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Carga Viral
Dr. Juan Carlos Romero
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CARGA VIRAL
� Consiste en la detección por medio de la amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos del ARN del VIH.
� Se logra su detección gracias al avance que ha experimentado la biología molecular.
� Su detección ha permitido demostrar la modificación que � Su detección ha permitido demostrar la modificación que realiza la TARV sobre la historia natural de la infección VIH.
� Depende del método empleado y la capacidad de detectar mínimas cantidades de ARN del virus.
� Se expresa en copias de ARNv /ml .
� Posee las principales características se un buen marcados de laboratorio: Sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo y reproducibilidad.
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PROPIEDADES DE LA CARGA VIRAL
� La CV plasmática es la resultante del equilibrio dinámico entre los distintos compartimientos virales.
� Son reproducibles.
� No existe equivalencia directa entre los diferentes � No existe equivalencia directa entre los diferentes métodos utilizados comercialmente.
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INDICACIONES CLINICAS Y USO DE CV
INDICACIÓN CLÍNICA INFORMACIÓN USO
SD. Compatible con infección aguda VIH
Establece el diagnóstico cuando la prueba de anticuerpos es negativa o indeterminada
Diagnóstico
Valoración inicial de una infección VIH recientemente diagnosticada
CV basal Apoya decisión en conjunto con CD4(+) de iniciar o no tratamiento
Control de pacientes VIH(+) sin TARV
Cambios de la carga viral ídem
Luego de 3-6 semanas del inicio o cambio de TARV
Valoración inicial de eficacia de TARV
Decisión de continuar o cambiar esquema
Control c/3-6 meses en pacientes con TARV
Duración del efecto antiretroviral
Decisión de continuar o cambiar TARV
Acontecimientos clínicos o disminución significativa de LTCD4(+)
Asociación con CV variable o inestable
ídem
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�Principio General:
– Lisis de la muestra
DIGNOSTICOMOLECULAR
– Extracción del Ácido Nucleíco
– Amplificación del Ácido Nucleíco
– Detección del Ácido Nucleíco
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METODOS
� Reacción en Cadena de la Polimerasa -PCR-
� ADN PROVIRALAmplificación basada en la transcripción � Amplificación basada en la transcripción NASBA
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PCRReaccion en CCadena de la PPolimerasa
� Aplicación del proceso de Replicación:� Utilizado para amplificar segmentos cortos de
ADN� Específica para identificar genes o segmentos � Específica para identificar genes o segmentos
de genes de cualquier microorganismo� Utiliza una ADN polimerasa resistente al calor� Primers específicos � Reacción controlada� Millones de copias de secuencia objetivo
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PCR Amplifica una secuencia espec ífica
Secuencia del Objetivo
Hebra Doble Hélice del DNA
Cromosoma
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Transcripción Reversa - Paso 1 – Primer se une a la secuencia objetivo de RNA
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Transcripción Reversa - Paso 2 - r Tth DNA Polimerasa Cataliza la extensión de los Primers incorporando Nucleótidos Complementarios
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Fin de la Transcripción Reversa - Paso 3 –Resulta una síntesis de un DNA Complementario (cDNA) a la Secuencia Objetivo de RNA
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Fin del 1er Ciclo de la PCR – Resulta una Copia de una Doble Cadena de DNA (Amplicon) de la Secuencia Objetivo
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PCR – Amplificación Exponencial: Cada Nuevo Ciclo duplica la cantidad del Objetivo, Resultando en un Incremento Exponencial en Amplicones
1 cycle = 1 (RNA/cDNA hybrid)
2 cycle = 2
3 cycle = 4
Single strand RNA
4 cycle = 8
5 cycle = 16
6 cycle = 32
7 cycle = 64
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ADN PROVIRAL� Al momento de nacer no se distingue entre los
anticuerpos maternos tranferidos por vía placentaria
de los generados por infección del niño.
� Determinación cualitativa de ADN proviral integrado
en células mononucleares de sangre periférica poren células mononucleares de sangre periférica por
PCR.
� Se recomienda a las 24-48 hrs de vida, si es positiva
indica infección intrauterina.
� Si es negativa debe repetirse a los 15 días y a las 6
semanas.
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ROCHE
1. AmplliPrep (extracción)
2. Cobas (Amplificacion-
Detección)
3. Cobas Taq-Man 48
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NASBASample + Lysis buffer
Nucleic acid
Release of nucleic acid
Stabilization of nucleic acid
Binding of nucleic acid
Proteins
Lipidsetc.
Washes
Elution buffer
Purified Nucleic acid
Purification of nucleic acid,
removal of inhibitors
Recover nucleic acid in
small volume
Binding of nucleic acid
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Fluorescencia Norm
alizada
Señal Fluorescente
(real-time)reacción NASBA
Determinación NASBA
0 10 20 30 40 50 60
Fluorescencia Norm
alizada
Tiempo (minutos)
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Norm
alized fluorescence
Fluorescent signal
(real-time)
Determinación en el tiempo
0 10 20 30 40 50 60
Time (minutes)
Norm
alized fluorescence
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&&
Dos plataformas – Un reactivo
Extracción Magnética
“BOOM®” Manual
Magnética
“BOOM®”
Automatizada
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Carga Viral de VIH -1
� La cuantificación de la Carga Viral de VIH de manera
precisa y confiable es esencial para el manejo clínico y
terapéutico del paciente infectado por el VIH
� Los resultados Precisos y Confiables dependen de:
� Integridad de la muestra de Sangre
�Reactivos adecuados y protocolo de procesamiento
� Instrumento con plataforma validada
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Recolección de la Muestra� Debe utilizarse plasma con EDTA.
� Las muestras para las pruebas de Carga Viral debenser tomadas en tubos estériles con anticoagulanteEDTA. (Restos de detergentes provenientes de tuboslavados, inhiben la reacción. (1.5 ml de Plasma)
� Mantenga las muestras de sangre total entre 2-25°C� Mantenga las muestras de sangre total entre 2-25°Cpor no más de 6 horas
� Separe el plasma de la sangre total dentro de lasprimeras 6 horas por medio de centrifugación de 800– 1600 rpm por 20 minutos
� Transfiera el plasma a un tubo estéril depolipropileno
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Integridad de la Muestra� Consideraciones Críticas
� Uso del Anticoagulante adecuado – K 3EDTA (spray dried) evita el efecto de dilución para un c onteo absoluto adecuado
� Volumen adecuado de colección para lograr la anticuoagulación adecuada
� Mezcle bien el tubo después de recolectar la muestr a para evitar la formación de coagulos
� El tubo debe ser rotulado con el nombre completo de l paciente, cédula, día y hora de toma de muestra
� No utilizar tubos con EDTA y Gel .
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Transporte de la Muestra
� La sangre total debe ser mantenida entre 2-25°C y e l plasma debe ser separado por centrifugación en meno s de 6 horas
� El plasma puede ser transportado a temperatura ambi ente � El plasma puede ser transportado a temperatura ambi ente (22°C) hasta por 24 horas
� El plasma puede ser transportado de 2-8°C hasta por 5 dias
� De -20 a -80°C por periodos de tiempo superiores a 5 dias
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� Diagnóstico� Pronóstico� Terapia� Contagio� Contagio� Blips
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GraciasGracias