Aislamiento Viral

Los virus son parásitos intracelulares obligados y por tanto requieren células vivas para su multiplicación hasta mediados del siglo pasado los animales y huevos embrionados eran los sistemas mas comúnmente utilizados para asilarlos.Desde 1950 se empezaron a utilizar cultivos celulares a partir de una variedad de tejidos humanos y de animales este método ha sido reemplazado.Aunque el aislamiento viral es el estándar de oro para la el diagnostico de la mayoría de las infecciones virales, en la practica rutinaria solo se utilizan en laboratorios de referencia por razones de costo, tiempo de respuesta, riesgo bilógico y sobre todo, por la necesidad de personal especialmente entrenado en estas estas técnicas.

De igual forma el aislamiento del virus tiene una sensibilidad y especificidad muy alta. Debido a que solo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad.Sin embargo, existen algunas desventajas en el aislamiento del virus:El proceso suele ser lento, ya que demanda días a semana la identificación , y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para la atención del paciente. Además es un proceso laborioso y caro.

El aislamiento viral se clasifica en cultivo in vivo y cultivo in vitro.

Dentro de los cultivos in vitro tenemos a los cultivos celulares y dentro del cultivo in vivo están los cultivos en animales de experimentación y los huevos embrionados.Aislamiento en animales de experimentación: los ratones lactantantes fueron muy usados para el aislamiento viral, pero su uso tiende a disminuir ante el desarrollo de los cultivos celulares; sin embargo, se siguen usando para algunos virus como para el grupo Coxsackie A que no crecen en otros medios. Otros virus solo crecen en ciertos especies de animales como simios o en mosquitos; estos procedimiento se utilizan con fines de investigativos.

Asilamiento en huevos embrionados: Los virus pueden inocularse en diferentes estructuras de huevo embrionado de pollo o de pato. La replicación viral puede evidenciarse por la muerte del embrión o mediante la detección.Este sistema tiene la ventaja de ser bacteriológicamente estéril, carecer de respuesta inmune y ser de fácil manipulación.Este presenta ventaja para las cepas de influenza A, que pueden aislarse mas fácilmente en este sistema que en los cultivos celulares.

Cultivos in vitro

Cultivos celulares Monocapa celular Líneas celulares diploidesLíneas celulares continuas Hemadsorcion Hemaglutinación viral

CULTIVOS CELULARESLos cultivos celulares son los biosusbtratos empleados para la propagación de los virus. Un cultivo celular es obtenido de explantes de órganos o de embriones de animales.

Es una técnica que permite el mantenimiento de las células In vitro manteniendo al máximos su propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

TIPOS DE SUSTRATOS

VIDRIO

Empleado como sustrato de cultivo es de escaso costo y tiene mucha facilidad de limpieza y esterilización.

TIPOS DE SUSTRATO PLASTICO

El plástico mas empleado es el poli estireno de buena calidad óptica debido a que este plástico es hidrofobico requiere un tratamiento mediante irradiación gamma, químico, o mediante descargas eléctricas que produzca una superficie hidrofilica.

CRECIMIENTOS

CRECIMIENTO EN MONOCAPA

Las células se adhieren al sustratos y en esa forma inician la proliferación.

CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN

Son células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato.

MONOCAPA CELULAREsta monocapa de células crece en un medio de cultivo complejo que contiene albúmina, vitaminas ,sales, glucosa ,etc. en un sistema buffer .Se previene la contaminación bacteriana adicionándole a los medios antibióticos adecuados .Los cultivos celulares en monocapa son los mas usados ,aunque hay otros sistemas (cultivo en suspensión ,explantes ,cultivo de órganos, cultivo en microcarriers ,etc.)

LOS CULTIVOS CELULARES SE DIVIDEN EN :

CULTIVO PRIMARIO: El cultivo iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo. Un cultivo primario debe ser considerado como tal hasta que se subcultive con éxito por primera vez. En ese momento se considera una línea celular.

VENTAJAS DEL CULTIVO PRIMARIO:

El estar más cercanas a las células que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, presentando las características siguientes:☼ Mayor sensibilidad que una línea celular ya establecida.☼ Baja probabilidad de que las células se transformen en malignas, por lo que esta técnica es indispensable en la elaboración de vacunas.

DESVENTAJAS DEL CULTIVO PRIMARIO

☼ Alta probabilidad de presentar virus adventicios o latentes.☼ Necesidad de implementar una tecnología de punta para controles de calidad.

LINEA CELULARES DIPLOIDES:

Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen.

Una línea celular se origina a partir de un cultivo primario en el momento del primer subcultivo exitoso. El término línea celular implica que los cultivos de la misma consisten en numerosos linajes de células presentes originalmente en el cultivo primario.

LÍNEAS CELULARES CONTINUA

Tiene alta capacidad para multiplicarse in vitro, permite un número finito de subcultivo por lo menos 70 veces de un cultivo primario y son heteropoide.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LÍNEAS CELULARES CONTINUAS

Ventajas 1.Disponibilidad para todos los

investigadores de stocks de células idénticas

2.Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los laboratorios

3.Libre de contaminación con agente extraños

LOS CULTIVOS CELULARES

Varían de acuerdo con su susceptibilidad a los diferentes virus con una relación especifica huésped-virus Ejemplos:1.Línea celular HDP2(células heteroploides

humanas derivadas del carcinomas laríngeo se recomiendan para VRS virus respiratorio sincicial y Adenovirus

2.La MRC5 es una línea diploide fibroblastica del pulmón embrionario se utiliza para aislamiento de citomegalovirus

3.La MDCK es una línea celular diploide de riñón canino se recomienda para el aislamiento del virus influenza:

Incubación 37°C Tiempo hasta 14 días Observación microscópico a 24,48 ,72 horas y luego dos veces por sem.

Efectos cito paticos es la visualización morfológicas producidas por la acción del virus VRSHPS-2Adenovirus No producen efecto cito patico se recurre a técnicas. Hemadsorcion Hemaglutinación Tinción en anticuerpo monoclonales

HEMOADSORCIÓNLa técnica de hemoadsorción se basa en la capacidad de los glóbulos rojos de determinada especie animal de unirse a proteínas virales que tienen capacidad hemoaglutinante. Si se dispensa glóbulos rojos a una monocapa de cultivo celular infectada con virus es posible observar microscópicamente la adherencia de los mismos a células que contienen virus. Por medio de esta técnica, es posible demostrar la infección por aquellos virus que presentan proteínas hemoaglutinantes.

CELULAS NO INFECTADAS

Muchos glóbulos rojos se agrupan alrededor de las células y pueden llegar a cubrirlas. El resto de los globulos rojos estan dispersos.

Los glóbulos rojos se encuentran dispersos en toda la monocapa celular forma aleatoria .

CELULAS INFECTADAS CON UN VIRUS HEMOAGLUITINANTE

HEMOAGLUTINACIÓN VIRAL

DEFINICIÓN.-Este fenómeno fue descrito por primera vez por Hirst en 1941, quien observo en un embrión de pollo la aglutinación de glóbulos rojos en un vaso sanguíneo roto, mientras realizaba pases de virus de influenza en el líquido alantoideo.Hirst reconoció la importancia de este hallazgo y describió la hemoaglutinación como un método para ensayo de virus. Hemoaglutinación es la propiedad que tienen ciertos virus para unir y aglutinar eritrocitos de mamíferos y aves, debido a las proteínas que poseen en su capa externa Esta hemoaglutinación inducida por virus puede usarse para facilitar la identificación de un virus desconocido.

La hemoaglutinación es uno de los métodos más comunes para cuantificar partículas virales en suspensión. Un virus hemaglutinante es capaz de aglutinar glóbulos rojos (GR) de determinada especie animal. Ej: Virus Influenza. Virus Dengue, Virus Parainfluenza, Virus de la Rubeola, etc. REACCIONES DE HEMAGLUTINACIÓNBase: unión Ag-Ac (enlaces no-covalentes).Etapas:- Interacción primaria (no visualizable)- Interacción secundaria (aparición de un fenómeno visible como la aglutinación o la precipitación).

MECANISMO DE LA HEMOAGLUTINACIÓN

La actividad enzimàtica de las proteínas virales (hemaglutininas) produce hemaglutinaciòn en la cual  los eritrocitos se unen por medio de puentes.Muchos virus contienen proteínas en su capa externa que los capacitan para aglutinar glóbulos rojos de varias especies. En influenza y algunos paramixovirus, la hemaglutinación de la superficie, que es una glucoproteína, se fija al glóbulo rojo que posee receptores complementarios. El virus produce elusión sobre el glóbulo rojo a 37° C debido a la destrucción del ácido neuramínico en sus receptores por la neurominidasa del virión, El virus eluido puede aglutinar un glóbulo rojo fresco, pero éste, una vez eluido ya no puede ser aglutinado por la misma especie de virus, debido a la pérdida de sus receptores.

Inhibición de la Hemaglutinación (IHA)

La IHA se fundamenta en el bloqueo de la proteínas virales hemoaglutinantes por los anticuerpos específicos. Cuando se enfrenta un virus conocido a un suero problema, éstos se unen impidiendo la hemoaglutinación viral. (provocando la IHA).

Esta técnica es utilizada para tipificar (identificar) virus con capacidad hemoaglutinante presentes en una muestra dada (virus influenza, parainfluenza, etc).