no tratados, a los dieci-séis y veintidós meses de la inoculación (figura4a y 4b).Esta reducción de la severidad de sín-tomas, junto con la menor incidencia de ellosantes referida, determinó una disminución sig-nificativa (P < 0,05) de la cantidad total de en-fermedad en los plantones tratados reflejadapor el ABCPE (figura 4c). La infección por V.dahliae redujo el crecimiento de la plantones,pero la reducción en el desarrollo de verticilosisconferida por los tratamientos con Bioten ate-nuó dicho efecto. En los plantones tratados, laenfermedad desarrollada dio lugar a una re-ducción del 29% del perímetro en la base deltronco y del 58% en el peso fresco de la planta.Sin embargo, dichos perímetro y peso frescofueron, respectivamente,1,5 y 1,3 veces supe-riores en los plantones tratados con respecto alos no tratados (datos no mostrados).

Discusión yconclusiones

Los resultados de este trabajo indicanconvincentemente que las estirpesICC012 de T. asperellum e ICC080 de T.gamsii que componen el formulado Biotentienen el potencial de reducir el desarrollode verticilosis en plantones de olivo,en ex-tensión adecuada para utilizar el productoen una estrategia de manejo integrado dela enfermedad basado en la capacidaddel olivo de la planta adulta de recuperar-se de síntomas moderadamente severos.Dicho potencial de biocontrol se ha de-mostrado de forma reproducible en experi-mentos repetidos en ambiente controladocon condiciones ad hoc para el desarrolloóptimo de verticilosis,que incluyó la var.Pi-cual muy susceptible al patotipo D de V.dahliae, densidad de inóculo de éste queen investigaciones anteriores aseguraronel desarrollo de infección severa (Merca-do-Blanco et al., 2002; 2004) y tempera-tura de incubación favorable para el pató-geno y la enfermedad.

El nivel de biocontrol de la enfermedadalcanzado en dicho escenario experimen-tal varió con el procedimiento de inocula-ción; de manera que la reducción de verti-cilosis fue superior y más consistentecuando los plantones autoenraizados se

FIGURA 5.Efecto del tratamiento con Bioten sobre el desarrollo dela verticilosis del olivo en condiciones de campo.

Plantones de Picual de seis meses de edad cuyo cepellón radical se tratócon una suspensión de Bioten® al 5% en agua desionizada estéril (Bioten),o sólo con ésta, se incubaron 3 meses a 25±1ºC,se transplantaron a micro-parcelas solarizadas infestadas o no con Verticillium dahliae defoliante(Vd), y se trataron o no con Bioten al 2% en el momento del transplante, y denuevo con Bioten® al 1% aproximadamente 1 año después de éste.A) Plan-tas control no tratadas con Bioten® severamente afectadas por Verticilosis(nótense el plantón muerto señalados por la flecha), 28 meses después dela inoculación con V.dahliae. B) Plantas tratadas con Bioten,28 meses des-pués de la inoculación con V. dahliae (nótese la menor severidad de sínto-mas y mayor desarrollo comparado con las plantas control).

Verticilium dahliae

Verticilium dahliae + Bioten ®

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inocularon por inmersión del sistema radicalen una suspensión de conidias del patóge-no, que dio lugar a una elevada incidencia yseveridad de enfermedad en los plantonesno tratados inoculados con V. dahliae. Eneste caso,el efecto más consistente del bio-control fue la reducción de la severidad desíntomas de verticilosis, que fue siempre in-ferior en más de 30% a la del control no tra-tado con el formulado Bioten,aunque la inci-dencia de enfermedad también resultó redu-cida en proporción variable dependiendo dela combinación experimental. Comparativa-mente, la inoculación por transplante a sue-lo infestado por el patógeno determinó ma-yor variabilidad experimental y menor desa-rrollo de enfermedad en los plantones no tra-tados con Bioten, que ha dificultado la valo-ración de los efectos del formulado como es-tadísticamente significativa. No obstante, eltratamiento con Bioten también redujo encierta extensión la incidencia y severidad desíntomas de verticilosis en comparación conlos controles no tratados. Los mecanismosque subyacen en la supresión de verticilosisen olivo por las estirpes de T.asperellum y T.gamsii no han sido objeto de esta investiga-ción, ni son aun conocidos. Numerosas in-vestigaciones sobre el control biológico deenfermedades de plantas indican que el bio-control puede resultar de uno o varios meca-nismos, incluyendo:

• La competición por nutrientes, nichosecológicos o zonas de infección.

• La inhibición directa del patógeno me-diante antibiosis o lisis.

• El parasitismo.• La inducción de la expresión de meca-

nismos de defensa innatos en la planta(Cook y Baker,1983).

En nuestros experimentos,que la supre-sión de enfermedad se produjera tanto enprocesos de infección que promueven el ac-ceso del inóculo directamente al xilema (i.e.,inmersión radical),como en los que promue-ven la penetración de tejido radical intacto(i.e., transplante a suelo infestado), sugiereque en dicha supresión puede intervenir másde un mecanismo.

La supresión de verticilosis por el trata-miento con Bioten en condiciones controla-das fue reproducido en condiciones de cam-po que simularon un proceso de plantacióncomercial. Dicha supresión también se ca-racterizó por la reducción global de la severi-dad de síntomas en los plantones tratados,

que determinó una disminución significativadel 60% en el ABCPE.En esta reducción subya-ce el incremento de la proporción de tejidosano respecto del sintomático con el creci-miento del plantón, sugiriendo que no tuvieronlugar nuevas infecciones por V.dahliae en el te-jido radical formado de novo,a pesar del conti-nuado aporte de nuevo inóculo del patógenoque se produjo en las microparcelas por las ho-jas infectadas que cayeron de las plantas afec-tadas por la enfermedad. Indirectamente, la re-ducción global de la cantidad de enfermedadconferida por los tratamientos con Bioten tam-bién puede repercutir positivamente sobre laepidemiología de la verticilosis del olivo,en tan-to que contribuye a reducir el aporte de hojas in-fectadas porV.dahliae D sobre el suelo.En esteescenario,merece ser resaltado el elevado po-tencial de enfermedad determinado por la ele-vada densidad de inóculo en el suelo de las mi-croparcelas (650 propágulos/g suelo seco).Dicho potencial quedó reflejado por la prontaaparición de los primeros síntomas de verticilo-sis a los cuatro meses de la inoculación y el100% de incidencia de enfermedad en losplantones no tratados doce meses después.Comparativamente, López-Escudero y Blanco-López (2007) tardaron ocho meses en obser-var los primeros síntomas de verticilosis enplantones Picual transplantados a suelo infes-tado con 10 microesclerocios/g suelo de V.dahliae D,y fueron necesarios veinticuatro me-ses para alcanzar una incidencia de enferme-dad de 55%.Por el contrario,en plantones simi-lares en nuestro experimento el mismo patotipoD había causado una incidencia de 91% deverticilosis en los controles no tratados con Bio-ten a los diez meses de la inoculación.

En nuestros experimentos,como ocurre ge-neralmente en estudios de control biológico deenfermedades de plantas, el tratamiento conlos agentes de biocontrol no impidió el desarro-llo de verticilosis pero redujo de forma significa-tiva la cantidad de enfermedad.Además, el ni-vel de supresión alcanzado con las estirpes deTrichoderma spp.de Bioten es comparable conel de investigaciones similares con el mismo odiferentes patosistemas y agentes de biocon-trol (por ejemplo: Hervás et al., 1998; Landa etal., 2001; Mercado-Blanco et al., 2004). Elloindica que los tratamientos de biocontrol de-ben ser concebidos y comprendidos como uncomponente más de una estrategia de manejointegrado de enfermedades de cultivos (Landaet al.,2004),en este caso la verticilosis del oli-vo. En la verticilosis del olivo, dicha estrategia

debe ir dirigida a obviar escenarios de altopotencial inicial de enfermedad medianteacciones previas a la plantación,e incluye laelección de suelos que contengan la menorcantidad posible de inóculo virulento del pa-tógeno,el empleo de las variedades de olivomenos susceptibles al patotipo D de V. dah-liae,la utilización de plantones certificados li-bres del patógeno, y la protección de éstoscontra infecciones subsiguientes a su plan-tación (Jiménez Díaz et al.,2003; Tjamos y Ji-ménez-Díaz, 1998). Posiblemente, la utiliza-ción para nuestros experimentos de planto-nes Arbequina (menos susceptibles que Pi-cual) habría potenciado el nivel de supresiónde verticilosis derivado del tratamiento conBioten (Jiménez Díazet al.,no publicado).Fi-nalmente, la utilización de Bioten en una es-trategia de control integrado de la verticilosisdel olivo aconseja que el tratamiento del sis-tema radical del plantón durante la produc-ción viverista vaya acompañado por la subsi-guiente aplicación periódica del productodurante los dos primeros años de planta-ción, a fin de asegurar el adecuado estable-cimiento del árbol y en previsión del accesode nuevo inóculo del patógeno a través deagua o restos vegetales infestados (Jiménez-Díaz et al.,1998; 2008b; Navas-Cortéset al.,2008; Rodríguez Jurado y Bejarano Alcázar;2007). En la actualidad, Bioten es el únicoproducto biológico de uso fitosanitario auto-rizado en olivo para el control de la verticilo-sis.Aunque en el registro de productos fitosa-nitarios autorizados para el control de la en-fermedad se incluyen los fungicidas Proclo-raz y Folpet (http://www.mapa.es /es/agri-cultura/pags/fitos/registro), el control de laverticilosis del olivo mediante tratamientosfungicidas permanece por ser demostradoexperimentalmente a pesar de los numero-sos esfuerzos de investigación y experimen-tación que parecen haber sido realizados.l

Agradecimientos

Los autores (RMJD,JLTC,BBLC,y JANC) son miembros delGrupo de investigación AGR 136 “Sanidad Vegetal” delPAIDI, Junta de Andalucía. Las investigaciones de los au-tores referidas en este artículo han sido financiadas por elproyecto ‘Verticilosis del olivo’ subvencionado Isagro Es-paña,S.L.,la Fundación Ramón Areces y ayudas de inves-tigación del PAIDI, Junta de Andalucía.

BibliografíaExiste una amplia bibliografía a disposición de nuestroslectores que pueden solicitar en el e-mail: redaccion@eu-media.es.

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