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INFORMETÉCNICODELAOPCIÓNCURRICULARENLAMODALIDADDE:PROYECTODEINVESTIGACIÓN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

ASESOR EXTERNO: Dr. Luc Dendooven ASESORA INTERNA: Dra. Olivia Franco Hernández

México, D. F. Junio 2009

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO

PRESENTA: Conrado Martínez Suárez

Evaluación de las Comunidades Microbianas en un Suelo del

Ex-lago de Texcoco Contaminado con Fenantreno y Antraceno, Utilizando Técnicas de Biología Molecular

II

III

AgradecimientosEn primer lugar quisiera agradecer a todos los integrantes del laboratorio de

Ecología de Suelos del Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del

CINVESTAV quienes me brindaron su apoyo en estos últimos meses, de manera

particularalassiguientespersonas:alM.enC.FabiánFernándezLuqueño,alM.en

C.CésarValenzuelaEncinas,alM.enC.EdgarVázquezNúñezyalDr.JavierDíazde

laSernaZavala,cuyaayudafuefundamentalparalaculminacióndeesteproyecto.

Además, al Dr. Luc Dendooven por su infinito apoyo y consejo; a la Dra. Olivia

FrancoHernández,porsusleccionesalolargodelaLicenciaturayasesoríaeneste

proyecto; a Eduardo Jiménez Zurita por su larga amistad y aportaciones a este

trabajo;amiscompañerosdelaUPIBIEfraín,Diana, JenniyGaby,porsoportarme

durante estos cuatro arduos años; y finalmente, demaneramuy afectuosa, amis

padresyfamiliaporhaberestadosiempreahíentodomomento.Muchasgracias.

IV

TABLADECONTENIDOS

RESUMENDELFORODEPROYECTOTERMINAL...............................................................VII1.INTRODUCCIÓN..................................................................................................................................... 1

2.JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................................................... 3

3.OBJETIVOS............................................................................................................................................... 43.1.Objetivogeneral............................................................................................................................ 43.2.Objetivosespecíficos .................................................................................................................. 4

4.MARCOTEÓRICO.................................................................................................................................. 54.1.Elsuelo.............................................................................................................................................. 54.1.1.Definicióndelsuelo ............................................................................................................ 54.1.2.Principalesfuncionesdelsuelo ..................................................................................... 54.1.3.Característicasypropiedadesfísico‐químicasdelsuelo.................................... 6

4.2.SuelosSalinosySódicos............................................................................................................ 74.2.1.UbicaciónydescripcióndelEx‐lagodeTexcoco.................................................... 74.2.2.CaracterísticasgeneralesdelossuelosdelEx–LagodeTexcoco ................. 8

4.3.HidrocarburosdelPetróleo ..................................................................................................... 94.3.1.HidrocarburosPolicíclicosAromáticos ..................................................................... 94.3.1.1.Riesgosalasalud ...........................................................................................................11

4.4.Tecnologíasparalaremediacióndesitioscontaminados........................................124.4.1.Tratamientoinsitu............................................................................................................134.4.2.Tratamientoexsitu ...........................................................................................................13

4.5.Biorremediación.........................................................................................................................134.5.1.Factoresinvolucradosenelprocesodebiorremediación...............................154.5.1.1.Factoresmedioambientales ......................................................................................154.5.1.2.FactoresFísicos ..............................................................................................................164.5.1.3.Factoresquímicos..........................................................................................................16

4.6.Utilizacióndemicroorganismosextremosenlabiorremediacióndehidrocarburos ......................................................................................................................................174.7.TécnicasdeBiologíaMolecularenelestudiodelaecologíadelsuelo ...............174.7.1.Perfiladogenotípicodelacomunidadmicrobiana(técnicasdehuellagenómica)..........................................................................................................................................184.7.2.ReacciónenCadenadelaPolimerasa(PCR) .........................................................194.7.3.Electroforesisengelcongradientedesnaturalizante(DGGE).......................22

5.METODOLOGÍA....................................................................................................................................245.1.Muestreodelsuelo ....................................................................................................................245.2.Preparacióndelsuelo...............................................................................................................245.3.DiseñoExperimentalytratamientospropuestos ........................................................245.3.1.Contaminacióndelsuelo ................................................................................................26

5.4.Análisisfísicosyquímicos......................................................................................................265.5.AnálisisdePAHs .........................................................................................................................275.5.TécnicasdeBiologíaMolecular............................................................................................28

V

5.5.1.ExtraccióndeDNAmetagenómicodelsuelo.........................................................285.5.2.AmplificaciónporPCRdelgen16SrDNA. ...............................................................285.5.3.AmplificaciónporPCRanidadaconpinzaricaenGCdeunfragmentode500p.b.delaregiónvariableV3delgen16rDNA. .........................................................285.5.4.Electroforesisengelcongradientedesnaturalizante .......................................30

6.RESULTADOS........................................................................................................................................326.1.CaracterizacióndelsuelodelEx‐lagodeTexcoco .......................................................326.2.Cinéticadedegradacióndefenantrenoyantraceno ..................................................336.3.AnálisisrespirométricodeCO2 ............................................................................................356.4.DinámicasdeNitrógenoinorgánico...................................................................................376.4.1.DinámicadeNH4+ ..............................................................................................................376.4.2.DinámicadeNO2‐ ...............................................................................................................376.4.3.DinámicadeNO3‐ ...............................................................................................................38

6.5.ExtraccióndeDNAmetagenómicodelsuelo .................................................................406.6.AmplificaciónporReacciónenCadenadelaPolimerasa(PCR)............................416.6.1.PCR1500p.b.delgen16SrDNA..................................................................................416.6.2.PCRanidadade500p.b.delaregiónvariableV3delgen16SrDNA ..........41

7.ANÁLISISYDISCUSIÓNDERESULTADOS...............................................................................447.1.Caracterizacióndelsuelo........................................................................................................447.2.CinéticadedegradacióndefenantrenoyantracenoyAnálisisrespirométricodeCO2 ......................................................................................................................................................447.4.DinámicadeNitrógeno............................................................................................................477.5.Perfiladogenotípicodelacomunidadpor16SrDNA–DGGE.................................497.5.1.Variacióndeladiversidad ..................................................................................................507.5.2.Análisisdeagrupamiento ..............................................................................................53

8.CONCLUSIONES...................................................................................................................................56

9.PROPUESTADECONTINUACIÓNYRECOMENDACIONESPARATRABAJOSFUTUROS.....................................................................................................................................................5710.REFERENCIAS....................................................................................................................................60

11.ANEXO...................................................................................................................................................63

VI

ÍndicedeTablas

Tabla4.1.Composicióndeproductosderivadosdelpetróleo………………………………….…………9Tabla4.2.HidrocarburosdelpetróleoquedebenanalizarseduranteunderramesegúnlaNOM–138–SEMARNAT2003…………...………………………………………………………………………….10Tabla4.3.EstructurasmolecularesdediversosPAHscomunes………………………….…………….11Tabla4.4.PrincipalescaracterísticasfísicasycarcinogénicasdelosPAHsprioritariosparalaUSEPA……………………………………………………………………………….……………………..……………….12Tabla4.5.Principalestecnologíasderemediacióndesuelosysuefectosobreloscontaminantes………………………………………………………………………………………………………………14Tabla5.1.Descripcióndetratamientosutilizadosenestainvestigación…………………..……….25Tabla5.2.ReactivosyconcentracionesutilizadasparalaamplificaciónporPCRdelgen16SrDNA………………………..…………………………………………………………………………….………………29Tabla6.1.CaracterizacióndelsuelodelEx‐lagodeTexcoco…………………………………...….……32Tabla6.2.ComparacióndemediasdeTukeyparafenantrenoyantracenoalolargodelaincubación………………………………………………………………….……………………………….....................…35Tabla6.3.ProducciónacumulativaydiariadeCO2paratodoslostratamientosdelaincubación………………………………………………………………………………………...………………………….37Tabla6.4.CuantificacióndeDNAmetagenómicodelsuelo……………………………………………...40Tabla11.1.Valoresdelacurvadecalibracióndelmarcadorλ‐styIparalacuantificacióndeDNA…….………………………………………………………………………………….……...…..63Tabla11.2.CuantificacióndelasextraccionesdeDNAparalosdías0y56…..……………….….64Tabla11.3a.Matrizdepresenciayausenciadebandas–Día0…………………………………..……67Tabla11.3b.Matrizdepresenciayausenciadebandas–Día56……………………………..........…67Tabla11.4a.Matrizdeintensidaddebandasdiscretas‐Día0…………………….………………….…68TablaA.4b.Matrizdeintensidaddebandasdiscretas‐Día56………………………..............………..68ÍndicedeFiguras

Fig.4.1.Diagramadeflujodelosdiferentesposibilidadesenlaaplicacióntécnicasdebiologíamolecularenelestudiodecomunidadesmicrobianas………….……………...……...……..20Fig.4.2.Diagramaesquemáticodelareacciónencadenadelapolimerasa(PCR)….………...21Fig.5.1.Diagramaesquemáticodelasunidadesexperimentalesutilizadasenlaincubaciónaerobiadelsuelo…………………………………………………………...……………..……………...26Fig.5.2.Diagramadebloquesdelametodologíaempleadaparalacontaminacióndelsuelo…………………………………………………………………………………............................................................27Fig.5.3.ProtocolodeamplificacióndePCR1500p.b.delgenrDNA16S………………......……....29Fig.5.4.DiseñoExperimentaldelproyectodeinvestigación………………………………..………….31Fig.6.1.CinéticadedegradacióndeFenantrenoyAntraceno……..……………………….….............34Fig.6.2.ProducciónacumulativadeCO2…………………………………………………………...…………..36Fig.6.3.DinámicadeNitrógenoinorgánico….....……………………………………………………...……….39Fig.6.4.ExtraccionesdeDNAmetagenómicodelsuelo……………………………………...……………40Fig.6.5.AmplificaciónporPCRde1500p.b.delgen16SrDNA……………………………….............41Fig.6.6.AmplificaciónPCRanidadade500p.b.delaregiónvariableV3delgen16SrDNA………………………………………………………………………………………………………………………….…42Fig.6.6.PerfilesgenotípicosdeDGGE……………………………………………………………………………..43Fig.7.1.Variacióndelladiversidadbacteriana………………………..……………………………………...52Fig.7.2.PorcentajededisminucióndelíndicedediversidaddeShannon(H´)………………….52Fig.7.3.Dendogramasdeagrupamiento……………….………………………………………….…………….56

VII

1

1.INTRODUCCIÓN

LosHidrocarburosPolicíclicosAromáticos(PAHs,porsussiglaseninglés)sonungrupode

contaminantes orgánicos formados por dos o más anillos bencénicos fusionados. Estos

compuestosseencuentrandistribuidosenelsuelo,mar,sistemasfluvialesysedimentos,y

supresenciaseatribuyeprincipalmenteaprocesosdecombustión incompletademateria

orgánica de fuentes naturales y antropogénicas, así como a los derrames y descargas

directasdepetróleoysusderivados.

Debidoalascaracterísticasdeestoscontaminantes(persistenciaenelambiente,toxicidad,

mutagenicidad y carcinogenicidad), la Agencia de Protección al Ambiente de los Estados

Unidos (USEPA) ha enlistado a quince PAHs como contaminantes prioritarios para la

remediaciónde entre los cualesquince sonpotencialmente carcinogénicosparahumanos

segúnreportesdelaAgenciaInternacionalparalaInvestigaciónenCáncer(IRAC)(Zhang,

etal.,2006).

En México no se cuenta con un estimado de las emisiones de PAHs al ambiente; sin

embargo, se conoceque lasactividadesquegeneranunamayorcantidadson: lasquemas

agrícolas y prácticas de roza, tumba y quema; la quema de combustibles fósiles para

producción de energía primaria (petróleo) y secundaria (combustóleo, gas natural y

gasolinas); la quema de leña en hogares; y finalmente, las actividades de explotación,

extracciónytransportedepetróleo(Fernández‐Bermauntzetal.,2004).

Diversos estudios han demostrado que la biodegradación de un amplio rango de

hidrocarburos(incluidoslosPAHs),puedeocurrirenvariadosambientesextremos(altaso

bajastemperaturas,pHácidoobásico,altasconcentracionesdesaloaltaspresiones).Estas

extraordinarias características, presentes en los microorganismos de dichos ambientes,

podríanseraprovechadasenmúltiplesaplicaciones,talescomoladegradacióndedesechos

orgánicosenpresenciadeaguas industrialesconaltoscontenidosdesales,abajasoaltas

temperaturas; en la remediación de derrames petroleros en ambientes como desiertos,

playas,ciénegas,entreotros(MargesinR.ySchinner,2001).

2

UncasodeambienteextremoloencontramosenlossuelosqueconformanlazonadelEx‐

lagodeTexcoco,modificadosporlaintensaactividaddedrenadoque,desdeelsigloXVII,se

ha llevado a cabo con el fin de evitar inundaciones en la Ciudad de México. Dichas

modificacionessemanifiestanencondicionesextremascomoconductividadeseléctricasde

hasta150dsm‐1ypHalcalino(8.5‐10.5)(Betancur–Galvisetal.,2006)

Investigar la degradacióndePAHs enun ambiente extremo comoel de los suelos salino‐

alcalinosdelEx‐lagodeTexcocoresultadegraninterésdebidoalasaltasexpectativasque

se tienen en cuanto a la identificación y aislamiento de microorganismos tolerantes y

degradadores de PAHs para su aplicación futura en tecnologías de biorremediación de

ambientescomolosquesehanseñalado;asícomoparaaportarevidenciasyconocimiento

científico relevante sobre losprocesosde atenuaciónnaturalde los contaminantes en los

ecosistemasterrestres.

ParadeterminarloanteriorserealizóunacinéticadedegradacióndedosPAHs(fenantreno

y antraceno) en una incubación aerobia durante 56 días con el objetivo de evidenciar la

capacidadderemociónquetienenlascomunidadesmicrobianasexistentesensuelosalino‐

alcalino del Ex‐lago de Texcoco. Además, se analizó el efecto de los PAHs y el medio

utilizado para su incorporación al suelo (acetona) sobre las dinámicas de nitrógeno

inorgánico y en el comportamiento respirométrico de los microorganismos edáficos.

Finalmente, se obtuvieron perfiles genotípicos de la comunidad bacteriana mediante la

técnicadeElectroforesisenGelconGradienteDesnaturalizante(DGGE)deunfragmentode

aproximadamente 500 pares de bases del gen 16S rDNA para analizar los cambios

estructuralesocurridosenlacomunidadmicrobianaduranteelperíodoincubación.

3

2.JUSTIFICACIÓN

SibienenlaactualidadnoexistecontaminaciónporHidrocarburosPolicíclicosAromáticos

en los suelos del Ex‐lago de Texcoco, el estudio de los efectos que estos contaminantes

tienen sobre la comunidad microbiana de un suelo salino‐alcalino permitirá evaluar la

posible utilización de microorganismos provenientes de este ecosistema para la

optimización de los procesos de remediación y biorrecuperación de suelos y ambientes

extremos similares. Además, este estudio coadyuvará a la comprensión ecológica de los

procesos de atenuación natural de estos contaminantes en sitios con características

ambientalesadversas.

4

3.OBJETIVOS

3.1.Objetivogeneral

Analizarelefectodelantracenoy fenantrenosobre la comunidadmicrobianadeunsuelo

salino–alcalinodelEx–lagodeTexcoco.

3.2.Objetivosespecíficos

• Evaluar la degradación aerobia de fenantreno y antraceno en un suelo salino–

alcalinodelEx‐lagodeTexcocoencondicionesdelaboratorio.

• Estudiar el efecto de la contaminación por fenantreno y antraceno sobre las

dinámicasdeNitrógenoinorgánicoenelsuelo.

• Analizar la estructura y dinámica de la comunidad microbiana del suelo al ser

contaminadoconfenantrenoyantraceno.

5

4.MARCOTEÓRICO

4.1.Elsuelo

4.1.1.Definicióndelsuelo

Elsueloesgeneralmentedefinidocomolacapasuperiordelacortezaterrestre,mismoque

estácompuestodepartículasminerales,materiaorgánica,agua,aireyorganismosvivos,y

es la interfaz entre la tierra (geósfera), el aire (atmósfera) y el agua (hidrosfera) (COM,

2002). Otra definición, de Ortiz‐Villanueva (1984), expresa que el suelo es el material

mineralno consolidado sobre la superficie terrestre, queha estado sujeto e influenciado

por factores pedogenéticos (o de formación de suelos) y del medio ambiente como el

materialmadre,elclima,losmacroymicroorganismosylatopografía,todosellosactuando

enunperíodode tiempoyoriginandounproducto–elsuelo–quedifieredelmaterialdel

cual es derivado en muchas propiedades y características (físicas, químicas, biológicas y

morfológicas).

4.1.2.Principalesfuncionesdelsuelo

DeacuerdoconlaComisióndelasComunidadesEuropeas(COM,2002)elsuelodesarrolla

unaseriedefuncionesambientales,económicasysocio‐culturalesdegranimportancia:

• Fuente de alimento y biomasa. Los alimentos y otros productos agrícolas,

esencialesparalavidahumana,asícomolasilviculturadependenensutotalidaddel

suelo. Prácticamente toda la vegetación –pastos, cultivos y árboles– necesita del

sueloparaobtenertantoaguaynutrientescomosoportefísico.

• Almacenamiento, transformación y filtración. El suelo almacena minerales,

materia orgánica, agua y varias sustancias químicas y contribuye en parte a su

transformación. Sirve de filtro natural de las aguas subterráneas, es la principal

reservadeaguapotable,yliberaCO2,metanoyotrosgasesalaatmósfera.

• Fuentedemateriasprimas.El sueloproporcionamateriascomoarcillas, arenas,

mineralesyturba.

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• Entorno físico y cultural para la humanidad. El suelo sirve de base a las

actividades humanas y es así mismo un elemento del paisaje y del patrimonio

cultural.

• Hábitat y reserva genética. El suelo es el hábitat de una gran cantidad de

organismosdetodotipoqueviventantoenelsuelocomosobreél,cadaunoconun

genotipoirreemplazable.Desempeña,porlotanto,unaseriedefuncionesecológicas

esenciales.

4.1.3.Característicasypropiedadesfísico­químicasdelsuelo

• Textura.Serefierea laproporciónrelativadearena, limoyarcillaenel suelo.Es

una característica muy importante ya que afecta a otras propiedades (físicas,

químicasybiológicas).Engeneral, losde texturas finas (arcillosos)poseenmayor

capacidad de adsorción de nutrientes y sonmás fértiles. Los de texturas gruesas

(arenosas)sonmásporososypermitenunamásrápidainfiltracióndelagua(Ortiz‐

Villanueva,1984).

• MateriaOrgánica(M.O.).Provienedelasraíces,residuosdeplantasyorganismos

vivientes omuertos del suelo y suele representar en suelosmineralesmenos del

20%, así como en suelos orgánicos más de 20% de la composición total (Ortiz‐

Villanueva, 1984). La M.O. es de suma importancia en el suelo debido a que

desarrollalassiguientesfunciones(FassenderyBornemisza,1987):

a. Suministrodeelementosnutritivospormineralización(particularmente:N,

P,Symicronutrientes)paralasplantas

b. Aumentalacapacidaddeintercambiocatiónicoyaniónicodelossuelos.

c. Afecta la estructura del suelo, pues favorece la formación de agregados

individualesydisminuyesuplasticidad.

d. Mejora la retención y el drenaje del agua, y además disminuye la

evaporacióndelamisma

e. Sereducenlaspérdidasdelsueloporerosión(Ortiz‐Villanueva,1984).

• Intercambiode cationes.Puede serde tipo aniónico (sulfatos, fosfatos, cloruros,

nitratos)o catiónico (calcio,magnesio, sodio,potasio, amonio)y es llevadaa cabo

por las arcillas y coloides orgánicos del suelo. Esta propiedad sirve como fuente

importantedenutrientesparalasplantas(Ortiz‐Villanueva,1984)

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4.2.SuelosSalinosySódicos

LaOrganizacióndeAgriculturay(FAO,porsussiglaseninglés)defineque,desdeelpunto

devistaagrícola,unsuelosalinoesaquélquecontienesuficientecantidaddesalesneutras

solublesparaafectaradversamenteelcrecimientodelamayoríadeloscultivosdeplantas.

DeacuerdoconRichards(1954)(Abron,Yadav,&Massoud,1988)unsuelosalinotieneuna

conductividadeléctricaenelextractodesaturaciónmayora4dSm‐1a25°C;sinembargo,la

SociedaddelaCienciadelSuelodeAmérica(SSSA,porsussiglaseninglés)hadisminuidoel

límitedeestossuelosconrespectoa losnosalinosaunvalorde2dSm‐1.Lasprincipales

sales presentes en suelos de esta clase son los cloruros y sulfatos de sodio, calcio y

magnesio. Se presentan en algunos casos niveles apreciables de nitratos. Muchos suelos

salinoscontienencantidadessignificativasdeyeso(sulfatodesodio)(Abronetal.,1988).

Lassalesenexcesomantienenlasarcillasdelossuelossalinosenunestadofloculado,porlo

que estos suelos suelen tener buenas propiedades físicas. La estructura de los mismos

sueleserbuenaylascaracterísticasdelabradoypermeabilidadalagualleganasermejores

quelasdesuelosnosalinos.Sinembargo,cuandoocurrelixiviaciónporaguabajaensales,

algunosdeestossuelostiendenadispersarseresultandoenunabajapermeabilidadalagua

yaire,particularmentecuandolossueloscontienenarcillaspesadas(Abronetal.,1988).

Porotraparte, los suelosdenominados comosódicos sonaquellosquedesdeelpuntode

vistadelaagricultura,presentanporcentajesdesodiointercambiablemayoresa15%,yque

de talmanera afectan el crecimiento de lamayoría de los cultivos. La principal causa de

reaccionesalcalinasdelossueloseslahidrólisisdeloscationesintercambiables,asícomo

desales:CaCO3,MgCO3,Na2CO3,entreotras(Abronetal.,1988).’

4.2.1.UbicaciónydescripcióndelEx­lagodeTexcoco

De acuerdo con la Red Hemisférica de Reservas para Aves Playeras (RHRAP)

(http://www.whsrn.org,2008)elEx‐LagodeTexcocoformapartedelacuencahidrológica

del Valle deMéxico, situada en el centro del Eje Neovolcánico que atraviesa el territorio

nacionaldesdelacostadelPacíficohastaelGolfodeMéxico,conunasuperficiede10,000

ha.Geográficamenteseencuentralocalizadoentrelosparalelos19º25’y19º35’N,yentre

8

los meridianos 98º55’ y 99º03’ O y abarca los municipios de Ecatepec, Atenco,

Chimalhuacán,NetzahualcóyotlyTexcoco,enelEstadodeMéxico,México.

El clima de este sitio es semiárido templado, con verano cálido, y precipitación pluvial

mínima de 460 mm y máxima de 600 mm por año. El área se encuentra a una altitud

promediode2230m.s.n.m.(Gutiérrez‐CastorenayOrtiz‐Solorio,1999).

SegúnlaRHRAP(http://www.whsrn.org,2008),conlosrecientestrabajosderecuperación

del área se han generado ambientes integrados por 6,000 ha de praderas de pastizales

halófitosde las especiesEgagrostis obtusiflora yDistichlis spicata, zonasdebosquede las

especies Tamarix spp., y Casuarina spp., charcas someras y zonas de tule; las 4,000 ha

restantes son embalses artificiales que regulan aguas residuales, tratadas y de origen

pluvial. La vegetación acuática y subacuática se encuentra representada por los tulares

Scirpuslacustris,S.californicus,S.paludosusyTyphaangustiflora.

4.2.2.CaracterísticasgeneralesdelossuelosdelEx–LagodeTexcoco

Los suelos en el áreahan sido formadospor cenizas volcánicas depositadas in situ en un

ambientelacustreycubiertorecientementepormaterialcoluvial.Elacuíferoestácercade

la superficie (80–150 cm); el agua subterránea es altamente salina y son dominantes las

sales NaCl y Na2CO3. Los suelos son salino‐sódicos con un pH entre 8.5 y 10.5, y

conductividades electrolíticas en extractos de saturación entre 4 y 70 dS m‐1. Además,

presentanporcentajesdesodio intercambiableelevados(60‐80%); la texturadel sueloes

delimosaaarcillosa,suestructuraesgranularenlasuperficieyprismáticaenelsubsuelo.

Los contenidos demateria orgánica se encuentran entre 20 y 50 g kg‐1 de suelo seco. El

drenaje natural es pobre y a pesar de que los suelos son profundos, las raíces están

restringidas por una capa de ceniza compacta de 5 a 20 cm de grosor a profundidades

medias(16‐40cm).Laintemperizaciónestáavanzada;unaevaporaciónalta(aprox.2000

mmaño‐1ylaprecipitaciónpluvial,relativamentebaja,incrementanlaconcentracióndesal

delasolucióndelsuelo(Luna‐Guidoetal.,2002)

9

4.3.HidrocarburosdelPetróleo

Elpetróleoysusproductosderivadossonmezclascomplejasdecompuestosorgánicos.En

laTabla4.1semuestranlosmayorescomponentesdelosdistintosproductosdelpetróleo.

Además, laNormaOficialMexicanaNOM–138–SEMARNAT–2003 (2005) establece límites

máximos permisibles de contaminación en suelos para diversos productos asociados a

derramesdehidrocarburos(Tabla4.2).

Tabla4.1.Composicióndeproductosderivadosdelpetróleo

FUENTE:NyerySkladany,1989(TomadodeBakeryHerson,1994)

4.3.1.HidrocarburosPolicíclicosAromáticos

Deentreloshidrocarburosdelpetróleopodemosdistinguiraungrupodecompuestosmuy

especiales, conocidos con el nombre genérico de Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos

(PAHs,porsussiglaseninglés).Estoscompuestoscontienendosomásanillosaromáticos

fusionados (Tabla 4.3), cuya persistencia bioquímica proviene de una densa nube de

electrones‐π a ambos lados de la estructura del anillo, haciéndolos resistentes al ataque

nucleofílico(Johnsenetal.,2005).

Producto ComponentesprincipalesGas Alcanos lineales y ramificados. Uno a cinco carbonos de

longitud,i.e.:etano,propano.Gasolina Hidrocarburoslinealesyramificados.Seisadiezcarbonosde

longitud.Cicloalcanosyalquilbencenostambiénpresentes.Keroseno/Combustibledieselno.1

Hidrocarburos linealesy ramificados.Onceadocecarbonosde longitud, principalmente. Alcanos lineales predominan.Cicloalcanos y aromáticos también presentes. Contienen debajasaindetectablesconcentracionesdebencenoyPAHs.Laturbosina(JetA)tieneunacomposiciónsimilar.

Gasóleosligeros Doceadieciochocarbonosdelongitud.Menorporcentajedealcanos lineales que en keroseno. Contiene cicloalcanos ycicloalcanosaromáticos,olefinasyolefinasaromáticascomoestirenos.Estosproductosincluyenaldieselycombustóleo.

Gasóleos pesados y aceiteslubricantesligeros

Hidrocarburosde18a25carbonosdelongitud.

Lubricantes Hidrocarburosde26a38carbonosdelongitudAsfaltos Compuestospolicíclicospesados

10

Tabla4.2.HidrocarburosdelpetróleoquedebenanalizarseduranteunderrameHidrocarburosProducto

contaminante Fracciónpesada

PAHs Fracciónmedia

PAHs Fracciónligera

BTEX

Mezclas X X X X X XPetróleocrudo X X Combustóleo X X Parafinas X X Petrolatos X X Aceites X X Gasóleo X X Diesel X X

Turbosina X X Keroseno X X Creosota X X Gasavión X XGasolvente X XGasolinas X XGasnaftas X X

FUENTE:NOM–138–SEMARNAT–2003(2005).

LosPAHsestánpresentesenpequeñascantidadesenlosproductosderivadosdelpetróleo,

talescomocombustóleosyaceitescrudos,yengrandescantidadesenlacreosotautilizada

en la preservación de madera (Baker y Herson, 1994). Estos compuestos resultan

omnipresentes en el ambiente como resultado de la combustión incompleta de materia

orgánica,fuentesdeemisión,gasesdecombustióndelosautomóviles,plantasgeneradoras

de energía eléctrica a base de carbón, materia doméstica y materia de fuentes de área

(Finlayson‐PittsyPitts,1997).

11

Tabla4.3.EstructurasmolecularesdediversosPAHscomunes

FUENTE:ModificadadeZhangetal.,2006

4.3.1.1.Riesgosalasalud

Los Hidrocarburos policíclicos aromáticos son ubicuos en el ambiente, lo que conlleva a

encontrarnivelesmediblesdeexposiciónenlapoblacióngeneral.Unafuentesignificativaa

exposicióndePAHs es el humodel tabaco; en los no fumadores y población expuesta no

ocupacional,ladietaesfrecuentementelamayorfuentedeexposiciónaPAHs(IARC,2006).

Sehaencontradoqueexisteunamayorexposiciónaestoscontaminantesentrabajadores

delasindustriasdegasificacióndecarbón,produccióndecoque,destilacióndealquitránde

hulla,conservacióndemaderasutilizandocreosota, produccióndealuminio,manufactura

deelectrodosdecarbono,produccióndecarburodecalcio,limpiezadechimeneas,asícomo

plantasdeenergíatermoeléctrica(IARC,2006).

EnunestudiorealizadoporlaIARC(2006)semencionaque,porejemplo,existeevidencia

deunmayorriesgodecontraercáncerdepulmónentretrabajadoresde laproducciónde

coque.Asuvez,sedeterminóquelostrabajadoresdeplantasdecoquedeEstadosUnidosy

Canadá,presentabanunamayorincidenciadecáncerdepulmónyqueelriesgoeramayor

enáreasdetrabajocercanasahornos.

PAH(no.anillos)

Estructuramolecular

PAH(no.deanillos) Estructuramolecular

Naftaleno(2)

Pireno(4)

Antraceno(3)

Benzo(a)pireno(5)

Fenantreno(3)

Coroneno(7)

12

Dadalaatenciónqueseledebeprestaraestoscontaminantes,laAgenciadeProtecciónal

Ambiente de los Estados Unidos (USEPA) ha enlistado 17 PAHs como contaminantes

prioritarios para la remediación (Tabla 4.4), de entre los cuales 15 PAHs son

potencialmente carcinogénicos para humanos según reportes de la Agencia Internacional

paralaInvestigaciónenCáncer(IRAC)(Zhang,etal.,2006).

Tabla4.4.PrincipalescaracterísticasfísicasycarcinogénicasdelosPAHsprioritariosparalaUSEPA

1ClasificacióndelaIARCdebidosuriesgocarcinogénicoahumanos:1)Carcinogénico,2A)Probablementecarcinogénico,2B)Posiblementecarcinogénico,y3)Carcinogenicidadnoclasificable.NR:Noreportado.FUENTE:Zhangetal.,2006

4.4.Tecnologíasparalaremediacióndesitioscontaminados

Las tecnologías disponibles para el tratamiento y remediación de sitios contaminados

pueden clasificarse inicialmente como: físicas, químicas y biológicas. En la Tabla 4.5 se

resumenlasprincipalestecnologíasexistentesasícomosuefectosobreloscontaminantes

PAHs Númerodeanillos

Solubilidada25°C(mgL­1)

Coeficientedepartición

Octanol:Agua

Grupocarcinogénico1

Naftaleno 2 3.2 2.3x103 2BNaftilamina 2 4.6 1.4x103 1Acenafteno 3 3.4 2.1x104 NRAcenaftileno 3 3.93 1.2x104 NRFluoreno 3 1.9 1.5x104 3Antraceno 3 0.05–0.07 2.8x104 3Fenantreno 3 1.0–1.3 2.9x104 3Fluoranteno 4 0.26 3.4x105 3Criseno 4 0.002 4.0x105 3Pireno 4 0.14 2.0x105 3Benz(a)antraceno 4 0.01 4.0x105 2ABenzo(b)fluoranteno 5 NR 4.0x106 2BBenzo(k)fluoranteno 5 NR 7.0x106 2BBenzo(a)pireno 5 0.0038 1.0x106 2ADibenz(a,b)antraceno 5 0.0005 1.0x106 2ABenzo(g,h,i)perileno 6 0.0003 1.0x107 3Indenol(1,2,3‐c,d)pireno

6 0.062 5.0x107 2B

13

tratados. Los tratamientos de remediación, ya sean físicos, químicos o biológicos, pueden

clasificarse,deacuerdoalsitioenelquesellevenacabo,como:insituyexsitu.

4.4.1.Tratamientoinsitu

Laremediaciónserealizadirectamenteenelsitiodondesepresentólacontaminación.Su

principalventajaesque implicaunamínimaperturbacióndelsitioy tierrasaledañas.Los

procesos insitu,generalmente involucran ladistribucióndeaireyaguaa travésdelsuelo

contaminado,loquesevefavorecidopormediospermeablesybajaheterogeneidaddelas

condicionesfísicasydedistribucióndelacontaminación(Scullion,2006).

4.4.2.Tratamientoexsitu

Los procesos ex situ se llevan a cabo mediante una excavación del volumen de suelo

contaminado,yaseaonsite(sobreelsitio),i.e.compostajeolandfarming(biolabranza),oen

unidades de tratamiento como biorreactores. Este tipo de tratamientos ofrecen un gran

alcanceencuantoalmanejodecondicionesparaoptimizar laeficienciadel tratamientoy

paracontrolarelesparcimientodeloscontaminantes(Scullion,2006).

4.5.Biorremediación

Labiorremediaciónsedefinecomoelusodemicroorganismosoprocesosmicrobianospara

descontaminarydegradarcontaminantesdelambiente(BakeryHerson,1994).Elobjetivo

últimodelabiorremediaciónobiorrecuperaciónesmineralizarloscontaminantes,estoes,

transformaraquellos compuestosquímicosnocivos en compuestos inocuos, tales comoel

CO2o algúnotro gaso sustancia inorgánica, aguaymaterial celularpara losorganismos

responsablesdeladegradación(Eweisetal.,1999).

Las tecnologías ex situ en cuanto biorremediación son los biorreactores, landfarming,

compostaje y algunas otras formas de tratamiento en fase sólida. Por otro lado, las

tecnologías in situ pueden ser el bioventeo, bioestimulación y bioaumentación (Baker &

Herson,1994).

14

Tabla4.5.Principalestecnologíasderemediacióndesuelosysuefectosobreloscontaminantes

FUENTE:Scullion,2006

Labiorremediaciónofrecevariasventajas (BakeryHerson,1994)sobreotras tecnologías

convencionalesderemediación,algunasdeestasson:

• Puedeserrealizadaenelsitio,loqueeliminacostosdetransportación.

• Siserealizainsitulaperturbacióndelsitiosedisminuye

• Enocasiones,losprocesosdemanufacturaeindustrialespuedencontinuar,mientas

serealizalabiorremediación.

• Eliminapermanentementelosdesechos

• Permite el acoplamiento con otras técnicas de remediación en un tren de

tratamiento.

EfectosobreloscontaminantesTipodeRemediación

Tratamientooproceso Destrucción/

DegradaciónExtracción/Pérdida

Estabilización

Térmico x x Solidificación (x) xExtracciónconvapor x Aireación (x) X Lavado (x) X

FÍSICA

Electrorremediación (x) x Oxidación x x x

Reducción (x) x x

Hidrólisis x x

Solubilización (x) x

QUÍMICA

ManipulacióndepH (x) x x

Landfarming x (x) xBiopilas x (x) xCompostaje x (x) xBiorreactores x (x)

BIOLÓGICA(conmicroorga–nismos)

Biolixiviación x Fitoestabilización (x) (x) xFitoextracción (x) x (x)

Fitorremediación

Fitodegradación x (x) (x)

15

En contraste con las ventajas mencionadas, la biorremediación también presenta ciertas

limitacionesydesventajas(BakeryHerson,1994):

• Algunoscompuestos ‐cloradosometales,porejemplo‐noson fácilmente tratables

biológicamente.

• Para algunos compuestos químicos la degradación microbiana puede llevar a la

produccióndesustanciasmástóxicasomóvilesqueloscompuestosoriginales.

• Dadoquelabiorremediaciónesunatecnologíaespecíficaparacadasitio,loscostos

deevaluación, caracterizaciónydeterminacióndeviabilidadpuedensermásaltos

queparaotrastecnologíasconvencionales.

4.5.1.Factoresinvolucradosenelprocesodebiorremediación

Los factoresqueafectanel rendimientode labiorremediaciónpuedenclasificarseen tres

grandesgrupos:medioambientales,físicosyquímicos.Éstossedescribenacontinuación.

4.5.1.1.Factoresmedioambientales

Son aquellos necesarios para proporcionar las condiciones óptimas de crecimiento a los

microorganismos que llevan a cabo la biorrecuperación. Estos factores son: temperatura,

pH,disponibilidaddenutrientes,oxígenoyhumedad(Eweisetal.,1999).

Las bacterias de un suelo actúan habitualmente en el intervalo de 5 a 40ºC, aunque la

temperaturadependedecadaespecie.Confrecuencialosmohosylevadurassuelenrealizar

mejorsucometidoavaloresdepHbajosoneutros.Lamayoríadelosmicroorganismosse

desarrollanmejordentrodelrangodepHde6a9,encontrándoselascondicionesóptimas

decrecimientoentre7y8(Eweisetal.,1999).

Los nutrientes son aquellos compuestos químicos necesarios para el crecimiento

microbianoquenoproporcionanenergíaocarbono.Losmásimportantessonnitrógenoy

fósforo, cuyas cantidades son normalmente insuficientes en los sitios de recuperación

(Eweis,etal.,1999).

16

Eloxígenoeselreceptorfinaldeelectronesgeneralmenteempleadoenprocesosbiológicos

ytambiénesnecesarioenreaccionesredoxcatalizadasporenzimas.Lahumedadconstituye

otrofactormuyimportante,yaquelosmicroorganismosobtienenlosnutrientesnecesarios

para su crecimiento apartir de soluciones acuosas.Debido aque la solubilidaddelO2 en

aguaesbaja,contenidosmuyaltosdehumedadsetraducenenunabajadisponibilidadde

oxígeno(Eweisetal.,1999).

4.5.1.2.FactoresFísicos

Los factores físicos más importantes en la biorremediación son la disponibilidad de los

contaminantesparalosmicroorganismos,lapresenciadeaguaylaprovisióndeunaceptor

de electrones adecuado (Eweis et al., 1999). La disponibilidad constituye un concepto

complejo,relacionadoconlaafinidaddeloscontaminantesporlasfasessólidasygaseosas,

laestructuraintersticialdelasfasessólidasylapresenciadelascomunidadesmicrobianas

adecuadas(Eweisetal.,1999).

Beck et al. (1995), hacen énfasis en la naturaleza bifásica del desprendimiento del

contaminantedelafasesólida,endondeloscompuestosnosondegradadosodesprendidos

suficientemente rápido del suelo y la disponibilidad química y biológica decrece

rápidamenteenperíodosdeminutosahoras, luego lentamenteenperíodosdesemanasa

meses, debido a procesos de adsorción y difusión referidos como ageing (añejamiento),

relacionadosconlamateriaorgánicadelsuelo.

4.5.1.3.Factoresquímicos

El factor químico demayor importancia es la estructuramolecular del contaminante. La

capacidad para ser biodegradado está relacionada con factores tales como solubilidad,

grado de ramificación, grado de saturación y la naturaleza y efecto de los sustituyentes

(Eweissetal.,1999).

17

4.6. Utilización de microorganismos extremos en la biorremediación de

hidrocarburos

Sehademostradoqueunagrancantidaddeloshidrocarburosquecontaminanelambiente,

principalmente debido a la descarga accidental o a procesos industriales, pueden ser

degradados(mineralizadosotransformados)envariosambientesextremoscaracterizados

por bajas o altas temperaturas, pH ácido o alcalino, alta salinidad o altas presiones; y

aquellos adaptados a más de una condición, ofrecen un potencial especial para la

descontaminación biológica de hábitats donde varias condiciones extremas se presentan

simultáneamente(MargesinR.ySchinner,2001).

Sehademostradoqueenambientessalinos,tantoalgunasarqueascomootraseubacterias

puedendegradarunampliorangodecontaminantesorgánicos;sinembargo,éstasúltimas

se presentan como las más prometedoras, debido a que podrían poseer una diversidad

metabólica mucho mayor, ya que las enzimas utilizadas en su metabolismo de

biodegradaciónpodríanserdetipoconvencional(i.e.,norequierensal)ysimilaresalasde

microorganismosnohalófilos(Orenetal.,1992.CitadoenMargesinySchinner,2001).

4.7.TécnicasdeBiologíaMolecularenelestudiodelaecologíadelsuelo

El reciente surgimiento de investigaciones en ecología molecular, las cuales emplean

herramientas moleculares para resolver problemas ecológicos (Eguiarte et al., 2007), ha

proporcionado pruebas irrefutables de la existencia de una gran variedad de nuevos

microorganismos en el ambiente en cantidades y variedades comparativamente mucho

mayoresaaquellosmicroorganismossusceptiblesasercultivadosenlaboratorio(Rondon

etal.,2000).Además,sehaevidenciadoquedichoscultivosfallanalintentarreproducirlos

nichos ecológicos y relaciones simbióticas que se encuentran en ambientes naturales

complejos y que son requeridos para soportar el amplio espectro de la diversidad

microbiana(Nockeretal.,2007).

Dichas herramientas de la ecología molecualr se basan en general en la utilizaición de

moléculas orgánicas que funcionan como marcadores moleculares (i.e. ácidos grasos de

fofolípidos o ácidos nucléicos: DNA y RNA), los cuales están presentes en todos los

18

microorganismosypuedenserextraídosdeéstossinnecesidaddesercultivados(Nogales,

2005).

Existendiversasinvestigacionesyrevisiones,talescomoladeRappéyGiovannoni(2003),

que han determinado que, sólo 26 de los aproximadamente 52 linajes mayores o phyla

dentro del dominio Bacteria tenían representantes cultivables. En esta revisión se

menciona,porejemplo,el casodelphylumVerrucomicrobium,aerobioheterótrofoaislado

de ambientes de agua dulce, del cual tres de sus cinco subgrupos, no contienen ningún

representantecultivable.Enotroestudio(Dunbaretal.,1999),elcualanalizaladiversidad

decomunidadesen larizósferadepiñónendossuelosáridosdelsudoestede losEstados

Unidos,comparandolastécnicasdecultivoenlaboratorioyladelibreríasapartirdeclones

de16SrDNA,sedeterminóuntotalde34y498filotipos,respectivamente.Dichosfilotipos

correspondieron a 3 y 7 divisiones de bacterianas, para cada técnica, demostrando la

desigualdad existente entre las técnicas cultivables convencionales y las técnicas de

ecologíamolecularactuales.

4.7.1.Perfiladogenotípicodelacomunidadmicrobiana(técnicasdehuella

genómica).

Se conocen con este nombre una variedad de técnicas genotípicas que proporcionan un

patrón o perfil de la diversidad de la comunidad microbiana, y que están basadas en la

separación física de especies únicas de ácidos nucleicos (Muyzer, 1999). La principal

característica de estos métodos es que permiten el análisis simultáneo de múltiples

muestras,loquehaceposiblecompararladiversidadgenéticadecomunidadesmicrobianas

dediferenteshábitats,oestudiarelcomportamientodeunacomunidadindividualalolargo

del tiempo (Muyzer, 1999). Mediante el empleo de estos métodos, el análisis de

metagenomas proporciona información valiosa con respecto a la diversidad, riqueza de

especies y estructura poblacional. Así mismo, permite una comparación transversal de

diferentescomunidades,monitoreodecambios temporalescomoresultadodelcambioen

losparámetrosambientales,evaluacióndelosimpactosdelabiorremediaciónymodelado

ecológico(Nockeretal.,2007).

Algunas de las principales técnicas de huella o perfilado genómico se mencionan a

19

continuación:

1. Fragmentos polimórficos de longitud variable (RFLP) o Análisis de restricción deDNA

ribosomal(ARDRA).

2.Análisisautomatizadodelespaciadorintergénicoribosomal(ARISA)

3.Electroforesisengel congradientedesnaturalizante (DGGE)oElectroforesisengel con

gradientedetemperatura(TGGE).

4.PerfiladodeRNAdebajopesomolecular(LMWRNAfingerprinting)

5.Polimorfismodeconformacióndecadenasimple(SSCP)

6.DNApolimórficoamplificadoaleatoriamente

En la figura4.1semuestraundiagramade flujoqueresumelospasosen laaplicaciónde

técnicas debiologíamolecular para el estudiode la estructura, dinámica y funciónde las

comunidadesmicrobianasendiversosambientes,entreelloselsuelo.

Acontinuaciónsedaráunabreveexplicaciónacercadeunatécnicadesumaimportanciaen

labiologíamolecular:lareacciónencadenadelapolimerasa(PCR,porsussiglaseninglés).

Despuésdelocualseprofundizaráenunadelastécnicasdehuellagenómicamencionadas

anteriormente: DGGE; ya que esta técnica será ampliamente discutida a lo largo de este

trabajo.

4.7.2.ReacciónenCadenadelaPolimerasa(PCR)

La PCR es unmétodo de amplificación rápida deDNA in vitro, que tiene la capacidad de

multiplicarmoléculasdematerialgenéticohastamilesdemillonesdevecesenuntubode

ensaye, proporcionando grandes cantidades de genes para su clonación, secuenciación o

mutagénesis(Madiganetal.,2004).

LaPCR se lleva a cabode forma completamentebioquímica,mediante lautilizaciónde la

enzimaDNApolimerasa,lacualdirigelasíntesisdenuevoDNAdecadenasencillaapartir

deunDNAmolde,utilizandodeoxinucleótidoscomosustrato.Estavaliosaenzimasintetiza

DNAendirección5’a3’ypuedeagregarnucleótidosalextremo3’deunoligonucleótido

20

(llamado,iniciadoroprimer),elcualessintetizadosegúnlasecuencianucleotídicadeuna

regióndelgendeseado(Watsonetal.,2004;Madiganetal.,2004).

Acontinuaciónsemencionaránydescribiráncadaunade lasetapasquese llevan acabo

durantecadaciclodePCR(Fig.4.2)(Watsonetal.,2004;Madiganetal.,2004;Eguiarteet

al.,2007;Lodishetal.,2003).

Fig.4.1.Diagramadeflujodelosdiferentesposibilidadesenlaaplicacióntécnicasdebiologíamolecularenelestudiodecomunidadesmicrobianas.FUENTE:Muyzer,1998.

21

1. Desnaturalización inicial: Este

paso involucra la aplicación de

calor para lograr la separación de

las dos cadenas sencillas. Cuando

seutilizalaenzimaTaqPolimerasa

(proveniente de la bacteria

Thermus aquaticus), esta

temperatura suele ser de

aproximadamente95°C.

2. Desnaturalización: Este paso

inicia el bloque de repetición de

ciclos y se lleva a cabo a lamisma

temperaturadelpasoanterior.

3. Alineamiento: La temperatura se

reducehastaunos50–60°C,loque

permite la hibridación

(alineamiento) de los

oligonucleótidos específicos,

añadidos en altas concentraciones.

Las largas cadenas de DNA

permanecerán apartadas debido a

subajaconcentración.

4. Elongación: Los oligonucleótidos

hibridados servirán de iniciadores

(primers) para la síntesis de las

cadenas de DNA en presencia

de deoxinucleótidos (dNTPs) y

una enzima resistente a la

temperatura, tal como la Taq

polimerasa, mencionada

anteriormente. En este paso la

temperaturaóptimaesde72°C.

Fig.4.2.Diagramaesquemáticodelareacciónencadenadelapolimerasa(PCR).LosrectángulospequeñosrepresentanoligonucleótidosquesirvendeprimersparalasíntesisdecadenascomplementariasdeDNAdelgenespecíficomediantelaenzimaTaq.polimerasa.NótesequecadacicloadicionalduplicalacantidaddelfragmentodeDNAdeinterés.Alcabodeunos20ciclossetendránaproximadamenteunmillóndecopiasdecadamoléculaoriginal.FUENTE:Lodishetal.,2003.

22

Esta serie de pasos (2, 3 y 4, Desnaturalización – Alineamiento – Elongación) se repite

tantoscicloscomoseanecesario(e.g.35ciclos).

5. Elongaciónfinal:Alcompletarselosciclosdeamplificación,sevuelveaelevar

latemperaturaa72°Cparapermitirquelaenzimasinteticelosfragmentosque

pudieronhaberquedadoincompletos.

Luegodecadacicloelnúmerodecopiasdelasecuenciadeseadaseduplicará;porlotanto,

ésta aumentará de forma exponencial, mientras que cualquier otra secuencia de DNA

originalpermanecerásinamplificar.

4.7.3.Electroforesisengelcongradientedesnaturalizante(DGGE)

Comoyaseanalizó, laPCR,permiteamplificarunconjuntodegenesdeidénticotamañoy

delimitadosporunmismopardeiniciadoresocebadores;sinembargo,sisedesearealizar

elanálisisdeunacomunidadmicrobiana(paraunanálisisfilogenéticoodeterminarelperfil

genotípicodelacomunidad,porejemplo)esnecesariosepararesosfragmentosdeDNAde

mismalongitudperocondistintasecuenciadeparesdebases.Paraello,sepuederecurrira

la clonación molecular o cualquiera de las técnicas de huella dactilar que se enlistaron

anteriormente. Ahora, se explicará con detalle en que consiste la técnica conocida como

DGGE, de la cual existe una gran cantidad de estudios y revisiones sobre diversas

aplicacionesyambientesanalizados(Nockeretal.,2007;Muyzer,1999;Malik,2008)

Elprocedimientoestábasadaen laelectroforesisde fragmentosdelgen16SrDNA(500–

700p.b.)amplificadosporPCRengelesdepoliacrilamida,loscualescontienenungradiente

linealmentecrecientededesnaturalizantes(Muyzer,1993).LaseparaciónenunDGGEestá

basada en lamovilidad electroforética de unamolécula parcialmente fundida en geles de

poliacrilamida,lacualdecreceencomparaciónconladelaformacompletamentehelicoidal

de lamolécula (Muyzer,1993).Conforme lasmoléculasavanzana travésdel gel y seven

expuestas a condiciones desnaturalizantes cada vez más fuertes, los productos de PCR

alcanzanunpuntodondeocurrelaseparacióndelDNAdedoblehélice;esteseconocecomo

punto de fusión (melting point) de la molécula, el cual depende principalmente de la

longitud del producto, su contenido de Guanina y Citosina (GC) y la secuencia de

23

nucleótidos. Entre mayor la estabilidad intrínseca, mayor debe ser la condición

desnaturalizanteparaalcanzarladesnaturalización.(Nockeretal.,2007)

Dadoque cadaunade las secuenciade fragmentosparticulares varía, éstasdetendrán su

migración en diferentes posiciones en el gradiente desnaturalizante y así podrán ser

separadasefectivamentemedianteestatécnica.(Muyzer,1993).Laseparacióndecadenas

se consigue a través de los químicos desnaturalizantes formamida (0 – 40%) y urea (0 –

7M)yaunatemperaturaconstantede60ºCaproximadamente(Nockeretal.,2007).

Enlosgelescongradientedesnaturalizante,secuenciasadicionalesricasenGC,puedenser

incorporados en uno de los primers para modificar el comportamiento de fusión de los

fragmentos de interés hasta el grado en que cerca del 100% de todas las variaciones de

secuenciasposiblespuedenserdetectadas(Muyzer,1993).

4.7.4.Utilizacióndelgen16SrDNAcomomarcadormolecular

El desarrollo de técnicas que involucran el estudio de los ácidos nucleicos, DNA y RNA,

permiten estudiar la estructura microbiana a un nivel genético. Aunque en principio

cualquiergenpuedeserutilizadoconestefin,elgencondificantedelasubunidadpequeña

delRNAribosómico,16SrDNA,(ysuequivalenteeneucariotas,18SrDNA)esunexcelente

marcadormoleculardebidoalassiguientescaracterísticas(Muyzer,1999):

a) Estápresenteentodoslosorganismos.

b) Tiene regiones conservadas y otras altamente variables, lo que permite diseñar

primersysondasgeneralesyespecíficas.

c) Contieneunnúmeroadecuadodesecuenciasparainferirunanálisisfilogenético.

d) Esunimportantecomponentecelular,loquefacilitasudetección.

e) Se transfiere verticalmente, ya que se considera que no está sujeto a transmisión

horizontalentremicroorganismos(Nogales,2005)

24

5.METODOLOGÍA

5.1.Muestreodelsuelo

Lasmuestrasempleadasparaesteexperimentofuerontomadasdetressitiosdistintos(S1,

S2yS3),removiendolacubiertavegetalyrecolectandoelsuelodelacapasuperficial(0–

15cm).EstostressitiosestánubicadosenlazonadelEx‐lagodeTexcoco(N.L.19o30’’,W.L.

98o 53’) a una altitud de 2500 m.s.n.m., con una temperatura promedio anual 16° C y

precipitación anual promedio de 600 mm (principalmente de julio a septiembre). En

general, los suelos de ese sitio son salino‐alcalinos con presencia de sales como NaCl y

Na2CO3. El pH fluctúa entre 8.5 y 10.5, y la conductividad eléctrica (EC) en extracto de

saturaciónvade4a150dSm‐1yelsuelotieneunaltoporcentajedesodiointercambiable

(60‐80%)(Fernández‐Luqueño,etal.,2008).

5.2.Preparacióndelsuelo

Previamentealestablecimientode la incubación, la totalidaddelsuelo fuecribadoconun

tamiz de 5 mm, y ajustado a un 40% de su CRA mediante la adición de agua destilada.

Inmediatamentedespués fuepreincubadoenrecipientesdeplásticodurante10díaspara

reactivar la actividad microbiana del suelo. Se colocaron dos frascos en el interior del

recipiente,unocon100mLdeNaOH1MparacapturaelCO2producido,yelotrocon100

mL de agua destilada para evitar la desecación del suelo. El suelo fue aireado

periódicamenteparaevitarcondicionesdeanaerobiosis.

5.3.DiseñoExperimentalytratamientospropuestos

Untotalde90unidadesexperimentalessedispusieronparasersometidasaunaincubación

aerobiadurante56días.Cadaunadeestasunidades(Fig.5.1)seconformaronporunfrasco

ámbarde947mLdecapacidadalqueseañadióaguadestiladaparamantenerlahumedad

dentro de la unidad experimental; además se colocaron otros 2 frascos en su interior: el

primerocon20gsuelo(baseseca)ajustadoal40%desuCRAyaplicandolostratamientos

queseindicanposteriormente.Elsegundofrascocontenía20mLdesolución1MdeNaOH

paracapturarelCO2emitidodurantelaincubación.

25

Enelprimertratamiento(PAHs)elsuelosecontaminócon1200mgdefenantrenokg‐1SSy

520mgdeantracenokg‐1SS;estetratamientoseestablecióparatressitios(S1,S2yS3)y

por triplicado. En el segundo tratamiento (Acetona) el suelo se adicionó con 3 mL de

acetona; se estableció para un sitio (S1) y por triplicado. El tercer tratamiento contenía

únicamentelos20gdesueloysirviócomotratamientotestigo(Control);estetratamiento

seestablecióparaunsitio(S1)yportriplicado(Tabla5.1).

Además,seañadieron3unidadesadicionalesparacadadíademuestreo(3,7,14,28y56)

lascualesconteníanúnicamenteunfrascocon10mLdeaguadestiladayotromáscon20

mL de solución 1M de NaOH , que sirvieron como controles del CO2 presente en la

atmósfera.

Delas90unidadesmencionadasinicialmentesetomaron15(3Control,3Acetonay9

PAHs) que se utilizaron como tiempo cero y fueron analizadas inmediatamente para

determinar N inorgánico (NH4+, NO3‐, NO2‐), PAHs y CO2. Las unidades restantes (75) se

sellaron e incubaron por 56 días. Después de 3, 7, 14, 28, 56 días se tomaron las 15

unidades correspondientesy seanalizaronparadeterminarN inorgánico,PAHsyCO2.En

todosloscasosdemuestreo(0,3,7,14,28y56días)setomaron10gparadeterminación

deNinorgánico,1.5gparaextracciónyanálisisdePAHs;asícomo0.5gparalaextracción

deDNA(únicamentedías0y56);elsuelorestanteseconservóenultracongelacióna‐80°C

(Fig.5.4).

Tabla5.1.Descripcióndetratamientosutilizadosenestainvestigación

Tratamiento Nombre Características

1 PAHs20gsueloa+1200mgfenantrenokg‐1suelo+520mgAntracenokg‐1suelo+3mLAcetona

2 Acetona 20gsuelo+3mLAcetona

3 Control 20gsuelo

amasadesueloexpresadaenbaseseca

26

Fig.5.1.Diagramaesquemáticodelasunidadesexperimentalesutilizadasenlaincubaciónaerobiadelsuelo.Dentrodelfrascodemayorcapacidadseagregóaguadestiladaparamantenerlahumedaddentrodelmicrocosmos.Secolocaronademásdosfrascos,unocon20gsuelo(baseseca)preincubadoal40%CRAyaplicandoeltratamientocorrespondiente(PAHs,AcetonaoControl).Elotrofrascocontenía20mLdeNaOH1.0MelcualservíaparacapturarlasemisionesdeCO2.Lasunidadesexperimentalessesometieronaunaincubaciónaerobiadurante56días.

5.3.1.Contaminacióndelsuelo

Como ya se mencionó antes, el tratamiento 1 (PAHs) fue contaminado con 1200 mgfenantrenokg‐1 s.s.+520mgAntracenokg‐1 s.s.; esto se realizóde la formaque indicaeldiagramadelafigura5.2.Enelcasodelaadicióndeacetonaeneltratamiento2(Acetona),serealizaronlosmismospasosqueindicaeldiagrama,conladiferenciadequeseagrególamismacantidaddeacetonaenvezdesoluciónmadredePAHs.5.4.Análisisfísicosyquímicos

1. La medición de pH se realizó en una suspensión 1:2.5 suelo‐agua usando un

electrododevidrio(Thomas,1996).2. La determinación de conductividad eléctrica (CE) se realizó en extracto de

saturación(Rhoadeset.al,1989).3. La textura del suelo se determinó utilizando el método del hidrómetro (Gee y

Bauder,1986).4. Elcarbonoorgánicototalsedeterminóconunanalizadordecarbonoorgánicototal

TOC‐VCSN(SHIMADZU,USA).5. El carbono inorgánico se determinó mediante la captura de CO2 en 20 mL de

solución1MdeNaOH,tituladoposteriormenteconunasolución1MdeHCl.6. ElnitrógenototalseanalizómedianteelmétodoKjeldahl(Bremmer,1996)7. El N inorgánico (NH4+, NO2‐ y NO3‐) se determinó colorimétricamente en un

analizadorautomáticoSanPlusSystem–SKALAR(Mulvaney,1996).

27

Fig.5.2.Diagramadebloquesqueindicalametodologíaempleadaparalacontaminacióndel

suelo

5.5.AnálisisdePAHs

La extracciónde antracenoy fenantrenoen lasmuestrasde suelo se realizóutilizandoel

métodode extraccióndesarrolladopor Songet al. (1995), que en general sebasa enuna

seriede tresextraccionesutilizandoacetona comodisolvente, adiciónde sulfatode sodio

paraeliminarlahumedad,agitaciónenvórtex,bañodesonicaciónyseparacióndefasespor

centrifugación. Inmediatamente después, una alícuota de 2 µL se analizó en un

cromatógrafoHewlett‐Packard4890‐DGC(USA)equipadoconundetectordeionizaciónde

flama. Seutilizóuna columnaHP‐5deHewlett‐Packard (USA) conuna longitudde1.5m,

diámetrointernode0.53mmygrosordepelículade1.5µm.Comogasacarreadorseutilizó

Heconunflujode7mLmin‐1.Latemperaturadelhornoseajustóparaquefuerade140a

1.PreparacióndeunasoluciónmadredePAHscon8.00mgFenantrenomL‐1

acetonay3.47mgAntracenomL‐1acetona

Secontamiron5gdesuelo(baseseca)preincubadocon3mLdesoluciónmadre

corresponientesa24y10.4mgdeFenantrenoyAntraceno,respectivamente(queen20gdesueloseco,adicionan1200y520ppm,segúnelcaso)

Losfrascoscon5gdesuelocontamiandofueronsometidosaevaporaciónenunacámradevacío,hastaquesedejódepercibireloloraacetona

Cadamuestrasereinoculócon15g(baseseca)desueloparacompletaruntotalde20g

Lasmuestrasfueronsometidasala

incubaciónaerobiadurante0,3,7,14,28y

56días.

28

170°Carazónde2°Cmin‐1,manteniendolos170°Cpor5minyaumentadahasta280°Ca

30°Cmin‐1ymantenidaasípor10min.Latemperaturadelinyectorseajustóa280°Cyla

deldetectora300°C(Fernández‐Luqueñoetal.,2008)

5.5.TécnicasdeBiologíaMolecular

5.5.1.ExtraccióndeDNAmetagenómicodelsuelo

La extracción de DNA se realizó utilizando el PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO,

laboratories, Inc.), que en general se basa en: 1) lisis mecánica, 2) lisis química, 2)

eliminacióndeproteínas,RNAyácidoshúmicos,4) capturadelDNAaunamembranade

sílica, y 5) lavados con etanol. El producto final se diluyó en 60 µL de agua bidestilada y

esterilizada, y se almacenó en congelación a ‐20°C hasta su utilización en pasos

subsecuentes.

5.5.2.AmplificaciónporPCRdelgen16SrDNA.

EL DNA extraído fue utilizado como molde para la amplificación del gen 16S rDNA. El

contenidodelamezcladereacción(V=25μL)semuestraenlaTabla5.2.Elpardeprimers

queseemplearonsonel46F(5'‐GCCTAACACATGCAAGTC‐3′)(YuandMorrison2004)y

el 1540R (5'‐AAG GAG GTG ATC CAG CCGCA‐3') (Edwards et al., 1989). Los ciclos de

amplificación se llevaron a cabo en un equipo Touchgene Gradient FTGRAD2D (TECHNE

DUXFORT,Cambridge,UK),deacuerdoalprotocoloquesemuestraenlaFig.5.3.

5.5.3.AmplificaciónporPCRanidadaconpinzaricaenGCdeunfragmentode500

p.b.delaregiónvariableV3delgen16rDNA.

Apartirdelproductoamplificadode1500p.b.delgen16SrDNAserealizóunaPCRanidada

utilizandolosprimers46F(5'‐GCCTAACACATGCAAGTC‐3′)(YuyMorrison2004)y534R

(5'‐ATT ACC GCG GCT GCT GG ‐3') (Muyzer et al., 1993)., al primero de los cuales se le

agregalasiguientesecuenciaenelextremo5'paraobtener:46FGC:CGCCCGCCGCGCGCG

GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG.Elcontenidodelamezcladereacciónsemuestra

en la Tabla 5.3. El protocolo de ampliación se modificó con respecto del anterior en la

temperaturadealineación,lacualseelevóde57°Ca59°Cparaaumentarlaespecificidadde

29

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

T(°C)

t(min)

lareacciónyde35a30ciclosdeamplificación;todaslasdemáscondicionespermanecieron

sincambios.

Tabla5.2.ReactivosyconcentracionesutilizadasparalaamplificaciónporPCRdelgen16SrDNA

Reactivo(concentración

inicial)

Vol(µL)

Concentraciónfinal

Reactivo Vol(µL)

Concentraciónfinal

PCR Buffer(10x)

2.5 1 BSA 7.5 30%

MgCl225mM 2.0 4.0 H2O 8.625 34.5%PrimerFyR 1.25 0.5cadauno DMSO 1.5 6%Taq. Polimerasa(5u/μL)

0.125 0.625 DNA 1 ≈0.2μg

dNTP´s (dATP,dGTP, dCTP ydTTP)

0.4 200μM(cadauno)

Fig.5.3.ProtocolodeamplificacióndePCR1500p.b.delgenrDNA16S

x 35 ciclos

93°C

57°C

72°C 72°C

4°C

93°C

10 min 1 min

1 min

2 min 10 min

∞

30

5.5.4.Electroforesisengelcongradientedesnaturalizante

Paraobtenerelpatróndebandeode losproductosde laregiónvariableV3(0.5Kpb) de

cada tratamiento, días 0 y 56, se realizó la técnica de electroforesis en gel con gradiente

desnaturalizante (DGGE) de acuerdo a reportes publicados porMuyzer (1993). Se colocó

aproximadamentelamismacantidaddeproductodePCRenungeldepoliacrilamidaal8%

m/v(37.5:1,acrilamida:bisacrilamida)enTAE0.5X ,conungradientedesnaturalizantede

45–60%(100%dedesnaturalizantescontienenurea7My formamida40%v/ven0.5X

TAE).Laelectroforesisderealizóaunatemperaturade60°C,inicialmentea170V(10min.)

y luego a 50 V (20 h.). Posteriormente a la electroforesis, los geles se tiñeron en una

solución de bromuro de etidio en TAE 0.5x durante 10 min. y se fotografiaron en un

transiluminadorUV.

31

Fig.5.4.DiseñoExperimentaldelproyectodeinvestigación

ExtraccióndeDNAtotaldelsuelo(MOBIO,laboratories,inc.)

Ampli�icaciónporPCRdelgencodi�icadordelasubunidad16SrRNA(1.5kpb)

Ampli�icaciónanidadadeunfragmentode0.5kpbconpinzaricaenGCdelgen16SrRNA

Análisisdelpatróndebandeodelproductoampli�icadomediantelatécnicadeDGGE(Muyzer,1993)

32

6.RESULTADOS

6.1.CaracterizacióndelsuelodelEx­lagodeTexcoco

DetallesdelacaracterizaciónrealizadaalsuelosemuestranenlaTabla6.1.

Tabla6.1.CaracterizacióndelsuelodelEx­lagodeTexcocoParámetros/unidades Valor

pHH2O 9.7

CapacidaddeRetencióndeAguaCRA(gkg­1)a 569

Contenidodeagua(gkg­1)a 12

Carbonoorgánico(gkg­1)a 58.2

Carbonoinorgánico(gkg­1)a 12.97

NitrógenoKjeldahltotal(gkg­1)a 0.6

N­NH4+(mgkg­1)a 13.7

N­NO3­(mgkg­1)a 3.5

N­NO2­(mgkg­1)a 1.3

Conductividadeléctrica(dSm­1) 7.6

Contenidodearcilla(gkg­1)a 24

Contenidodelimo(gkg­1)a 103

Contenidodearena(gkg­1)a 873

Textura Arenofrancoso

aEstosvaloresestánexpresadosenbasesecadesueloCadavalorrepresentalamediade3repeticionesde3Sitiosdistintos(n=9)

33

6.2.Cinéticadedegradacióndefenantrenoyantraceno

El grado de eficiencia de extracción de PAHs por el método empleado fue de 98.9%,

considerandoqueseadicionaron1200mgfenantrenokg‐1suelosecoyquelaextracciónde

estecompuestoeneldía0(dondenohaexistidodegradaciónalguna)delaincubaciónfue

de1076mgfenantrenokg‐1sueloseco.Enelcasodeantracenolaeficiencia fuede97.3%

paraantraceno,considerandoqueseadicionaron520mgantracenokg‐1suelosecoyqueal

día0seextrajeron506mgantracenokg‐1sueloseco.

La cinética de degradación de PAHs muestra un claro descenso en la concentración de

fenantreno(FEN)a lo largodeltiempo;sinembargo,estadegradaciónnofuesignificativa

entodalaincubación,talycomolodemuestralacomparacióndemediasdeTukey(P<0.05)

(Tabla 6.2). Comopuedeobservarse en la Fig. 6.1a, lamayordegradación se lleva a cabo

entrelosdías3y7delaincubaciónalcanzandounaremocióndel29.5%;existiendoademás

unadiferenciasignificativaentreestosvalores.Entrelosdías7y14seobservadenuevoun

descenso en la concentración de FEN; sin embargo, la comparación de medias realizada

indica que no existe diferencia significativa entre estos valores. En días posteriores de la

incubaciónnosedetectóningúndescensoadicionalenlaconcentracióndeFEN.Alfinalde

laincubaciónselogródegradarun45%delcontaminante.

En cuanto a la degradación de antraceno (ANT), el comportamiento a lo largo de la

incubaciónfuesimilaralodescritoparaFEN.Laúnicadiferenciaesqueentrelosdías3y7

ladegradaciónnofuesignificativa(Tabla6.2);sinembargoentrelosdías7y14siocurrió

undescensosignificativodelaconcentracióndeANT.Al finaldela incubaciónsedegradó

un31%delcontaminante.

34

Fig.6.1.CinéticadedegradacióndeFenantrenoyAntracenoenelsuelodelEx­lagodeTexcocoenunaincubaciónaerobiadurante56días

ConcentracióndePAHs(mgkg­1sueloseco)

35

Tabla6.2.ComparacióndemediasdeTukeyparafenantrenoyantracenoalolargodelaincubación

MDSeslaMínimaDiferenciaSignificativaentremedias(P<0.05)LosvalorescondiferenteletramayúsculaindicanqueexisteunadiferenciasignificativaentreellosTodoslosvaloresrepresentanlamediadenueverepeticiones(n=9)

6.3.AnálisisrespirométricodeCO2

LaproducciónacumulativadeCO2 (Fig. 6.2) semantuvo sindiferencias apreciables entre

lostratamientoshastaeldía14delaincubación.Sinembargo,eneldía28,eltratamiento

Acetona presentóunadiferenciamuyevidente con respectoa losotrosdos tratamientos

(PAHs yControl),quehastaesedíapermanecíansindiferenciasapreciables.Finalmente,

eneldía56de la incubación, los tres tratamientosevidencianproduccionesacumulativas

deCO2biendiferenciadas,siendoelordenascendentedeestas:Control<PAHs<Acetona.

EltratamientoAcetonafue9.2y2.2vecesmayorqueControlyPAHs,respectivamente.

Complementandolainformaciónanterior,sedeterminólaproduccióndiariadeCO2enmg

C‐CO2kg‐1suelosecod‐1.Estosvalores,resultadodelcálculodelapendienteentrecadadía

demuestreo, semuestran en la Tabla 6.3. En dicha tabla es posible apreciar que para el

tratamientoControllaproduccióndiariamásaltasemanifestóeneldía3delaincubación,

yquedespuésdeestepunto,dichaproduccióndecrecegradualmentehastavalores<1mg

C‐CO2kg‐1s.s.d‐1.Porotrolado,enelcasodeltratamientoAcetona,laproduccióndiariade

CO2disminuyóconsiderablementeeneldía7conrespectoaldía3(i.e.18veces).Después

deestepunto, lageneraciónaumentónotablementehastaalcanzarsuvalormásaltoenel

día28(152.9mgC‐CO2kg‐1s.s.d‐1),parafinalmentedescenderhastavaloressimilaresalos

presentados por el tratamientoPAHs en el mismo día. Por último, el tratamientoPAHs

presentóuncomportamientomuysimilaraAcetonahastaeldía7;despuésdeestepunto,

Fenantreno AntracenoDía Media Media

0 1076 A 506 A3 1088 A 542 A7 767 B 474 A14 610 B 368 B28 589 B 359 B56 624 B 351 B

MDS 257.38 105.71

36

laproduccióndiariasemantuvoenvaloresmuchomenores(3y5.2veces,paradía14y28,

respectivamente) son respecto a Acetona. En el día 56, la producción en PAHs fue

prácticamentelamismaaltratamientomencionado,rondandoéstosenvaloresde32±1mg

C‐CO2kg‐1s.s.d‐1.

Fig.6.2.ProducciónacumulativadeCO2enelsuelodelEx‐lagodeTexcocodelostratamientos:Control,PAHsyAcetonaenunaincubaciónaerobiade56días.

37

Tabla6.3.ProducciónacumulativaydiariadeCO2paratodoslostratamientosdelaincubación

ProducciónacumulativadeCO2

(mgC­CO2kg­1s.s)

ProduccióndiariadeCO2(mgC­CO2kg­1ss.sd­1)

Día PAHs Acetona Control PAHs Acetona Control0 0.00 0.00 0.00 ‐ ‐ ‐3 99.82 97.38 44.00 33.27 32.46 14.677 107.04 112.63 77.52 1.81 3.81 8.3814 192.50 372.20 167.59 12.21 37.08 12.8728 606.38 2512.80 351.27 29.56 152.90 13.1256 1535.46 3383.86 368.87 33.18 31.11 0.63

Losvaloresrepresentanlamediade9(PAHs)o3(AcetonaySuelo)repeticiones.Cadavalordeproduccióndiariarepresentalapendienteentreunpardedíasdemuestreo(0,3,7,14,28y56)

6.4.DinámicasdeNitrógenoinorgánico

6.4.1.DinámicadeNH4+

LaconcentracióndelNH4+extraíbleensuelo (Fig.6.3a)para los tres tratamientos (PAHs,

Acetona yControl) disminuyó apreciablemente en los días 3 y 7, hasta concentraciones

próximasa23,14y3mgNkg‐1 sueloseco,respectivamente.ParaPAHs, laconcentración

se mantiene prácticamente constante hasta el día 28, para luego volver a disminuir

apreciablementeeneldía56hastaaproximadamente9mgNkg‐1sueloseco.ParaAcetona,

laconcentraciónsiguedisminuyendohastaaproximadamente2mgNkg‐1suelosecoenel

día28,yparaeldía56laconcentraciónseincrementaapreciablementehastaunos21mgN

kg‐1sueloseco.ParaControl, laconcentraciónsemantieneconstantehastaeldía28,pero

paraeldía56sepresentaunaumentosignificativodelaconcentraciónhastaunos9mgkg‐1

sueloseco.

6.4.2.DinámicadeNO2­

En todos los tratamientos (PAHs, Acetona y Control) las concentraciones de NO2‐ se

mantuvieronmenoresa1.29mgNkg‐1sueloseco.Lasconcentracionesdeestecompuesto

paraeldía56fueron1.23,0.69y0.43mgNkg‐1suelosecoparaPAHs,ControlyAcetona,

respectivamente(Fig.6.3b).

38

6.4.3.DinámicadeNO3­

Comoseobservaen laFig.6.3c, en todos los tratamientos (PAHs,Acetona yControl) se

presentóundescensonotableenlaconcentracióndeNO3‐hacíaeldía3,ubicándosetodos

ellosaproximadamenteen22mgNkg‐1sueloseco.Sinembargo,apartirdeestemomento

eltratamientoControlseempiezaacomportardeformadistintaalresto,yaqueseobserva

unaumentosostenidoenlaconcentracióndeNO3‐hastaalcanzarunaconcentraciónde56.7

mg N kg‐1 suelo seco en el día 56. Los otros dos tratamientos, presentan un descenso

apreciable en la concentración de NO3‐, siendo más notorio este decremento en el

tratamientoAcetona,llegandohasta10.8mgNkg‐1suelosecoeneldía56;mientrasqueel

tratamientoPAHstieneunaconcentraciónenestemismodíade20.2mgNkg‐1sueloseco.

39

Fig.6.3.DinámicadeNitrógenoinorgánicoenelsuelodelEx‐lagodeTexcocoparalos

tratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)enunaincubaciónaerobiade56días.

ConcentracióndeNitrógenoinorgánico(mgNkg­1 sueloseco)

40

6.5.ExtraccióndeDNAmetagenómicodelsuelo

En la Fig. 6.4. se observa la imagen de un gel con las extracciones respectivas de los

tratamientos PAHs (T1), Acetona (T2) y Control (T3) de los días 0 y 56. El tamaño

aproximadodelasmoléculasdeDNAmetagenómicoextraídasesunpocomenora19329

p.b.deacuerdoconelmarcadorLambda‐styI(λ).

Fig.6.4.ImagendeungeldeagarosaconlasextraccionesdeDNAmetagenómicodelsuelodelEx‐lagodeTexcocodelostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)paralos

días0y56delaincubación.SeutilizóelmarcadordetamañoLambda­styI(λ).

Además, se calculóque la cantidaddeDNAextraído fueenpromediode0.8200y1.0922

mg, para los días 0 y 56, respectivamente (Tabla 6.4). Una explicaciónmás detallada de

cómo se llevó a cabo la cuantificación de DNA se presenta en el Anexo al final de este

documento.

Tabla6.4.CuantificacióndeDNAmetagenómicodelsuelo

TratamientosMasatotaldeDNAextraída

(mg)

Mediapordía(mg)

T1D0 4.7574T2D0 5.9406T3D0 5.8038

5.5006±0.6472

T1D56 6.1596T2D56 6.9486T3D56 8.829

7.3124±1.3713

Mediatotal 6.4065±1.3800

19329 7743 6223 4254 3472 2690 1882 1498 925 421

p.b. λ T1 T2 T3 T1 T2 T3 λ

D0D56

41

6.6.AmplificaciónporReacciónenCadenadelaPolimerasa(PCR)

6.6.1.PCR1500p.b.delgen16SrDNA

Seamplificóunfragmentodeaproximadamente1500p.b,comoloindicalaposicióndela

bandaobtenidayelmarcadormolecularutilizado(Fig.6.5).Seobservaunasegundabanda

menos intensa de un fragmento inespecífico de unos pocos pares de bases menos a la

deseada.

Fig.6.5.ImagendeungeldeunaPCRdeunfragmentodeaproximadamente1500p.b.delgen16SrDNAdelostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)paralosdías0y56dela

incubaciónymarcadorde1500p.b.6.6.2.PCRanidadade500p.b.delaregiónvariableV3delgen16SrDNA

Se amplificóun fragmentode aproximadamente500p.b. como lo indica la posiciónde la

banda amplificada y el marcador molecular empleado (Fig. 6.6). No se observa ninguna

banda inespecíficapor loqueseconfirmaque lacondicionesde laPCRempleadasson las

adecuadas para el fragmento. Además, la reacción negativa no amplificó ninguna banda

descartándosecualquierposiblecontaminacióndelasmuestras.

T1 T2 T3

a) D0 b) D56

T1 T2 T3

1500 p.b.

1500 p.b.

42

Fig.6.6.ImagendeungeldePCRdeunfragmentodeaproximadamente500p.b.conpinzaricaenGCdelaregiónvariableV3delgen16SrDNAdelostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)paralosdías0y56delaincubación,reacciónnegativa(–)ymarcadorde

500p.b.6.7.PerfiladogenotípicodelacomunidadporDGGE

Se obtuvieron los perfiles genómicos (o patrones de bandeo) de cada uno de los

tratamientos propuestos (PAHs, Acetona y Control) para los días 0 y 56 (Fig. 6.6)

utilizandoungradientedesnaturalizantede45–60%deureayformamida.Éstosperfiles

se analizan más adelante para determinar los cambios en la diversidad y estructura

bacterianadelsueloalcomienzoyfinaldelaincubaciónaerobiapor56días.

T1 T2 T3 ( - )

T1 T2 T3

a)D0

b)D56

500p.b.

43

Fig.6.6.ImágenesdedosgelesdeDGGEdelexperimentodelsuelodelEx­lagodeTexcococonlosTratamientos:T1=PAHs,T2=AcetonayT3=Control,paralosdíasD0(a)yD56(b).

Ambosgelestienenungradientedesnaturalizantede45­60%Urea­Formamidaysecorrierondemaneraconjuntaalmismovoltaje(45V)por20h.enTAE0.5Xaunatemperatura

constante(60°C).

a) b)

D0 T1 T2 T3 D56 T1 T2 T3

PAHs Acetona Control PAHs Acetona Control

44

7.ANÁLISISYDISCUSIÓNDERESULTADOS

7.1.Caracterizacióndelsuelo

ComoseobservaenlaTabla6.1,dentrode lasprincipalescaracterísticasdetectadasenel

suelo, podemos observar que el pHH2O es de 9.7, y que se encuentra dentro del rango

característicode los suelosdeeste sitio:8.5a10.5 (Luna,2002).Deacuerdoa laNorma

OficialMexicanaNOM–022–SEMARNAT–2000,estesuelosecaracterizacomoFuertemente

alcalino.Porotrolado,laconductividadeléctrica(C.E.)enelextractodesaturaciónresultó

de7.6dSm‐1,locualreflejalaaltasalinidadcaracterísticadeesossuelos;sinembargo,este

valor es cercano a los límites inferiores de CE reportados para el suelo del Ex‐lago de

Texcoco:0.4a70Sm‐1(Luna,2002).Deacuerdoalamismanorma,estesueleseclasifica

comoSalino.LacantidaddenitrógenoKjeldhalresultóde0.6gNkg‐1s.s.,locualconforme

alamismanorma,clasificaalacantidaddenitrógenototaldelsuelocomoBajo.

7.2.CinéticadedegradacióndefenantrenoyantracenoyAnálisisrespirométricode

CO2

Se calculó el porcentaje de recuperación de estos hidrocarburos mediante la técnica

utilizada(Songetal.,1995)enelsuelodelEx‐lagodeTexcoco,elcualfuede97%paraFEN

y90%ANT.Song(2002)enunestudiocomparativodediferentesmétodosdeextracción,

determinóqueestemismométodoparaunsuelocon0.5%dearcilla,1.5%delimoy98.2%

dearena,unpHde7.4y0.1%demateriaorgánica,laeficienciaderecuperaciónparaestos

PAHserade74.1y94.6%,respectivamenteparaFENyANT.Por lotanto,seobservaque

estatécnicadeextraccióndePAHsessumamenteefectivaparaunsueloarenofrancosodel

Ex‐lagodeTexcoco.

EnloquerespectaalacinéticadedegradacióndeFEN,sedeterminóqueparaeldía56se

tieneunporcentajede remociónde48%, Podemosobservardeacuerdoa lasFig.6.2ay

6.2b que la mayor parte de la remoción de FEN se realizó en los primeros 14 días del

experimento, y que en días posteriores la concentración se mantuvo prácticamente

asintótica. En el caso de ANT se observa el mismo comportamiento, sin embargo la

degradacióndeestecontaminantefuemenor(i.e.32.5%).

45

Beck,etal.(1995),mencionanqueenocasionesalgunoscompuestosnosondegradadoso

liberados suficientemente rápido del suelo, y que su disponibilidad química y biológica

decrece rápidamente en períodos de minutos a horas, y luego lentamente en períodos

semanas a meses, debido a procesos de adsorción y difusión conocidos como ageing o

añejamiento, que dependen de las diferentes características de la materia orgánica del

suelo.EnelcasodelosPAHssemenciona,además,quedebidoacaracterísticasfísicascomo

labajasolubilidadenagua(1.03‐1.3mgL‐1paraFENy0.05‐0.07mgL‐1paraANT)ylaalta

tasa de distribución de sólido:agua (Ko:w 1 = 2.9x104 paraFEN y 2.8x104 paraANT), estos

contaminantessuelenacumularseenlafasesólidadelambienteterrestre(Zhang,2006).De

acuerdoaloanterior,ademásdelabajatasadedegradaciónencontradaparaambosPAHs,

lamenorremocióndeANTenelsuelosepudodeberalamenorsolubilidadenaguayasu

mayortasadedistribuciónsólido:agua.

En cuanto al análisis respirométrico de CO2, como se describió anteriormente, el

tratamientoAcetona, fue el que presentó unamayor generación de CO2 a lo largo de la

incubación.,seguidaporeltratamientoPAHs,yfinalmenteelControl.

Laadicióndecontaminantesimplicó,debidoalabajasolubilidaddelFENyANTenagua,la

incorporación de éstos a través de un solvente orgánico (i.e. acetona). Es sabido, que la

acetona puede causar efectos tóxicos y en ocasiones irreversibles sobre las poblaciones

bacterianas y la microfauna del suelo (Brinch et al., 2001). Por esta causa se utilizó un

protocolo en el que solo el 25%del suelo es contaminado, y luego es reinoculado con el

suelo restante (no contaminado).Además, como seplanteó en la seccióndeMetodología,

ese25%desuelocontaminadoessometidoavacíoparalograrevaporareldisolvente;sin

embargo, aún cuando la acetona tiene una presión de vapor muy alta (231.06 mmHg a

25°C),laacetonaescompletamentemiscibleenagua(WHO,1998)porloquenoesposible

volatilizarlatotalidaddelaacetona,yunapartequedadisponibledurantelaincubación

Conformea loanterior, lapresenciadeacetonaenelsueloen lostratamientosAcetonay

PAHs, en aproximadamente la misma proporción (ya que ambos fueron sometidos a

exactamentealmismoprocedimientodecontaminaciónyevaporación)causóunaumento

1Kow=coeficientedeparticiónoctanol:agua

46

importanteenlaproduccióndeCO2acumulativo(Fig.6.2).Esteaumentopudotenerunpar

deexplicacionesencuantoalefectocausadoporlaacetona:

1. Laacetonatieneunefectoletalparaalgunosmicroorganismosdelsuelo,porloque

losmicroorganismossobrevivientespuedenutilizarlabiomasademicroorganismos

muertos como fuente de C para su crecimiento (Brinch et al., 2002. Citado en

ÁlvarezBernaletal.,2006).

2. La acetona puede ser utilizada directamente como fuente de C por diversos

microorganismos,talescomoMethylobacterium,RhodococcusyArthrobacter(Moet

al.,1997.CitadoenFernández‐Luqueño,etal.,2008).

Enesteexperimentoambasexplicacionespodríantenercabidadadoque,comoseobserva

enlaTabla6.3, losvaloresdeproduccióndiariadeCO2(considerandounavalorinicialde

cero)indicanqueenelDía3laproduccióndiariadeCO2enPAHsyAcetona(siendoestas

muysimilares)esenpromedio2.4vecesmayorqueparaelControl.Adicionalmente,este

aumentoenlageneracióndeCO2nosevetraducidoenundescensodelasconcentraciones

de PAHs, tal y como se observa en la Fig. 6.1. Por otro lado, para PAHs y Acetona, se

observóunclarodescensoen laproduccióndiariaparaelDía7 (i.e.8.5vecesmenorcon

respectoalDía3).Laexplicaciónparaestedescensorepentinoentreeldía3y7,podríaser

que, la generación relativamente alta en el Día 3 enPAHs yAcetona se debió a que los

microorganismos que sobrevivieron al efecto tóxico de la acetona se aprovecharon de

aquellos que murieron. Este hecho ha sido reportado anteriormente y se conoce como

primingeffect,yenestecasoelaumentoenproduccióndeCO2podríadebersealreemplazo

delabiomasadelsuelopornuevabiomasaformadademicroorganismos.

Una vez superado este punto de la incubación, la producción diaria de CO2 vuelve a

aumentarhastaeldía28enAcetonayhastaeldía56enPAHs.Estasetapasdeaumentode

CO2 serían resultado de la utilización del C fácilmente biodegradable de acetona (WHO,

1998)ydeFENyANT,porpartedemicroorganismoscapacesdemetabolizarlos(Andreoni

etal.,2004),enlostratamientoscorrespondientes.

ApesardeobservarunaumentoconsiderabledeCO2enPAHs yAcetona con respectoa

Control, la producción de CO2 en PAHs se mantuvo siempre por debajo de Acetona

durante toda la incubación. En un experimento similar con un suelo agrícola (Acolman,

47

Estado de México) utilizando acetona como disolvente y fenantreno, antraceno y

bezno(a)pireno como contaminantes se observó que la adición de acetona por sí sola

incrementabalaproduccióndeCO21.9veces,perocuandoseagregabanloscontaminantes

la producción aumentaba 2.8 veces con respecto del suelo control (Álvarez–Bernal et al.,

2006).Hasta la fechano seha reportado si para el casodel suelodeEx‐lagodeTexcoco,

existe un efecto similar al de un suelo agrícola; sin embargo, en esta investigación se

encontróquelaadicióndeFENyANTprovocanunainhibiciónimportanteenlaproducción

deCO2porlosmicroorganismosedáficos,yestehechopuedetenerlassiguientescausas:

1. En un estudio enmicrocosmos en el que se propone un protocolo de análisis de

degradacióndePAHsylaformacióndemetabolitosensueloutilizandofenantreno

comoPAHmodeloeinoculandoconMycobacteriumsp.AP1enunsueloagrícola,se

detectólaformacióndetresmetabolitos,siendoelácidodifénicoelmásabundante

deéstos,elcualademásnopresentóunareducciónalolargodelaincubaciónaún

despuésdequeladegradacióndePAHshabíacesado(comoresultadodelalimitada

disponibilidaddelFEN).Enestemismoestudiosemencionaqueestemetabolitoes

potencialmentetóxicoyqueademássehadescritoquelaacumulacióndeproductos

oxidadospuedeinhibirlabiodegradacióndelPAHparental(AriasL.etal.,2008).

2. En un estudio de Andreoni, et al. (2004), en donde se estudian las actividades

enzimáticas y comunidades microbianas en suelos contaminados con PAHs,

encontraron que en un suelo con largo historial de contaminación con PAHs la

actividad enzimática fue sumamente baja debido a la presencia dichos

contaminantes, i.e.,Kiss,etal.(1998)(Andreonietal.,2004)mencionanquedesde

niveles moderados de contaminación con hidrocarburos se puede disminuir la

actividad en diversas enzimas del suelo, mostrando cada enzima una diferente

sensibilidadalapresenciadecontaminantes.

7.4.DinámicadeNitrógeno

ComosepuedeobservarenlaFig.6.3,laadicióndedisolventeenAcetonayacetona+FEN

+ANTenPAHsmodificólasconcentracionesextraíblesdeNO3‐yNH4+enelsuelodelEx–

lagodeTexcoco,aunqueestamodificaciónnofueigualparaambostratamientos.

48

LadinámicadeNO3‐(Fig.6.3c)seresultóafectada,talycomoseobservaenlagráfica,ylas

concentraciones de este compuesto se mantuvieron siempre en el siguiente orden de

magnitudControl>PAHs>Acetona;éstadisminucióndeconcentracionessepuededebera

lassiguientesrazones:

1. Sehaobservadoenexperimentosanterioresquelosmicroorganismosdelsuelodel

Ex–lago de Texcoco son capaces de inmovilizar grandes cantidades de nitrógeno

inorgánico,especialmentecuandohayunsustratofácilmentedegradable,yademás

estehechonoestárelacionadoconunaumentodirectoen laactividadmicrobiana

(Vega‐Jarquínetal.,2003).

2. Laadicióndehidrocarburos(diesel)yotroscompuestosorgánicos(comoglucosa)a

unsuelosinpreviahistoriadecontaminaciónindujounainmovilizacióndeN‐NH4+,

inhibiendo temporalmente lanitrificación, como resultadode la incorporacióndel

nitrógeno a compuestos microbiológicamente sintetizados (i.e. aminoácidos y

proteínas)(DeniyPenninckx,1999).

3. De a cuerdo conVanBeen y Paul (1979), se considera que la adición dematerial

orgánicoconunarazónC:N>30ocasionaráinmovilizacióndelnitrógenoinorgánico

(Fernández‐Luqueñoetal.,2008)

Por lo tanto, la adiciónde acetona,FEN yANT, todos compuestos altamente carbonados,

pudo provocar en un inicio la inmovilización biológica de NO3‐ y NH4+, los cuales

posteriormente habrían sido utilizados para sintetizar moléculas orgánicas (proteínas),

especialmenteelNH4+, yaque se sabeque su incorporacióna labiomasa requieremenor

cantidaddeenergíaqueladeNO3‐(LindellandPost,2001;citadoenVega‐Jarquín,2003).

Adicionalmente,seobservaunefectodiferencialenlostratamientosPAHsyAcetona.Enel

tratamientoPAHs, la adición simultánea de FEN,ANT y acetona provocaron unamenor

incorporacióndeN‐NH4+conrespectoaAcetona(quesoloconteníaacetona);estedescenso

se ve acompañado, como se explica anteriormente, de una menor producción de CO2,

resultado del descenso de actividad microbiológica debido a la presencia de los

contaminantes. Demanera correspondiente, se observa que para el caso deN‐NO3‐, a lo

largodelaincubación,siempreseencontraronmayoresconcentracionesdelcompuestoen

PAHsqueenAcetona.

49

Conformealoanteriorsepudodeterminarqueexistióunainhibicióntemporaldelproceso

denitrificaciónenelsuelodelEx‐lagodeTexcoco,comoresultadodelainmovilizacióndeN

inorgánico.EstainhibicióncausadaporlainmovilizacióndelN,aunadoalaescasezdedicho

nutriente en el suelo del Ex–lago de Texcoco, como la han descrito otros investigadores

(Vega‐Jarquínetal., 2003), hace evidentequeparamejorar la tasadebiodegradacióndel

FENyANT,seríanecesarioadicionarunafuentericaennitrógeno(asícomodefósforode

serpreciso).EnZhang,etal.(2006)semencionaquelarazónC:N:Póptimaparalaactividad

microbiológicaesde100:5:1.

7.5.Perfiladogenotípicodelacomunidadpor16SrDNA–DGGE

Las imágenes obtenidas de los geles deDGGE (Fig. 6.6) fueron analizadas, conforme a lo

descrito en el Anexo de este informe, para determinar los cambios estructurales de la

comunidadmedianteel índicedediversidaddeShannon,asícomocon laconstrucciónde

un dendograma para cada uno de los días (0 y 56) estableciendo la similitud entre los

patronesdebandeodecadaunodelostratamientos.

Antesdecontinuarconesteanálisisesimportanteresaltarqueexistendiversosaspectosde

la técnica empleada que pueden modificar o influenciar los resultados obtenidos. Los

errores (o alteraciones) que se pueden obtener vandesde la extraccióndelDNAhasta la

separación de los ribotipos (i.e. bandas) mediante el DGGE; los principales aspectos a

considerarson:

• ExtraccióndeDNA.Durante estepaso la lisis preferencial o insuficientede ciertas

células puede llevarse a cabo, quedando parcial o totalmente excluidas del

monitoreo de la biodiversidad total. La pureza del material genético extraído

también es crucial para los pasos subsecuentes de amplificación por PCR

(Wintzingerodeetal.,1997).

• Amplificación por PCR. Esta reacción está sujeta a una conjunto de errores que,

aunqueengeneralmenoresyocurridosdemanerahomogénea,puedenllevarauna

mala interpretación de los resultados. Las principales causas de error en esta

técnica son: a) Inhibición de la PCR por sustancias coextraídas como los ácidos

húmicos (Wintzingerode et al., 1997); b) Formación de artefactos de secuencia

(quimeras,heteroduplexoerroresdeamplificacióndelaTaqpolimerasa)(Acinaset

al, 2005); c) Distribución no uniforme de productos por amplificación desigual

50

(conocidoeningléscomoPCRbias)(Acinasetal,2005);d)existenciademásdeuna

regióndelgenrDNA(operónrrn) (Wintzingerodeetal.,1997).Adicionalmente, la

existencia de un pinza de GC en uno de los primers de la PCR anidada puede

provocar la aparición de bandas adicionales que interfieren con el análisis de las

bandasdeinterés(Wintzingerodeetal.,1997).

• DGGE.Apesardequeestá técnicaessumamenteeficienteypermite laseparación

de secuencias con una eficiencia cercana al 100%, algunas limitantes importantes

que se han descrito son: a) la comparación entre geles distintos es complicada

debido a las variaciones entre éstos (Nocker et al., 2007); b) la técnica no es

completamente cuantitativa (Sanz y Kochling, 2007); c) las especies menos

abundantes no podrán ser resueltas por la técnica debido a una sensibilidad

limitada(Nockeretal.,2007);d)losfragmentosobtenidos(200‐600p.b.)sonmuy

pequeñosparaunbuenanálisisfilogenético(SanzyKochling,2007).

Una vez entendidas las limitaciones intrínsecas en la técnica, que como semencionó van

desdelaposibleexclusióndeDNAdealgunosmicroorganismos,elpotencialfavorecimiento

de algunas secuencias en el paso de PCR, así como la posible obtención de artefactos y

finalmente, lacomplejacomparaciónentrediferentesgelesdeDGGE,sepuederealizarun

análisis de los patrones de bandeo obtenidos, aprovechando sus ventajas y teniendo en

cuentalassalvedadesantesreferidas.

7.5.1.Variacióndeladiversidad

En laFig. 7.1 se apreciaunagráficaquedescribe la evoluciónque sufriódiversidadde la

comunidad microbiana del inicio al final de la incubación para los tratamientos PAHs,

AcetonayControl.Seobservaqueeneldía0 laadicióndeFENyANTenel tratamiento

PAHs incrementóapreciablementeladiversidaddelacomunidad(H´=2.9)conrespectoa

los otrosdos tratamientos (H´=2.3 y2.4, paraAcetona yControl, respectivamente). Por

otrolado,eneldía56eltratamientoAcetonapresentóelmenoríndicedediversidad(H´=

1.8),mientras que los otros dos tratamientos presentaron valores semejantes (H´=1.9 y

2.2,paraPAHsyControl,respectivamente.

En un estudio deAndreoni et al. (2004) se describe que un suelo Alemán, con una largo

historialdeexposiciónaPAHsyalcanos(i.e.desde la IIGuerraMundial),yademásnunca

51

remediado, fue mucho menos diverso, de acuerdo con el índice de Shannon (mismo al

utilizado en este estudio), en comparación con otros dos suelos: uno Italiano agrícola no

contaminado,yelotro,unsueloBelgaconexposiciónmediaaPAHs(menosde3años),que

ademáspresentólamayordiversidaddemicroorganismos.

Además de los efectos sobre la diversidad que tienen los PAHs hay que considerar las

consecuencias debidas a la adición de acetona como medio de incorporación de los

hidrocarburos a un 25% del total del suelo. Brinch et al. (2001), los cuales proponen el

protocolode contaminaciónque se siguió eneste estudio (verMetodología), encontraron

que la acetona (al igual que el diclorometano) tenía un fuerte efecto tóxico sobre las

poblaciones de bacterias y protozoos, las cuales se vieron sumamente disminuidas; sin

embargo, también observaron que algunas de estas poblaciones eran capaces de

recuperarsehastanivelesinclusivemayoresalosdelsuelocontrolalpocotiempo.

Considerandolosresultadosobtenidos,podemosafirmarqueeneldía0,aunaspocashoras

delacontaminación(≈2h),laadicióndeFENyANTenPAHsprovocaronunaumentodela

diversidad microbiana del suelo, favoreciendo el aumento de aquellas poblaciones de

bacteriasmásafinesaloscompuestos.

Porotraparte,seobservóqueenlostrestratamientoladiversidaddecaeeneldía56;sin

embargo, los tratamientosPAHsyAcetona fueron losmásafectadosyaqueredujeronsu

diversidadenun35y21%,respectivamente,mientrasqueelControlsóloperdióun8%de

la diversidad de microorganismos (Fig. 7.2). Por lo tanto, se puede apreciar que las

condicionesdelaincubaciónreducen,porsímismas,ladiversidaddelsuelodiscretamente

(8%),debidoa factores como lahumedad,oxígeno, temperatura, ausenciade luz, faltade

nutrientes,entreotros;mientrasqueladisminuciónrestanteestaríadirectamenteasociada

alostratamientosaplicadosenPAHsyAcetona.

52

Fig.7.1.Variacióndelladiversidadbacteriana,medidaporelíndicedeShannon(H´)durantelaincubaciónaerobiapor56díasenlostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3).

Fig.7.2.PorcentajededisminucióndelíndicedediversidaddeShannon(H´)enlostratamientosPAHs(T1),Acetona(T2)yControl(T3)deldía0al56delaincubación.

53

7.5.2.Análisisdeagrupamiento

AdemásdelíndicedeShannon,otraformadeanalizarlosperfilesgenotípicosesmediante

unanálisisdeagrupamiento,elcualmedianteundendogramafenéticopermiteconocerla

similitudentrelospatronesdebandeodecadaunodelostratamientosensusrespectivos

días (Fromin et al., 2002). Dichos dendogramas fueron construidos como se indica en el

Anexo al final del informe y se presentan en la Fig. 7.3. El algoritmo de agrupamiento

utilizadofueeldeUPGMA(UnweightedPairGroupArithmeticAverages)yuncoeficientede

distancias fue utilizado para conocer la diferencia entre los perfiles. Como es posible

observarenlaFig.7.3,aldía0los3tratamientos(PAHs,AcetonayControl)parecenestar

pocoasociadosentreellos,yaqueAcetonayControlsecorrelacionaronconuncoeficiente

de0.03–muybajo–,mientrasquePAHs apareceaúnmenos correlacionadocon losotros

dos (‐0.16). Por el contrario, al día 56, los tratamientosPAHs yAcetona presentaron un

coeficientedecorrelaciónde0.69–alto–,mientrasqueelControlsecorrelacionóa‐0.18de

losotrosdos.

Mediante este análisis de agrupamiento es posible observar que en el día 0 los tres

tratamientos son muy distintitos entre ellos, especialmente el tratamiento PAHs. Lo

anteriordemuestraqueenprimerlugar,laacetonatieneunimpactomuyimportantesobre

lacomunidaddemicroorganismosedáficos(Fig.7.1);sinembargo,nosedescartaunefecto

del tratamientoPAHs, lo cual concuerda con el aumento de la diversidad encontrado en

dichotratamientoparaeldía0,comosemencionóanteriormente.Porotraparte,eneldía

56seobservaquelostratamientosAcetonayPAHsseencuentranmuchomásfuertemente

asociadosqueel tratamientoControl, locual indicaqueenestepuntode la incubaciónel

impactomássignificativovienedadoporlaadicióndeacetonaynoporlaadicióndeFENy

ANT.Enotraspalabras,eneldía56,elefectoqueejercieronloshidrocarburosFENyANTal

iniciode la incubaciónhadisminuidonotoriamente,yahora laestructuramicrobianasólo

es modificada por la acetona, siendo además una modificación severa, y probablemente

irreversible(paraalgunaspoblaciones)

La obtención de perfiles genotípicos en tiempos intermedios de la incubación

(especialmente en los días 7 y 14, ya que en este período se lleva a cabo la mayor

degradación de contaminantes) podría revelar información importante en cuanto al

54

desarrollodepoblacionesdebacteriascapacesdedegradarPAHs,yaqueseesperaríaqueel

númerodebandas(i.e. riqueza)y ladiversidaddelsueloaumentaranenestosdías,yque

ademásestasbandaspodrían ser suficientemente intensas comoparapermitir su cortey

extraccióndelgeldepoliacrilamidaparaunasubsecuentereamplificaciónysecuenciación,

loqueposibilitaríasuulterioridentificaciónaunniveldegéneroprobablemente.

Lasugerenciaquesehaceenelpárrafoanterioresimportanteyaque,comosemencionará

más adelante en la Sección 9, se esperaría que en los días 7 y 14 las poblaciones

degradadoras se manifestaran más intensamente en el DGGE, ya que a diferencia de lo

observadoenesta investigacióneneldía0,apesardehaberaumentado ladiversidadde

especies, ninguna banda originada por la adición de PAHs fue lo suficientemente intensa

comoparapoderhabersidocortadayposteriormentesecuenciada.Noobstante,existeuna

hipótesis estipulada por Johnsen (Johnsen et al., 2005) la cual indica que muy

probablemente las poblaciones degradadoras de PAHs se encuentran en una fase seudo

estacionaria de crecimiento, y las células nuevas solo reemplazan a las células que van

decayendo;estodebidoprincipalmentealabajabiodisponibilidaddelcontaminante.Detal

forma, que si esto se cumpliera, sería complicado apreciar un notorio incremento en la

intensidaddelasbandasenelDGGE,porloqueposiblementeéstanoseríalatécnicamás

aplicableparatalfin.

55

Fig.7.3.DendogramadeagrupamientoentrelostratamientosT1(PAHs),T2(Acetona)yT3(Control)enlosdías0(a)y56(b).Eneldía0(a)T2yT3seagrupanconuncoeficientedecorrelaciónde0.03,mientrasqueT1lohaceseagrupaestosa­0.16.Eneldía56,T1yT2se

agrupanconuncoeficientede0.69,mientasqueT3lohacea­0.18.

Coeficientedecorrelación

T1

T2

T3

Coeficientedecorrelación

T1

T2

T3

a)

b)

56

8.CONCLUSIONES

Los microorganismos presentes en el suelo salino–alcalino del Ex–lago de Texcoco son

capacesdedegradarPAHs(i.e.fenantrenoyantraceno)aeróbicamenteyencondicionesde

laboratorio; sin embargo, la baja biodisponibilidad de estos compuestos, así como la

inhibición que ejercen sobre el metabolismo microbiano se presentan como limitantes

importantesparasucompletadegradación.

Lanitrificaciónenelsueloesinhibidatemporalmentecomoconsecuenciadelaadiciónde

PAHsyacetona.Loanterior,aunadoalaescasacantidaddenitrógenopresenteenelsuelo,

sugieren que de ser necesario un programa de biorremediación en estos suelos sería

importante considerar laadicióndeuna fuente ricaennitrógeno, loque incrementaría la

tasadedegradacióndeloscontaminantes.

LacontaminaciónconPAHsincrementóladiversidadenlacomunidadmicrobianadelsuelo

del Ex–lago de Texcoco a corto plazo (≈2h), confirmándose la presencia de

microorganismosafinesaestoscontaminantes;encontraste,laestructuradelacomunidad

microbiana al final de la incubación es afectada severamente por la adición de acetona,

dejandodeapreciarseunefectodirectodeloshidrocarburos.

La utilización de microorganismos provenientes del suelo del Ex–lago de Texcoco se

presenta como una alternativa potencialmente aplicable a la biorremediación de

ecosistemas salino–alcalinos contaminados conPAHs; no obstante todavía se requiere un

mayor conocimiento sobre la capacidad real de biodegradación de las comunidades

microbianas(bacterias,hongosyarqueas)deestesuelo,asícomosobresu factibilidadde

estimulación, aislamiento y adaptación para poder ser empleados en la recuperación de

sitiosimpactados.

57

9.PROPUESTADECONTINUACIÓNYRECOMENDACIONESPARATRABAJOS

FUTUROS

Conlaintencióndeseguiraportandoconocimientosparalaoptimizacióndelastecnologías

de biorremediación de contaminantes como los PAHs, así como al entendimiento de las

consecuenciasecológicasquemuchasactividadesantropogénicastienensobreelambiente,

yenconcordanciaconlosresultadosqueseobtuvieronenesteproyectodeinvestigación,

sepresentaacontinuaciónlaestrategiaexperimentalqueseseguiráenuncortoplazo,así

comoalgunaspropuestasyrecomendacionesparatrabajosfuturos.

Propuestaexperimentaldecontinuación

LatécnicadeDGGEempleadapermitelaobtencióndeperfilesgenotípicosdelacomunidad

los cuales describen la diversidad y estructura de lamisma, y además permiten estudiar

cambiosalolargodeltiempo.Otrasdelasventajasquepresentaestatécnicaesqueunavez

obtenido el patrón de bandeo, se puede proceder al corte y extracción de ciertas bandas

discretas, para su posterior elución, y reamplificación, lo cual permite secuenciar éstos

fragmentospara finalmente identificar losmicroorganismosyconstruirunárbol fenético.

Conformealoanteriorseplantealasiguienteestrategiaexperimentalparalacontinuación

delactualexperimento.

1. LosgelesdeDGGE se tiñen conbromurode etidio y sonobservadosmedianteun

transiluminadorUV.

2. Lasbandasqueporsuintensidadyresoluciónseandistinguiblessecortanyextraen

delgel.

3. Lasbandassoncolocadasentuboseppendorfde1.5mLadicionando30μLdeagua

bidestiladayesterilizadayserefrigerana4°Cdurante24h,yposteriormenteson

congeladosa‐20°Chastasuposteriorutilización.

4. SerealizaunaPCRconlosmismosprimersutilizadosenlaPCRanidadade500p.b.

(ver Metodología), pero sin la pinza rica en GC en el primer correspondiente. Se

deberánestandarizarlascondicionesparaestaPCR.

5. Losampliconesresultantessonconcentradosypurificados.

6. Lasmuestrassonsecuenciadas

58

7. Lassecuenciasobtenidassoncomparadascon lasbasesdedatosdisponiblesen la

redyanalizadaspormediodeunconjuntodeprogramasdebioinformáticaparala

construccióndelosárbolesfenéticos.

NOTA:Lospasos1a3yahansidorealizados

Propuestasparatrabajosfuturos

Como fue posible observar en esta investigación, la diversidad de microorganismos

aumentóconsiderablementeeneltratamientoconFENyANT(i.e.PAHS)encomparación

con losotrosdos tratamientos (i.e.CONTROL yACETONA) en el día0; sin embargo esta

diversidaddisminuíaparaeldía56,observándoseunefectomayoritariamentedebidoala

acetonaenestedía.

Aunqueenesteproyectosoloseplanteólaobtencióndeperfilesgenotípicosenlosdías0y

56, paraobservar los efectos inmediatos y a largoplazode losPAHs sobre la comunidad

microbiana, la obtención de perfiles intermedios podría revelar datos interesantes y

complementarios a los encontrados en este experimento. Específicamente, como se

mencionóenladiscusión,serecomiendalaobtencióndelosperfilesenlosdías7y14dela

incubación,yaqueenestosdíasse llevaacabolamayorpartedeladegradacióndePAHs,

por lo que se esperaría ver un incremento en las poblaciones de bacterias capaces de

degradarestoscontaminantes.Además,seríamuyprobablelaaparicióndebandasdeuna

intensidad mayor, las cuales podrían ser cortadas, extraídas y reamplificadas para

secuenciarse y así determinar que microorganismos son los responsables de la

relativamentealtadegradaciónobservadaendichoperiodo.

Unavezidentificadoslosmicroorganismos,seríafactibleconocersisoncultivablesono,de

formaquesepodríapensarenelaislamientoycultivodeestosmicroorganismosparasu

usopotencialcomocepasdegradadorasdePAHsensuelosalcalinosysalinosoambientes

similarescomolodescribenMargesinR.ySchinner(2001).

Otra forma factible de analizar la comunidadmicrobiana esmediante la construcción de

librerías a través de la clonación en células de Escherichia coli, lo cual permitiría la

obtención de fragmentos demayor tamaño del gen 16S rDNA (≈ 1500 p.b.) y un análisis

59

mucho más avanzado y detallado de la comunidad microbiana (ver Metodología en

Valenzuela‐Encinas, 2008).Asímismo, sería interesante realizar la identificacióndeotros

microorganismos,i.e.arqueas(Valenzuela‐Encinas,2008)yhongos,loscualesrespondena

los genes 16S y 18S rDNA, respectivamente, y para los cuales, al igual que en el caso de

bacterias, existen primers universales que permiten un análisis filogenético de sus

poblacionesyaseamediante lautilizaciónde técnicasdeperfiladogenómico(e.g.DGGEo

TGGE),porclonación,ounacombinacióndeéstas.

60

10.REFERENCIAS

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62

40. Rondon,M.R.,PaulR.A.,Bettermann,A.D.,Brady,S.F.,Grossman,T.H.,LilesM.R.,Loiacono,K.A.,Lynch,B.A.,Macneil,I.A.,Minor,C.,TiongC.L.,Gilman,M.,Osburne,M.S.,Clardy,J.,Handelsman,J.y Goodman, R. M. (2000). Cloning the Soil Metagenome: a Strategy for Accessing the Genetic andFunctional Diversity of Uncultured Microorganisms. Applied and Environmental Microbiology. 66(6):2541–2547.41. Sanz,J.L.yKochling,T.(2007).Molecularbiologytechniquesusedinwastewatertreatment:Anoverview.ProcessBiochemistry.42(2):119‐133.42. Scullion,J.(2006).Remediatingpollutedsoils.Naturwissenschaften.93:51‐65.43. Song, Y.F., Ou, Z.Q., Sun, T.H., Yediler, A., Lorinci, G., Kettrup, A., 1995. Analitycal method forpolycylic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil and plants samples. Chinese Journal of AppliedEcology.6,92‐96.44. Thomas, G.W., 1996. Soil pH and Soil Acidity En: Sparks, D. L. (Ed) Methods of Soil Analysis:ChemicalMethodsPart3,enSoilScienceSocietyofAmericaInc.,AmericanSocietyofAgronomyInc.,Madison,Wisconsin,USA,pp.475‐490.45. Valenzuela‐Encinas, C., Neria‐González, I., Alcántara‐Hernández, J., Enríquez‐Aragón, J. A.,Estrada‐Alvarado, I., Hernández‐Rodríquez C., Dendooven, L. y Marsch, R. (2008). Phylogeneticanalysis of the archeal community in an alakile‐saline soil of the former lake Texcoco (Mexico).Extremophiles.12:247‐254.46. Vega‐Jarquin C, Garcia‐MendozaM, Jablonowski N, Luna‐GuidoM, Dendooven L (2003) Rapidimmobilizationofappliednitrogeninsaline–alkalinesoils.PlantSoil256:379–38847. Watson, Baker, Bell, Gann, Levine y Losick. (2004). Molecular Biology of the Gene. 5a ed.InternationalEdition.PearsonInternationalEdition.48. WHO,1998.WorlHealthOrganization,(1998).EnvironmentalHealthCriteria207.Génova,Suiza.49. Wintzingerode,F.v.,Gobel,U.F.yStackebrandb,E.(1997).Determinationofmicrobialdiversityinenvironmentalsamples:pitfallsofPCR‐basedrRNAanalysis.FederationofEuropeanMicrobiologicalSocietiesMicrobiologyReviews21:213‐229.50. YuZ,MorrisonM(2004)Comparisonsofdifferenthypervariableregionsofrrsgenesforuseinfingerprinting of microbial communities by PCR‐denaturing gradient gel electrophoresis. AppliedEnvironmentalMicrobiology,70:4800‐4806.51. Zhang, X., Cheng, S., Zhu, C. y Sun, S. (2006). Microbial PAH‐Degradation in Soil: DegradationPathwaysandContributingFactors.Pedosphere.16(5):555‐565.10.1.PáginasWEB

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63

11.ANEXO

CuantificacióndeDNAFig.11.1.Curvadecalibracióndelmarcadorλ­styIparalacuantificacióndeDNAgenómico

Tabla11.1.Valoresdelacurvadecalibracióndelmarcadorλ­styIparalacuantificacióndeDNA

A(p.b.) B(mg) C(Densidad)19329 0.00039852 123.2107743 0.000159643 91.106223 0.000128304 72.0204254 8.77077E‐05 48.3203472 7.15847E‐05 55.5802690 5.54616E‐05 39.4701882 3.88025E‐05 28.4101489 3.06998E‐05 21.720925 1.90714E‐05 10.980421 8.68005E‐06 .74 1.52571E‐06 .

A=Tamañodelfragmento(p.b.)B=MasadeDNA(mg)

0

0.00002

0.00004

0.00006

0.00008

0.0001

0.00012

0.00014

0.00016

0.00018

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

MasadeDNA(mg)

densidaddepixeles

Curvadecalibracióndeλ­styIparalacuantiuicacióndeDNA

64

C=DensidaddepixelesdeterminadamedianteGelEvalTabla11.2.CuantificacióndelasextraccionesdeDNAparalosdías0y56

Tratamientos

D(Densidad) B(mg) F(μg)Mediapordía

T1D0 84.290 0.00015858 4.7574T2D0 104.010 0.00019802 5.9406T3D0 101.730 0.00019346 5.8038

5.5006±0.6472

T1D56 107.660 0.00020532 6.1596T2D56 120.810 0.00023162 6.9486T3D56 152.150 0.0002943 8.829

7.3124±1.3713

Mediatotal

6.4065±1.3800

D=DensidadobtenidamedianteGelEvalB=MasadeDNA(mg)quesecargóenelpozodelgeldeagarosaparalacuantificaciónF=MasatotaldeDNAen60μLdeextracción(μg)

MemoriadeCálculo

DeacuerdoalaTabla10.1elprocedimientodecálculoeselsiguiente:

MasadeDNA=(Tamañodelfragmento)*(ConcentracióndeDNAenelmarcador)/

((NúmerototaldeparesdebasesenLambda)*(Volumendemarcadorcargado))

Mediante esta ecuación se construyó la curva de calibración de la Fig. 10.1, en la cual,

posteriormente, se interpolaron losvaloresdedensidaddepixelesobtenidosmedianteel

programaGelEvalparacadaunadelasmuestras,correspondientesalostrestratamientos

decadadía(0y56).EstosvaloressemuestranenlaTabla10.2.,yfueronobtenidosconla

ecuacióndelarecta:

Masa(mg)=2E^6(Densidadpixeles)–1E^­5mg

Finalmente,paraconocerlamasatotaldeDNAextraído:

F(μg)=(B(mg)*1000μg/mg*60μLdeaguadedilución)/2μLdeextraccióncargados

65

ConstruccióndefenogramasApartir de los geles deDGGE (Fig. 6.6.) se determinaron con ayuda del softwareGelDoc

(Biorad) las intensidades relativas de las bandas presentes en cada carril de los geles;

despuésdichasbandas fueron sometidas a examenvisual, de formaque sedescartarono

incluyeronbandasqueelprogramadetectabaono,segúnelcaso.Luegoseestableciócuáles

delasbandasdetectadaseranidénticasentrecadacarrildeunmismogelbajoelsupuesto

deque dos omásbandas son exactamente lasmismas, si presentan elmismopatrónde

corrimientoatravésdelgel(fundamentobásicodelatécnicadeDGGE).Finalmente,conel

procedimiento descrito se realizó una matriz de presencia (1) y ausencia (0) de bandas

(Tablas10.3ay10.3b).

Mediantelamatrizqueseconstruyóseprocedióalaconstruccióndeldendogramafenético

utilizando la paquetería de NTSYSpc 2.0 (Numerical Taxonomy And Multivariate Analysis

System) siguiendo los pasos necesarios para crear un análisis de agrupamiento (cluster

analysis),loscualesbásicamenteson:1)Estandarizacióndelamatrizmedianteelprograma

stand, 2) Cómputo de unamatriz de distancias con simint, 3) Análisis de agrupamiento

simpledelamatrizdedistanciasconshan,4)Construccióndeldendogramacontreey,5)

Determinación de los valores cofenéticos con coph. Mediante este procedimiento se

construyeronlosdosfenogramas(Fig.7.3ayb)

DeterminacióndelíndicedeShannondediversidadBasándonosenlamatrizdepresenciayausenciadebandas(TablaA.3)sedeterminaronlas

intensidades relativas de cada una de las bandas discretas identificadas. Para ello se

recurrióalsoftwareGelDoc(Biorad)quepermitedeterminar la intensidaddecadabanda

medianteelempleodecurvasdensitométricas,endonde las intensidadescorrespondena

lasalturasde lospicoseneldensitograma.Aéstadensidadse le sustrajo ladensidaddel

fondo(background),quecorresponderíaaladensidaddadaporelbromurodeetidioporsí

solo. De esta forma se calculó la intensidad de cada banda que corresponde a una

aproximacióndelaproporcióndecadaespecie(banda)dentrodelapoblacióntotal.

EnlaTablasA.4ayA.4bsemuestranlosdatosdelasintensidadesdecadaunadelasbandas

individuales (con el fondo ya sustraído). A través de estos valores se calculó el índice de

66

Shannon(H´)usandoelprogramaDiversdelaUniversidaddeCataluña.Esteíndiceemplea

lasiguienteecuación:

Donde:s=númerodeespeciesenlamuestraPi=Proporcióndeespeciesienlamuestra,ysecalculócomo:

Donde:ni=intensidaddelabandaienelcarrilN=sumadeintensidaddetodaslasbandas(s)enuncarril

Mediantelosíndicesdelostrestratamientos(PAHs,AcetonayControl)paralosdías0y

56segraficaronlosvaloresdelaFig.7.1

€

H '= − Pi logPii=1

s

∑

€

Pi =niN

67

Tabla11.3a.Matrizdepresenciayausenciadebandas–Día0

Tabla11.3b.Matrizdepresenciayausenciadebandas–Día56

0=Ausenciadeunabandadiscreta1=PresenciadeunabandadiscretaLasumatoriadebandasencadacarrilcorrespondealariquezadelostratamientoscorrespondientes.Tratamientos:T1(PAHs),T2(Acetona)yT3(Control)

Bandas T1 T2 T3A 1 0 0B 1 0 0C 1 0 0D 0 1 0E 1 0 0F 0 1 0G 1 0 1H 0 0 1I 0 0 1J 1 0 0K 0 0 1L 1 0 0M 0 1 0N 1 0 1O 0 0 1P 1 0 0Q 1 0 0R 1 0 0S 1 0 1T 1 1 1U 1 1 1V 0 1 1W 0 1 0X 1 0 0Y 0 0 0Z 1 1 1AA 1 1 0BB 1 1 1CC 1 1 0DD 0 0 1

TOTAL 19 11 13

Bandas T1 T2 T3A 0 1 1B 0 0 1C 1 1 0D 1 0 0E 0 0 1F 0 0 1G 0 0 1H 1 1 1I 1 1 1J 0 0 1K 1 1 1L 1 1 1M 1 1 1

TOTAL 7 7 11

Tabla11.4a.Matrizdeintensidaddebandasdiscretas­Día0

Tabla11.4b.Matrizdeintensidaddebandasdiscretas­Día56

Tratamientos

(densidaddepixeles)BANDAS PAHs ACEOTNA CONTROL

A 52 0 0B 47 0 0C 41 0 0D 0 37 0E 38 0 0F 0 30 0G 36 0 22H 0 0 23I 0 0 20J 42 0 0K 0 0 20L 41 0 0M 0 24 0N 38 0 22O 0 0 25P 85 0 0Q 50 0 0R 36 0 0S 30 0 12T 46 31 28U 30 20 22V 0 12 10W 0 48 0X 46 0 0Y 0 0 0Z 47 49 76AA 63 63 0BB 105 99 36CC 39 40 0DD 0 0 21Σ 912 453 337

Tratamientos

(densidaddepixeles)Bandas PAHs ACETONA CONTROL

A 0 39 36B 0 0 17C 66 43 0D 57 0 0E 0 0 22F 0 0 17G 0 0 35H 61 35 30I 58 32 22J 0 0 110K 70 80 47L 139 150 42M 44 72 27Σ 495 451 405

69