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Efecto del surfactante sobre la fibrosis pulmonar: estudios in
vitro e in vivo
Efecto del surfactante sobre la fibrosis pulmonar: estudios in
vitro e in vivoDr. Luis Guillermo Vázquez de Lara Cisneros.
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SUSTANCIA TENSIOACTIVA PULMONAR (SURFACTANTE)SUSTANCIA TENSIOACTIVA
PULMONAR (SURFACTANTE)
Complejo lipoproteínico producido por los neumocitos tipo II, destaca en su composición un alto contenido de DPPC y la presencia de apoproteínas específicas
Complejo lipoproteínico producido por los neumocitos tipo II, destaca en su composición un alto contenido de DPPC y la presencia de apoproteínas específicas
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Composición del Surfactante Pulmonar (SP)
Composición del Surfactante Pulmonar (SP)
1 Y. Y. Zuo, et al., "Current perspectives in pulmonary surfactant--inhibition, enhancement and evaluation," Biochim. Biophys. Acta 1778(10), 1947 (2008).
PC insaturada33%
DPPC36%
PG10%
PE3%
PI1%
SPM2%
Chol2%
DG1%
Lyso-bis-PA2%
Proteinas 10%
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PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DEL SURFACTANTE
PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DEL SURFACTANTE
• HIDROFÓBICAS• SP-B• SP-C
• HIDROFÍLICAS• SP-A• SP-D
• HIDROFÓBICAS• SP-B• SP-C
• HIDROFÍLICAS• SP-A• SP-D INMUNIDAD NATURAL
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Sistema del surfactanteSistema del surfactante
• Función biofísica– Disminuye la tensión
superficial– Evita el colapso
alveolar– Estabiliza el alveolo– Disminuye el trabajo
respiratorio
• Función biofísica– Disminuye la tensión
superficial– Evita el colapso
alveolar– Estabiliza el alveolo– Disminuye el trabajo
respiratorio
2P
r
Ley de Laplace
Diámetro de la burbujaTe
nsi
ón
su
pe
rfic
ial m
N/m
2
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Sistema del surfactanteSistema del surfactante
• Función en la inmunidad:– Fracción lípida
• Bacteriostático
– SP-D• Aglutinación de bacterias
– SP-A• Opsonización de bacterias• Aumenta la fagocitosis por los macrófagos alveolares.• Modulación de la secreción de citocinas en macrófagos y
linfocitos alveolares
• Función en la inmunidad:– Fracción lípida
• Bacteriostático
– SP-D• Aglutinación de bacterias
– SP-A• Opsonización de bacterias• Aumenta la fagocitosis por los macrófagos alveolares.• Modulación de la secreción de citocinas en macrófagos y
linfocitos alveolares
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El surfactante en enfermedades pulmonares
El surfactante en enfermedades pulmonares
• Modificación de:– Concentración
• Enfermedad de membrana hialina
– Estructura• Deficiencia de SP-B o SP-C
– Función• Inactivación por proteínas, fosfolipasas, ácidos
grasos– SIRPA– Síndrome de aspiración de meconio– Infecciones
• Modificación de:– Concentración
• Enfermedad de membrana hialina
– Estructura• Deficiencia de SP-B o SP-C
– Función• Inactivación por proteínas, fosfolipasas, ácidos
grasos– SIRPA– Síndrome de aspiración de meconio– Infecciones
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Sistema del surfactanteSistema del surfactante
• Otras funciones:– Modulador de la actividad de células que no
pertenecen al sistema inmune• Fibroblastos pulmonares• ?
• Otras funciones:– Modulador de la actividad de células que no
pertenecen al sistema inmune• Fibroblastos pulmonares• ?
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Fibrosis Pulmonar IdiopáticaFibrosis Pulmonar Idiopática
• Se caracteriza por la proliferación de fibroblastos y acumulación de matriz extracelular
• Las regiones de lesiones crónicas con cicatrización y panalización contrastan con regiones de lesión aguda en donde se observan focos de fibroblastos y miofibroblastos que proliferan activamente .
Cool y col.
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FPIFPI
• Histológicamente se observan zonas fibróticas en forma de panal de abejas que se alternan con áreas aparentemente sanas.
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Fibrosis Pulmonar IdiopáticaFibrosis Pulmonar Idiopática
• Incidencia 30 casos por 100 000• No hay tratamiento• Muerte 3 a 5 años después de los
primeros síntomas
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PatogénesisPatogénesis
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Teoría de una reparación aberrante
Teoría de una reparación aberrante
• Activación aberrante del epitelio • Liberación de mediadores fibrogénicos
por parte de las células epiteliales• Estimulación de focos de fibroblastos,
disminuyendo su apoptosis y aumentando la liberación de factores fibrogénicos.
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ANTECEDENTESANTECEDENTES
• En algún momento de la patogénesis de la fibrosis pulmonar, los fibroblastos entran en contacto con el surfactante.
• El surfactante disminuye la proliferación y la secreción de mediadores de la inflamación en fibroblastos de pulmón.
• En algún momento de la patogénesis de la fibrosis pulmonar, los fibroblastos entran en contacto con el surfactante.
• El surfactante disminuye la proliferación y la secreción de mediadores de la inflamación en fibroblastos de pulmón.
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Efecto del surfactante sobre fibroblastos de pulmón
humano normal
Efecto del surfactante sobre fibroblastos de pulmón
humano normal
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OBJETIVOSOBJETIVOS
• Determinar el efecto sobre la tasa de crecimiento y apoptosis de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de surfactante.
• Determinar la expresión de mRNA para colágena tipo I, TIMP-1, MMP-1 en cultivos de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de las sustancias mencionadas.
• Determinar el efecto sobre la tasa de crecimiento y apoptosis de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de surfactante.
• Determinar la expresión de mRNA para colágena tipo I, TIMP-1, MMP-1 en cultivos de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de las sustancias mencionadas.
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EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA TASA DE CRECIMIENTO CELULAR EN MEDIO
SIN SUERO
EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA TASA DE CRECIMIENTO CELULAR EN MEDIO
SIN SUERO
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ENSAYO DE ELISA PARA FRAGMENTACIÓN DE DNA
ENSAYO DE ELISA PARA FRAGMENTACIÓN DE DNA
0
0.5
1
1.5
2
Control Survanta Survanta + SP-A
DE
NS
IDA
D O
PT
ICA
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EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLÁGENA
EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLÁGENA
1 2 3 4
1) CONTROL
2) SP-A 50 g/ml
3) SURVANTA 500 g/ml
4) SURVANTA + SP-A 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
CONTROL SP-A SURV SURV SP-A
RE
LA
CIO
N C
OL
AG
EN
A/1
8S
COLÁGENA
18 S
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EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE COLÁGENA EN EL
MEDIO DE CULTIVO
EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE COLÁGENA EN EL
MEDIO DE CULTIVO
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EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLAGENASA
EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLAGENASA
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
RE
LA
CIÓ
N C
OL
AG
EN
AS
A/G
AP
DH
R 0 0 0,36775056 0,17025796
1 2 3 4
1) CONTROL
2) SP-A 50 g/ml
3) SURVANTA 500 g/ml
4) SURVANTA + SP-A
1 2 3 4
COLAGENASA
18 S
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CONCLUSIONESCONCLUSIONES
• SURVANTA:– Induce la apoptosis en cultivos de fibroblastos
de pulmón humano normal.
– Disminuye la expresión génica y síntesis de pro 1(I) colágena.
– Aumenta la expresión génica de MMP-1 y actividad colagenolítica en el medio.
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En conjunto, estos resultados sugieren que el surfactante puede tener un
efecto antifibrosante In vivo
En conjunto, estos resultados sugieren que el surfactante puede tener un
efecto antifibrosante In vivo
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Efecto de la DPPC, el PG, y la PE sobre la expresión de colágena, en cultivos de
fibroblastos de pulmón humano normal
Efecto de la DPPC, el PG, y la PE sobre la expresión de colágena, en cultivos de
fibroblastos de pulmón humano normal
Yair Romero L
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ObjetivoObjetivo
Determinar el efecto de los fosfolípidos más representativos del surfactante pulmonar en la
expresión de colágena en fibroblastos de pulmón humano normal.
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Efecto de Survanta, DPPC, PG y PE 600 mg*L-1
sobre la expresión génica de colágena
Efecto de Survanta, DPPC, PG y PE 600 mg*L-1
sobre la expresión génica de colágena
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Efecto de los componentes del SP a dosis fisiológicas por 24 hrs.
Efecto de los componentes del SP a dosis fisiológicas por 24 hrs.
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Curva dosis respuesta de la PE a 48 hrs Curva dosis respuesta de la PE a 48 hrs
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Efecto de la PE 50 mg*L-1 en el tiempoEfecto de la PE 50 mg*L-1 en el tiempo
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ConclusionesConclusiones
• A dosis altas dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina disminuyen la expresión de colágena.
• A dosis que corresponden a la concentración del surfactante pulmonar en el interior del alveolo, sólo la PE disminuye significativamente la expresión de colágena.
• La fosfatidiletanolamina actúa de manera tiempo y dosis dependiente.
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Efecto del surfactante y la fosfatidiletanolamina sobre la fibrosis
pulmonar en un modelo in vivo
Efecto del surfactante y la fosfatidiletanolamina sobre la fibrosis
pulmonar en un modelo in vivo
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Modelo de fibrosis pulmonar in vivo
Modelo de fibrosis pulmonar in vivo
• Administración de bleomicina transtraqueal a ratones susceptibles.
• Cepa C57BL/6• Se midió:
– Curva ponderal de los animales– Colágena con la técnica de hidroxiprolina y/o
Sircoll– Analisis histopatológico
• Tinción de Masson
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Administración del surfacante pulmonar por vía inhalada
Administración del surfacante pulmonar por vía inhalada
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Protocolo para la administración de surfactante inhalado
Protocolo para la administración de surfactante inhalado
• Los fosfolípidos del surfactante se metabolizan aproximadamente en 48 horas.
• En el modelo de bleomicina, la fibrosis se obtiene alrededor del día 20
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Diseño experimentalDiseño experimental
Grupo 1
Solucion salina intrataqueal
Nebulizaciones con solución
salina
Grupo 2
Bleomicina intratraqueal
Nebulizaciones con solución
salina
Grupo 3
Bleomicina intratraqueal
Nebulizaciones con surfactante
Grupo 4
Bleomicina intratraqueal
Nebulizaciones con surfactante
+ PE
Grupo 5
Bleomicina intratraqueal
Nebulizaciones con PE
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Concentración de colágenaConcentración de colágena
Grupo n Colágena total (µg/mL) (promedio±SD)
p (comparado con grupo 2)
Control (grupo 1) 7 51.9 ± 22.1 .003Salina (grupo 2) 7 99.2 ± 8.1Survanta (grupo 3) 7 73.6 ± 18.8 .327Survanta enriquecido con PE (grupo 4)
6 51.02 ± 29.7 .004
PE 5 56.63 ± 24.1 .02
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Estudio histopatológicoEstudio histopatológico
H & E
M
Control (no bleomicina)
PESurvanta + PE
SurvantaSalina
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ConclusionesConclusiones
• El surfactante enriquecido con fosfatidiletanolamina mejora la fibrosis cuando es administrado tempranamente en el modelo murino de fibrosis pulmonar.
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IMPLICACIONESIMPLICACIONES
• En conjunto, estos resultados sugieren que la administración temprana de surfactante pudiera tener un efecto terapéutico en patología pulmonar que conduce a fibrosis del parénquima
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AgradecimientosAgradecimientos
• Yair Romero López• Nathalie Rosales• Beatriz Tlatelpa