COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA
GERENCIA DE ANÁLISIS Y DESARROLLO DE PRUEBAS INMUNOQUÍMICAS Y BIOLOGÍA MOLECULAR
PROTOCOLO DE CONFIRMACIÓN DEL MÉTODO: DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL EN HIGADO DE BOVINO POR EL ENSAYO INMUNOENZIMATICO
DE ELISA
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PROTOCOLO DE CONFIRMACIÓN DEL MÉTODO DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL PARA
HIGADO DE BOVINO POR EL ENSAYO INMUNOENZIMATICO DE ELISA PARA EL KIT DE NUEVO DESARROLLO RIDASCREEN FAST R-BIOPHARM R-1711
Elaboró
Revisó: Autorizó
I.A. Sara Vargas García
M. en C. Luz Sandra Sánchez del Angel
M. en MM. Dianelly Yazmin Colli Magaña
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ÍNDICE.
1. OBJETIVO 2. ALCANCE
3. METODO DE ENSAYO
4. EQUIPO 5. MATERIALES 6. REACTIVOS 7. MUESTRA
8. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Verificación del Sistema de ELISA Repetibilidad Reproducibilidad (precisión intermedia) Especificidad % de Recobro Ruido de fondo de matriz.
9. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
10. BIBLIOGRAFIA
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1. OBJETIVO 1.1 Objetivo general:
Realizar la confirmación del método de prueba para la determinación de clenbuterol en muestras de hígado bovina por medio del uso del kit de ELISA R-1711.
1.2 Objetivos específicos: Diseñar y desarrollar los ensayos para determinar: Repetibilidad, Precisión intermedia, Especificidad/selectividad, Recuperación, Verificación del sistema de ELISA.
2. ALCANCE:
Esta confirmación aplica al método para la determinación de clenbuterol en muestras de hígado con el kit de Clenbuterol Fast de R-Biopharm R-1711.
3. MÉTODO DE ENSAYO
Método CCAYAC-M-265/8 utilizando el kit de nuevo desarrollo Clenbuterol Fast Ridascreen R-1711 3.1 Diagrama del proceso analítico. Son 3 etapas de preparación de la muestra: Homogeneización, extracción y evaporación.
I) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.
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3.3 Diagrama analítico de flujo (prueba de ELISA):
(sin filtro)
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4. EQUIPO.
Equipo
Características ID
Calificación /Calibración, M.
Preventivo
Centrifuga
Marca:Thermo mod. Heraeus refrigerada. De 8 camisas con velocidad de 3500 a 4500 rpm. y control de temperatura
2929
Refrigerador
Equipo modular.Temperatura promedio 2°C a 8°C.
Congelador Equipo modular.Temperatura promedio -20°C.
Congelador Con temperatura promedio -20°C.
Balanza Granataria con sensibilidad de 0.01g
Procesador de alimentos u
homogeneizador Sistema de homogeneización Ultraturrax
Lector de ELISA
Marca:Biotek modelo: ELx800 con longitud de onda de 400 a 750 nm.
882
Equipo de Computo De escritorio con software Ridasoftwin, data reduction for inmunoassays R-Biopharm.
NA
Termómetro
De vidrio, con escala de 20 a 100°C de inmersión parcial. 822
Termómetro
De vidrio, con escala de menos -2 a 10°C 2170
Vortex De un plato con regulador de agitación. Marca VWR 2970
Micropipetas de volumen variable
De 2 a 20 µl 836
De 50 a 300 µl 831
De 100 a 1000 µl 841
De 500 a 5000 µl 2973
De 30 a 300 µl 2614
Micropipeta multicanal de 8 canales de volumen variable de 50 a 300 mcl.
Micropipeta multicanal de 8 canales de volumen variable de 30 a 300 μL
5. MATERIALES. Material de laboratorio de uso general.
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6. REACTIVOS.
6.1 Generales.
Nombre Formula Marca, Grado o pureza
Lote y Especificación
Agua tipo I H2O Agua Tipo I N/A
Buffer de lavado Incluido en Kit de
detección
R-Biopharm
N/A
Kit RIDASCREEN Clenbuterol ensayo inmunoenzimático
-----
R-Biopharm Cat: R1711
Clenbuterol Fast Con placa de 96 micropozos,
6 estándares (std 1 [0 ppt], std 2 [75 ppt], std 3 [150 ppt], std 4 [300 ppt], std 5 [900 ppt], std 6 [2700 ppt]), 1 sol conjugado, 1 sol. sustrato/Cromógeno, 1 sol. de paro 1 sol. buffer de lavado
Acetonitrilo CH3CN pureza grado ≥ 99%
6.2 PATRONES DE REFERENCIA.
Nombre Formula Marca, Grado o pureza
Catalogo
RIDA Clenbuterol Spiking Solution
C12H18Cl2N2O clenbuterol en buffer de lavado
R-Biopharm Cat: R1799
7. MUESTRA. Se recomienda partir de una matriz muy fresca ya sea que contenga o no clenbuterol, la cual se debe caracterizar realizando por lo menos 6 repeticiones independientes. Si la matriz es negativa a la presencia de clenbuterol, se puede utilizar como matriz de soporte para preparar los niveles del ensayo a través de la fortificación.
7.1 Muestra control negativa de hígado caracterizada. Se utilizarán muestras que son obtenidas en la rutina de trabajo, donde se ha obtenido un resultado de concentración menor a 100 ppt.
7.2 Muestra control positiva de hígado caracterizada. Se utilizarán muestras que son obtenidas
en la rutina de trabajo y que contienen una concentración aproximada entre 900 y 2700 ppt. De no contar con este tipo de muestras trabajar con el esquema de fortificación.
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8 DESARROLLO EXPERIMENTAL.
8.1 Determinar la verificación del sistema de ELISA (repetibilidad del sistema). 8.1.1 Realizar la curva de calibración del kit 3 veces por un analísta, en la misma corrida y con el mismo kit. 8.1.2 Leer en el lector de placas de ELISA la densidad óptica (DO) 8.1.3 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.1.4 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 1. 8.1.5 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación
de los resultados (X, DS y CV respectivamente).
Tabla 1 (archivo:xxxxx)
Laboratorio:
Unidades (ng/Kg= ppt)
Respuesta analítica (DO)
*ng/Kg Curva A Curva B Curva C X DS %CV
0
75
150
300
900
2700 *Puntos de la curva del kit R-1711.
Formato de gráficas
Laboratorio: Clenbuterol
Unidades: ng/kg (ppt)
ng/kg Curva A Curva B Curva C PROM S Cv
0.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
75.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
150.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
300.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
900.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
2700.00 #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
Respuesta analítica (DO)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0.00 1000.00 2000.00 3000.00
Res
pues
ta A
nalít
ica
Concentración
Linealidad del Sistema
Curva A
Curva B
Curva C
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0.00 500.00 1000.00 1500.00 2000.00 2500.00 3000.00
Res
pues
ta a
nalít
ica
Concentración
CURVA A
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0.00 500.00 1000.00 1500.00 2000.00 2500.00 3000.00
Res
pues
ta a
nalít
ica
Concentración
CURVA B
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0.00 500.00 1000.00 1500.00 2000.00 2500.00 3000.00
Res
pues
ta a
nalít
ica
Concentración
CURVA C
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8.1.6 Criterios de aceptación.
Herramienta estadística Nomenclatura Criterio
Coeficiente de variación %CV ≤20%
8.2 Repetibilidad del ensayo 8.2.1 Realizar al menos, 6 repeticiones independientes de una muestra positiva y 6 repeticiones de
una negativa de carne. 8.2.2 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA. 8.2.3 Leer en lector de placas de ELISA sin filtro. 8.2.4 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.2.5 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 2. 8.2.6 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación
de los resultados.
Tabla 2 (Archivo: )
Replicas Muestra
Concentración Muestra positiva
Analista 1
Concentración Muestra negativa
Analista 1
1
2
3
4
5
6
X
DS
%CV
8.2.7 Criterios de aceptación.
Herramienta estadística Nomenclatura Criterio
Coeficiente de variación CV ≤20%
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8.3 Reproducibilidad (precisión intermedia utilizando muestras nativas)
8.3.1 Realizar al menos 6 repeticiones independientes de la muestra positiva de hígado, por 2 analistas en 2 diferentes días.
8.3.2 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA. 8.3.3 Leer en lector de placas de ELISA. 8.3.4 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.3.5 Registrar las lecturas obtenida en la tabla 3. 8.3.6 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación
de los resultados.
Tabla 3 (Archivo: )
Replicas Muestra
Concentración Muestra positiva Analista 1
Concentración Muestra negativa Analista 2
Día 1 1
2
3
4
5
6
Día 2 1
2
3
4
5
6
Xr
DSr
%CVr
XR
DSR
%CVR
8.3.7 Criterios de aceptación.
Herramienta estadística Nomenclatura Criterio
Coeficiente de variación %CV ≤20%
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8.4 Reproducibilidad (precisión intermedia utilizando muestra fortificada en al menos 4 niveles).
8.4.1 Se puede elegir cualquier nivel, pero es recomendable aquellos que caigan en la parte lineal de la curva y considerar el límite de corte que actualmente es de 2000 ppt. Se recomienda probar también 500ppt y 300ppt.
8.4.2 Se realizarán 6 replicas de muestras independientes de la matriz para cada nivel. 8.4.3 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA. 8.4.4 Leer en lector de placas de ELISA. 8.4.5 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.4.6 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 4. 8.4.7 Se calculará, el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de
variación de los resultados.
Tabla 4 (Archivo: )
Replicas Muestra
Concentración de niveles N1 Analista 1
Concentración de niveles N2 Analista 1
Concentración de niveles N3 Analista 1
Concentración de niveles N4 Analista 1
1
2
3
4
5
6
X
DS
%CV
8.4.8 Criterios de aceptación.
Herramienta estadística Nomenclatura Criterio
Coeficiente de variación %CV ≤20%
8.5 Ruido de fondo de matriz.
Se puede omitir el ensayo sobre este parámetro y utilizar los datos generados en el numeral 8.1 de repetibilidad del ensayo. Si esto no es posible entonces proceder como se describe enseguida.
8.5.1 Realizar 3 replicas de una muestra negativa de hígado, donde la concentración sea menor de 500 ppt. (el nivel puede cambiar de acuerdo al límite de detección del kit).
8.5.2 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA.
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8.5.3 Leer en lector de placas de ELISA 8.5.4 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.5.5 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 5. 8.5.6 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación
de los resultados.
Tabla 5 (Archivo:xxxx )
Replicas Muestras
Concentración Muestra Analista
1
2
3
X
D. E
% CV
8.5.7 Criterios de aceptación.
8.6 % de Recobro
8.6.1 Trabajar con los niveles de fortificación N1, N2, N3 y N,4 que el laboratorio haya establecido en
el numeral 8.4 del presente documento. 8.6.2 Realizar los cálculos para adicionar una solución estándar de clenbuterol de concentración
conocida a una muestra de carne cuya concentración sea menor a 100 ppt (puede ser la muestra que se utilizó para analizar el ruido de fondo). Enseguida se muestra un ejemplo.
Ejemplo de cálculo de fortificación: Se desea fortificar una muestra de hígado a 0.4 ppb (ng/mL). El protocolo descrito en el Kit para la preparación de la muestra describe que se debe de partir de 3.0g de hígado. La solución fortificante que se preparó tiene una concentración de 10 ng/mL (ppb).
Aplicando la fórmula: Tenemos que: v= C. fortificación x m C. fortificante
Herramienta estadística Nomenclatura Criterio
Coeficiente de variación %CV ≤20%
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Donde: v= Volumen de la solución fortificante a utilizar (mL) C.fortificación= Concentración a la cual se desea fortificar la muestra (ppb) C. fortificante= Concentración de la solución fortificante (ppb)(ng/mL) m: Cantidad de muestra fortificar (gramos o mL) Aplicando la fórmula: (0.4ppb) (3.0 g.) v=_______________= 0.12mL = 120µL de sol. fortificadora de 10 ppb + 2.0 g carne 10 ppb
8.6.3 Realizar 6 réplicas independientes de cada una de las muestras fortificadas en cada nivel. 8.6.4 Utilizar el método RIDASCREEN Clenbuterol R1711, para ELISA. 8.6.5 Leer en lector de placas de ELISA 8.6.6 Procesar las lecturas en el software Ridasoftwin. 8.6.7 Registrar las lecturas obtenidas en la tabla 6 y 7. 8.6.8 Calcular el promedio de las concentraciones, la desviación estándar y el coeficiente de variación
de los resultados. 8.6.9 Realizar cálculos para obtener el % de recuperación, tomando en cuenta el promedio del ruido
de fondo.
Tabla 6 (Archivo:xxxx )
N1: Cantidad adicionada
N2: Cantidad adicionada
Promedio Muestra blanco (Carne)
Promedio Muestra blanco (Carne)
Replicas Muestra Lectura en ppt
% Recuperación Replicas Muestra Lectura en ppt
% Recuperación
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
X X
DS DS
%CV %CV
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Tabla 7 (Archivo:xxxx )
N3: Cantidad adicionada
N4: Cantidad adicionada
Promedio Muestra blanco (Carne)
Promedio Muestra blanco (Carne)
Replicas Muestra Lectura en ppt
% Recuperación Replicas Muestra Lectura en ppt
% Recuperación
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
X X
DS DS
%CV %CV
8.6.10 Criterios de aceptación.
Herramienta estadística Nomenclatura Criterio
Coeficiente de variación %CV ≤20%
% de recuperación %R 70-130%
8.7 Especificidad / Selectividad (solo en caso de contar con estándares de ractopamina y
salbutamol ó silpaterol) 8.7.1 Seleccionar al salbutamol y ractopamina como otros b-agonistas que pueden estar presentes en
las matrices estudiadas. 8.7.2 Seleccionar el nivel al cual se va a realizar el ensayo de especificidad. Se recomienda
considerar que la concentración seleccionada sea 10 veces mayor al LD. 8.7.3 Fortificar con estas dos soluciones y por separado, dos muestras de carne (muestra
caracterizada como negativa) y realizar al menos 10 repeticiones para cada uno de los b-agosnistas.
8.7.4 Realizar el análisis y determine la concentración. 8.7.5 Realizar otro ensayo con al menos 5 repeticiones independientes con otras dos matrices de
carne fortificadas por un lado con clenbuterol y ractopamina y por otro con clenbuterol y salbutamol mezcladas en una proporción 1:3 (1 parte de clenbuterol y 3 partes del otro beta agonista) para verificar posibles interferencias con el analito.
8.7.6 En caso de existir interferencia con algún(os) analito(s) afín(es), se deberá dejar constancia escrita de este hallazgo en el informe de validación.
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9. Tabla de criterios de aceptación.
9.1 Los criterios para la confirmación del método de prueba fueron obtenidos de varias guías de validación de fuentes oficiales o del mismo proveedor del kit y se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 8 (Archivo:xxxx )
Parámetro Criterio de aceptación Fuente bibliográfica Resultado de la
confirmación Conclusión
Verificación del sistema de ELISA
Coef. Correlación o linealidad R2 >90 y
CV≤20%
Revista Ambito Regulador. Centro para el control estatal de la
calidad de los medicamentos
CECMED. La Habana No. 00-53, 2007
Repetibilidad El coeficiente de variación
para un sistema inmunoquimico es ≤20%
Guidelines on bioanalytical method validation. European Medicines Agency
2011.
Precisión intermedia
El coeficiente de variación para un sistema
inmunoquimico debe ser ≤20%
Guidelines on bioanalytical method validation. European Medicines Agency
2011
% de Recobro 70-130% (aprox. 87% en
promedio)
Inserto del Kit RIDASCREEN
Clenbuterol Fast de la Cia. R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany
R- 1711
Especificidad / Selectividad
Ninguna detección para otros beta agonistas
diferentes a clenbuterol
Community Reference Laboratories Residues (CRLS) 20/1/2010.Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer).
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9.2 Los criterios de validez del método de prueba de ELISA proporcionado por el fabricante del Kit
RIDASCREEN Clenbuterol Fast de la Cia. R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany R- 1711, se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 9 (Archivo:xxxx )
Parámetro Criterio de aceptación Resultado de la confirmación Conclusión
Temperatura ambiente de realización del ensayo
20-25°C
Absorbancia del estándar 1 (St con cero de concentración)
>0.8
%CV entre repeticiones de las inoculaciones en el pozo de la ELISA
10%
Forma de la curva
Comparar con la forma de la curva del certificado de análisis del kit del mismo lote
Recuperación 70-130%
10. Bibliografía. 10.1 Inserto del Kit RIDASCREEN Clenbuterol Fast de la Cia. R-Biopharm AG, Darmstadt,
Germany. Inmunoensayo enzimático para el análisis cuantitativo de Clenbuterol y otros β-agonistas. Marzo 2017.
10.2 Métodos Analíticos adecuados a su propósito „Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y Temas Relacionados” 2da. Edición Desarrollado por: Eurachem Publicación técnica CNM-MRD-PT-030 CENAM.
10.3 Community Reference Laboratories Residues (CRLS) 20/1/2010.Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer).
10.4 Application note. R-biopharm. Compiliance criteria for manual testing of RIDASCREEN antibiotic/hormone tests (competitive). 2017-10.