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INFORMETÉCNICODELAOPCIÓNCURRICULARENLAMODALIDADDE:PROYECTODEINVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
ASESOR EXTERNO: Dr. Luc Dendooven ASESORA INTERNA: Dra. Olivia Franco Hernández
México, D. F. Junio 2009
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO
PRESENTA: Conrado Martínez Suárez
Evaluación de las Comunidades Microbianas en un Suelo del
Ex-lago de Texcoco Contaminado con Fenantreno y Antraceno, Utilizando Técnicas de Biología Molecular
II
III
AgradecimientosEn primer lugar quisiera agradecer a todos los integrantes del laboratorio de
Ecología de Suelos del Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del
CINVESTAV quienes me brindaron su apoyo en estos últimos meses, de manera
particularalassiguientespersonas:alM.enC.FabiánFernándezLuqueño,alM.en
C.CésarValenzuelaEncinas,alM.enC.EdgarVázquezNúñezyalDr.JavierDíazde
laSernaZavala,cuyaayudafuefundamentalparalaculminacióndeesteproyecto.
Además, al Dr. Luc Dendooven por su infinito apoyo y consejo; a la Dra. Olivia
FrancoHernández,porsusleccionesalolargodelaLicenciaturayasesoríaeneste
proyecto; a Eduardo Jiménez Zurita por su larga amistad y aportaciones a este
trabajo;amiscompañerosdelaUPIBIEfraín,Diana, JenniyGaby,porsoportarme
durante estos cuatro arduos años; y finalmente, demaneramuy afectuosa, amis
padresyfamiliaporhaberestadosiempreahíentodomomento.Muchasgracias.
IV
TABLADECONTENIDOS
RESUMENDELFORODEPROYECTOTERMINAL...............................................................VII1.INTRODUCCIÓN..................................................................................................................................... 1
2.JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................................................... 3
3.OBJETIVOS............................................................................................................................................... 43.1.Objetivogeneral............................................................................................................................ 43.2.Objetivosespecíficos .................................................................................................................. 4
4.MARCOTEÓRICO.................................................................................................................................. 54.1.Elsuelo.............................................................................................................................................. 54.1.1.Definicióndelsuelo ............................................................................................................ 54.1.2.Principalesfuncionesdelsuelo ..................................................................................... 54.1.3.Característicasypropiedadesfísico‐químicasdelsuelo.................................... 6
4.2.SuelosSalinosySódicos............................................................................................................ 74.2.1.UbicaciónydescripcióndelEx‐lagodeTexcoco.................................................... 74.2.2.CaracterísticasgeneralesdelossuelosdelEx–LagodeTexcoco ................. 8
4.3.HidrocarburosdelPetróleo ..................................................................................................... 94.3.1.HidrocarburosPolicíclicosAromáticos ..................................................................... 94.3.1.1.Riesgosalasalud ...........................................................................................................11
4.4.Tecnologíasparalaremediacióndesitioscontaminados........................................124.4.1.Tratamientoinsitu............................................................................................................134.4.2.Tratamientoexsitu ...........................................................................................................13
4.5.Biorremediación.........................................................................................................................134.5.1.Factoresinvolucradosenelprocesodebiorremediación...............................154.5.1.1.Factoresmedioambientales ......................................................................................154.5.1.2.FactoresFísicos ..............................................................................................................164.5.1.3.Factoresquímicos..........................................................................................................16
4.6.Utilizacióndemicroorganismosextremosenlabiorremediacióndehidrocarburos ......................................................................................................................................174.7.TécnicasdeBiologíaMolecularenelestudiodelaecologíadelsuelo ...............174.7.1.Perfiladogenotípicodelacomunidadmicrobiana(técnicasdehuellagenómica)..........................................................................................................................................184.7.2.ReacciónenCadenadelaPolimerasa(PCR) .........................................................194.7.3.Electroforesisengelcongradientedesnaturalizante(DGGE).......................22
5.METODOLOGÍA....................................................................................................................................245.1.Muestreodelsuelo ....................................................................................................................245.2.Preparacióndelsuelo...............................................................................................................245.3.DiseñoExperimentalytratamientospropuestos ........................................................245.3.1.Contaminacióndelsuelo ................................................................................................26
5.4.Análisisfísicosyquímicos......................................................................................................265.5.AnálisisdePAHs .........................................................................................................................275.5.TécnicasdeBiologíaMolecular............................................................................................28
V
5.5.1.ExtraccióndeDNAmetagenómicodelsuelo.........................................................285.5.2.AmplificaciónporPCRdelgen16SrDNA. ...............................................................285.5.3.AmplificaciónporPCRanidadaconpinzaricaenGCdeunfragmentode500p.b.delaregiónvariableV3delgen16rDNA. .........................................................285.5.4.Electroforesisengelcongradientedesnaturalizante .......................................30
6.RESULTADOS........................................................................................................................................326.1.CaracterizacióndelsuelodelEx‐lagodeTexcoco .......................................................326.2.Cinéticadedegradacióndefenantrenoyantraceno ..................................................336.3.AnálisisrespirométricodeCO2 ............................................................................................356.4.DinámicasdeNitrógenoinorgánico...................................................................................376.4.1.DinámicadeNH4+ ..............................................................................................................376.4.2.DinámicadeNO2‐ ...............................................................................................................376.4.3.DinámicadeNO3‐ ...............................................................................................................38
6.5.ExtraccióndeDNAmetagenómicodelsuelo .................................................................406.6.AmplificaciónporReacciónenCadenadelaPolimerasa(PCR)............................416.6.1.PCR1500p.b.delgen16SrDNA..................................................................................416.6.2.PCRanidadade500p.b.delaregiónvariableV3delgen16SrDNA ..........41
7.ANÁLISISYDISCUSIÓNDERESULTADOS...............................................................................447.1.Caracterizacióndelsuelo........................................................................................................447.2.CinéticadedegradacióndefenantrenoyantracenoyAnálisisrespirométricodeCO2 ......................................................................................................................................................447.4.DinámicadeNitrógeno............................................................................................................477.5.Perfiladogenotípicodelacomunidadpor16SrDNA–DGGE.................................497.5.1.Variacióndeladiversidad ..................................................................................................507.5.2.Análisisdeagrupamiento ..............................................................................................53
8.CONCLUSIONES...................................................................................................................................56
9.PROPUESTADECONTINUACIÓNYRECOMENDACIONESPARATRABAJOSFUTUROS.....................................................................................................................................................5710.REFERENCIAS....................................................................................................................................60
11.ANEXO...................................................................................................................................................63
VI
ÍndicedeTablas
Tabla4.1.Composicióndeproductosderivadosdelpetróleo………………………………….…………9Tabla4.2.HidrocarburosdelpetróleoquedebenanalizarseduranteunderramesegúnlaNOM–138–SEMARNAT2003…………...………………………………………………………………………….10Tabla4.3.EstructurasmolecularesdediversosPAHscomunes………………………….…………….11Tabla4.4.PrincipalescaracterísticasfísicasycarcinogénicasdelosPAHsprioritariosparalaUSEPA……………………………………………………………………………….……………………..……………….12Tabla4.5.Principalestecnologíasderemediacióndesuelosysuefectosobreloscontaminantes………………………………………………………………………………………………………………14Tabla5.1.Descripcióndetratamientosutilizadosenestainvestigación…………………..……….25Tabla5.2.ReactivosyconcentracionesutilizadasparalaamplificaciónporPCRdelgen16SrDNA………………………..…………………………………………………………………………….………………29Tabla6.1.CaracterizacióndelsuelodelEx‐lagodeTexcoco…………………………………...….……32Tabla6.2.ComparacióndemediasdeTukeyparafenantrenoyantracenoalolargodelaincubación………………………………………………………………….……………………………….....................…35Tabla6.3.ProducciónacumulativaydiariadeCO2paratodoslostratamientosdelaincubación………………………………………………………………………………………...………………………….37Tabla6.4.CuantificacióndeDNAmetagenómicodelsuelo……………………………………………...40Tabla11.1.Valoresdelacurvadecalibracióndelmarcadorλ‐styIparalacuantificacióndeDNA…….………………………………………………………………………………….……...…..63Tabla11.2.CuantificacióndelasextraccionesdeDNAparalosdías0y56…..……………….….64Tabla11.3a.Matrizdepresenciayausenciadebandas–Día0…………………………………..……67Tabla11.3b.Matrizdepresenciayausenciadebandas–Día56……………………………..........…67Tabla11.4a.Matrizdeintensidaddebandasdiscretas‐Día0…………………….………………….…68TablaA.4b.Matrizdeintensidaddebandasdiscretas‐Día56………………………..............………..68ÍndicedeFiguras
Fig.4.1.Diagramadeflujodelosdiferentesposibilidadesenlaaplicacióntécnicasdebiologíamolecularenelestudiodecomunidadesmicrobianas………….……………...……...……..20Fig.4.2.Diagramaesquemáticodelareacciónencadenadelapolimerasa(PCR)….………...21Fig.5.1.Diagramaesquemáticodelasunidadesexperimentalesutilizadasenlaincubaciónaerobiadelsuelo…………………………………………………………...……………..……………...26Fig.5.2.Diagramadebloquesdelametodologíaempleadaparalacontaminacióndelsuelo…………………………………………………………………………………............................................................27Fig.5.3.ProtocolodeamplificacióndePCR1500p.b.delgenrDNA16S………………......……....29Fig.5.4.DiseñoExperimentaldelproyectodeinvestigación………………………………..………….31Fig.6.1.CinéticadedegradacióndeFenantrenoyAntraceno……..……………………….….............34Fig.6.2.ProducciónacumulativadeCO2…………………………………………………………...…………..36Fig.6.3.DinámicadeNitrógenoinorgánico….....……………………………………………………...……….39Fig.6.4.ExtraccionesdeDNAmetagenómicodelsuelo……………………………………...……………40Fig.6.5.AmplificaciónporPCRde1500p.b.delgen16SrDNA……………………………….............41Fig.6.6.AmplificaciónPCRanidadade500p.b.delaregiónvariableV3delgen16SrDNA………………………………………………………………………………………………………………………….…42Fig.6.6.PerfilesgenotípicosdeDGGE……………………………………………………………………………..43Fig.7.1.Variacióndelladiversidadbacteriana………………………..……………………………………...52Fig.7.2.PorcentajededisminucióndelíndicedediversidaddeShannon(H´)………………….52Fig.7.3.Dendogramasdeagrupamiento……………….………………………………………….…………….56
VII
1
1.INTRODUCCIÓN
LosHidrocarburosPolicíclicosAromáticos(PAHs,porsussiglaseninglés)sonungrupode
contaminantes orgánicos formados por dos o más anillos bencénicos fusionados. Estos
compuestosseencuentrandistribuidosenelsuelo,mar,sistemasfluvialesysedimentos,y
supresenciaseatribuyeprincipalmenteaprocesosdecombustión incompletademateria
orgánica de fuentes naturales y antropogénicas, así como a los derrames y descargas
directasdepetróleoysusderivados.
Debidoalascaracterísticasdeestoscontaminantes(persistenciaenelambiente,toxicidad,
mutagenicidad y carcinogenicidad), la Agencia de Protección al Ambiente de los Estados
Unidos (USEPA) ha enlistado a quince PAHs como contaminantes prioritarios para la
remediaciónde entre los cualesquince sonpotencialmente carcinogénicosparahumanos
segúnreportesdelaAgenciaInternacionalparalaInvestigaciónenCáncer(IRAC)(Zhang,
etal.,2006).
En México no se cuenta con un estimado de las emisiones de PAHs al ambiente; sin
embargo, se conoceque lasactividadesquegeneranunamayorcantidadson: lasquemas
agrícolas y prácticas de roza, tumba y quema; la quema de combustibles fósiles para
producción de energía primaria (petróleo) y secundaria (combustóleo, gas natural y
gasolinas); la quema de leña en hogares; y finalmente, las actividades de explotación,
extracciónytransportedepetróleo(Fernández‐Bermauntzetal.,2004).
Diversos estudios han demostrado que la biodegradación de un amplio rango de
hidrocarburos(incluidoslosPAHs),puedeocurrirenvariadosambientesextremos(altaso
bajastemperaturas,pHácidoobásico,altasconcentracionesdesaloaltaspresiones).Estas
extraordinarias características, presentes en los microorganismos de dichos ambientes,
podríanseraprovechadasenmúltiplesaplicaciones,talescomoladegradacióndedesechos
orgánicosenpresenciadeaguas industrialesconaltoscontenidosdesales,abajasoaltas
temperaturas; en la remediación de derrames petroleros en ambientes como desiertos,
playas,ciénegas,entreotros(MargesinR.ySchinner,2001).
2
UncasodeambienteextremoloencontramosenlossuelosqueconformanlazonadelEx‐
lagodeTexcoco,modificadosporlaintensaactividaddedrenadoque,desdeelsigloXVII,se
ha llevado a cabo con el fin de evitar inundaciones en la Ciudad de México. Dichas
modificacionessemanifiestanencondicionesextremascomoconductividadeseléctricasde
hasta150dsm‐1ypHalcalino(8.5‐10.5)(Betancur–Galvisetal.,2006)
Investigar la degradacióndePAHs enun ambiente extremo comoel de los suelos salino‐
alcalinosdelEx‐lagodeTexcocoresultadegraninterésdebidoalasaltasexpectativasque
se tienen en cuanto a la identificación y aislamiento de microorganismos tolerantes y
degradadores de PAHs para su aplicación futura en tecnologías de biorremediación de
ambientescomolosquesehanseñalado;asícomoparaaportarevidenciasyconocimiento
científico relevante sobre losprocesosde atenuaciónnaturalde los contaminantes en los
ecosistemasterrestres.
ParadeterminarloanteriorserealizóunacinéticadedegradacióndedosPAHs(fenantreno
y antraceno) en una incubación aerobia durante 56 días con el objetivo de evidenciar la
capacidadderemociónquetienenlascomunidadesmicrobianasexistentesensuelosalino‐
alcalino del Ex‐lago de Texcoco. Además, se analizó el efecto de los PAHs y el medio
utilizado para su incorporación al suelo (acetona) sobre las dinámicas de nitrógeno
inorgánico y en el comportamiento respirométrico de los microorganismos edáficos.
Finalmente, se obtuvieron perfiles genotípicos de la comunidad bacteriana mediante la
técnicadeElectroforesisenGelconGradienteDesnaturalizante(DGGE)deunfragmentode
aproximadamente 500 pares de bases del gen 16S rDNA para analizar los cambios
estructuralesocurridosenlacomunidadmicrobianaduranteelperíodoincubación.
3
2.JUSTIFICACIÓN
SibienenlaactualidadnoexistecontaminaciónporHidrocarburosPolicíclicosAromáticos
en los suelos del Ex‐lago de Texcoco, el estudio de los efectos que estos contaminantes
tienen sobre la comunidad microbiana de un suelo salino‐alcalino permitirá evaluar la
posible utilización de microorganismos provenientes de este ecosistema para la
optimización de los procesos de remediación y biorrecuperación de suelos y ambientes
extremos similares. Además, este estudio coadyuvará a la comprensión ecológica de los
procesos de atenuación natural de estos contaminantes en sitios con características
ambientalesadversas.
4
3.OBJETIVOS
3.1.Objetivogeneral
Analizarelefectodelantracenoy fenantrenosobre la comunidadmicrobianadeunsuelo
salino–alcalinodelEx–lagodeTexcoco.
3.2.Objetivosespecíficos
• Evaluar la degradación aerobia de fenantreno y antraceno en un suelo salino–
alcalinodelEx‐lagodeTexcocoencondicionesdelaboratorio.
• Estudiar el efecto de la contaminación por fenantreno y antraceno sobre las
dinámicasdeNitrógenoinorgánicoenelsuelo.
• Analizar la estructura y dinámica de la comunidad microbiana del suelo al ser
contaminadoconfenantrenoyantraceno.
5
4.MARCOTEÓRICO
4.1.Elsuelo
4.1.1.Definicióndelsuelo
Elsueloesgeneralmentedefinidocomolacapasuperiordelacortezaterrestre,mismoque
estácompuestodepartículasminerales,materiaorgánica,agua,aireyorganismosvivos,y
es la interfaz entre la tierra (geósfera), el aire (atmósfera) y el agua (hidrosfera) (COM,
2002). Otra definición, de Ortiz‐Villanueva (1984), expresa que el suelo es el material
mineralno consolidado sobre la superficie terrestre, queha estado sujeto e influenciado
por factores pedogenéticos (o de formación de suelos) y del medio ambiente como el
materialmadre,elclima,losmacroymicroorganismosylatopografía,todosellosactuando
enunperíodode tiempoyoriginandounproducto–elsuelo–quedifieredelmaterialdel
cual es derivado en muchas propiedades y características (físicas, químicas, biológicas y
morfológicas).
4.1.2.Principalesfuncionesdelsuelo
DeacuerdoconlaComisióndelasComunidadesEuropeas(COM,2002)elsuelodesarrolla
unaseriedefuncionesambientales,económicasysocio‐culturalesdegranimportancia:
• Fuente de alimento y biomasa. Los alimentos y otros productos agrícolas,
esencialesparalavidahumana,asícomolasilviculturadependenensutotalidaddel
suelo. Prácticamente toda la vegetación –pastos, cultivos y árboles– necesita del
sueloparaobtenertantoaguaynutrientescomosoportefísico.
• Almacenamiento, transformación y filtración. El suelo almacena minerales,
materia orgánica, agua y varias sustancias químicas y contribuye en parte a su
transformación. Sirve de filtro natural de las aguas subterráneas, es la principal
reservadeaguapotable,yliberaCO2,metanoyotrosgasesalaatmósfera.
• Fuentedemateriasprimas.El sueloproporcionamateriascomoarcillas, arenas,
mineralesyturba.
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• Entorno físico y cultural para la humanidad. El suelo sirve de base a las
actividades humanas y es así mismo un elemento del paisaje y del patrimonio
cultural.
• Hábitat y reserva genética. El suelo es el hábitat de una gran cantidad de
organismosdetodotipoqueviventantoenelsuelocomosobreél,cadaunoconun
genotipoirreemplazable.Desempeña,porlotanto,unaseriedefuncionesecológicas
esenciales.
4.1.3.Característicasypropiedadesfísicoquímicasdelsuelo
• Textura.Serefierea laproporciónrelativadearena, limoyarcillaenel suelo.Es
una característica muy importante ya que afecta a otras propiedades (físicas,
químicasybiológicas).Engeneral, losde texturas finas (arcillosos)poseenmayor
capacidad de adsorción de nutrientes y sonmás fértiles. Los de texturas gruesas
(arenosas)sonmásporososypermitenunamásrápidainfiltracióndelagua(Ortiz‐
Villanueva,1984).
• MateriaOrgánica(M.O.).Provienedelasraíces,residuosdeplantasyorganismos
vivientes omuertos del suelo y suele representar en suelosmineralesmenos del
20%, así como en suelos orgánicos más de 20% de la composición total (Ortiz‐
Villanueva, 1984). La M.O. es de suma importancia en el suelo debido a que
desarrollalassiguientesfunciones(FassenderyBornemisza,1987):
a. Suministrodeelementosnutritivospormineralización(particularmente:N,
P,Symicronutrientes)paralasplantas
b. Aumentalacapacidaddeintercambiocatiónicoyaniónicodelossuelos.
c. Afecta la estructura del suelo, pues favorece la formación de agregados
individualesydisminuyesuplasticidad.
d. Mejora la retención y el drenaje del agua, y además disminuye la
evaporacióndelamisma
e. Sereducenlaspérdidasdelsueloporerosión(Ortiz‐Villanueva,1984).
• Intercambiode cationes.Puede serde tipo aniónico (sulfatos, fosfatos, cloruros,
nitratos)o catiónico (calcio,magnesio, sodio,potasio, amonio)y es llevadaa cabo
por las arcillas y coloides orgánicos del suelo. Esta propiedad sirve como fuente
importantedenutrientesparalasplantas(Ortiz‐Villanueva,1984)
7
4.2.SuelosSalinosySódicos
LaOrganizacióndeAgriculturay(FAO,porsussiglaseninglés)defineque,desdeelpunto
devistaagrícola,unsuelosalinoesaquélquecontienesuficientecantidaddesalesneutras
solublesparaafectaradversamenteelcrecimientodelamayoríadeloscultivosdeplantas.
DeacuerdoconRichards(1954)(Abron,Yadav,&Massoud,1988)unsuelosalinotieneuna
conductividadeléctricaenelextractodesaturaciónmayora4dSm‐1a25°C;sinembargo,la
SociedaddelaCienciadelSuelodeAmérica(SSSA,porsussiglaseninglés)hadisminuidoel
límitedeestossuelosconrespectoa losnosalinosaunvalorde2dSm‐1.Lasprincipales
sales presentes en suelos de esta clase son los cloruros y sulfatos de sodio, calcio y
magnesio. Se presentan en algunos casos niveles apreciables de nitratos. Muchos suelos
salinoscontienencantidadessignificativasdeyeso(sulfatodesodio)(Abronetal.,1988).
Lassalesenexcesomantienenlasarcillasdelossuelossalinosenunestadofloculado,porlo
que estos suelos suelen tener buenas propiedades físicas. La estructura de los mismos
sueleserbuenaylascaracterísticasdelabradoypermeabilidadalagualleganasermejores
quelasdesuelosnosalinos.Sinembargo,cuandoocurrelixiviaciónporaguabajaensales,
algunosdeestossuelostiendenadispersarseresultandoenunabajapermeabilidadalagua
yaire,particularmentecuandolossueloscontienenarcillaspesadas(Abronetal.,1988).
Porotraparte, los suelosdenominados comosódicos sonaquellosquedesdeelpuntode
vistadelaagricultura,presentanporcentajesdesodiointercambiablemayoresa15%,yque
de talmanera afectan el crecimiento de lamayoría de los cultivos. La principal causa de
reaccionesalcalinasdelossueloseslahidrólisisdeloscationesintercambiables,asícomo
desales:CaCO3,MgCO3,Na2CO3,entreotras(Abronetal.,1988).’
4.2.1.UbicaciónydescripcióndelExlagodeTexcoco
De acuerdo con la Red Hemisférica de Reservas para Aves Playeras (RHRAP)
(http://www.whsrn.org,2008)elEx‐LagodeTexcocoformapartedelacuencahidrológica
del Valle deMéxico, situada en el centro del Eje Neovolcánico que atraviesa el territorio
nacionaldesdelacostadelPacíficohastaelGolfodeMéxico,conunasuperficiede10,000
ha.Geográficamenteseencuentralocalizadoentrelosparalelos19º25’y19º35’N,yentre
8
los meridianos 98º55’ y 99º03’ O y abarca los municipios de Ecatepec, Atenco,
Chimalhuacán,NetzahualcóyotlyTexcoco,enelEstadodeMéxico,México.
El clima de este sitio es semiárido templado, con verano cálido, y precipitación pluvial
mínima de 460 mm y máxima de 600 mm por año. El área se encuentra a una altitud
promediode2230m.s.n.m.(Gutiérrez‐CastorenayOrtiz‐Solorio,1999).
SegúnlaRHRAP(http://www.whsrn.org,2008),conlosrecientestrabajosderecuperación
del área se han generado ambientes integrados por 6,000 ha de praderas de pastizales
halófitosde las especiesEgagrostis obtusiflora yDistichlis spicata, zonasdebosquede las
especies Tamarix spp., y Casuarina spp., charcas someras y zonas de tule; las 4,000 ha
restantes son embalses artificiales que regulan aguas residuales, tratadas y de origen
pluvial. La vegetación acuática y subacuática se encuentra representada por los tulares
Scirpuslacustris,S.californicus,S.paludosusyTyphaangustiflora.
4.2.2.CaracterísticasgeneralesdelossuelosdelEx–LagodeTexcoco
Los suelos en el áreahan sido formadospor cenizas volcánicas depositadas in situ en un
ambientelacustreycubiertorecientementepormaterialcoluvial.Elacuíferoestácercade
la superficie (80–150 cm); el agua subterránea es altamente salina y son dominantes las
sales NaCl y Na2CO3. Los suelos son salino‐sódicos con un pH entre 8.5 y 10.5, y
conductividades electrolíticas en extractos de saturación entre 4 y 70 dS m‐1. Además,
presentanporcentajesdesodio intercambiableelevados(60‐80%); la texturadel sueloes
delimosaaarcillosa,suestructuraesgranularenlasuperficieyprismáticaenelsubsuelo.
Los contenidos demateria orgánica se encuentran entre 20 y 50 g kg‐1 de suelo seco. El
drenaje natural es pobre y a pesar de que los suelos son profundos, las raíces están
restringidas por una capa de ceniza compacta de 5 a 20 cm de grosor a profundidades
medias(16‐40cm).Laintemperizaciónestáavanzada;unaevaporaciónalta(aprox.2000
mmaño‐1ylaprecipitaciónpluvial,relativamentebaja,incrementanlaconcentracióndesal
delasolucióndelsuelo(Luna‐Guidoetal.,2002)
9
4.3.HidrocarburosdelPetróleo
Elpetróleoysusproductosderivadossonmezclascomplejasdecompuestosorgánicos.En
laTabla4.1semuestranlosmayorescomponentesdelosdistintosproductosdelpetróleo.
Además, laNormaOficialMexicanaNOM–138–SEMARNAT–2003 (2005) establece límites
máximos permisibles de contaminación en suelos para diversos productos asociados a
derramesdehidrocarburos(Tabla4.2).
Tabla4.1.Composicióndeproductosderivadosdelpetróleo
FUENTE:NyerySkladany,1989(TomadodeBakeryHerson,1994)
4.3.1.HidrocarburosPolicíclicosAromáticos
Deentreloshidrocarburosdelpetróleopodemosdistinguiraungrupodecompuestosmuy
especiales, conocidos con el nombre genérico de Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos
(PAHs,porsussiglaseninglés).Estoscompuestoscontienendosomásanillosaromáticos
fusionados (Tabla 4.3), cuya persistencia bioquímica proviene de una densa nube de
electrones‐π a ambos lados de la estructura del anillo, haciéndolos resistentes al ataque
nucleofílico(Johnsenetal.,2005).
Producto ComponentesprincipalesGas Alcanos lineales y ramificados. Uno a cinco carbonos de
longitud,i.e.:etano,propano.Gasolina Hidrocarburoslinealesyramificados.Seisadiezcarbonosde
longitud.Cicloalcanosyalquilbencenostambiénpresentes.Keroseno/Combustibledieselno.1
Hidrocarburos linealesy ramificados.Onceadocecarbonosde longitud, principalmente. Alcanos lineales predominan.Cicloalcanos y aromáticos también presentes. Contienen debajasaindetectablesconcentracionesdebencenoyPAHs.Laturbosina(JetA)tieneunacomposiciónsimilar.
Gasóleosligeros Doceadieciochocarbonosdelongitud.Menorporcentajedealcanos lineales que en keroseno. Contiene cicloalcanos ycicloalcanosaromáticos,olefinasyolefinasaromáticascomoestirenos.Estosproductosincluyenaldieselycombustóleo.
Gasóleos pesados y aceiteslubricantesligeros
Hidrocarburosde18a25carbonosdelongitud.
Lubricantes Hidrocarburosde26a38carbonosdelongitudAsfaltos Compuestospolicíclicospesados
10
Tabla4.2.HidrocarburosdelpetróleoquedebenanalizarseduranteunderrameHidrocarburosProducto
contaminante Fracciónpesada
PAHs Fracciónmedia
PAHs Fracciónligera
BTEX
Mezclas X X X X X XPetróleocrudo X X Combustóleo X X Parafinas X X Petrolatos X X Aceites X X Gasóleo X X Diesel X X
Turbosina X X Keroseno X X Creosota X X Gasavión X XGasolvente X XGasolinas X XGasnaftas X X
FUENTE:NOM–138–SEMARNAT–2003(2005).
LosPAHsestánpresentesenpequeñascantidadesenlosproductosderivadosdelpetróleo,
talescomocombustóleosyaceitescrudos,yengrandescantidadesenlacreosotautilizada
en la preservación de madera (Baker y Herson, 1994). Estos compuestos resultan
omnipresentes en el ambiente como resultado de la combustión incompleta de materia
orgánica,fuentesdeemisión,gasesdecombustióndelosautomóviles,plantasgeneradoras
de energía eléctrica a base de carbón, materia doméstica y materia de fuentes de área
(Finlayson‐PittsyPitts,1997).
11
Tabla4.3.EstructurasmolecularesdediversosPAHscomunes
FUENTE:ModificadadeZhangetal.,2006
4.3.1.1.Riesgosalasalud
Los Hidrocarburos policíclicos aromáticos son ubicuos en el ambiente, lo que conlleva a
encontrarnivelesmediblesdeexposiciónenlapoblacióngeneral.Unafuentesignificativaa
exposicióndePAHs es el humodel tabaco; en los no fumadores y población expuesta no
ocupacional,ladietaesfrecuentementelamayorfuentedeexposiciónaPAHs(IARC,2006).
Sehaencontradoqueexisteunamayorexposiciónaestoscontaminantesentrabajadores
delasindustriasdegasificacióndecarbón,produccióndecoque,destilacióndealquitránde
hulla,conservacióndemaderasutilizandocreosota, produccióndealuminio,manufactura
deelectrodosdecarbono,produccióndecarburodecalcio,limpiezadechimeneas,asícomo
plantasdeenergíatermoeléctrica(IARC,2006).
EnunestudiorealizadoporlaIARC(2006)semencionaque,porejemplo,existeevidencia
deunmayorriesgodecontraercáncerdepulmónentretrabajadoresde laproducciónde
coque.Asuvez,sedeterminóquelostrabajadoresdeplantasdecoquedeEstadosUnidosy
Canadá,presentabanunamayorincidenciadecáncerdepulmónyqueelriesgoeramayor
enáreasdetrabajocercanasahornos.
PAH(no.anillos)
Estructuramolecular
PAH(no.deanillos) Estructuramolecular
Naftaleno(2)
Pireno(4)
Antraceno(3)
Benzo(a)pireno(5)
Fenantreno(3)
Coroneno(7)
12
Dadalaatenciónqueseledebeprestaraestoscontaminantes,laAgenciadeProtecciónal
Ambiente de los Estados Unidos (USEPA) ha enlistado 17 PAHs como contaminantes
prioritarios para la remediación (Tabla 4.4), de entre los cuales 15 PAHs son
potencialmente carcinogénicos para humanos según reportes de la Agencia Internacional
paralaInvestigaciónenCáncer(IRAC)(Zhang,etal.,2006).
Tabla4.4.PrincipalescaracterísticasfísicasycarcinogénicasdelosPAHsprioritariosparalaUSEPA
1ClasificacióndelaIARCdebidosuriesgocarcinogénicoahumanos:1)Carcinogénico,2A)Probablementecarcinogénico,2B)Posiblementecarcinogénico,y3)Carcinogenicidadnoclasificable.NR:Noreportado.FUENTE:Zhangetal.,2006
4.4.Tecnologíasparalaremediacióndesitioscontaminados
Las tecnologías disponibles para el tratamiento y remediación de sitios contaminados
pueden clasificarse inicialmente como: físicas, químicas y biológicas. En la Tabla 4.5 se
resumenlasprincipalestecnologíasexistentesasícomosuefectosobreloscontaminantes
PAHs Númerodeanillos
Solubilidada25°C(mgL1)
Coeficientedepartición
Octanol:Agua
Grupocarcinogénico1
Naftaleno 2 3.2 2.3x103 2BNaftilamina 2 4.6 1.4x103 1Acenafteno 3 3.4 2.1x104 NRAcenaftileno 3 3.93 1.2x104 NRFluoreno 3 1.9 1.5x104 3Antraceno 3 0.05–0.07 2.8x104 3Fenantreno 3 1.0–1.3 2.9x104 3Fluoranteno 4 0.26 3.4x105 3Criseno 4 0.002 4.0x105 3Pireno 4 0.14 2.0x105 3Benz(a)antraceno 4 0.01 4.0x105 2ABenzo(b)fluoranteno 5 NR 4.0x106 2BBenzo(k)fluoranteno 5 NR 7.0x106 2BBenzo(a)pireno 5 0.0038 1.0x106 2ADibenz(a,b)antraceno 5 0.0005 1.0x106 2ABenzo(g,h,i)perileno 6 0.0003 1.0x107 3Indenol(1,2,3‐c,d)pireno
6 0.062 5.0x107 2B
13
tratados. Los tratamientos de remediación, ya sean físicos, químicos o biológicos, pueden
clasificarse,deacuerdoalsitioenelquesellevenacabo,como:insituyexsitu.
4.4.1.Tratamientoinsitu
Laremediaciónserealizadirectamenteenelsitiodondesepresentólacontaminación.Su
principalventajaesque implicaunamínimaperturbacióndelsitioy tierrasaledañas.Los
procesos insitu,generalmente involucran ladistribucióndeaireyaguaa travésdelsuelo
contaminado,loquesevefavorecidopormediospermeablesybajaheterogeneidaddelas
condicionesfísicasydedistribucióndelacontaminación(Scullion,2006).
4.4.2.Tratamientoexsitu
Los procesos ex situ se llevan a cabo mediante una excavación del volumen de suelo
contaminado,yaseaonsite(sobreelsitio),i.e.compostajeolandfarming(biolabranza),oen
unidades de tratamiento como biorreactores. Este tipo de tratamientos ofrecen un gran
alcanceencuantoalmanejodecondicionesparaoptimizar laeficienciadel tratamientoy
paracontrolarelesparcimientodeloscontaminantes(Scullion,2006).
4.5.Biorremediación
Labiorremediaciónsedefinecomoelusodemicroorganismosoprocesosmicrobianospara
descontaminarydegradarcontaminantesdelambiente(BakeryHerson,1994).Elobjetivo
últimodelabiorremediaciónobiorrecuperaciónesmineralizarloscontaminantes,estoes,
transformaraquellos compuestosquímicosnocivos en compuestos inocuos, tales comoel
CO2o algúnotro gaso sustancia inorgánica, aguaymaterial celularpara losorganismos
responsablesdeladegradación(Eweisetal.,1999).
Las tecnologías ex situ en cuanto biorremediación son los biorreactores, landfarming,
compostaje y algunas otras formas de tratamiento en fase sólida. Por otro lado, las
tecnologías in situ pueden ser el bioventeo, bioestimulación y bioaumentación (Baker &
Herson,1994).
14
Tabla4.5.Principalestecnologíasderemediacióndesuelosysuefectosobreloscontaminantes
FUENTE:Scullion,2006
Labiorremediaciónofrecevariasventajas (BakeryHerson,1994)sobreotras tecnologías
convencionalesderemediación,algunasdeestasson:
• Puedeserrealizadaenelsitio,loqueeliminacostosdetransportación.
• Siserealizainsitulaperturbacióndelsitiosedisminuye
• Enocasiones,losprocesosdemanufacturaeindustrialespuedencontinuar,mientas
serealizalabiorremediación.
• Eliminapermanentementelosdesechos
• Permite el acoplamiento con otras técnicas de remediación en un tren de
tratamiento.
EfectosobreloscontaminantesTipodeRemediación
Tratamientooproceso Destrucción/
DegradaciónExtracción/Pérdida
Estabilización
Térmico x x Solidificación (x) xExtracciónconvapor x Aireación (x) X Lavado (x) X
FÍSICA
Electrorremediación (x) x Oxidación x x x
Reducción (x) x x
Hidrólisis x x
Solubilización (x) x
QUÍMICA
ManipulacióndepH (x) x x
Landfarming x (x) xBiopilas x (x) xCompostaje x (x) xBiorreactores x (x)
BIOLÓGICA(conmicroorga–nismos)
Biolixiviación x Fitoestabilización (x) (x) xFitoextracción (x) x (x)
Fitorremediación
Fitodegradación x (x) (x)
15
En contraste con las ventajas mencionadas, la biorremediación también presenta ciertas
limitacionesydesventajas(BakeryHerson,1994):
• Algunoscompuestos ‐cloradosometales,porejemplo‐noson fácilmente tratables
biológicamente.
• Para algunos compuestos químicos la degradación microbiana puede llevar a la
produccióndesustanciasmástóxicasomóvilesqueloscompuestosoriginales.
• Dadoquelabiorremediaciónesunatecnologíaespecíficaparacadasitio,loscostos
deevaluación, caracterizaciónydeterminacióndeviabilidadpuedensermásaltos
queparaotrastecnologíasconvencionales.
4.5.1.Factoresinvolucradosenelprocesodebiorremediación
Los factoresqueafectanel rendimientode labiorremediaciónpuedenclasificarseen tres
grandesgrupos:medioambientales,físicosyquímicos.Éstossedescribenacontinuación.
4.5.1.1.Factoresmedioambientales
Son aquellos necesarios para proporcionar las condiciones óptimas de crecimiento a los
microorganismos que llevan a cabo la biorrecuperación. Estos factores son: temperatura,
pH,disponibilidaddenutrientes,oxígenoyhumedad(Eweisetal.,1999).
Las bacterias de un suelo actúan habitualmente en el intervalo de 5 a 40ºC, aunque la
temperaturadependedecadaespecie.Confrecuencialosmohosylevadurassuelenrealizar
mejorsucometidoavaloresdepHbajosoneutros.Lamayoríadelosmicroorganismosse
desarrollanmejordentrodelrangodepHde6a9,encontrándoselascondicionesóptimas
decrecimientoentre7y8(Eweisetal.,1999).
Los nutrientes son aquellos compuestos químicos necesarios para el crecimiento
microbianoquenoproporcionanenergíaocarbono.Losmásimportantessonnitrógenoy
fósforo, cuyas cantidades son normalmente insuficientes en los sitios de recuperación
(Eweis,etal.,1999).
16
Eloxígenoeselreceptorfinaldeelectronesgeneralmenteempleadoenprocesosbiológicos
ytambiénesnecesarioenreaccionesredoxcatalizadasporenzimas.Lahumedadconstituye
otrofactormuyimportante,yaquelosmicroorganismosobtienenlosnutrientesnecesarios
para su crecimiento apartir de soluciones acuosas.Debido aque la solubilidaddelO2 en
aguaesbaja,contenidosmuyaltosdehumedadsetraducenenunabajadisponibilidadde
oxígeno(Eweisetal.,1999).
4.5.1.2.FactoresFísicos
Los factores físicos más importantes en la biorremediación son la disponibilidad de los
contaminantesparalosmicroorganismos,lapresenciadeaguaylaprovisióndeunaceptor
de electrones adecuado (Eweis et al., 1999). La disponibilidad constituye un concepto
complejo,relacionadoconlaafinidaddeloscontaminantesporlasfasessólidasygaseosas,
laestructuraintersticialdelasfasessólidasylapresenciadelascomunidadesmicrobianas
adecuadas(Eweisetal.,1999).
Beck et al. (1995), hacen énfasis en la naturaleza bifásica del desprendimiento del
contaminantedelafasesólida,endondeloscompuestosnosondegradadosodesprendidos
suficientemente rápido del suelo y la disponibilidad química y biológica decrece
rápidamenteenperíodosdeminutosahoras, luego lentamenteenperíodosdesemanasa
meses, debido a procesos de adsorción y difusión referidos como ageing (añejamiento),
relacionadosconlamateriaorgánicadelsuelo.
4.5.1.3.Factoresquímicos
El factor químico demayor importancia es la estructuramolecular del contaminante. La
capacidad para ser biodegradado está relacionada con factores tales como solubilidad,
grado de ramificación, grado de saturación y la naturaleza y efecto de los sustituyentes
(Eweissetal.,1999).
17
4.6. Utilización de microorganismos extremos en la biorremediación de
hidrocarburos
Sehademostradoqueunagrancantidaddeloshidrocarburosquecontaminanelambiente,
principalmente debido a la descarga accidental o a procesos industriales, pueden ser
degradados(mineralizadosotransformados)envariosambientesextremoscaracterizados
por bajas o altas temperaturas, pH ácido o alcalino, alta salinidad o altas presiones; y
aquellos adaptados a más de una condición, ofrecen un potencial especial para la
descontaminación biológica de hábitats donde varias condiciones extremas se presentan
simultáneamente(MargesinR.ySchinner,2001).
Sehademostradoqueenambientessalinos,tantoalgunasarqueascomootraseubacterias
puedendegradarunampliorangodecontaminantesorgánicos;sinembargo,éstasúltimas
se presentan como las más prometedoras, debido a que podrían poseer una diversidad
metabólica mucho mayor, ya que las enzimas utilizadas en su metabolismo de
biodegradaciónpodríanserdetipoconvencional(i.e.,norequierensal)ysimilaresalasde
microorganismosnohalófilos(Orenetal.,1992.CitadoenMargesinySchinner,2001).
4.7.TécnicasdeBiologíaMolecularenelestudiodelaecologíadelsuelo
El reciente surgimiento de investigaciones en ecología molecular, las cuales emplean
herramientas moleculares para resolver problemas ecológicos (Eguiarte et al., 2007), ha
proporcionado pruebas irrefutables de la existencia de una gran variedad de nuevos
microorganismos en el ambiente en cantidades y variedades comparativamente mucho
mayoresaaquellosmicroorganismossusceptiblesasercultivadosenlaboratorio(Rondon
etal.,2000).Además,sehaevidenciadoquedichoscultivosfallanalintentarreproducirlos
nichos ecológicos y relaciones simbióticas que se encuentran en ambientes naturales
complejos y que son requeridos para soportar el amplio espectro de la diversidad
microbiana(Nockeretal.,2007).
Dichas herramientas de la ecología molecualr se basan en general en la utilizaición de
moléculas orgánicas que funcionan como marcadores moleculares (i.e. ácidos grasos de
fofolípidos o ácidos nucléicos: DNA y RNA), los cuales están presentes en todos los
18
microorganismosypuedenserextraídosdeéstossinnecesidaddesercultivados(Nogales,
2005).
Existendiversasinvestigacionesyrevisiones,talescomoladeRappéyGiovannoni(2003),
que han determinado que, sólo 26 de los aproximadamente 52 linajes mayores o phyla
dentro del dominio Bacteria tenían representantes cultivables. En esta revisión se
menciona,porejemplo,el casodelphylumVerrucomicrobium,aerobioheterótrofoaislado
de ambientes de agua dulce, del cual tres de sus cinco subgrupos, no contienen ningún
representantecultivable.Enotroestudio(Dunbaretal.,1999),elcualanalizaladiversidad
decomunidadesen larizósferadepiñónendossuelosáridosdelsudoestede losEstados
Unidos,comparandolastécnicasdecultivoenlaboratorioyladelibreríasapartirdeclones
de16SrDNA,sedeterminóuntotalde34y498filotipos,respectivamente.Dichosfilotipos
correspondieron a 3 y 7 divisiones de bacterianas, para cada técnica, demostrando la
desigualdad existente entre las técnicas cultivables convencionales y las técnicas de
ecologíamolecularactuales.
4.7.1.Perfiladogenotípicodelacomunidadmicrobiana(técnicasdehuella
genómica).
Se conocen con este nombre una variedad de técnicas genotípicas que proporcionan un
patrón o perfil de la diversidad de la comunidad microbiana, y que están basadas en la
separación física de especies únicas de ácidos nucleicos (Muyzer, 1999). La principal
característica de estos métodos es que permiten el análisis simultáneo de múltiples
muestras,loquehaceposiblecompararladiversidadgenéticadecomunidadesmicrobianas
dediferenteshábitats,oestudiarelcomportamientodeunacomunidadindividualalolargo
del tiempo (Muyzer, 1999). Mediante el empleo de estos métodos, el análisis de
metagenomas proporciona información valiosa con respecto a la diversidad, riqueza de
especies y estructura poblacional. Así mismo, permite una comparación transversal de
diferentescomunidades,monitoreodecambios temporalescomoresultadodelcambioen
losparámetrosambientales,evaluacióndelosimpactosdelabiorremediaciónymodelado
ecológico(Nockeretal.,2007).
Algunas de las principales técnicas de huella o perfilado genómico se mencionan a
19
continuación:
1. Fragmentos polimórficos de longitud variable (RFLP) o Análisis de restricción deDNA
ribosomal(ARDRA).
2.Análisisautomatizadodelespaciadorintergénicoribosomal(ARISA)
3.Electroforesisengel congradientedesnaturalizante (DGGE)oElectroforesisengel con
gradientedetemperatura(TGGE).
4.PerfiladodeRNAdebajopesomolecular(LMWRNAfingerprinting)
5.Polimorfismodeconformacióndecadenasimple(SSCP)
6.DNApolimórficoamplificadoaleatoriamente
En la figura4.1semuestraundiagramade flujoqueresumelospasosen laaplicaciónde
técnicas debiologíamolecular para el estudiode la estructura, dinámica y funciónde las
comunidadesmicrobianasendiversosambientes,entreelloselsuelo.
Acontinuaciónsedaráunabreveexplicaciónacercadeunatécnicadesumaimportanciaen
labiologíamolecular:lareacciónencadenadelapolimerasa(PCR,porsussiglaseninglés).
Despuésdelocualseprofundizaráenunadelastécnicasdehuellagenómicamencionadas
anteriormente: DGGE; ya que esta técnica será ampliamente discutida a lo largo de este
trabajo.
4.7.2.ReacciónenCadenadelaPolimerasa(PCR)
La PCR es unmétodo de amplificación rápida deDNA in vitro, que tiene la capacidad de
multiplicarmoléculasdematerialgenéticohastamilesdemillonesdevecesenuntubode
ensaye, proporcionando grandes cantidades de genes para su clonación, secuenciación o
mutagénesis(Madiganetal.,2004).
LaPCR se lleva a cabode forma completamentebioquímica,mediante lautilizaciónde la
enzimaDNApolimerasa,lacualdirigelasíntesisdenuevoDNAdecadenasencillaapartir
deunDNAmolde,utilizandodeoxinucleótidoscomosustrato.Estavaliosaenzimasintetiza
DNAendirección5’a3’ypuedeagregarnucleótidosalextremo3’deunoligonucleótido
20
(llamado,iniciadoroprimer),elcualessintetizadosegúnlasecuencianucleotídicadeuna
regióndelgendeseado(Watsonetal.,2004;Madiganetal.,2004).
Acontinuaciónsemencionaránydescribiráncadaunade lasetapasquese llevan acabo
durantecadaciclodePCR(Fig.4.2)(Watsonetal.,2004;Madiganetal.,2004;Eguiarteet
al.,2007;Lodishetal.,2003).
Fig.4.1.Diagramadeflujodelosdiferentesposibilidadesenlaaplicacióntécnicasdebiologíamolecularenelestudiodecomunidadesmicrobianas.FUENTE:Muyzer,1998.
21
1. Desnaturalización inicial: Este
paso involucra la aplicación de
calor para lograr la separación de
las dos cadenas sencillas. Cuando
seutilizalaenzimaTaqPolimerasa
(proveniente de la bacteria
Thermus aquaticus), esta
temperatura suele ser de
aproximadamente95°C.
2. Desnaturalización: Este paso
inicia el bloque de repetición de
ciclos y se lleva a cabo a lamisma
temperaturadelpasoanterior.
3. Alineamiento: La temperatura se
reducehastaunos50–60°C,loque
permite la hibridación
(alineamiento) de los
oligonucleótidos específicos,
añadidos en altas concentraciones.
Las largas cadenas de DNA
permanecerán apartadas debido a
subajaconcentración.
4. Elongación: Los oligonucleótidos
hibridados servirán de iniciadores
(primers) para la síntesis de las
cadenas de DNA en presencia
de deoxinucleótidos (dNTPs) y
una enzima resistente a la
temperatura, tal como la Taq
polimerasa, mencionada
anteriormente. En este paso la
temperaturaóptimaesde72°C.
Fig.4.2.Diagramaesquemáticodelareacciónencadenadelapolimerasa(PCR).LosrectángulospequeñosrepresentanoligonucleótidosquesirvendeprimersparalasíntesisdecadenascomplementariasdeDNAdelgenespecíficomediantelaenzimaTaq.polimerasa.NótesequecadacicloadicionalduplicalacantidaddelfragmentodeDNAdeinterés.Alcabodeunos20ciclossetendránaproximadamenteunmillóndecopiasdecadamoléculaoriginal.FUENTE:Lodishetal.,2003.
22
Esta serie de pasos (2, 3 y 4, Desnaturalización – Alineamiento – Elongación) se repite
tantoscicloscomoseanecesario(e.g.35ciclos).
5. Elongaciónfinal:Alcompletarselosciclosdeamplificación,sevuelveaelevar
latemperaturaa72°Cparapermitirquelaenzimasinteticelosfragmentosque
pudieronhaberquedadoincompletos.
Luegodecadacicloelnúmerodecopiasdelasecuenciadeseadaseduplicará;porlotanto,
ésta aumentará de forma exponencial, mientras que cualquier otra secuencia de DNA
originalpermanecerásinamplificar.
4.7.3.Electroforesisengelcongradientedesnaturalizante(DGGE)
Comoyaseanalizó, laPCR,permiteamplificarunconjuntodegenesdeidénticotamañoy
delimitadosporunmismopardeiniciadoresocebadores;sinembargo,sisedesearealizar
elanálisisdeunacomunidadmicrobiana(paraunanálisisfilogenéticoodeterminarelperfil
genotípicodelacomunidad,porejemplo)esnecesariosepararesosfragmentosdeDNAde
mismalongitudperocondistintasecuenciadeparesdebases.Paraello,sepuederecurrira
la clonación molecular o cualquiera de las técnicas de huella dactilar que se enlistaron
anteriormente. Ahora, se explicará con detalle en que consiste la técnica conocida como
DGGE, de la cual existe una gran cantidad de estudios y revisiones sobre diversas
aplicacionesyambientesanalizados(Nockeretal.,2007;Muyzer,1999;Malik,2008)
Elprocedimientoestábasadaen laelectroforesisde fragmentosdelgen16SrDNA(500–
700p.b.)amplificadosporPCRengelesdepoliacrilamida,loscualescontienenungradiente
linealmentecrecientededesnaturalizantes(Muyzer,1993).LaseparaciónenunDGGEestá
basada en lamovilidad electroforética de unamolécula parcialmente fundida en geles de
poliacrilamida,lacualdecreceencomparaciónconladelaformacompletamentehelicoidal
de lamolécula (Muyzer,1993).Conforme lasmoléculasavanzana travésdel gel y seven
expuestas a condiciones desnaturalizantes cada vez más fuertes, los productos de PCR
alcanzanunpuntodondeocurrelaseparacióndelDNAdedoblehélice;esteseconocecomo
punto de fusión (melting point) de la molécula, el cual depende principalmente de la
longitud del producto, su contenido de Guanina y Citosina (GC) y la secuencia de
23
nucleótidos. Entre mayor la estabilidad intrínseca, mayor debe ser la condición
desnaturalizanteparaalcanzarladesnaturalización.(Nockeretal.,2007)
Dadoque cadaunade las secuenciade fragmentosparticulares varía, éstasdetendrán su
migración en diferentes posiciones en el gradiente desnaturalizante y así podrán ser
separadasefectivamentemedianteestatécnica.(Muyzer,1993).Laseparacióndecadenas
se consigue a través de los químicos desnaturalizantes formamida (0 – 40%) y urea (0 –
7M)yaunatemperaturaconstantede60ºCaproximadamente(Nockeretal.,2007).
Enlosgelescongradientedesnaturalizante,secuenciasadicionalesricasenGC,puedenser
incorporados en uno de los primers para modificar el comportamiento de fusión de los
fragmentos de interés hasta el grado en que cerca del 100% de todas las variaciones de
secuenciasposiblespuedenserdetectadas(Muyzer,1993).
4.7.4.Utilizacióndelgen16SrDNAcomomarcadormolecular
El desarrollo de técnicas que involucran el estudio de los ácidos nucleicos, DNA y RNA,
permiten estudiar la estructura microbiana a un nivel genético. Aunque en principio
cualquiergenpuedeserutilizadoconestefin,elgencondificantedelasubunidadpequeña
delRNAribosómico,16SrDNA,(ysuequivalenteeneucariotas,18SrDNA)esunexcelente
marcadormoleculardebidoalassiguientescaracterísticas(Muyzer,1999):
a) Estápresenteentodoslosorganismos.
b) Tiene regiones conservadas y otras altamente variables, lo que permite diseñar
primersysondasgeneralesyespecíficas.
c) Contieneunnúmeroadecuadodesecuenciasparainferirunanálisisfilogenético.
d) Esunimportantecomponentecelular,loquefacilitasudetección.
e) Se transfiere verticalmente, ya que se considera que no está sujeto a transmisión
horizontalentremicroorganismos(Nogales,2005)
24
5.METODOLOGÍA
5.1.Muestreodelsuelo
Lasmuestrasempleadasparaesteexperimentofuerontomadasdetressitiosdistintos(S1,
S2yS3),removiendolacubiertavegetalyrecolectandoelsuelodelacapasuperficial(0–
15cm).EstostressitiosestánubicadosenlazonadelEx‐lagodeTexcoco(N.L.19o30’’,W.L.
98o 53’) a una altitud de 2500 m.s.n.m., con una temperatura promedio anual 16° C y
precipitación anual promedio de 600 mm (principalmente de julio a septiembre). En
general, los suelos de ese sitio son salino‐alcalinos con presencia de sales como NaCl y
Na2CO3. El pH fluctúa entre 8.5 y 10.5, y la conductividad eléctrica (EC) en extracto de
saturaciónvade4a150dSm‐1yelsuelotieneunaltoporcentajedesodiointercambiable
(60‐80%)(Fernández‐Luqueño,etal.,2008).
5.2.Preparacióndelsuelo
Previamentealestablecimientode la incubación, la totalidaddelsuelo fuecribadoconun
tamiz de 5 mm, y ajustado a un 40% de su CRA mediante la adición de agua destilada.
Inmediatamentedespués fuepreincubadoenrecipientesdeplásticodurante10díaspara
reactivar la actividad microbiana del suelo. Se colocaron dos frascos en el interior del
recipiente,unocon100mLdeNaOH1MparacapturaelCO2producido,yelotrocon100
mL de agua destilada para evitar la desecación del suelo. El suelo fue aireado
periódicamenteparaevitarcondicionesdeanaerobiosis.
5.3.DiseñoExperimentalytratamientospropuestos
Untotalde90unidadesexperimentalessedispusieronparasersometidasaunaincubación
aerobiadurante56días.Cadaunadeestasunidades(Fig.5.1)seconformaronporunfrasco
ámbarde947mLdecapacidadalqueseañadióaguadestiladaparamantenerlahumedad
dentro de la unidad experimental; además se colocaron otros 2 frascos en su interior: el
primerocon20gsuelo(baseseca)ajustadoal40%desuCRAyaplicandolostratamientos
queseindicanposteriormente.Elsegundofrascocontenía20mLdesolución1MdeNaOH
paracapturarelCO2emitidodurantelaincubación.
25
Enelprimertratamiento(PAHs)elsuelosecontaminócon1200mgdefenantrenokg‐1SSy
520mgdeantracenokg‐1SS;estetratamientoseestablecióparatressitios(S1,S2yS3)y
por triplicado. En el segundo tratamiento (Acetona) el suelo se adicionó con 3 mL de
acetona; se estableció para un sitio (S1) y por triplicado. El tercer tratamiento contenía
únicamentelos20gdesueloysirviócomotratamientotestigo(Control);estetratamiento
seestablecióparaunsitio(S1)yportriplicado(Tabla5.1).
Además,seañadieron3unidadesadicionalesparacadadíademuestreo(3,7,14,28y56)
lascualesconteníanúnicamenteunfrascocon10mLdeaguadestiladayotromáscon20
mL de solución 1M de NaOH , que sirvieron como controles del CO2 presente en la
atmósfera.
Delas90unidadesmencionadasinicialmentesetomaron15(3Control,3Acetonay9
PAHs) que se utilizaron como tiempo cero y fueron analizadas inmediatamente para
determinar N inorgánico (NH4+, NO3‐, NO2‐), PAHs y CO2. Las unidades restantes (75) se
sellaron e incubaron por 56 días. Después de 3, 7, 14, 28, 56 días se tomaron las 15
unidades correspondientesy seanalizaronparadeterminarN inorgánico,PAHsyCO2.En
todosloscasosdemuestreo(0,3,7,14,28y56días)setomaron10gparadeterminación
deNinorgánico,1.5gparaextracciónyanálisisdePAHs;asícomo0.5gparalaextracción
deDNA(únicamentedías0y56);elsuelorestanteseconservóenultracongelacióna‐80°C
(Fig.5.4).
Tabla5.1.Descripcióndetratamientosutilizadosenestainvestigación
Tratamiento Nombre Características
1 PAHs20gsueloa+1200mgfenantrenokg‐1suelo+520mgAntracenokg‐1suelo+3mLAcetona
2 Acetona 20gsuelo+3mLAcetona
3 Control 20gsuelo
amasadesueloexpresadaenbaseseca
26
Fig.5.1.Diagramaesquemáticodelasunidadesexperimentalesutilizadasenlaincubaciónaerobiadelsuelo.Dentrodelfrascodemayorcapacidadseagregóaguadestiladaparamantenerlahumedaddentrodelmicrocosmos.Secolocaronademásdosfrascos,unocon20gsuelo(baseseca)preincubadoal40%CRAyaplicandoeltratamientocorrespondiente(PAHs,AcetonaoControl).Elotrofrascocontenía20mLdeNaOH1.0MelcualservíaparacapturarlasemisionesdeCO2.Lasunidadesexperimentalessesometieronaunaincubaciónaerobiadurante56días.
5.3.1.Contaminacióndelsuelo
Como ya se mencionó antes, el tratamiento 1 (PAHs) fue contaminado con 1200 mgfenantrenokg‐1 s.s.+520mgAntracenokg‐1 s.s.; esto se realizóde la formaque indicaeldiagramadelafigura5.2.Enelcasodelaadicióndeacetonaeneltratamiento2(Acetona),serealizaronlosmismospasosqueindicaeldiagrama,conladiferenciadequeseagrególamismacantidaddeacetonaenvezdesoluciónmadredePAHs.5.4.Análisisfísicosyquímicos
1. La medición de pH se realizó en una suspensión 1:2.5 suelo‐agua usando un
electrododevidrio(Thomas,1996).2. La determinación de conductividad eléctrica (CE) se realizó en extracto de
saturación(Rhoadeset.al,1989).3. La textura del suelo se determinó utilizando el método del hidrómetro (Gee y
Bauder,1986).4. Elcarbonoorgánicototalsedeterminóconunanalizadordecarbonoorgánicototal
TOC‐VCSN(SHIMADZU,USA).5. El carbono inorgánico se determinó mediante la captura de CO2 en 20 mL de
solución1MdeNaOH,tituladoposteriormenteconunasolución1MdeHCl.6. ElnitrógenototalseanalizómedianteelmétodoKjeldahl(Bremmer,1996)7. El N inorgánico (NH4+, NO2‐ y NO3‐) se determinó colorimétricamente en un
analizadorautomáticoSanPlusSystem–SKALAR(Mulvaney,1996).
27
Fig.5.2.Diagramadebloquesqueindicalametodologíaempleadaparalacontaminacióndel
suelo
5.5.AnálisisdePAHs
La extracciónde antracenoy fenantrenoen lasmuestrasde suelo se realizóutilizandoel
métodode extraccióndesarrolladopor Songet al. (1995), que en general sebasa enuna
seriede tresextraccionesutilizandoacetona comodisolvente, adiciónde sulfatode sodio
paraeliminarlahumedad,agitaciónenvórtex,bañodesonicaciónyseparacióndefasespor
centrifugación. Inmediatamente después, una alícuota de 2 µL se analizó en un
cromatógrafoHewlett‐Packard4890‐DGC(USA)equipadoconundetectordeionizaciónde
flama. Seutilizóuna columnaHP‐5deHewlett‐Packard (USA) conuna longitudde1.5m,
diámetrointernode0.53mmygrosordepelículade1.5µm.Comogasacarreadorseutilizó
Heconunflujode7mLmin‐1.Latemperaturadelhornoseajustóparaquefuerade140a
1.PreparacióndeunasoluciónmadredePAHscon8.00mgFenantrenomL‐1
acetonay3.47mgAntracenomL‐1acetona
Secontamiron5gdesuelo(baseseca)preincubadocon3mLdesoluciónmadre
corresponientesa24y10.4mgdeFenantrenoyAntraceno,respectivamente(queen20gdesueloseco,adicionan1200y520ppm,segúnelcaso)
Losfrascoscon5gdesuelocontamiandofueronsometidosaevaporaciónenunacámradevacío,hastaquesedejódepercibireloloraacetona
Cadamuestrasereinoculócon15g(baseseca)desueloparacompletaruntotalde20g
Lasmuestrasfueronsometidasala
incubaciónaerobiadurante0,3,7,14,28y
56días.
28
170°Carazónde2°Cmin‐1,manteniendolos170°Cpor5minyaumentadahasta280°Ca
30°Cmin‐1ymantenidaasípor10min.Latemperaturadelinyectorseajustóa280°Cyla
deldetectora300°C(Fernández‐Luqueñoetal.,2008)
5.5.TécnicasdeBiologíaMolecular
5.5.1.ExtraccióndeDNAmetagenómicodelsuelo
La extracción de DNA se realizó utilizando el PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO,
laboratories, Inc.), que en general se basa en: 1) lisis mecánica, 2) lisis química, 2)
eliminacióndeproteínas,RNAyácidoshúmicos,4) capturadelDNAaunamembranade
sílica, y 5) lavados con etanol. El producto final se diluyó en 60 µL de agua bidestilada y
esterilizada, y se almacenó en congelación a ‐20°C hasta su utilización en pasos
subsecuentes.
5.5.2.AmplificaciónporPCRdelgen16SrDNA.
EL DNA extraído fue utilizado como molde para la amplificación del gen 16S rDNA. El
contenidodelamezcladereacción(V=25μL)semuestraenlaTabla5.2.Elpardeprimers
queseemplearonsonel46F(5'‐GCCTAACACATGCAAGTC‐3′)(YuandMorrison2004)y
el 1540R (5'‐AAG GAG GTG ATC CAG CCGCA‐3') (Edwards et al., 1989). Los ciclos de
amplificación se llevaron a cabo en un equipo Touchgene Gradient FTGRAD2D (TECHNE
DUXFORT,Cambridge,UK),deacuerdoalprotocoloquesemuestraenlaFig.5.3.
5.5.3.AmplificaciónporPCRanidadaconpinzaricaenGCdeunfragmentode500
p.b.delaregiónvariableV3delgen16rDNA.
Apartirdelproductoamplificadode1500p.b.delgen16SrDNAserealizóunaPCRanidada
utilizandolosprimers46F(5'‐GCCTAACACATGCAAGTC‐3′)(YuyMorrison2004)y534R
(5'‐ATT ACC GCG GCT GCT GG ‐3') (Muyzer et al., 1993)., al primero de los cuales se le
agregalasiguientesecuenciaenelextremo5'paraobtener:46FGC:CGCCCGCCGCGCGCG
GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG.Elcontenidodelamezcladereacciónsemuestra
en la Tabla 5.3. El protocolo de ampliación se modificó con respecto del anterior en la
temperaturadealineación,lacualseelevóde57°Ca59°Cparaaumentarlaespecificidadde
29
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T(°C)
t(min)
lareacciónyde35a30ciclosdeamplificación;todaslasdemáscondicionespermanecieron
sincambios.
Tabla5.2.ReactivosyconcentracionesutilizadasparalaamplificaciónporPCRdelgen16SrDNA
Reactivo(concentración
inicial)
Vol(µL)
Concentraciónfinal
Reactivo Vol(µL)
Concentraciónfinal
PCR Buffer(10x)
2.5 1 BSA 7.5 30%
MgCl225mM 2.0 4.0 H2O 8.625 34.5%PrimerFyR 1.25 0.5cadauno DMSO 1.5 6%Taq. Polimerasa(5u/μL)
0.125 0.625 DNA 1 ≈0.2μg
dNTP´s (dATP,dGTP, dCTP ydTTP)
0.4 200μM(cadauno)
Fig.5.3.ProtocolodeamplificacióndePCR1500p.b.delgenrDNA16S
x 35 ciclos
93°C
57°C
72°C 72°C
4°C
93°C
10 min 1 min
1 min
2 min 10 min
∞
30
5.5.4.Electroforesisengelcongradientedesnaturalizante
Paraobtenerelpatróndebandeode losproductosde laregiónvariableV3(0.5Kpb) de
cada tratamiento, días 0 y 56, se realizó la técnica de electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante (DGGE) de acuerdo a reportes publicados porMuyzer (1993). Se colocó
aproximadamentelamismacantidaddeproductodePCRenungeldepoliacrilamidaal8%
m/v(37.5:1,acrilamida:bisacrilamida)enTAE0.5X ,conungradientedesnaturalizantede
45–60%(100%dedesnaturalizantescontienenurea7My formamida40%v/ven0.5X
TAE).Laelectroforesisderealizóaunatemperaturade60°C,inicialmentea170V(10min.)
y luego a 50 V (20 h.). Posteriormente a la electroforesis, los geles se tiñeron en una
solución de bromuro de etidio en TAE 0.5x durante 10 min. y se fotografiaron en un
transiluminadorUV.
31
Fig.5.4.DiseñoExperimentaldelproyectodeinvestigación
ExtraccióndeDNAtotaldelsuelo(MOBIO,laboratories,inc.)
Ampli�icaciónporPCRdelgencodi�icadordelasubunidad16SrRNA(1.5kpb)
Ampli�icaciónanidadadeunfragmentode0.5kpbconpinzaricaenGCdelgen16SrRNA
Análisisdelpatróndebandeodelproductoampli�icadomediantelatécnicadeDGGE(Muyzer,1993)
32
6.RESULTADOS
6.1.CaracterizacióndelsuelodelExlagodeTexcoco
DetallesdelacaracterizaciónrealizadaalsuelosemuestranenlaTabla6.1.
Tabla6.1.CaracterizacióndelsuelodelExlagodeTexcocoParámetros/unidades Valor
pHH2O 9.7
CapacidaddeRetencióndeAguaCRA(gkg1)a 569
Contenidodeagua(gkg1)a 12
Carbonoorgánico(gkg1)a 58.2
Carbonoinorgánico(gkg1)a 12.97
NitrógenoKjeldahltotal(gkg1)a 0.6
NNH4+(mgkg1)a 13.7
NNO3(mgkg1)a 3.5
NNO2(mgkg1)a 1.3
Conductividadeléctrica(dSm1) 7.6
Contenidodearcilla(gkg1)a 24
Contenidodelimo(gkg1)a 103
Contenidodearena(gkg1)a 873
Textura Arenofrancoso
aEstosvaloresestánexpresadosenbasesecadesueloCadavalorrepresentalamediade3repeticionesde3Sitiosdistintos(n=9)
33
6.2.Cinéticadedegradacióndefenantrenoyantraceno
El grado de eficiencia de extracción de PAHs por el método empleado fue de 98.9%,
considerandoqueseadicionaron1200mgfenantrenokg‐1suelosecoyquelaextracciónde
estecompuestoeneldía0(dondenohaexistidodegradaciónalguna)delaincubaciónfue
de1076mgfenantrenokg‐1sueloseco.Enelcasodeantracenolaeficiencia fuede97.3%
paraantraceno,considerandoqueseadicionaron520mgantracenokg‐1suelosecoyqueal
día0seextrajeron506mgantracenokg‐1sueloseco.
La cinética de degradación de PAHs muestra un claro descenso en la concentración de
fenantreno(FEN)a lo largodeltiempo;sinembargo,estadegradaciónnofuesignificativa
entodalaincubación,talycomolodemuestralacomparacióndemediasdeTukey(P<0.05)
(Tabla 6.2). Comopuedeobservarse en la Fig. 6.1a, lamayordegradación se lleva a cabo
entrelosdías3y7delaincubaciónalcanzandounaremocióndel29.5%;existiendoademás
unadiferenciasignificativaentreestosvalores.Entrelosdías7y14seobservadenuevoun
descenso en la concentración de FEN; sin embargo, la comparación de medias realizada
indica que no existe diferencia significativa entre estos valores. En días posteriores de la
incubaciónnosedetectóningúndescensoadicionalenlaconcentracióndeFEN.Alfinalde
laincubaciónselogródegradarun45%delcontaminante.
En cuanto a la degradación de antraceno (ANT), el comportamiento a lo largo de la
incubaciónfuesimilaralodescritoparaFEN.Laúnicadiferenciaesqueentrelosdías3y7
ladegradaciónnofuesignificativa(Tabla6.2);sinembargoentrelosdías7y14siocurrió
undescensosignificativodelaconcentracióndeANT.Al finaldela incubaciónsedegradó
un31%delcontaminante.
34
Fig.6.1.CinéticadedegradacióndeFenantrenoyAntracenoenelsuelodelExlagodeTexcocoenunaincubaciónaerobiadurante56días
ConcentracióndePAHs(mgkg1sueloseco)
35
Tabla6.2.ComparacióndemediasdeTukeyparafenantrenoyantracenoalolargodelaincubación
MDSeslaMínimaDiferenciaSignificativaentremedias(P<0.05)LosvalorescondiferenteletramayúsculaindicanqueexisteunadiferenciasignificativaentreellosTodoslosvaloresrepresentanlamediadenueverepeticiones(n=9)
6.3.AnálisisrespirométricodeCO2
LaproducciónacumulativadeCO2 (Fig. 6.2) semantuvo sindiferencias apreciables entre
lostratamientoshastaeldía14delaincubación.Sinembargo,eneldía28,eltratamiento
Acetona presentóunadiferenciamuyevidente con respectoa losotrosdos tratamientos
(PAHs yControl),quehastaesedíapermanecíansindiferenciasapreciables.Finalmente,
eneldía56de la incubación, los tres tratamientosevidencianproduccionesacumulativas
deCO2biendiferenciadas,siendoelordenascendentedeestas:Control<PAHs<Acetona.
EltratamientoAcetonafue9.2y2.2vecesmayorqueControlyPAHs,respectivamente.
Complementandolainformaciónanterior,sedeterminólaproduccióndiariadeCO2enmg
C‐CO2kg‐1suelosecod‐1.Estosvalores,resultadodelcálculodelapendienteentrecadadía
demuestreo, semuestran en la Tabla 6.3. En dicha tabla es posible apreciar que para el
tratamientoControllaproduccióndiariamásaltasemanifestóeneldía3delaincubación,
yquedespuésdeestepunto,dichaproduccióndecrecegradualmentehastavalores<1mg
C‐CO2kg‐1s.s.d‐1.Porotrolado,enelcasodeltratamientoAcetona,laproduccióndiariade
CO2disminuyóconsiderablementeeneldía7conrespectoaldía3(i.e.18veces).Después
deestepunto, lageneraciónaumentónotablementehastaalcanzarsuvalormásaltoenel
día28(152.9mgC‐CO2kg‐1s.s.d‐1),parafinalmentedescenderhastavaloressimilaresalos
presentados por el tratamientoPAHs en el mismo día. Por último, el tratamientoPAHs
presentóuncomportamientomuysimilaraAcetonahastaeldía7;despuésdeestepunto,
Fenantreno AntracenoDía Media Media
0 1076 A 506 A3 1088 A 542 A7 767 B 474 A14 610 B 368 B28 589 B 359 B56 624 B 351 B
MDS 257.38 105.71
36
laproduccióndiariasemantuvoenvaloresmuchomenores(3y5.2veces,paradía14y28,
respectivamente) son respecto a Acetona. En el día 56, la producción en PAHs fue
prácticamentelamismaaltratamientomencionado,rondandoéstosenvaloresde32±1mg
C‐CO2kg‐1s.s.d‐1.
Fig.6.2.ProducciónacumulativadeCO2enelsuelodelEx‐lagodeTexcocodelostratamientos:Control,PAHsyAcetonaenunaincubaciónaerobiade56días.
37
Tabla6.3.ProducciónacumulativaydiariadeCO2paratodoslostratamientosdelaincubación
ProducciónacumulativadeCO2
(mgCCO2kg1s.s)
ProduccióndiariadeCO2(mgCCO2kg1ss.sd1)
Día PAHs Acetona Control PAHs Acetona Control0 0.00 0.00 0.00 ‐ ‐ ‐3 99.82 97.38 44.00 33.27 32.46 14.677 107.04 112.63 77.52 1.81 3.81 8.3814 192.50 372.20 167.59 12.21 37.08 12.8728 606.38 2512.80 351.27 29.56 152.90 13.1256 1535.46 3383.86 368.87 33.18 31.11 0.63
Losvaloresrepresentanlamediade9(PAHs)o3(AcetonaySuelo)repeticiones.Cadavalordeproduccióndiariarepresentalapendienteentreunpardedíasdemuestreo(0,3,7,14,28y56)
6.4.DinámicasdeNitrógenoinorgánico
6.4.1.DinámicadeNH4+
LaconcentracióndelNH4+extraíbleensuelo (Fig.6.3a)para los tres tratamientos (PAHs,
Acetona yControl) disminuyó apreciablemente en los días 3 y 7, hasta concentraciones
próximasa23,14y3mgNkg‐1 sueloseco,respectivamente.ParaPAHs, laconcentración
se mantiene prácticamente constante hasta el día 28, para luego volver a disminuir
apreciablementeeneldía56hastaaproximadamente9mgNkg‐1sueloseco.ParaAcetona,
laconcentraciónsiguedisminuyendohastaaproximadamente2mgNkg‐1suelosecoenel
día28,yparaeldía56laconcentraciónseincrementaapreciablementehastaunos21mgN
kg‐1sueloseco.ParaControl, laconcentraciónsemantieneconstantehastaeldía28,pero
paraeldía56sepresentaunaumentosignificativodelaconcentraciónhastaunos9mgkg‐1
sueloseco.
6.4.2.DinámicadeNO2
En todos los tratamientos (PAHs, Acetona y Control) las concentraciones de NO2‐ se
mantuvieronmenoresa1.29mgNkg‐1sueloseco.Lasconcentracionesdeestecompuesto
paraeldía56fueron1.23,0.69y0.43mgNkg‐1suelosecoparaPAHs,ControlyAcetona,
respectivamente(Fig.6.3b).
38
6.4.3.DinámicadeNO3
Comoseobservaen laFig.6.3c, en todos los tratamientos (PAHs,Acetona yControl) se
presentóundescensonotableenlaconcentracióndeNO3‐hacíaeldía3,ubicándosetodos
ellosaproximadamenteen22mgNkg‐1sueloseco.Sinembargo,apartirdeestemomento
eltratamientoControlseempiezaacomportardeformadistintaalresto,yaqueseobserva
unaumentosostenidoenlaconcentracióndeNO3‐hastaalcanzarunaconcentraciónde56.7
mg N kg‐1 suelo seco en el día 56. Los otros dos tratamientos, presentan un descenso
apreciable en la concentración de NO3‐, siendo más notorio este decremento en el
tratamientoAcetona,llegandohasta10.8mgNkg‐1suelosecoeneldía56;mientrasqueel
tratamientoPAHstieneunaconcentraciónenestemismodíade20.2mgNkg‐1sueloseco.
39
Fig.6.3.DinámicadeNitrógenoinorgánicoenelsuelodelEx‐lagodeTexcocoparalos
tratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)enunaincubaciónaerobiade56días.
ConcentracióndeNitrógenoinorgánico(mgNkg1 sueloseco)
40
6.5.ExtraccióndeDNAmetagenómicodelsuelo
En la Fig. 6.4. se observa la imagen de un gel con las extracciones respectivas de los
tratamientos PAHs (T1), Acetona (T2) y Control (T3) de los días 0 y 56. El tamaño
aproximadodelasmoléculasdeDNAmetagenómicoextraídasesunpocomenora19329
p.b.deacuerdoconelmarcadorLambda‐styI(λ).
Fig.6.4.ImagendeungeldeagarosaconlasextraccionesdeDNAmetagenómicodelsuelodelEx‐lagodeTexcocodelostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)paralos
días0y56delaincubación.SeutilizóelmarcadordetamañoLambdastyI(λ).
Además, se calculóque la cantidaddeDNAextraído fueenpromediode0.8200y1.0922
mg, para los días 0 y 56, respectivamente (Tabla 6.4). Una explicaciónmás detallada de
cómo se llevó a cabo la cuantificación de DNA se presenta en el Anexo al final de este
documento.
Tabla6.4.CuantificacióndeDNAmetagenómicodelsuelo
TratamientosMasatotaldeDNAextraída
(mg)
Mediapordía(mg)
T1D0 4.7574T2D0 5.9406T3D0 5.8038
5.5006±0.6472
T1D56 6.1596T2D56 6.9486T3D56 8.829
7.3124±1.3713
Mediatotal 6.4065±1.3800
19329 7743 6223 4254 3472 2690 1882 1498 925 421
p.b. λ T1 T2 T3 T1 T2 T3 λ
D0D56
41
6.6.AmplificaciónporReacciónenCadenadelaPolimerasa(PCR)
6.6.1.PCR1500p.b.delgen16SrDNA
Seamplificóunfragmentodeaproximadamente1500p.b,comoloindicalaposicióndela
bandaobtenidayelmarcadormolecularutilizado(Fig.6.5).Seobservaunasegundabanda
menos intensa de un fragmento inespecífico de unos pocos pares de bases menos a la
deseada.
Fig.6.5.ImagendeungeldeunaPCRdeunfragmentodeaproximadamente1500p.b.delgen16SrDNAdelostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)paralosdías0y56dela
incubaciónymarcadorde1500p.b.6.6.2.PCRanidadade500p.b.delaregiónvariableV3delgen16SrDNA
Se amplificóun fragmentode aproximadamente500p.b. como lo indica la posiciónde la
banda amplificada y el marcador molecular empleado (Fig. 6.6). No se observa ninguna
banda inespecíficapor loqueseconfirmaque lacondicionesde laPCRempleadasson las
adecuadas para el fragmento. Además, la reacción negativa no amplificó ninguna banda
descartándosecualquierposiblecontaminacióndelasmuestras.
T1 T2 T3
a) D0 b) D56
T1 T2 T3
1500 p.b.
1500 p.b.
42
Fig.6.6.ImagendeungeldePCRdeunfragmentodeaproximadamente500p.b.conpinzaricaenGCdelaregiónvariableV3delgen16SrDNAdelostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)paralosdías0y56delaincubación,reacciónnegativa(–)ymarcadorde
500p.b.6.7.PerfiladogenotípicodelacomunidadporDGGE
Se obtuvieron los perfiles genómicos (o patrones de bandeo) de cada uno de los
tratamientos propuestos (PAHs, Acetona y Control) para los días 0 y 56 (Fig. 6.6)
utilizandoungradientedesnaturalizantede45–60%deureayformamida.Éstosperfiles
se analizan más adelante para determinar los cambios en la diversidad y estructura
bacterianadelsueloalcomienzoyfinaldelaincubaciónaerobiapor56días.
T1 T2 T3 ( - )
T1 T2 T3
a)D0
b)D56
500p.b.
43
Fig.6.6.ImágenesdedosgelesdeDGGEdelexperimentodelsuelodelExlagodeTexcococonlosTratamientos:T1=PAHs,T2=AcetonayT3=Control,paralosdíasD0(a)yD56(b).
Ambosgelestienenungradientedesnaturalizantede4560%UreaFormamidaysecorrierondemaneraconjuntaalmismovoltaje(45V)por20h.enTAE0.5Xaunatemperatura
constante(60°C).
a) b)
D0 T1 T2 T3 D56 T1 T2 T3
PAHs Acetona Control PAHs Acetona Control
44
7.ANÁLISISYDISCUSIÓNDERESULTADOS
7.1.Caracterizacióndelsuelo
ComoseobservaenlaTabla6.1,dentrode lasprincipalescaracterísticasdetectadasenel
suelo, podemos observar que el pHH2O es de 9.7, y que se encuentra dentro del rango
característicode los suelosdeeste sitio:8.5a10.5 (Luna,2002).Deacuerdoa laNorma
OficialMexicanaNOM–022–SEMARNAT–2000,estesuelosecaracterizacomoFuertemente
alcalino.Porotrolado,laconductividadeléctrica(C.E.)enelextractodesaturaciónresultó
de7.6dSm‐1,locualreflejalaaltasalinidadcaracterísticadeesossuelos;sinembargo,este
valor es cercano a los límites inferiores de CE reportados para el suelo del Ex‐lago de
Texcoco:0.4a70Sm‐1(Luna,2002).Deacuerdoalamismanorma,estesueleseclasifica
comoSalino.LacantidaddenitrógenoKjeldhalresultóde0.6gNkg‐1s.s.,locualconforme
alamismanorma,clasificaalacantidaddenitrógenototaldelsuelocomoBajo.
7.2.CinéticadedegradacióndefenantrenoyantracenoyAnálisisrespirométricode
CO2
Se calculó el porcentaje de recuperación de estos hidrocarburos mediante la técnica
utilizada(Songetal.,1995)enelsuelodelEx‐lagodeTexcoco,elcualfuede97%paraFEN
y90%ANT.Song(2002)enunestudiocomparativodediferentesmétodosdeextracción,
determinóqueestemismométodoparaunsuelocon0.5%dearcilla,1.5%delimoy98.2%
dearena,unpHde7.4y0.1%demateriaorgánica,laeficienciaderecuperaciónparaestos
PAHserade74.1y94.6%,respectivamenteparaFENyANT.Por lotanto,seobservaque
estatécnicadeextraccióndePAHsessumamenteefectivaparaunsueloarenofrancosodel
Ex‐lagodeTexcoco.
EnloquerespectaalacinéticadedegradacióndeFEN,sedeterminóqueparaeldía56se
tieneunporcentajede remociónde48%, Podemosobservardeacuerdoa lasFig.6.2ay
6.2b que la mayor parte de la remoción de FEN se realizó en los primeros 14 días del
experimento, y que en días posteriores la concentración se mantuvo prácticamente
asintótica. En el caso de ANT se observa el mismo comportamiento, sin embargo la
degradacióndeestecontaminantefuemenor(i.e.32.5%).
45
Beck,etal.(1995),mencionanqueenocasionesalgunoscompuestosnosondegradadoso
liberados suficientemente rápido del suelo, y que su disponibilidad química y biológica
decrece rápidamente en períodos de minutos a horas, y luego lentamente en períodos
semanas a meses, debido a procesos de adsorción y difusión conocidos como ageing o
añejamiento, que dependen de las diferentes características de la materia orgánica del
suelo.EnelcasodelosPAHssemenciona,además,quedebidoacaracterísticasfísicascomo
labajasolubilidadenagua(1.03‐1.3mgL‐1paraFENy0.05‐0.07mgL‐1paraANT)ylaalta
tasa de distribución de sólido:agua (Ko:w 1 = 2.9x104 paraFEN y 2.8x104 paraANT), estos
contaminantessuelenacumularseenlafasesólidadelambienteterrestre(Zhang,2006).De
acuerdoaloanterior,ademásdelabajatasadedegradaciónencontradaparaambosPAHs,
lamenorremocióndeANTenelsuelosepudodeberalamenorsolubilidadenaguayasu
mayortasadedistribuciónsólido:agua.
En cuanto al análisis respirométrico de CO2, como se describió anteriormente, el
tratamientoAcetona, fue el que presentó unamayor generación de CO2 a lo largo de la
incubación.,seguidaporeltratamientoPAHs,yfinalmenteelControl.
Laadicióndecontaminantesimplicó,debidoalabajasolubilidaddelFENyANTenagua,la
incorporación de éstos a través de un solvente orgánico (i.e. acetona). Es sabido, que la
acetona puede causar efectos tóxicos y en ocasiones irreversibles sobre las poblaciones
bacterianas y la microfauna del suelo (Brinch et al., 2001). Por esta causa se utilizó un
protocolo en el que solo el 25%del suelo es contaminado, y luego es reinoculado con el
suelo restante (no contaminado).Además, como seplanteó en la seccióndeMetodología,
ese25%desuelocontaminadoessometidoavacíoparalograrevaporareldisolvente;sin
embargo, aún cuando la acetona tiene una presión de vapor muy alta (231.06 mmHg a
25°C),laacetonaescompletamentemiscibleenagua(WHO,1998)porloquenoesposible
volatilizarlatotalidaddelaacetona,yunapartequedadisponibledurantelaincubación
Conformea loanterior, lapresenciadeacetonaenelsueloen lostratamientosAcetonay
PAHs, en aproximadamente la misma proporción (ya que ambos fueron sometidos a
exactamentealmismoprocedimientodecontaminaciónyevaporación)causóunaumento
1Kow=coeficientedeparticiónoctanol:agua
46
importanteenlaproduccióndeCO2acumulativo(Fig.6.2).Esteaumentopudotenerunpar
deexplicacionesencuantoalefectocausadoporlaacetona:
1. Laacetonatieneunefectoletalparaalgunosmicroorganismosdelsuelo,porloque
losmicroorganismossobrevivientespuedenutilizarlabiomasademicroorganismos
muertos como fuente de C para su crecimiento (Brinch et al., 2002. Citado en
ÁlvarezBernaletal.,2006).
2. La acetona puede ser utilizada directamente como fuente de C por diversos
microorganismos,talescomoMethylobacterium,RhodococcusyArthrobacter(Moet
al.,1997.CitadoenFernández‐Luqueño,etal.,2008).
Enesteexperimentoambasexplicacionespodríantenercabidadadoque,comoseobserva
enlaTabla6.3, losvaloresdeproduccióndiariadeCO2(considerandounavalorinicialde
cero)indicanqueenelDía3laproduccióndiariadeCO2enPAHsyAcetona(siendoestas
muysimilares)esenpromedio2.4vecesmayorqueparaelControl.Adicionalmente,este
aumentoenlageneracióndeCO2nosevetraducidoenundescensodelasconcentraciones
de PAHs, tal y como se observa en la Fig. 6.1. Por otro lado, para PAHs y Acetona, se
observóunclarodescensoen laproduccióndiariaparaelDía7 (i.e.8.5vecesmenorcon
respectoalDía3).Laexplicaciónparaestedescensorepentinoentreeldía3y7,podríaser
que, la generación relativamente alta en el Día 3 enPAHs yAcetona se debió a que los
microorganismos que sobrevivieron al efecto tóxico de la acetona se aprovecharon de
aquellos que murieron. Este hecho ha sido reportado anteriormente y se conoce como
primingeffect,yenestecasoelaumentoenproduccióndeCO2podríadebersealreemplazo
delabiomasadelsuelopornuevabiomasaformadademicroorganismos.
Una vez superado este punto de la incubación, la producción diaria de CO2 vuelve a
aumentarhastaeldía28enAcetonayhastaeldía56enPAHs.Estasetapasdeaumentode
CO2 serían resultado de la utilización del C fácilmente biodegradable de acetona (WHO,
1998)ydeFENyANT,porpartedemicroorganismoscapacesdemetabolizarlos(Andreoni
etal.,2004),enlostratamientoscorrespondientes.
ApesardeobservarunaumentoconsiderabledeCO2enPAHs yAcetona con respectoa
Control, la producción de CO2 en PAHs se mantuvo siempre por debajo de Acetona
durante toda la incubación. En un experimento similar con un suelo agrícola (Acolman,
47
Estado de México) utilizando acetona como disolvente y fenantreno, antraceno y
bezno(a)pireno como contaminantes se observó que la adición de acetona por sí sola
incrementabalaproduccióndeCO21.9veces,perocuandoseagregabanloscontaminantes
la producción aumentaba 2.8 veces con respecto del suelo control (Álvarez–Bernal et al.,
2006).Hasta la fechano seha reportado si para el casodel suelodeEx‐lagodeTexcoco,
existe un efecto similar al de un suelo agrícola; sin embargo, en esta investigación se
encontróquelaadicióndeFENyANTprovocanunainhibiciónimportanteenlaproducción
deCO2porlosmicroorganismosedáficos,yestehechopuedetenerlassiguientescausas:
1. En un estudio enmicrocosmos en el que se propone un protocolo de análisis de
degradacióndePAHsylaformacióndemetabolitosensueloutilizandofenantreno
comoPAHmodeloeinoculandoconMycobacteriumsp.AP1enunsueloagrícola,se
detectólaformacióndetresmetabolitos,siendoelácidodifénicoelmásabundante
deéstos,elcualademásnopresentóunareducciónalolargodelaincubaciónaún
despuésdequeladegradacióndePAHshabíacesado(comoresultadodelalimitada
disponibilidaddelFEN).Enestemismoestudiosemencionaqueestemetabolitoes
potencialmentetóxicoyqueademássehadescritoquelaacumulacióndeproductos
oxidadospuedeinhibirlabiodegradacióndelPAHparental(AriasL.etal.,2008).
2. En un estudio de Andreoni, et al. (2004), en donde se estudian las actividades
enzimáticas y comunidades microbianas en suelos contaminados con PAHs,
encontraron que en un suelo con largo historial de contaminación con PAHs la
actividad enzimática fue sumamente baja debido a la presencia dichos
contaminantes, i.e.,Kiss,etal.(1998)(Andreonietal.,2004)mencionanquedesde
niveles moderados de contaminación con hidrocarburos se puede disminuir la
actividad en diversas enzimas del suelo, mostrando cada enzima una diferente
sensibilidadalapresenciadecontaminantes.
7.4.DinámicadeNitrógeno
ComosepuedeobservarenlaFig.6.3,laadicióndedisolventeenAcetonayacetona+FEN
+ANTenPAHsmodificólasconcentracionesextraíblesdeNO3‐yNH4+enelsuelodelEx–
lagodeTexcoco,aunqueestamodificaciónnofueigualparaambostratamientos.
48
LadinámicadeNO3‐(Fig.6.3c)seresultóafectada,talycomoseobservaenlagráfica,ylas
concentraciones de este compuesto se mantuvieron siempre en el siguiente orden de
magnitudControl>PAHs>Acetona;éstadisminucióndeconcentracionessepuededebera
lassiguientesrazones:
1. Sehaobservadoenexperimentosanterioresquelosmicroorganismosdelsuelodel
Ex–lago de Texcoco son capaces de inmovilizar grandes cantidades de nitrógeno
inorgánico,especialmentecuandohayunsustratofácilmentedegradable,yademás
estehechonoestárelacionadoconunaumentodirectoen laactividadmicrobiana
(Vega‐Jarquínetal.,2003).
2. Laadicióndehidrocarburos(diesel)yotroscompuestosorgánicos(comoglucosa)a
unsuelosinpreviahistoriadecontaminaciónindujounainmovilizacióndeN‐NH4+,
inhibiendo temporalmente lanitrificación, como resultadode la incorporacióndel
nitrógeno a compuestos microbiológicamente sintetizados (i.e. aminoácidos y
proteínas)(DeniyPenninckx,1999).
3. De a cuerdo conVanBeen y Paul (1979), se considera que la adición dematerial
orgánicoconunarazónC:N>30ocasionaráinmovilizacióndelnitrógenoinorgánico
(Fernández‐Luqueñoetal.,2008)
Por lo tanto, la adiciónde acetona,FEN yANT, todos compuestos altamente carbonados,
pudo provocar en un inicio la inmovilización biológica de NO3‐ y NH4+, los cuales
posteriormente habrían sido utilizados para sintetizar moléculas orgánicas (proteínas),
especialmenteelNH4+, yaque se sabeque su incorporacióna labiomasa requieremenor
cantidaddeenergíaqueladeNO3‐(LindellandPost,2001;citadoenVega‐Jarquín,2003).
Adicionalmente,seobservaunefectodiferencialenlostratamientosPAHsyAcetona.Enel
tratamientoPAHs, la adición simultánea de FEN,ANT y acetona provocaron unamenor
incorporacióndeN‐NH4+conrespectoaAcetona(quesoloconteníaacetona);estedescenso
se ve acompañado, como se explica anteriormente, de una menor producción de CO2,
resultado del descenso de actividad microbiológica debido a la presencia de los
contaminantes. Demanera correspondiente, se observa que para el caso deN‐NO3‐, a lo
largodelaincubación,siempreseencontraronmayoresconcentracionesdelcompuestoen
PAHsqueenAcetona.
49
Conformealoanteriorsepudodeterminarqueexistióunainhibicióntemporaldelproceso
denitrificaciónenelsuelodelEx‐lagodeTexcoco,comoresultadodelainmovilizacióndeN
inorgánico.EstainhibicióncausadaporlainmovilizacióndelN,aunadoalaescasezdedicho
nutriente en el suelo del Ex–lago de Texcoco, como la han descrito otros investigadores
(Vega‐Jarquínetal., 2003), hace evidentequeparamejorar la tasadebiodegradacióndel
FENyANT,seríanecesarioadicionarunafuentericaennitrógeno(asícomodefósforode
serpreciso).EnZhang,etal.(2006)semencionaquelarazónC:N:Póptimaparalaactividad
microbiológicaesde100:5:1.
7.5.Perfiladogenotípicodelacomunidadpor16SrDNA–DGGE
Las imágenes obtenidas de los geles deDGGE (Fig. 6.6) fueron analizadas, conforme a lo
descrito en el Anexo de este informe, para determinar los cambios estructurales de la
comunidadmedianteel índicedediversidaddeShannon,asícomocon laconstrucciónde
un dendograma para cada uno de los días (0 y 56) estableciendo la similitud entre los
patronesdebandeodecadaunodelostratamientos.
Antesdecontinuarconesteanálisisesimportanteresaltarqueexistendiversosaspectosde
la técnica empleada que pueden modificar o influenciar los resultados obtenidos. Los
errores (o alteraciones) que se pueden obtener vandesde la extraccióndelDNAhasta la
separación de los ribotipos (i.e. bandas) mediante el DGGE; los principales aspectos a
considerarson:
• ExtraccióndeDNA.Durante estepaso la lisis preferencial o insuficientede ciertas
células puede llevarse a cabo, quedando parcial o totalmente excluidas del
monitoreo de la biodiversidad total. La pureza del material genético extraído
también es crucial para los pasos subsecuentes de amplificación por PCR
(Wintzingerodeetal.,1997).
• Amplificación por PCR. Esta reacción está sujeta a una conjunto de errores que,
aunqueengeneralmenoresyocurridosdemanerahomogénea,puedenllevarauna
mala interpretación de los resultados. Las principales causas de error en esta
técnica son: a) Inhibición de la PCR por sustancias coextraídas como los ácidos
húmicos (Wintzingerode et al., 1997); b) Formación de artefactos de secuencia
(quimeras,heteroduplexoerroresdeamplificacióndelaTaqpolimerasa)(Acinaset
al, 2005); c) Distribución no uniforme de productos por amplificación desigual
50
(conocidoeningléscomoPCRbias)(Acinasetal,2005);d)existenciademásdeuna
regióndelgenrDNA(operónrrn) (Wintzingerodeetal.,1997).Adicionalmente, la
existencia de un pinza de GC en uno de los primers de la PCR anidada puede
provocar la aparición de bandas adicionales que interfieren con el análisis de las
bandasdeinterés(Wintzingerodeetal.,1997).
• DGGE.Apesardequeestá técnicaessumamenteeficienteypermite laseparación
de secuencias con una eficiencia cercana al 100%, algunas limitantes importantes
que se han descrito son: a) la comparación entre geles distintos es complicada
debido a las variaciones entre éstos (Nocker et al., 2007); b) la técnica no es
completamente cuantitativa (Sanz y Kochling, 2007); c) las especies menos
abundantes no podrán ser resueltas por la técnica debido a una sensibilidad
limitada(Nockeretal.,2007);d)losfragmentosobtenidos(200‐600p.b.)sonmuy
pequeñosparaunbuenanálisisfilogenético(SanzyKochling,2007).
Una vez entendidas las limitaciones intrínsecas en la técnica, que como semencionó van
desdelaposibleexclusióndeDNAdealgunosmicroorganismos,elpotencialfavorecimiento
de algunas secuencias en el paso de PCR, así como la posible obtención de artefactos y
finalmente, lacomplejacomparaciónentrediferentesgelesdeDGGE,sepuederealizarun
análisis de los patrones de bandeo obtenidos, aprovechando sus ventajas y teniendo en
cuentalassalvedadesantesreferidas.
7.5.1.Variacióndeladiversidad
En laFig. 7.1 se apreciaunagráficaquedescribe la evoluciónque sufriódiversidadde la
comunidad microbiana del inicio al final de la incubación para los tratamientos PAHs,
AcetonayControl.Seobservaqueeneldía0 laadicióndeFENyANTenel tratamiento
PAHs incrementóapreciablementeladiversidaddelacomunidad(H´=2.9)conrespectoa
los otrosdos tratamientos (H´=2.3 y2.4, paraAcetona yControl, respectivamente). Por
otrolado,eneldía56eltratamientoAcetonapresentóelmenoríndicedediversidad(H´=
1.8),mientras que los otros dos tratamientos presentaron valores semejantes (H´=1.9 y
2.2,paraPAHsyControl,respectivamente.
En un estudio deAndreoni et al. (2004) se describe que un suelo Alemán, con una largo
historialdeexposiciónaPAHsyalcanos(i.e.desde la IIGuerraMundial),yademásnunca
51
remediado, fue mucho menos diverso, de acuerdo con el índice de Shannon (mismo al
utilizado en este estudio), en comparación con otros dos suelos: uno Italiano agrícola no
contaminado,yelotro,unsueloBelgaconexposiciónmediaaPAHs(menosde3años),que
ademáspresentólamayordiversidaddemicroorganismos.
Además de los efectos sobre la diversidad que tienen los PAHs hay que considerar las
consecuencias debidas a la adición de acetona como medio de incorporación de los
hidrocarburos a un 25% del total del suelo. Brinch et al. (2001), los cuales proponen el
protocolode contaminaciónque se siguió eneste estudio (verMetodología), encontraron
que la acetona (al igual que el diclorometano) tenía un fuerte efecto tóxico sobre las
poblaciones de bacterias y protozoos, las cuales se vieron sumamente disminuidas; sin
embargo, también observaron que algunas de estas poblaciones eran capaces de
recuperarsehastanivelesinclusivemayoresalosdelsuelocontrolalpocotiempo.
Considerandolosresultadosobtenidos,podemosafirmarqueeneldía0,aunaspocashoras
delacontaminación(≈2h),laadicióndeFENyANTenPAHsprovocaronunaumentodela
diversidad microbiana del suelo, favoreciendo el aumento de aquellas poblaciones de
bacteriasmásafinesaloscompuestos.
Porotraparte,seobservóqueenlostrestratamientoladiversidaddecaeeneldía56;sin
embargo, los tratamientosPAHsyAcetona fueron losmásafectadosyaqueredujeronsu
diversidadenun35y21%,respectivamente,mientrasqueelControlsóloperdióun8%de
la diversidad de microorganismos (Fig. 7.2). Por lo tanto, se puede apreciar que las
condicionesdelaincubaciónreducen,porsímismas,ladiversidaddelsuelodiscretamente
(8%),debidoa factores como lahumedad,oxígeno, temperatura, ausenciade luz, faltade
nutrientes,entreotros;mientrasqueladisminuciónrestanteestaríadirectamenteasociada
alostratamientosaplicadosenPAHsyAcetona.
52
Fig.7.1.Variacióndelladiversidadbacteriana,medidaporelíndicedeShannon(H´)durantelaincubaciónaerobiapor56díasenlostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3).
Fig.7.2.PorcentajededisminucióndelíndicedediversidaddeShannon(H´)enlostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)deldía0al56delaincubación.
53
7.5.2.Análisisdeagrupamiento
AdemásdelíndicedeShannon,otraformadeanalizarlosperfilesgenotípicosesmediante
unanálisisdeagrupamiento,elcualmedianteundendogramafenéticopermiteconocerla
similitudentrelospatronesdebandeodecadaunodelostratamientosensusrespectivos
días (Fromin et al., 2002). Dichos dendogramas fueron construidos como se indica en el
Anexo al final del informe y se presentan en la Fig. 7.3. El algoritmo de agrupamiento
utilizadofueeldeUPGMA(UnweightedPairGroupArithmeticAverages)yuncoeficientede
distancias fue utilizado para conocer la diferencia entre los perfiles. Como es posible
observarenlaFig.7.3,aldía0los3tratamientos(PAHs,AcetonayControl)parecenestar
pocoasociadosentreellos,yaqueAcetonayControlsecorrelacionaronconuncoeficiente
de0.03–muybajo–,mientrasquePAHs apareceaúnmenos correlacionadocon losotros
dos (‐0.16). Por el contrario, al día 56, los tratamientosPAHs yAcetona presentaron un
coeficientedecorrelaciónde0.69–alto–,mientrasqueelControlsecorrelacionóa‐0.18de
losotrosdos.
Mediante este análisis de agrupamiento es posible observar que en el día 0 los tres
tratamientos son muy distintitos entre ellos, especialmente el tratamiento PAHs. Lo
anteriordemuestraqueenprimerlugar,laacetonatieneunimpactomuyimportantesobre
lacomunidaddemicroorganismosedáficos(Fig.7.1);sinembargo,nosedescartaunefecto
del tratamientoPAHs, lo cual concuerda con el aumento de la diversidad encontrado en
dichotratamientoparaeldía0,comosemencionóanteriormente.Porotraparte,eneldía
56seobservaquelostratamientosAcetonayPAHsseencuentranmuchomásfuertemente
asociadosqueel tratamientoControl, locual indicaqueenestepuntode la incubaciónel
impactomássignificativovienedadoporlaadicióndeacetonaynoporlaadicióndeFENy
ANT.Enotraspalabras,eneldía56,elefectoqueejercieronloshidrocarburosFENyANTal
iniciode la incubaciónhadisminuidonotoriamente,yahora laestructuramicrobianasólo
es modificada por la acetona, siendo además una modificación severa, y probablemente
irreversible(paraalgunaspoblaciones)
La obtención de perfiles genotípicos en tiempos intermedios de la incubación
(especialmente en los días 7 y 14, ya que en este período se lleva a cabo la mayor
degradación de contaminantes) podría revelar información importante en cuanto al
54
desarrollodepoblacionesdebacteriascapacesdedegradarPAHs,yaqueseesperaríaqueel
númerodebandas(i.e. riqueza)y ladiversidaddelsueloaumentaranenestosdías,yque
ademásestasbandaspodrían ser suficientemente intensas comoparapermitir su cortey
extraccióndelgeldepoliacrilamidaparaunasubsecuentereamplificaciónysecuenciación,
loqueposibilitaríasuulterioridentificaciónaunniveldegéneroprobablemente.
Lasugerenciaquesehaceenelpárrafoanterioresimportanteyaque,comosemencionará
más adelante en la Sección 9, se esperaría que en los días 7 y 14 las poblaciones
degradadoras se manifestaran más intensamente en el DGGE, ya que a diferencia de lo
observadoenesta investigacióneneldía0,apesardehaberaumentado ladiversidadde
especies, ninguna banda originada por la adición de PAHs fue lo suficientemente intensa
comoparapoderhabersidocortadayposteriormentesecuenciada.Noobstante,existeuna
hipótesis estipulada por Johnsen (Johnsen et al., 2005) la cual indica que muy
probablemente las poblaciones degradadoras de PAHs se encuentran en una fase seudo
estacionaria de crecimiento, y las células nuevas solo reemplazan a las células que van
decayendo;estodebidoprincipalmentealabajabiodisponibilidaddelcontaminante.Detal
forma, que si esto se cumpliera, sería complicado apreciar un notorio incremento en la
intensidaddelasbandasenelDGGE,porloqueposiblementeéstanoseríalatécnicamás
aplicableparatalfin.
55
Fig.7.3.DendogramadeagrupamientoentrelostratamientosT1(PAHs),T2(Acetona)yT3(Control)enlosdías0(a)y56(b).Eneldía0(a)T2yT3seagrupanconuncoeficientedecorrelaciónde0.03,mientrasqueT1lohaceseagrupaestosa0.16.Eneldía56,T1yT2se
agrupanconuncoeficientede0.69,mientasqueT3lohacea0.18.
Coeficientedecorrelación
T1
T2
T3
Coeficientedecorrelación
T1
T2
T3
a)
b)
56
8.CONCLUSIONES
Los microorganismos presentes en el suelo salino–alcalino del Ex–lago de Texcoco son
capacesdedegradarPAHs(i.e.fenantrenoyantraceno)aeróbicamenteyencondicionesde
laboratorio; sin embargo, la baja biodisponibilidad de estos compuestos, así como la
inhibición que ejercen sobre el metabolismo microbiano se presentan como limitantes
importantesparasucompletadegradación.
Lanitrificaciónenelsueloesinhibidatemporalmentecomoconsecuenciadelaadiciónde
PAHsyacetona.Loanterior,aunadoalaescasacantidaddenitrógenopresenteenelsuelo,
sugieren que de ser necesario un programa de biorremediación en estos suelos sería
importante considerar laadicióndeuna fuente ricaennitrógeno, loque incrementaría la
tasadedegradacióndeloscontaminantes.
LacontaminaciónconPAHsincrementóladiversidadenlacomunidadmicrobianadelsuelo
del Ex–lago de Texcoco a corto plazo (≈2h), confirmándose la presencia de
microorganismosafinesaestoscontaminantes;encontraste,laestructuradelacomunidad
microbiana al final de la incubación es afectada severamente por la adición de acetona,
dejandodeapreciarseunefectodirectodeloshidrocarburos.
La utilización de microorganismos provenientes del suelo del Ex–lago de Texcoco se
presenta como una alternativa potencialmente aplicable a la biorremediación de
ecosistemas salino–alcalinos contaminados conPAHs; no obstante todavía se requiere un
mayor conocimiento sobre la capacidad real de biodegradación de las comunidades
microbianas(bacterias,hongosyarqueas)deestesuelo,asícomosobresu factibilidadde
estimulación, aislamiento y adaptación para poder ser empleados en la recuperación de
sitiosimpactados.
57
9.PROPUESTADECONTINUACIÓNYRECOMENDACIONESPARATRABAJOS
FUTUROS
Conlaintencióndeseguiraportandoconocimientosparalaoptimizacióndelastecnologías
de biorremediación de contaminantes como los PAHs, así como al entendimiento de las
consecuenciasecológicasquemuchasactividadesantropogénicastienensobreelambiente,
yenconcordanciaconlosresultadosqueseobtuvieronenesteproyectodeinvestigación,
sepresentaacontinuaciónlaestrategiaexperimentalqueseseguiráenuncortoplazo,así
comoalgunaspropuestasyrecomendacionesparatrabajosfuturos.
Propuestaexperimentaldecontinuación
LatécnicadeDGGEempleadapermitelaobtencióndeperfilesgenotípicosdelacomunidad
los cuales describen la diversidad y estructura de lamisma, y además permiten estudiar
cambiosalolargodeltiempo.Otrasdelasventajasquepresentaestatécnicaesqueunavez
obtenido el patrón de bandeo, se puede proceder al corte y extracción de ciertas bandas
discretas, para su posterior elución, y reamplificación, lo cual permite secuenciar éstos
fragmentospara finalmente identificar losmicroorganismosyconstruirunárbol fenético.
Conformealoanteriorseplantealasiguienteestrategiaexperimentalparalacontinuación
delactualexperimento.
1. LosgelesdeDGGE se tiñen conbromurode etidio y sonobservadosmedianteun
transiluminadorUV.
2. Lasbandasqueporsuintensidadyresoluciónseandistinguiblessecortanyextraen
delgel.
3. Lasbandassoncolocadasentuboseppendorfde1.5mLadicionando30μLdeagua
bidestiladayesterilizadayserefrigerana4°Cdurante24h,yposteriormenteson
congeladosa‐20°Chastasuposteriorutilización.
4. SerealizaunaPCRconlosmismosprimersutilizadosenlaPCRanidadade500p.b.
(ver Metodología), pero sin la pinza rica en GC en el primer correspondiente. Se
deberánestandarizarlascondicionesparaestaPCR.
5. Losampliconesresultantessonconcentradosypurificados.
6. Lasmuestrassonsecuenciadas
58
7. Lassecuenciasobtenidassoncomparadascon lasbasesdedatosdisponiblesen la
redyanalizadaspormediodeunconjuntodeprogramasdebioinformáticaparala
construccióndelosárbolesfenéticos.
NOTA:Lospasos1a3yahansidorealizados
Propuestasparatrabajosfuturos
Como fue posible observar en esta investigación, la diversidad de microorganismos
aumentóconsiderablementeeneltratamientoconFENyANT(i.e.PAHS)encomparación
con losotrosdos tratamientos (i.e.CONTROL yACETONA) en el día0; sin embargo esta
diversidaddisminuíaparaeldía56,observándoseunefectomayoritariamentedebidoala
acetonaenestedía.
Aunqueenesteproyectosoloseplanteólaobtencióndeperfilesgenotípicosenlosdías0y
56, paraobservar los efectos inmediatos y a largoplazode losPAHs sobre la comunidad
microbiana, la obtención de perfiles intermedios podría revelar datos interesantes y
complementarios a los encontrados en este experimento. Específicamente, como se
mencionóenladiscusión,serecomiendalaobtencióndelosperfilesenlosdías7y14dela
incubación,yaqueenestosdíasse llevaacabolamayorpartedeladegradacióndePAHs,
por lo que se esperaría ver un incremento en las poblaciones de bacterias capaces de
degradarestoscontaminantes.Además,seríamuyprobablelaaparicióndebandasdeuna
intensidad mayor, las cuales podrían ser cortadas, extraídas y reamplificadas para
secuenciarse y así determinar que microorganismos son los responsables de la
relativamentealtadegradaciónobservadaendichoperiodo.
Unavezidentificadoslosmicroorganismos,seríafactibleconocersisoncultivablesono,de
formaquesepodríapensarenelaislamientoycultivodeestosmicroorganismosparasu
usopotencialcomocepasdegradadorasdePAHsensuelosalcalinosysalinosoambientes
similarescomolodescribenMargesinR.ySchinner(2001).
Otra forma factible de analizar la comunidadmicrobiana esmediante la construcción de
librerías a través de la clonación en células de Escherichia coli, lo cual permitiría la
obtención de fragmentos demayor tamaño del gen 16S rDNA (≈ 1500 p.b.) y un análisis
59
mucho más avanzado y detallado de la comunidad microbiana (ver Metodología en
Valenzuela‐Encinas, 2008).Asímismo, sería interesante realizar la identificacióndeotros
microorganismos,i.e.arqueas(Valenzuela‐Encinas,2008)yhongos,loscualesrespondena
los genes 16S y 18S rDNA, respectivamente, y para los cuales, al igual que en el caso de
bacterias, existen primers universales que permiten un análisis filogenético de sus
poblacionesyaseamediante lautilizaciónde técnicasdeperfiladogenómico(e.g.DGGEo
TGGE),porclonación,ounacombinacióndeéstas.
60
10.REFERENCIAS
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62
40. Rondon,M.R.,PaulR.A.,Bettermann,A.D.,Brady,S.F.,Grossman,T.H.,LilesM.R.,Loiacono,K.A.,Lynch,B.A.,Macneil,I.A.,Minor,C.,TiongC.L.,Gilman,M.,Osburne,M.S.,Clardy,J.,Handelsman,J.y Goodman, R. M. (2000). Cloning the Soil Metagenome: a Strategy for Accessing the Genetic andFunctional Diversity of Uncultured Microorganisms. Applied and Environmental Microbiology. 66(6):2541–2547.41. Sanz,J.L.yKochling,T.(2007).Molecularbiologytechniquesusedinwastewatertreatment:Anoverview.ProcessBiochemistry.42(2):119‐133.42. Scullion,J.(2006).Remediatingpollutedsoils.Naturwissenschaften.93:51‐65.43. Song, Y.F., Ou, Z.Q., Sun, T.H., Yediler, A., Lorinci, G., Kettrup, A., 1995. Analitycal method forpolycylic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil and plants samples. Chinese Journal of AppliedEcology.6,92‐96.44. Thomas, G.W., 1996. Soil pH and Soil Acidity En: Sparks, D. L. (Ed) Methods of Soil Analysis:ChemicalMethodsPart3,enSoilScienceSocietyofAmericaInc.,AmericanSocietyofAgronomyInc.,Madison,Wisconsin,USA,pp.475‐490.45. Valenzuela‐Encinas, C., Neria‐González, I., Alcántara‐Hernández, J., Enríquez‐Aragón, J. A.,Estrada‐Alvarado, I., Hernández‐Rodríquez C., Dendooven, L. y Marsch, R. (2008). Phylogeneticanalysis of the archeal community in an alakile‐saline soil of the former lake Texcoco (Mexico).Extremophiles.12:247‐254.46. Vega‐Jarquin C, Garcia‐MendozaM, Jablonowski N, Luna‐GuidoM, Dendooven L (2003) Rapidimmobilizationofappliednitrogeninsaline–alkalinesoils.PlantSoil256:379–38847. Watson, Baker, Bell, Gann, Levine y Losick. (2004). Molecular Biology of the Gene. 5a ed.InternationalEdition.PearsonInternationalEdition.48. WHO,1998.WorlHealthOrganization,(1998).EnvironmentalHealthCriteria207.Génova,Suiza.49. Wintzingerode,F.v.,Gobel,U.F.yStackebrandb,E.(1997).Determinationofmicrobialdiversityinenvironmentalsamples:pitfallsofPCR‐basedrRNAanalysis.FederationofEuropeanMicrobiologicalSocietiesMicrobiologyReviews21:213‐229.50. YuZ,MorrisonM(2004)Comparisonsofdifferenthypervariableregionsofrrsgenesforuseinfingerprinting of microbial communities by PCR‐denaturing gradient gel electrophoresis. AppliedEnvironmentalMicrobiology,70:4800‐4806.51. Zhang, X., Cheng, S., Zhu, C. y Sun, S. (2006). Microbial PAH‐Degradation in Soil: DegradationPathwaysandContributingFactors.Pedosphere.16(5):555‐565.10.1.PáginasWEB
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63
11.ANEXO
CuantificacióndeDNAFig.11.1.CurvadecalibracióndelmarcadorλstyIparalacuantificacióndeDNAgenómico
Tabla11.1.ValoresdelacurvadecalibracióndelmarcadorλstyIparalacuantificacióndeDNA
A(p.b.) B(mg) C(Densidad)19329 0.00039852 123.2107743 0.000159643 91.106223 0.000128304 72.0204254 8.77077E‐05 48.3203472 7.15847E‐05 55.5802690 5.54616E‐05 39.4701882 3.88025E‐05 28.4101489 3.06998E‐05 21.720925 1.90714E‐05 10.980421 8.68005E‐06 .74 1.52571E‐06 .
A=Tamañodelfragmento(p.b.)B=MasadeDNA(mg)
0
0.00002
0.00004
0.00006
0.00008
0.0001
0.00012
0.00014
0.00016
0.00018
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
MasadeDNA(mg)
densidaddepixeles
CurvadecalibracióndeλstyIparalacuantiuicacióndeDNA
64
C=DensidaddepixelesdeterminadamedianteGelEvalTabla11.2.CuantificacióndelasextraccionesdeDNAparalosdías0y56
Tratamientos
D(Densidad) B(mg) F(μg)Mediapordía
T1D0 84.290 0.00015858 4.7574T2D0 104.010 0.00019802 5.9406T3D0 101.730 0.00019346 5.8038
5.5006±0.6472
T1D56 107.660 0.00020532 6.1596T2D56 120.810 0.00023162 6.9486T3D56 152.150 0.0002943 8.829
7.3124±1.3713
Mediatotal
6.4065±1.3800
D=DensidadobtenidamedianteGelEvalB=MasadeDNA(mg)quesecargóenelpozodelgeldeagarosaparalacuantificaciónF=MasatotaldeDNAen60μLdeextracción(μg)
MemoriadeCálculo
DeacuerdoalaTabla10.1elprocedimientodecálculoeselsiguiente:
MasadeDNA=(Tamañodelfragmento)*(ConcentracióndeDNAenelmarcador)/
((NúmerototaldeparesdebasesenLambda)*(Volumendemarcadorcargado))
Mediante esta ecuación se construyó la curva de calibración de la Fig. 10.1, en la cual,
posteriormente, se interpolaron losvaloresdedensidaddepixelesobtenidosmedianteel
programaGelEvalparacadaunadelasmuestras,correspondientesalostrestratamientos
decadadía(0y56).EstosvaloressemuestranenlaTabla10.2.,yfueronobtenidosconla
ecuacióndelarecta:
Masa(mg)=2E^6(Densidadpixeles)–1E^5mg
Finalmente,paraconocerlamasatotaldeDNAextraído:
F(μg)=(B(mg)*1000μg/mg*60μLdeaguadedilución)/2μLdeextraccióncargados
65
ConstruccióndefenogramasApartir de los geles deDGGE (Fig. 6.6.) se determinaron con ayuda del softwareGelDoc
(Biorad) las intensidades relativas de las bandas presentes en cada carril de los geles;
despuésdichasbandas fueron sometidas a examenvisual, de formaque sedescartarono
incluyeronbandasqueelprogramadetectabaono,segúnelcaso.Luegoseestableciócuáles
delasbandasdetectadaseranidénticasentrecadacarrildeunmismogelbajoelsupuesto
deque dos omásbandas son exactamente lasmismas, si presentan elmismopatrónde
corrimientoatravésdelgel(fundamentobásicodelatécnicadeDGGE).Finalmente,conel
procedimiento descrito se realizó una matriz de presencia (1) y ausencia (0) de bandas
(Tablas10.3ay10.3b).
Mediantelamatrizqueseconstruyóseprocedióalaconstruccióndeldendogramafenético
utilizando la paquetería de NTSYSpc 2.0 (Numerical Taxonomy And Multivariate Analysis
System) siguiendo los pasos necesarios para crear un análisis de agrupamiento (cluster
analysis),loscualesbásicamenteson:1)Estandarizacióndelamatrizmedianteelprograma
stand, 2) Cómputo de unamatriz de distancias con simint, 3) Análisis de agrupamiento
simpledelamatrizdedistanciasconshan,4)Construccióndeldendogramacontreey,5)
Determinación de los valores cofenéticos con coph. Mediante este procedimiento se
construyeronlosdosfenogramas(Fig.7.3ayb)
DeterminacióndelíndicedeShannondediversidadBasándonosenlamatrizdepresenciayausenciadebandas(TablaA.3)sedeterminaronlas
intensidades relativas de cada una de las bandas discretas identificadas. Para ello se
recurrióalsoftwareGelDoc(Biorad)quepermitedeterminar la intensidaddecadabanda
medianteelempleodecurvasdensitométricas,endonde las intensidadescorrespondena
lasalturasde lospicoseneldensitograma.Aéstadensidadse le sustrajo ladensidaddel
fondo(background),quecorresponderíaaladensidaddadaporelbromurodeetidioporsí
solo. De esta forma se calculó la intensidad de cada banda que corresponde a una
aproximacióndelaproporcióndecadaespecie(banda)dentrodelapoblacióntotal.
EnlaTablasA.4ayA.4bsemuestranlosdatosdelasintensidadesdecadaunadelasbandas
individuales (con el fondo ya sustraído). A través de estos valores se calculó el índice de
66
Shannon(H´)usandoelprogramaDiversdelaUniversidaddeCataluña.Esteíndiceemplea
lasiguienteecuación:
Donde:s=númerodeespeciesenlamuestraPi=Proporcióndeespeciesienlamuestra,ysecalculócomo:
Donde:ni=intensidaddelabandaienelcarrilN=sumadeintensidaddetodaslasbandas(s)enuncarril
Mediantelosíndicesdelostrestratamientos(PAHs,AcetonayControl)paralosdías0y
56segraficaronlosvaloresdelaFig.7.1
€
H '= − Pi logPii=1
s
∑
€
Pi =niN
67
Tabla11.3a.Matrizdepresenciayausenciadebandas–Día0
Tabla11.3b.Matrizdepresenciayausenciadebandas–Día56
0=Ausenciadeunabandadiscreta1=PresenciadeunabandadiscretaLasumatoriadebandasencadacarrilcorrespondealariquezadelostratamientoscorrespondientes.Tratamientos:T1(PAHs),T2(Acetona)yT3(Control)
Bandas T1 T2 T3A 1 0 0B 1 0 0C 1 0 0D 0 1 0E 1 0 0F 0 1 0G 1 0 1H 0 0 1I 0 0 1J 1 0 0K 0 0 1L 1 0 0M 0 1 0N 1 0 1O 0 0 1P 1 0 0Q 1 0 0R 1 0 0S 1 0 1T 1 1 1U 1 1 1V 0 1 1W 0 1 0X 1 0 0Y 0 0 0Z 1 1 1AA 1 1 0BB 1 1 1CC 1 1 0DD 0 0 1
TOTAL 19 11 13
Bandas T1 T2 T3A 0 1 1B 0 0 1C 1 1 0D 1 0 0E 0 0 1F 0 0 1G 0 0 1H 1 1 1I 1 1 1J 0 0 1K 1 1 1L 1 1 1M 1 1 1
TOTAL 7 7 11
Tabla11.4a.MatrizdeintensidaddebandasdiscretasDía0
Tabla11.4b.MatrizdeintensidaddebandasdiscretasDía56
Tratamientos
(densidaddepixeles)BANDAS PAHs ACEOTNA CONTROL
A 52 0 0B 47 0 0C 41 0 0D 0 37 0E 38 0 0F 0 30 0G 36 0 22H 0 0 23I 0 0 20J 42 0 0K 0 0 20L 41 0 0M 0 24 0N 38 0 22O 0 0 25P 85 0 0Q 50 0 0R 36 0 0S 30 0 12T 46 31 28U 30 20 22V 0 12 10W 0 48 0X 46 0 0Y 0 0 0Z 47 49 76AA 63 63 0BB 105 99 36CC 39 40 0DD 0 0 21Σ 912 453 337
Tratamientos
(densidaddepixeles)Bandas PAHs ACETONA CONTROL
A 0 39 36B 0 0 17C 66 43 0D 57 0 0E 0 0 22F 0 0 17G 0 0 35H 61 35 30I 58 32 22J 0 0 110K 70 80 47L 139 150 42M 44 72 27Σ 495 451 405
69