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EDICIÓN DE GENOMAS CON NUCLEASAS SITIO-DIRIGIDAS
Dr Yuri Jorge Peña Ramírez Ecosur Campeche
Ciclo de Seminarios nuevas técnicas de mejoramiento genético de plantas. Secretaría Ejecutiva CIBIOGEM
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CONTENIDO:
• Qué es la edición de genomas
• Herramientas para la edición de genomas • Nucleasas de dedos de zinc (ZFN)
• Nucleasas tipo activadores de transcripción (TALEN)
• Nucleasas de Secuencias Palindrómicas Repetidas Inversas (CRISPR-Cas)
• OGMs en desarrollo empleando esta tecnología
• Retos para su detección y monitoreo
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¿QUÉ ES LA EDICIÓN DE GENOMAS?
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CAZANDO PATOS
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CAZANDO PATOS
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CAZANDO UNA PLANTA GM
En los métodos tradicionales de generación de plantas GM (Agrobacterium y Biobalística), el sitio de inserción del transgén no puede ser controlado. La inserción puede ser incluso múltiple y ocurre en sitios al azar del genoma.
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EL PROBLEMA DE UN MÉTODO AL AZAR
• Consumo de tiempo seleccionando el evento deseado
• Efectos pleiotrópicos
• Silenciamiento
• Etc.
HIV-Tat WT
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MAYOR PRECISIÓN ES MEJOR
La edición de genomas emplea herramientas que incrementan sustancialmente la precisión y eliminan muchos de los problemas de las técnicas tradicionales
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¿QUÉ ES LA EDICIÓN DE GENOMAS?
La edición de genomas de refiere a un tipo de ingeniería genética en el que manipulan directamente secuencias en el genoma.
A diferencia de las técnicas previas, esta manipulación se dirige a sitios específicos.
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EN GENERAL:
Se realiza a partir del corte del ADN en ambas cadenas en secuencias específicas y únicas en un genoma…
..seguido de procesos de reparación por recombinación homóloga o no-homóloga
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HERRAMIENTAS PARA LA EDICIÓN DE GENOMAS
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TECNOLOGÍAS ACTUALES
• Nucleasas de dedos de zinc (ZFN)
• Nucleasas tipo activadores de transcripción (TALEN)
• Nucleasas de Secuencias Palindrómicas Repetidas Inversas (CRISPR-Cas)
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NUCLEASAS DE DEDOS DE ZINC
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ZFNS O ZN
Las nucleasas de dedos de Zinc se componen de dos partes:
1) Los dedos de Zinc
Son dominios de naturaleza proteica capaces de reconocer un trinucleótido de una secuencia específica
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ZFNS O ZN
Las nucleasas de dedos de Zinc se componen de dos partes:
1) Los dedos de Zinc
Pueden manipularse de manera modular para dirigir su unión a una secuencia en particular
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ZFNS O ZN
Las nucleasas de dedos de Zinc se componen de dos partes:
1) Los dedos de Zinc
2) La nucleasa FokI
Es una nucleasa de Flavobacterium okeanokoites que ha sido modificada para generar un corte secuencia-independiente
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ZFNS O ZN
Los dominios de dedos de Zinc, fusionados a la nucleasa FokI, trabajan juntos para unir secuencias específicas de 18 pb (probabilísticamente únicas en el genoma)
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ZFNS O ZN
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Transcription Activator Like Effector NucleaseS
TALENS
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TRANSCRIPTION ACTVATOR LIKE EFFECTORS
• Son sistemas originalmente caracterizados en Xantomonas en donde las proteínas TALE son secretadas cuando infectan una gran variedad de plantas activando en éstas genes que ayudan a la patogénesis.
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INGENIERÍA DE TALES
Se pueden generar secuencias personalizadas de TALEs para reconocer secuencias genómicas únicas
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INGENIERÍA DE TALES
A la secuencia de TALEs personalizada se puede fusionar la nucleasa FokI para generar el dímero funcional de corte
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TAL
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Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
CRISPR / CAS9
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CRISPR / CAS
Los CRISPR han sido encontrados en el 40% de las eubacterias y 90% de las arqueas secuenciadas.
Es un “sistema inmune” de las bacterias para defenderlas del ataque de bacteriófagos
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COMPONENTES DEL SISTEMA CRISPR / CAS9
El sistema CRISPR se compone de dos partes
1) Un componente protéico CAS9 con actividad de nucleasa
2) Un RNA guía que brinda especificidad al sistema
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ESPECIFICIDAD DEL SISTEMA CRISPR / CAS9
El sistema CRISPR se compone de dos partes
1) Un componente protéico CAS9 con actividad de nucleasa
2) Un RNA guía que brinda especificidad al sistema
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USO DE CRISPR / CAS9
Al igual que en los sistemas anteriores la edición con CRISPR puede emplearse para generar mutaciones puntuales, deleciones o inserciones cortas
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EN RESUMEN
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VENTAJAS DE LAS CRISPR / CAS
Facilidad de personalización. (Oligo de 20 nt).
Tipos de corte
Ediciones múltiples
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OGMS EN DESARROLLO
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ORGANISMOS EN DESARROLLO USANDO ZFN
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ORGANISMOS EN DESARROLLO USANDO ZFN
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OTROS OGMS EN DESARROLLO EMPLEANDO TALENS Y CRISPR/CAS
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RETOS PARA SU DETECCIÓN Y MONITOREO
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LOS EVENTOS DE EDICIÓN DE GENOMAS PUEDEN SER MUY SUTILES
• InDels pequeños (hasta de 1 base)
• Inserciones de genes estructurales (Cisgenes, transgenes o secuencias sintéticas)
• Uso de reguladores internos o solo la modificación de éstos
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POR SU ATENCIÓN, MUCHAS GRACIAS!!! Yuri Jorge Peña Ramírez Contacto: Correo electrónico: [email protected] Teléfono: 981 1273720 ext 2306 Web personal www.cultivo.com.mx Twitter: @Biotec_Forestal