doctorado en ciencias y biotecnologÍa de plantas · elidé avilés berzunza, gracias porque sin tu...
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DOCTORADO EN CIENCIAS Y
BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS
Transformación genética del achiote (Bixa ore/lana L.)
con el gen reportero u idA vía Agrobacterium tumefaciens
Tesis que para obtener el grado de Doctor en Ciencias presenta:
Juan Manuel Zaldívar Cruz
Centro de Investigación Científica de Yucatán
Mérida, Yucatán, México. 2004
No creo haber conseguido ya la meta ni me considero peñecto, sino prosigo mi
carrera hasta alcanzar a Cristo Jesús, quien ya me dio alcance. No, hermanos,
yo no pretendo haberlo conseguido todavía. Digo solamente esto: olvidando lo
que dejé atrás, me lanzo hacia adelante y corro hacia la meta, con miras al
premio para el cual Dios nos llamó desde arriba en Cristo Jesús.
Fil 3, 12-14.
A mi madre Sra. Flora Ma. Cruz Vda. de Zaldívar, quien me dio la vida,
sembró mi destino, me hizo crecer y me inculcó, sin darse cuenta, a base de
sacrificios, la fuerza para levantarme después de caer y las ganas de luchar y
triunfar en la vida ...
Esta tesis está dedicada íntegramente a mi hermano lng. Félix Genaro
Zaldívar Cruz, por creer siempre en mí, apoyarme y darme fuerzas para llegar
hasta aquí.
A mis otros hermanos lng. Jorge A. Zaldívar Cruz, Lic. Andrés M. Zaldívar
Cruz y Enf. Lourdes Zaldívar Cruz. Gracias por existir y darme fuerzas.
A mi sobrino Christopher Pérez Zaldívar, porque también ha colaborado,
animado e impulsado a la culminación de esta aventura.
CAPÍTULO 2
Usos de los genes reporteros.
Ventajas del uso de los genes reporteros.
1.8. El gen reportero uidA.
Tipos de sustratos de la enzima p-glucuronidasa.
Ventajas y desventajas del uso del gen reportero uidA.
1.9. Transformación de plantas mediada por A. tumefaciens
empleando el gen reportero uidA.
Hipótesis.
Objetivos.
Métodos.
2.1. Material vegetal.
2.1.1 . Medios de Cultivo.
2.1.2. Obtención de las plántulas.
2.1 .3. Obtención de los callos.
2.1.3.1. Caracterización de los callos
2.1.3.1.1. Determinación de la relación óptima de citocinina/auxina
para la obtención de brotes
2.1.3.2. Determinación de la dosis letal de kanamicina (dosis
respuesta) para ambos tipos de callos
2.1 .3.3. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la
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transformación de callos. 46
2.2. Agrobacterium tumefaciens. 47
2.2.1. Cepa . 47
2.2.2. Plásmido. 47
2.2.3. Transformación de LBA4404 con el plásmido pCAMBIA 2301 . 48
2.3 . Transformación y regeneración del material vegetal. 48
2.3.1. Transformación de hipocotilos de B. ore/lana. 48
2.3.2. Regeneración de brotes transformados directos a partir de
hipocotilos de dos variedades de B. ore/lana (criolla y trilobulada) . 49
2.3.3. Transformación de callos provenientes de hipocotilos de B.
ore/lana. 49
2.3.3.1 . Transformación de los callos con la cepa LBA4404::pCAMBIA
2301 . 50
2.3.3.2. Inducción de la formación de brotes a partir de los callos
transformados. 50
2.3.3.3. Regeneración de brotes transformados a partir de callos de
las variedades criolla y trilobulada de B. ore/lana. 50
2.3.3.4. Inducción de brotes y/o callos a partir de hipocotilos
transformados de B. ore/lana L con el pCAMBIA2301 para obtener
transformación estable.
2.4. Verificación de la transformación del material vegetal.
2.4.1. Prueba Histoquímica de GUS.
2.4.2. Selección de los brotes transformados de B. ore/lana por
51
51
51
medio de la prueba histoquímica de GUS. 52
2.4.3. Verificación de los callos transformados por medio de la
prueba Histoquímica de GUS. 53
2.4.4. Verificación de los brotes transformados con la prueba
histoquímica de GUS. 53
2.5. Mantenimiento de los regenerantes transformados. 53
2.5.1. Mantenimiento de los brotes transformados. 53
2.5.2. Enraizamiento de los brotes transformados. 53
2.5.3. Adaptación de las plantas transformadas de B. ore/lana en
invernadero.
REFERENCIAS.
CAPÍTULO 3 Resultados.
3.1. Agrobacterium tumefaciens.
3.1.1 . Selección de la cepa de A. tumefaciens con base en el tipo de
54
56
59
59
opina para la transformación de B. ore/lana L. 59
3.2. Regeneración. 60
3.2.1 Sistema de regeneración de brotes de B. ore/lana L. 60
3.3. Transformación transitoria de explantes de hipocotilos de Bixa
ore/lana L con LBA4404::pCAMBIA 2301. 64
3.4. Inducción de brotes y/o callos a partir de hipocotilos
transformados de B. ore/lana L con el pCAMBIA2301 para obtener
transformación estable.
3.4.1 . Inducción y mantenimiento de callos a partir de hipocotilos
transformados de B. ore/lana L.
64
66
3.5. Determinación de la relación óptima de citocinina/auxina para la
obtención de brotes a partir de callos. 69
3.6. Determinación de la dosis letal de kanamicina (dosis-respuesta)
para callos de achiote de las variedades criolla y trilobulada. 74
3.7. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la
transformación de callos de la variedad criolla .
3.8. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la
transformación de callos de la variedad criolla obtenidos a partir de
76
brotes cultivados en medio PC con 1 mg.L"1 de BAP. 78
3.9. Mantenimiento de los callos transformados con la cepa LBA4404
y el plásmido pCAMBIA2301 . 82
3.10. Selección de brotes transformados de la variedad criolla de B.
ore/lana, por medio de la prueba histoquímica de GUS.
REFERENCIAS
CAPÍTULO 4 Agrobacterium-mediated transient transformation of annatto (Bixa
82
85
ore/lana L.) hypocotyls with the gus reporter gene. 91
CAPÍTULO 5 CONCLUSIONES GENERALES. 99
CAPÍTULO 6 PERSPECTIVAS. 101
RECONOCIMIENTOS
Este trabajo se realizó en la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas del
Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C. haciendo uso de sus equipos e
instalaciones, bajo la asesoría y dirección del Dr. Gregario del Carmen Godoy
Hernández.
El Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) financió este trabajo a
través del proyecto No. 28643-B y con apoyos del Programa Integral para
Fortalecimiento del Posgrado.
El autor recibió la beca-crédito No. 66872 otorgada por el CONACYT para los estudios
de Doctorado.
AGRADECIMIENTOS
Porque Dr. Gregorio del Carmen Godoy Hernández, esta idea fue suya y me la
cedió en el momento que más necesitaba recuperar mis sueños, gracias por andar
este sendero de la ciencia conmigo, por la paciencia y el interés mostrados en mi
formación académica, también por la amistad, el apoyo y las enseñanzas.
Siempre tendré un sentimiento perenne de gratitud para todos los que me ayudaron a
llegar hasta aquí, muchísimas gracias a los miembros del comité tutora! y revisores de
tesis: Dr. José Juan Zúñiga Aguilar, Dr. Tomás González Estrada, Dr. Felipe A.
Vázquez Flota, Dr. Nicolás Villegas Sepúlveda, Dra. Renata Rivera Madrid y Dr.
Ángel Arturo Guevara García, por sus valiosas sugerencias y la revisión crítica con
la que siempre enriquecieron el presente escrito.
A la QFB. Elidé Avilés Berzunza, gracias porque sin tu ayuda en la realización de los
experimentos, no estaría viviendo esta emoción irrepetible.
Al Biol. Horacio Salomón Ballina Gómez, por la ayuda prestada para la realización
de algunos de los experimentos, por la selección de la cepa y principalmente por tu
amistad, aunque vayamos en diferentes sintonías.
-¿la vida, cuándo fue de veras nuestra?,
¿cuándo somos de veras lo que somos?,
bien mirado no somos, nunca somos
a solas sino vértigo y vacío( ... )
nunca la vida es nuestra, es de los otros,
la vida no es de nadie, todos somos
la vida -pan de sol para los otros,
los otros todos que nosotros somos-,
soy otro cuando soy, los actos míos
son más míos si son también de todos,
para que pueda ser he de ser otro,
salir de mí, buscarme entre los otros,
los otros que no son si yo no existo,
los otros que me dan plena existencia,
no soy, no hay yo, siempre somos nosotros,
la vida es otra, siempre allá, más lejos,
fuera de ti, de mí, siempre horizontes ...
Piedra de Sol
Octavio Paz
Obra poética 1 (1935-1970)
También quiero dar las gracias de todo corazón, a los otros que me dan plena
existencia, mis amigos, aquellas personas que de alguna u otra forma conocieron ,
animaron y motivaron a la culminación de este proyecto, por su apoyo durante estos
años que hemos estado juntos. Siempre os llevaré conmigo.
Los amigos que no son del CICY, pero si del ex-EDiPaJ
Pbro. Ricardo Ruiz Sacramento, lleana Alanzo Novelo, Luis A. Cervera Basulto,
Pastor E. Góngora Cárdenas y Aída Ma. Peniche Lara, Ma. Cecilia Rodríguez Alcacer,
Georgina Fernández Esquive! , Víctor S. Díaz Moreno, Virginia Brito González,
Alejandro Valdez Zapata y Luis A. Alvarez Cuevas.
La ciencia no está divorciada de la construcción del Reino.
Gracias por andar este camino conmigo,
Otros amigos que no son del CICY, pero no menos importantes
Dr. Ramón Rodríguez Rivera, M.C. Miguel Góngora Izquierdo y Prof. Agustín Paz
Martínez.
Con sus consejos, ánimos y amistad pude llegar al final de esta meta ... Gracias.
Los amigos que conocí en el CICY:
Dr. José Juan Zúñiga Aguilar (por las asesorías y consejos para salir adelante), Q.B.B.
Abril Chumba Sarmiento y Q.F.B. Freddy D. Campos Tamayo (gracias por estar
conmigo, por la amistad y las palabras de aliento para terminar esta aventura
científica.); Biols. Esteban Pachaco Torres y Julio César Canto Martín (si se pudo ... );
Dr. Francisco R. Quiroz Figueroa (gracias por las fotografías y la amistad} y el gurú Dr.
José A. Narváez Zapata (gracias por aclarar dudas y los consejos); mis hermanos lA.
Fidel Sánchez Mena, IPA. José Ulises González de la Cruz y Ma. Concepción de la
Cruz Leyva (gracias por la ayuda); M.C. Leticia Abdala Berzunza (aún desde
lejos ... gracias); M.C. Luci la Sánchez Cach (gracias por las asesorías), MC. lván
Córdova Lara (gracias por los consejos de PCR) y MC. Emilio Pérez Pachaco.
Gracias a todos ustedes por existir y darme fuerzas, sobre todo a los últimos no
mencionados por aprender a reconocerlos
El autor agradece la ayuda desinteresada de la LAE. María Solís V. y del ISC.
Mauricio Alvarado Sosa.
Y a la persona a quien debo el estar en el grupo del Dr. Godoy-Hernández:
Dr. José Armando Escamilla Bencomo
Gracias por los consejos y sugerencias al inicio del doctorado.
ABREVIATURAS
ABA: ácido abscísico
ADN: ácido desoxirribonucleico
ADN-T: ácido desoxirribonucleico transferido
AgN03: Nitrato de plata
ANA: ácido naftalenacético
AS: acetosiringona
BAP: 6-bencilaminopurina
CAMV: virus del mosaico de la coliflor
CAT: gen de la cloramfenicol acetiltransferasa
chv: genes cromosomales de virulencia
0.0.: unidades de densidad óptica
dxs: gen de la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa
EDT A: ácido etilendiaminotetraacetico
gus: gen reportero que codifica para la ~-glucuronidasa
IBA: ácido indol-butírico
Mn504 : sulfato de manganeso
m.s.n.m.: metros sobre el nivel del mar
NaCI: cloruro de sodio
NLS: señal específica de localización nuclear
NPTII: gen de la neomicina fosofotransferasa 11
PC: medio de cultivo de Phillips y Collins
TDZ: N-fenii-N' -1 ,2,3-tidiazol-5-ilurea
Ti: plásmido Ti o inductor de tumores
vir: genes de virulencia
X-Giuc: 5-bromo-4-cloro-3-indolil ~-D-glucorónico
CAPÍTULO 1
CAPÍTULO 2
CAPÍTULO 3
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1. El árbol de achiote (Fotografía de Gregorio Godoy
Hernández).
Figura 2. Interacción Agrobacterium-célula vegetal (Gelvin, 2000;
Págs.
3
modificada por Julio C. Canto-Martin, 2003). 17
Figura 3. El plásmido pCAMBIA 2301 (Cortesía de H. Ballina, 2002). 47
Figura 4. Diagrama de flujo de los experimentos a realizar. 55
Figura 5. Sistema de regeneración de hipocotilos de B. ore/lana. 62
Figura 6. Proceso de regeneración de Bixa ore/lana L. 63
Figura 7. Tinción histoquímica de GUS de los explantes de hipocotilos
de B. ore/lana de la variedad criolla, transformados con las tres cepas
de A. tumefaciens. 65
Figura 8. Inducción de callos a partir de hipocotilos transformados de
B. ore/lana de la variedad criolla con LBA4404::pCAMBIA 2301 . 66
Figura 9. Inducción de brotes y callos a partir de hipocotilos
transformados de B. ore/lana de la variedad criolla con
LBA4404::pCAMBIA 2301 .
Figura 10. Tinción histoquímica de GUS de los hipocotilos y callos de
B. ore/lana de la variedad criolla , transformados con la cepa LBA4404
67
y el pCAMBIA2301 . 68
Figura 11 . Determinación de la relación óptima de citocinina/auxina
para la obtención de brotes a partir de callos de achiote de la variedad
criolla . 70
Figura 12. Determinación de la relación óptima de citocinina/auxina
para la obtención de brotes a partir de callos de achiote de la variedad
trilobulada. 73
Figura 13. Dosis-respuesta a 8 concentraciones de kanamicina,
utilizando callos de achiote (B. ore/lana L.) de la variedad criolla . 76
Figura 14. Dosis-respuesta a 8 concentraciones de kanamicina,
utilizando callos de achiote (B. ore/lana L.) de la variedad trilobulada. 76
Figura 15. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la
transformación de callos de achiote de la variedad criolla por medio de
la prueba histoquímica de GUS. 78
Figura 16. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la
transformación de callos de achiote de la variedad criolla provenientes
de brotes crecidos en medio PC con 1 mg.L'1 BAP, por medio de la
prueba histoquímica de GUS.
Figura 17. Tinción histoquímica de GUS de los brotes obtenidos de
callos jóvenes de B. ore/lana de la variedad criolla, transformados con
la cepa LBA4404 y el pCAMBIA2301.
CAPÍTULO 4 Figure 4.1. Histochemical GUS assays during the transformation of
two varieties of Bixa ore/lana L. : Peruana (A-D) and Criolla (E-H).
Hypocotyls were transformed with either p81.121 or pCAMBIA 2301
vfa Agrobacterium tumefaciens (strain LBA4404). A and E: negative
controls .
81
84
95
LISTADO DE CUADROS
CAPÍTULO 1 Cuadro 1. Consumo mundial estimado de semillas de achiote en
1992 (Toneladas métricas).
Cuadro 2. Los genes reporteros más utilizados.
CAPÍTULO 2 Cuadro 3. Concentraciones de citocinina/auxina (mg.L"1)
empleadas para la determinación de la relación óptima para la
Págs.
7
21
obtención de brotes. 45
Cuadro 4. Concentraciones de Kanamicina (mg.L"1) empleadas
para la determinación de la dosis letal (dosis-respuesta). 46
Cuadro 5. Antibióticos utilizados para la selección de la cepa
bacteriana. 48
Cuadro 6. Componentes de la reacción de la ¡3-glucuronidasa. 52
CAPÍTULO 3 Cuadro 7. Prueba histoquímica de GUS de los explantes de
hipocotilos de B. ore/lana transformados con el pCAMBIA 2301
y tres cepas de A. tumefaciens.
Cuadro 8. Número de brotes obtenidos a partir de callos de
achiote de la variedad criolla en medio PC con diferentes
concentraciones de auxina/ citocinina.
Cuadro 9. Número de brotes obtenidos a partir de callos de
achiote de la variedad trilobulada en medio PC con diferentes
concentraciones de auxina/ citocinina.
Cuadro 10. Número de áreas o puntos azules de GUS en
callos de la variedad criolla de B. ore/lana L. 12 días después
60
71
74
de la transformación con la cepa LBA 4404::pCAMBIA2301 . 79
Cuadro 11. Número de áreas o puntos azules de GUS en
callos de la variedad criolla de B. ore/lana L. provenientes de
brotes cultivados en medio PC con 1 mg.L·1 BAP, 12 días
después de la transformación con la cepa LBA
4404::pCAMBIA2301 . 82
CAPÍTUL04 Table 4.1. lnfection frequency and number of GUS spots of two
varieties at 12 days after inoculation with strain LBA
4404::pCAMBIA2301 . 96
RESUMEN
Las plantas encierran un enorme potencial para la fabricación a gran escala
de productos químicos derivados de sus metabolismos primario y secundario, a través
de la manipulación genética de sus rutas biosintéticas. Entre ellas destaca el achiote
(Bixa ore/lana L.) por el pigmento llamado bixina que se localiza en sus semillas, que
es empleado en la industria alimentaria como colorante en mantequillas, quesos,
helados, yogurt, bebidas, postres, etc. En la actualidad existen variedades de achiote
con altos contenidos de bixina en sus semillas pero con cápsulas dehiscentes y
semillas con bajos contenidos de bixina con cápsulas no dehiscentes, por lo que el
uso de los métodos de ingeniería genética podría ser la respuesta para modificar el
contenido de bixina en la especie con bajos contenidos de bixina, pero con cápsulas
cerradas. Aunado a todo esto no existe hasta ahora un programa de mejoramiento
genético para esta especie ni se cuenta con un protocolo estable de transformación.
En este trabajo, se presentan los resultados sobre la transformación genética de
hipocotilos y/o callos de dos variedades de achiote (8. ore/lana L.) con el gen
reportero uidA vía Agrobacterium tumefaciens. Además se determinó la sensibilidad
de los callos a la kanamicina y la edad óptima de éstos para ser transformados. Se
trabajó con dos variedades de achiote y dos edades de callos para transformar. Se
obtuvieron dos protocolos de transformación: uno para hipocotilos de las dos
variedades y otro para los callos. Estos resultados permiten conocer que el achiote es
susceptible a la transformación, lo que permitiría también explorar la posibilidad de
introducirle nuevas características como mejorar su contenido de bixina mediante la
manipulación de los genes involucrados en la biosíntesis de carotenoides (como el
gen de la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa o dxs) o conferirle resistencia al ataque
de hongos, dado que la planta es muy susceptible a estos (Oidium bixae) , mediante la
expresión de genes como los que codifican para quitinasas.
ABSTRACT
Annatto (Bixa ore/lana L.), also known as achiote, is a native plant of tropical
America. Achiote is very appreciated beca use of the production of a pigment known as
bixin in the cover of its seeds. Bixin is an apocarotenoid used in the food industry as
coloring in butter, cheese, ice cream, yoghurt, drinks, etc., and in products dedicated to
body care. This species grows from Mexico to Brazil and is cultivated in other parts of
the world. In Mexico, and mainly in the Yucatan Península, the achiote plantations are
very heterogeneous due to severa! problems including its propagation via seeds, the
existence of annatto varieties with a high content of bixin but dehiscent pods and vice
versa, the absence of crop improvement programs, and the lack of plantations
dedicated to seed production. By generating or introducing new beneficia! traits to the
plants, tissue culture and genetic engineering are promising alternativas to circumvent
these problems. Thus, we decided to establish a project with the main goal of obtaining
an efficient protocol to transform B. ore/lana plants, based on the co-cultivation of
hypocotyls and/or calli with Agrobacterium tumefaciens carrying the uidA gene. Sorne
of the results obtained include the establishment of a plant regeneration protocol , and
the development of a method for tissue transient transformation using hypocotyls from
"criolla" and "trilobulada" achiote varieties using the uidA gene as reporter. In relation
to the plant regeneration protocol , we have found an optimal auxin/cytokinin balance to
obtain optimal bud formation (1 .5 mg·L"1 BAP and O mg·L·1 ANA for both varieties).
Regarding the selection of transformed tissues, we determined the sensibility to
kanamycin in normal tissues (10 mg·L·1 for "criolla" and 5.0 mg·L·1 for "trilobulada"
varieties, respectively). Also determinad the optimal age of the "criolla" variety calli for
achieving optimal transient transformation (7 days for calli of 180 days old , and 9 days
for calli produced from buds grown in PC medium with 1 mg·L·1 BAP, respectively) .
Even though the transient transformation protocol is reproducible, we have not
detected GUS staining in the subsequent buds obtained from neither hypocotyls nor
calli.
INTRODUCCIÓN
El achiote (Bixa ore/lana L.) es una planta originaria de América tropical ,
apreciada por producir en la cubierta de sus semillas el pigmento conocido como
bixina (Aparnathi et al., 1990; Arce, 1999). Este compuesto es un apocarotenoide,
empleado en la industria alimentaria como colorante en mantequillas, quesos,
helados, yogurt, bebidas, postres, etc. y en productos dedicados al cuidado del cuerpo
(Jondiko y Pattenden, 1989; Mercadante et al., 1997; Godoy-Hernández, 2000). La
especie crece desde México hasta Brasil y actualmente es cultivada en diversas
partes del mundo (Sánchez, 1965; Srivastava et al. , 1999). Perú es el principal
productor (35% del total) a nivel mundial de semillas de achiote y los Estados Unidos
el principal consumidor (33% de la producción). En 1993 se reportó un consumo total
mundial de 10,650 toneladas métricas (Market Development, 1993). En nuestro país y
principalmente en la península de Yucatán, las plantaciones de achiote son muy
heterogéneas debido a su propagación vía semilla. Existen variedades de achiote con
altos contenidos de bixina en sus semillas pero con cápsulas dehiscentes y semillas
con bajos contenidos de bixina con cápsulas no dehiscentes. Además de que no
existen programas de fitomejoramiento; se carece de plantaciones dedicadas a la
producción de semillas con altos contenidos de bixina. La ingeniería genética abre
nuevas perspectivas para modificar cultivos y provee nuevas soluciones para resolver
necesidades específicas (Hansen y Wright, 1999).
Los programas de fitomejoramiento, apoyados en la ingeniería genética se
proponen aumentar el rendimiento, disminuir las pérdidas ocasionadas por plagas y
enfermedades y reducir los costos de producción, aunado a otros intereses más
ambiciosos en el campo industrial , químico y farmaceútico (Potrykus, 1991 ).
Una alternativa para los cultivos de achiote sería el uso de las técnicas de
cultivo de tejidos vegetales, asociadas con las de la ingeniería genética para
introducirle nuevas características.
Para introducir nueva información genética en plantas, se deben de satisfacer
dos requisitos: disponer de un método para la regeneración in vitro de la especie de
interés y contar con un método de transformación eficiente (Birch, 1997; Hansen y
Wright, 1999). En la actualidad se cuenta con un método de regeneración in vitro de
plantas de achiote y se ha establecido una metodología de transformación que
permite la expresión transitoria del gen reportero uidA en hipocotilos de dos
variedades de achiote (criolla y trilobulada) y hemos obtenido expresión transitoria en
callos de la variedad criolla. Por todo lo anterior, resulta de gran importancia obtener
un protocolo de transformación estable a partir de hipocotilos y/o callos y demostrar
que por alguna de estas vías se puede obtener una transformación genética estable y
no solamente transitoria en plantas de achiote.
Así , en este trabajo se presentan los resultados obtenidos durante la
transformación de hipocotilos y callos de achiote (B. ore/lana L.) con el gen reportero
uidA vía A. tumefacies.
CAPÍTULO 1
ANTECEDENTES Juan Manuel Zaldívar-Cruz y Gregario Godoy-Hernández.
Parte de este capítulo fue sometido para su publicación en las revistas Ciencia de la
Academia Mexicana de Ciencias y en la Revista de Educación Bioquímica de la
Sociedad Mexicana de Bioquímica.
1. Modelo de Estudio Bixa ore/lana L.
Características de B. ore/lana
El achiote pertenece a la familia Bixaceae y su nombre científico es Bixa
ore/lana L. Su nombre deriva de la palabra caribeña bija orbiché, y orellana en honor
de Francisco Orellana, el primer explorador del Amazonas . En México se le conoce
con el nombre común de achiote, que proviene del náhuatl achiotl (Godoy-Hernández,
2000; Arce, 1999). Es el único miembro de este género en la familia Bixaceae. Es una
planta originaria del continente americano, pero está ampliamente distribuida en
muchos de los países tropicales. Es considerada una familia pantropical que se
distribuye desde México hasta Argentina , aunque se cultiva extensamente en otras
regiones tropicales y subtropicales (Aparnathi et al., 1990).
Clasificación taxonómica
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Orden: Viola/es
Familia: Bixaceae
1
Género: Bixa
Especie: Bixa ore/lana
(Arce, 1999; Cronquist, A., 1981)
Descripción botánica
El achiote es un arbusto de 2-1 O metros de altura, con copa piramidal,
redondeada o irregular y ramificación dicotómica, la corteza del tallo es lisa o poco
fisurada, de color pardo-rojizo, pardo-oscuro , pardo-verdoso o pardo-grisáceo (Figura
1 ), con pocas o muchas lenticelas de color pardo claro o amarillento (Rivera y Flores,
1988; Juárez et al. , 1998).
Las hojas son simples, alternas, pecioladas, cardadas, enteras, agudas y lisas
de hasta de 20 cm de largo, de forma deltoide, lanceoladas y pubescentes
(http://f.s.fed. us/globalliitf/Bixa). Las flores se producen en panículas terminales de 10-
25 cm de longitud, con 5-60 primordios florales, la mayoría de las cuales no alcanza
la madurez, pudiendo existir en tres tonalidades diferentes: flores blancas; flores
rosadas y flores lilas. Las flores hermafroditas están dispuestas en corimbos. Florece
en noviembre y se cosecha en marzo y abril (Aparnathi et al., 1990, Juárez, et al.,
1998).
2
Figura 1. El árbol de achiote (Fotografía de Gregorio Godoy-Hernández)
El fruto ofrece diferentes matices, pero en general puede ser de color rojo,
verde, naranja y amarillo y tiene forma ovoide, hemisférica o cónica, por lo que se dice
que tiene forma de cápsula acorazonada de unos 5-3 cm de largo, con características
de espinosidad (erizada de pelos rígidos), dehiscente o no, dependiendo de la
variedad, con una o dos valvas. Pueden ser de color naranja, verde, amarillo, rojo o
poseer diferentes tonalidades de ellos, la longitud puede ser de 2 a 5 cm (Juárez et al.,
19988) . Las semillas son casi triangulares, algo comprimidas y con tegumento carnoso
de color rojo (Rivera y Flores, 1988; Wurtz y Torreblanca, 1983). La floración y
3
fructificación se presenta en los meses de octubre-noviembre con cosechas en enero
febrero (Juárez et al., 1998). Aproximadamente crecen 50 semillas en el interior de los
frutos (Wurtz y Torreblanca, 1983). Las semillas son ovoides presentando un arilo de
color rojo-naranja (INIREB,1977) y un diámetro de 4 a 5 mm (Srivastava et al.,1999).
Cultivo del achiote
El achiote es propagado por semillas o por el injerto de retoños (D'Souza y
Sharon, 2001 ; Sahron y D'Souza, 2000). Sin embargo, también se usa otro método
llamado de estacas (Srivastava et al., 1999}. La selección de semillas juega un papel
importante en su propagación (Aparnathi et al., 1990). Las semillas son sembradas en
semilleros los cuales son regados regularmente. La germinación es de 8 a 1 O días.
Cuando las plántulas tienen una altura de 2.4-3.1 m, son trasplantadas al campo. Las
plántulas requieren cerca de tres años para producir frutos, pero la floración puede
empezar en el primer y segundo año (Sánchez, 1965; Srivastava et al., 1999). El
achiote es una planta poco exigente al tipo de suelo, crece bien desde suelos franco
arenosos hasta arcillosos bien drenados (ITC, 1993; Treja y Barrera, 1991 ). Los
suelos ideales para su cultivo son aquellos ricos en materia orgánica, con buen
contenido de humedad, planos o ligeramente ondulados, aluviones de los márgenes
de los ríos en donde se obtienen excelentes cosechas, o de lamerías donde progresa
la planta aceptablemente (Juárez et al., 1998b). Prospera bien en las zonas
tradicionales y marginales de la actividad agrícola comercial (GCEO, 1999). Se cultiva
entre las latitudes 25° N y 25° S a una altitud de 300 a 1000 m.s.n.m. El ámbito de
temperatura óptimo para su crecimiento oscila entre 24-30°C, en zonas con una
precipitación anual mayor a 1000 mm (Rivera y Flores, 1988). No soporta el frío y
crece mejor expuesto al sol que a la sombra (INIREB, 1977}.
4
Usos del achiote
El achiote es utilizado en la industria de la cerámica, para la elaboración de
barnices, pinturas y lacas. También se usa en tinción de telas de seda y algodón.
Debido a sus propiedades antioxidantes, la tendencia actual es su utilización en la
manufactura de cosméticos y de productos dedicados al cuidado del cuerpo (cremas,
lociones champús); además, ya que el aceite de achiote por ser emoliente y por su
alto contenido de carotenoides y su actividad de pro-vitamina A, provee a dichos
productos propiedades medicinales (Jondiko y Pattenden, 1989; Mercadante et al. ,
1997; Godoy-Hernández, 2000).
En algunos países, el achiote se utiliza para la alimentación de aves y en
innumerables actividades cul inarias. En Yucatán se emplea como condimento en
platillos tradicionales como la cochinita pibil , pollo pibil , mucbilpollos, cerdo adobado,
etc., así como para colorear el arroz (Godoy-Hernández, 2000).
Las semillas pueden usarse externamente como antiinflamatorio y cicatrizante
en casos de quemaduras, erupciones, dermatitis, etc. En uso interno como
defatigante, diurético y antiespasmódico digestivo. Se dice que las hojas son
antigonorreicas y antitricomoniásicas y las raíces son hipoglucemiantes (fase
experimental) y antiespasmódicas (Germosén-Robineau, 1995; Raintree Nutrition,
lnc., 2001 ).
Principales países productores del achiote
En la actualidad, el promedio de la producción anual de semillas de achiote
es de aproximadamente 10,000 toneladas. Dos terceras partes de esta producción es
comercializada como semilla y la otra tercera parte como extracto de las semillas
(Giuliano et al., 2003). Latinoamérica produce el 60% de la producción mundial de
achiote, seguido por África (27%) y Asia (12%). Los principales países productores de
semilla son Bolivia, Brasil , Colombia, República Dominicana, Ecuador, India,
Guatemala, Costa de Marfil , Jamaica, México, Perú, Kenia y Sri Lanka, mientras que
5
los importadores son Estados Unidos, Japón e Inglaterra (Mercadante et al.; 1997;
Giuliano et al., 2003 ).
Perú es el primer productor y exportador del mundo, seguido por Kenia y la
República Dominicana (Market Development, 1993). Sólo como ejemplo, en el
Cuadro 1 podemos encontrar un estimado del consumo mundial de semillas de
achiote para 1992 (Market Development, 1993).
El principal consumidor de semillas de achiote son los E.U.A. (33%), Oeste de
Europa (25%), Japón (18%) y Latinoamérica (14%). Entre los países de Europa, el
Reino Unido es el mayor consumidor de semillas de achiote con un estimado de
1,100 tons , seguido por Francia con 830 tons, otros países de la Comunidad Europea
consumen 700 tons, mientras que los del Oeste de Europa consumen 2760 tons .
El mayor consumidor en Latinoamérica es Brasil (dos tercios del consumo
total) , seguido por Venezuela, Argentina y Perú. Entre 1984 y 1990, Rusia y otros
países del este de Europa reportaron un consumo aproximado de 500 a 600
toneladas/año, representando el 60% del consumo total mundial (Market
Development, 1993).
Los Estados Unidos (EU) importan achiote como semilla cruda y como
concentrado, en 1994, EU importó 4.9 millones de kg de achiote. El precio del achiote
depende de la producción y ha fluctuado entre 2000 dólares por tonelada a 600
dólares por tonelada entre 1985 y 1995 (Giuliano et al., 2003). Las expectativas de
crecimiento del mercado para el achiote en los EU y en la Comunidad Económica
Europea, se espera que sea de un 2-3% anual (T JP Market Development, 1994 ). El
precio del achiote es proporcional al contenido de bixina en las semillas , el cual en
muchos casos debe ser por arriba del 2.7% (Giuliano et al., 2003;
htpp://www. tikho.com/agro/intro. html 2002),
http://www. prisma.org. pe/samco/samco achiote/mercado internacional. htm, 2002).
6
Cuadro 1. Consumo mundial estimado de semillas de achiote en 1992
(Toneladas métricas).
Semillas Extracto de
Región/País Consumo Importadas o achiote(equivalente en
Total extraídas semillas)
E.U.A. 3,340 3,040 300
Oeste de Europa 2,760 2,060 700
Japón 1,920 320 1,600
América Latina 1,490 750 740
Canadá 215 100 115
Resto del Mundo 925 420 505
TOTAL 10,650 6,690 3,960
Fuente: Market Development, 1993; ITC, 1993:, www.prisma.orq.pe/
En México, se cultiva en los estados de Veracruz, Tabasco, Campeche,
Yucatán , Oaxaca, Chiapas, Sinaloa y Tabasco (GCEO, 1999; Juárez et al., 1998a).
Según el Anuario Estadístico de la SAGARPA de 1999, en nuestro país se tiene una
producción nacional de 373.16 toneladas, con un valor aproximado de
$27,496.64/Ton. En el estado de Yucatán , se reportan 206 toneladas producidas para
ese mismo año, con un valor de $15,758.63/Ton.
2. Bixina
Es el pigmento más importante desde el punto de vista económico que posee
el achiote (Juárez, et al., 1998a,b). Se extrae del arilo o cubierta de las semillas y es de
color naranja-amarillento. Representa más del 80% de todos los carotenoides en las
semillas de B. ore/lana (Dendy, 1966; Reith y Gielen, 1971). Es el éster monometílico
del ácido cis-polieno dicarboxílico o el metil hidrógeno 9'Z-6,6'-diapocaroteno-6,6'
dioato, es un compuesto con 25 átomos de carbono y es un cis-carotenoide (Jondiko
y Pattenden, 1989; Mercadante et al., 1996).
7
Bixin
Biosíntesis de la Bixina
Los apocarotenoides son derivados de carotenoides de 40 átomos de
carbono, están ampliamente distribuidos en la naturaleza y tienen funciones
biológicas importantes en diversos organismos. Por ejemplo, la Vitamina A es
necesaria para el desarrollo y la visión en animales, mientras que en plantas, el ácido
abscísico (ABA) participa en el desarrollo de la semilla y en la adaptación a una
variedad de estreses. Muchos apocarotenoides han sido identificados en plantas,
pero sus funciones permanecen desconocidas (Schwartz, 2001 ).
La biosíntesis de los apocarotenoides es catalizada por enzimas que liberan
oxidativamente a los carotenoides. Existe evidencia para este tipo de enzimas en
organismos de todos los 5 reinos, pero hay poca información en su caracterización.
Recientemente, ha sido clonado el gen que codifica la enzima que participa en la
biosíntesis de ABA. La identificación y caracterización de este gen ha provisto de
bases para la identificación adicional de enzimas que degradan a carotenoides
(Schwartz, 2001; Walter, 1999).
La bixina pertenece a la pequeña familia de apocarotenoides naturales
presente en las semillas de Bixa ore/lana y representa más del 80% de los
carotenoides (Mercadante, 1999), en la actualidad ya se conocen las enzimas
involucradas en su ruta de biosíntesis (Bouvier et a/, . 2003; Jako, et a/., 2002).
Además de la bixina, se han encontrado trazas de otros carotenoides en las
semillas de achiote, siendo estos p,p-caroteno, criptoxantina, luteína, zeaxantína y
metil-bixina (Jondiko y Pattenden, 1989; Mercadante et a/., 1997).
8
Propiedades de la Bixina
Es un pigmento soluble en aceite, mientras que la norbixina, que es el
producto formado por su saponificación (adición de álcali), lo es en agua (Godoy
Hernández, 2000).
La bixina purificada es utilizada en muchos países desarrollados
principalmente en la industria alimentaria como colorante en mantequilla, quesos,
helados, yoghurt, bebidas, postres, productos cárnicos. También es usada para
potenciar el color de la masa en productos de panadería bajos en grasas y aceites
comestibles (Jondiko y Pattenden, 1989; Aparnathi et al., 1990).
3. Transformación g enética de plantas
El mejoramiento genético de especies frutales por los métodos clásicos es un
proceso lento y difícil , debido al tiempo tan largo de generación de esas plantas. Es
por esto, que hace de ellas los blancos ideales para la transferencia de genes, los
cuales pueden proveer una ruta directa para la introducción de un cambio genético
específico dentro de un período más corto de tiempo (Miguel y Oliveira, 1999). Uno de
los prerrequisitos para que pueda llevarse a cabo la transformación, es la
disponibilidad de un protocolo de regeneración que sea compatible con el método de
transferencia de la especie en cuestión (Nieto-Jacobo et al., 1999). Plantas
transgénicas de cultivares de especies tales como manzana (James, et al., 1989),
pera (Mourgues, et al., 1996), chabacano (Machado, et al. , 1992) y castaño (Seabra y
Pais, 1998) han sido obtenidas, pero muchas especies frutales de importancia
económica aún no han sido transformadas (Miguel y Oliveira, 1999).
La tecnología del ADN recombinante es una poderosa fuente para la
introducción de genes extraños en plantas perennes y para los estudios
fundamentales de la expresión de genes (Humara, et al., 1999).
Los procedimientos empleados para la transformación genética en plantas son
la transferencia directa de los genes a las célula vegetales (biobalística) o la
9
transferencia indirecta mediada por Agrobacterium tumefaciens (Belarmino y Mii ,
2000) .
El método de transformación mediado por Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria gram-negativa del suelo que
causa una enfermedad neoplásica en la planta debido a la transferencia e integración
de un juego de genes expresables en plantas en su genoma (Zupan y Zambryski ,
1995).
Esta bacteria infecta de manera natural los sitios de heridas en plantas
dicotiledóneas, causando la formación de tumores denominados agallas de la corona
(De la Riva, et al., 1998). La interacción Agrobacterium-célula vegetal es el único
ejemplo natural conocido de transporte del ácido desoxirribonucleico (ADN) entre
reinos . En este proceso, el ADN es transportado de la especie silvestre de
Agrobacterium hasta el núcleo de la célula vegetal (Sheng y Citovsky, 1996).
Por esta razón , es utilizada en estudios genéticos y moleculares para
introducir en plantas, un fragmento de ADN de interés. Durante la infección por A.
tumefaciens, un fragmento de ADN es transferido de la bacteria a la célula vegetal.
Esta porción de ADN es una copia de un segmento llamado el ADN-T (ADN
Transferido o T-ADN, Transferred DNA por sus siglas en inglés), éste es llevado por
un plásmido específico, el plásmido Ti (Tumor-inducing o inductor de tumores), el cual
se encuentra solamente en un pequeño porcentaje de poblaciones naturales de A.
tumefaciens (Peralta y Ream, 1985).
El ADN-T está delimitado por 25 pares de bases repetidas que lo flanquean ,
esos bordes son los únicos elementos cís necesarios para dirigir el procesamiento del
ADN. Únicamente el ADN entre esos bordes puede ser transferido a la célula vegetal
(Zupan y Zambryski, 1995).
El ADN-T contiene dos tipos de genes: los genes oncogénicos, que codifican
las enzimas involucradas en la síntesis de los reguladores del crecimiento de la planta
10
como son las auxinas y citocininas, los cuales son responsables para la formación de
los tumores y los genes que codifican la síntesis de opinas (Lewin, 1997).
Tipos de Opinas
Las opinas son compuestos producidos por la condensación entre
aminoácidos y azúcares, son sintetizados y excretados por células de la agalla de la
corona y consumidas por A. tumefaciens como fuentes de carbono y nitrógeno. Fuera
del ADN-T se localizan los genes del catabolismo de las opinas, los genes
involucrados en la transferencia conjugativa bacteria-bacteria (Hooykaas y
Schilperoort, 1992).
La primera opina descubierta fue un derivado poco común de un aminoácido
N2 -(1-D-carboxietii)-L-Iisina (lisopina), éste fue descubierto en una línea tumoral de
agalla de la corona en la década de los cincuentas. Más tarde se descubrieron otros
derivados inusuales, tales como N2-(1-D-carboxietii)-L-arginina (octopina) y N2-(1 ,3-D
dicarboxipropii)-L-arginina (nopal ina). Por algunos años, esas moléculas fueron
consideradas como el resultado de la perturbación del metabolismo nitrogenado en
células tumorales vegetales y el fenómeno se estudió con relación al estado
cancerígeno de las células de las agallas de la corona. Fue hasta la década de los
sesentas que se descubrió que el tipo de opina sintetizado en células tumorales era
determinado por la especie bacteriana inoculada y que las especies de Agrobacterium
podrían degradar las opinas con la misma especificidad con la cual ellas inducían su
síntesis (Dessaux, et al., 1993), de allí que una especie que induce un tumor que
contiene una octopina podría degradar este compuesto pero no una nopalina.
En la actual idad , se conocen cerca de 20 opinas, las primeras opinas
identificadas fueron la lisopina, octopina y la nopalina. Otras moléculas fueron el ácido
octopínico, el ácido nopalínico y la histopina, estas moléculas resultaron de la
condensación de aminoácidos básicos o ricos en nitrógeno (lisina, arginina, ornitina,
histidina) con piruvato o a-cetoglutarato. Otras moléculas como la leucinopina,
11
cucumopina, succinamopina y lactamas relacionadas son derivadas del a
cetoglutarato y los aminoácidos, leucina, histidina y glutamina, respectivamente.
Basado en la clase de opinas producidas en los tumores , la agrobacteria en la
que residen los plásmidos Ti se clasifican , dependiendo del autor como octopina,
nopalina, agropina (o succinamopina) y leucinopina (Hooykaas y Beijersbergen, 1994)
y por eso, los plámidos pueden ser divididos dentro de cuatro grupos, de acuerdo al
tipo de opina que contengan:
a) Plásmidos de Nopalina.
b) Plásmidos de Octopina
e) Plásmidos de Agropina
d) Plásmidos Ri.
Los plásmidos de nopalina tienen genes para sintetizar nopalina en los
tumores, para que este compuesto pueda ser utilizado por la bacteria. Estos tumores
pueden ser diferenciados dentro de brotes con estructuras anormales. Ellos han sido
llamados teratomas por analogía con ciertos tumores de mamíferos que retienen la
capacidad de diferenciación dentro de estructuras embrionarias.
Los plásmidos de octopinas son similares a los plásmidos de nopalina, pero la
opina relevante es diferente, sin embargo, los tumores de opina usualmente son
indiferenciados y no forman brotes de teratomas.
Los plásmidos de agropina llevan genes para el metabolismo de agropinas,
sus tumores no se diferencian, se desarrollan pobremente y mueren rápidamente.
Los plásmidos Ri pueden inducir enfermedades en la raíz peluda en algunas
plantas y agalla de la corona en otras. Ellos tienen genes tipo agropina y podrían tener
segmentos derivados de ambos plásmidos nopalina u octopina.
La especificidad de los genes de opina depende del tipo de plásmido. Los
genes necesarios para la síntesis de opinas se encuentran enlazados a genes cuyos
productos catabolizan la misma opina, de allí que cada especie de Agrobacterium
cause tumores de agallas de la corona para sintetizar opinas que serán utilizadas para
que el parásito pueda sobrevivir.
12
Las opinas pueden ser empleadas como fuentes de carbono y/o nitrógeno por
la especie de Agrobacterium introducida. El principio es que "/a célula vegetal
transformada sintetice esas opinas que la bacteria podría utilizar" (Lewin , 1997).
4. Funcionamiento del sistema Agrobacterium
El proceso de transferencia de genes de Agrobacterium a la célula vegetal
implica una serie de pasos esenciales y requiere de tres componentes genéticos.
Los componentes genéticos son: el ADN-T, la región de virulencia (vir) de 35
Kb, localizada en el plásmido Ti , constituido por 7 locus (virA, virB, virC, virO, virE, virG
y virH). Las proteínas , productos de estos genes, llamadas proteínas de virulencia
( Vir), responden a compuestos específicos excretados por las heridas de las plantas
para generar una copia del ADN-T y mediar su transferencia dentro de la célula
hospedera (Ward et al., 2002). El tercer componente son los genes cromosomales de
virulencia (chv) localizados en el cromosoma de Agrobacterium. Estos genes están
involucrados en la quimiotaxis bacteriana hacia y junto a la célula vegetal herida. Dado
que el ADN-T está definido por sus bordes, la región codificante del ADN-T tipo
silvestre, puede ser reemplazado por una secuencia única de ADN sin que se afecte la
transferencia desde Agrobacterium a la planta (Sheng y Citovsky, 1996).
La interacción Agrobacterium-célula vegetal consta de una serie de 7 pasos
(Figura 2) y éstos son:
1) Reconocimiento célula-célula .
2) Transducción de señales.
3) Señales de la planta.
4) Activación transcripcional .
5) Metabolismo del ADN-T.
6) Transporte intracelular.
7) Importe nuclear.
8) Integración del ADN-T.
13
Reconocimiento célula-célula
El contacto célula-célula es requerido para la interacción intercelular. El
reconocimiento Agrobacterium-célula hospedera es un proceso que se lleva a cabo en
dos pasos. Primero, la bacteria se enlaza débilmente a la superficie de la célula
hospedera, y segundo, la bacteria enlazada sintetiza filamentos de celulosa que
ayudan a estabilizar el enlazamiento inicial, dando como resultado una asociación más
fuerte entre Agrobacterium y la célula hospedera (Figura 2) (Sheng y Citovsky, 1996).
Transducción de señales
En este paso existe un reconocimiento de moléculas señalizadoras de la
planta y la activación de la vía de transporte del ADN-T. Para regular la infección de la
planta, la bacteria involucra a dos componentes del sistema de transducción de
señales, las proteínas de virulencia VirA y VirG. Estas proteínas sensan las moléculas
señalizadoras excretadas por las heridas de la célula vegetal y activan la expresión de
otros genes vir, iniciándose el proceso del transporte del ADN-T (Figura 2).
Señales de la planta
Las heridas en las plantas segregan savia con un pH ácido característico de
5.0 a 5.8 y un elevado contenido de compuestos fenólicos, tales como lignina y
precursores flavonoides. Estas condiciones estimulan específicamente la expresión de
los genes vir de Agrobacterium. El compuesto inductor (o coinductor) de los genes vir,
mejor caracterizado y más efectivo es la acetosiringona (AS), un compuesto fenólico
monocíclico (Stachel, et al., 1985). Estas moléculas no son detectadas o son
detectadas a muy bajos niveles, en plantas no dañadas, pero se incrementa su
contenido significativamente en células vegetales dañadas (Figura 2).
14
Activación transcripcional
Las moléculas señalizadoras liberadas por las células vegetales heridas son
reconocidas por el sistema regulatorio de dos componentes VirNVirG . No está claro
como las señales fenólicas son sensadas directamente por el componente sensor, Vir
A, o por alguna otra proteína receptora que podría interactuar con VirA. VirA detecta
las moléculas señalizadotas , principalmente pequeños compuestos fenólicos liberados
de las heridas de las plantas. Las señales para la activación de VirA incluyen pH
acídicos , compuestos fenólicos como las AS y cierta clase de monosacáridos que
actúan sinérgicamente con los compuestos fenólicos (De la Riva , et al., 1998).
VirA se autofosforila y transfiere este enlace a un residuo de VirG. VirG
funciona como un factor transcripcional regulando la expresión de los genes vir (Figura
2) (Gelvin , 2000).
Metabolismo del ADN-T
La inducción de la expresión de genes vir da como resultado la producción de
una copia de ADN-T que es capaz de transformar genéticamente a células vegetales .
Las proteínas involucradas durante este proceso son las VirD1 , VirD2, VirC1 y
VirD3. Dado que VirD2 está covalentemente unida a la hebra T, probablemente
participe en el proceso de integración (Gelvin , 2000) . VirD1 es requerida para el
procesamiento en vivo. Para el transporte de esta hebra de ADN-T se forma un
complejo proteína-ácido nucleico, llamado complejo-T, el cual consta de tres
componentes : la hebra de ADN T que lleva la información genética y sus proteínas
VirD2 y VirE2, las cuales protegen la hebra T. VirD2 sirve como proteína piloto para
guiar la hebra T de la bacteria a la célula vegetal (Gelvin , 2000; Tzfira y Citovsky,
2002).
15
Transporte intracelular
Una vez formado el complejo proteína-ADN-T, se forma un canal
transmembranal llamado pilus para transferir este complejo hasta el citoplasma de la
célula vegetal hospedera, este canal está compuesto por numerosas proteínas
codificadas por el operon virB, y por VirD4. VirB2 es la proteína pilina que ayuda a la
formación del pilus. El complejo ADN-T y VirE2 son transferidos de Agrobacterium a la
célula vegetal a través de este pilus, aunque el papel preciso del pilus en la
transferencia del ADN no está claro. El pilus es necesario para la transformación , por
lo que se ha sugerido que VirB2 interactúa directamente con la célula vegetal (Gelvin ,
2000; Ziemienowicz, 2001 ). Después de formado este canal , el complejo-T es
exportado al citoplasma de la célula vegetal hospedera (Figura 2) (Gelvin , 2000; Tzfira
y Citovsky, 2000).
Importe nuclear
La penetración del complejo-T dentro del núcleo de la célula hospedera está
relacionado con la infección viral. Este proceso es mediado por las proteínas VirD2 y
VirE2 y se requiere de una señal específica de localización nuclear (NLS). VirD2 actúa
dirigiendo el complejo-T hacia el núcleo de la célula hospedera. Se dice entonces que
existe una interacción con los receptores NLS de la célula hospedera y el transporte
del complejo-T a través del poro nuclear (Figura 2) (De la Riva , et al., 1998; Gelvin,
2000). Posiblemente VirF tenga una menor contribución en este proceso (De la Riva ,
et al., 1998).
Integración del ADN-T
El importe nuclear del complejo-T de Agrobacterium culmina con la integración
de la hebra T transportada dentro del cromosoma de la célula vegeta l. La inserción del
ADN-T dentro del genoma podría ser mediado por proteínas transportadas de la
16
bacteria y/o por factores de la célula hospedera. Recientemente ambas proteínas
asociadas a la hebra ADN-T, VirD2 y VirE2 han sido implicadas en el proceso de
integración. VirE2 protege a la hebra de posible degradación nucleolítica, es una
proteína que se enlaza al ADN y ayuda al transporte de la hebra a través del complejo
del poro nuclear (Gelvin, 2000). Una vez integrado se sintetiza la segunda hebra del
ADN-T (Figura 2) (Sheng y Citovsky, 1996).
Recientemente se ha empezado a visualizar el papel que podrían jugar las
proteínas de la planta en la integración del ADN-T (Gelvin , 2003a).
Agrobactelium tumefaciens
'5
Figura 2. Interacción Agrobacterium-célula vegetal (Gelvin, 2000: modificada por Julio C.
Canto-Martín, 2003).
17
5. Propiedades de la planta que afectan la transformación mediada por A.
tumefaciens
Las especies de plantas difieren grandemente en su susceptibilidad a la
infección por A. tumefaciens . Cada especie, diferente cultivar o ecotipo podría mostrar
diferencias en el grado de susceptibilidad a la tumorogénesis. Estas diferencias han
sido notadas en arroz, maíz, varias leguminosas, álamo, cucurbitáceas , especies de
Pinus, tomate, Arabidopsis, uva y otras especies (Akama et al., 1992; Yang et al.,
2000). Algunas de las diferencias en la frecuencia de transformación podrían atribuirse
a los factores ambientales y fisiológicos, una base genética para la susceptibilidad ha
sido bien establecida en unas cuantas especies (Gelvin , 2003b).
Las especies vegetales pueden diferir en su competencia temporal para la
transformación seguida de las heridas. Experimentos demostraron que apl icando la
bacteria a las heridas a diferentes tiempos después de herir, presentaban diferencias
en el número de tumores formados . Otros factores involucrados son el tipo de órgano
a emplear, el tejido y tipo de célula, la morfología de la célula, el tratamiento con
fitohormona, la inducción de la competencia de la célula, y la fase del ciclo celular o el
estado proliferativo de la célula (Gelvin , 2003a).
6. Perspectivas en la transformación de plantas mediada por A.
tumefaciens
Aunque el mecanismo molecular de la transformación de plantas mediada por
A. tumefaciens es conocido desde la segunda mitad de 1970, es hasta principios de
1980 cuando se empezó a aprovechar la capacidad de esta cepa para modificar
genéticamente cultivos . En la actualidad, se conoce poco sobre los eventos que tienen
lugar dentro la planta durante el ataque de A, tumefaciens: transferencia del ADN-T a
la célula hospedera, el transporte al núcleo y la integración del ADN-T al genoma de la
planta.
18
Las perspectivas de estudio de este mecanismo de transferencia de genes
están dirigidas hacia el entendimiento del mecanismo de tumorogénesis y
patogénesis . Por lo que seguramente la investigación estaría encaminada a la
sobreexpresión de los genes vegetales involucrados en el proceso de integración del
ADN-T o en la introducción de genes ortólogos de otras especies, para tener una
transformación estable. De esta forma tal vez se mitigaría el problema de la
generación de las multicopias o de la integración repetida del ADN-T, eventos
asociados con el silenciamiento de genes dependiente de la similitud de secuencias.
Otro aspecto de interés sería reducir la integración azarosa del ADN-T, lo que
ayudaría a la selección de eventos de integración y la inhibición de la expresión de
genes específicos de plantas involucrados en la transformación mediada por A.
tumefaciens (Gelvin, 1998; 2000, 20038 .b).
7. Los genes reporteros
La expresión de genes externos en células vegetales puede ser medida
determinando la abundancia o actividad del producto del gen. La secuencia codificante
de genes de enzimas bacterianas son determinadas fácilmente y su actividad
generalmente no se encuentra en plantas, esto constituye las bases de muchos genes
reporteros (Webb y Morris, 1992; Welsh y Morris, 1992).
El término gen reportero es utilizado para definir a un gen con fenotipo
medible y que puede distinguirse sobre un fondo de proteínas endógenas.
Generalmente, estos reporteros son seleccionados sobre la base de su sensibilidad,
rango dinámico, conveniencia y confiabilidad de sus ensayos (Naylor, 1999; Word ,
1995).
Un gen reportero codifica proteínas cuya expresión puede ser detectada (Bio
580, 2001 ), siendo los más utilizados los que codifican enzimas cuya actividad no se
encuentra en el organismo objeto de estudio (Bottinno, 2002). Se les ha llamado
genes reporteros porque proveen información concerniente a la regulación o acción de
un gen diferente (Herrera-Estrella , et al., 1988).
19
Los primeros genes reporteros uti lizados en plantas fueron los de la
Neomicina fosfotransferasa 11 (NPT 11) y el de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT)
(Gummeson, 2002).
En la actualidad, son utilizados continuamente nuevos métodos, genes y
ensayos mejorados. La metodología a utilizar depende de la clase de genes o
promotores que se quiera trabajar. Un gen reportero óptimo debería tener las
siguientes características :
1. La organización genética debería estar bien descrita.
2. El producto del gen no debería estar presente en el organismo o tejido
bajo estudio.
3. El producto del gen debería estar bien caracterizado con respecto a la
actividad bioquímica, dependencia del sustrato y estabilidad.
4. El producto del gen debería ser estable bajo diferentes condiciones
fisiológicas , por ejemplo órganos o tejidos, pHs o condiciones de luz.
5. La actividad enzimática debe ser fácilmente detectable y cuantificable.
6. La expresión del gen reportero debe de producir un cambio selectivo o
visible en el fenotipo de las células transformadas (Herrera-Estrella, et al.,
1988)
Tipos de genes reporteros
Los genes reporteros más utilizados se encuentran en el Cuadro 2.
20
Cuadro 2. Los genes reporteros más utilizados.
Gen reportero
Cloramfenicol acetiltransferasa (CAT)
P-glucuronidasa (gus)
p-galactosidasa (lac)
Luciferasa (lux)
Luciferasa (lux)
Fosfatasa alcalina
Proteina de fluorescencia verde (GFP)
Nopalina sintasa (NOS)
Nemomicina fosfotransferasa (nptll)
Octopina sintasa (OCS)
Origen
Bacteriano
Bacteriano
Bacteriano
Bacteriano
Luciérnaga
Placenta humana
Medusa
Bacteriano
Bacteriano
Bacteriano
Tomada de Naylor, 1999, Jefferson , 1987.
Usos de los genes reporteros
Han sido desarrol lados y utilizados en plantas para analizar la función de
promotores o para encontrar las regiones de un promotor que responda a un tipo
especí fico de señal y otras secuencias de genes, lo que ha incrementado el empleo de
los análisis transitorios (Suter-Crazzolara et al., 1995; Webb y Morris , 1992).
Esto puede realizarse de la siguiente forma :
1. Fusionando la región del promotor de un gen inducible a un gen
reportero.
2. Transformar las células vegetales con esta construcción .
3. Determinar la influencia de la señal sobre la expresión del gen
reportero.
4. Hacer más construcciones del promotor-gen reportero en los cuales
se eliminen reg iones de la secuencia .
5. Transformar con esta construcciones las células vegetales y ver si
todavía es inducible la expresión (Bio 580, 2001 ).
21
Ventajas del uso de los genes reporteros
En general , los genes reporteros tienen la ventaja de presentar un nivel bajo
de actividad en las células pero amplifican la señal de la superficie de la célula para
producir una alta sensibilidad y una respuesta fácilmente detectable (Naylor, 1999).
El uso de los genes reporteros simplifica el análisis de la expresión de genes,
facilita la comparación de secuencias diferentes o alteradas y mejora la sensibilidad
con la cual la medición de la actividad del gene puede ser realizada (Herrera-Estrella,
et al., 1988).
También pueden ser utilizados para estudiar la función de promotores,
además de monitorear de manera visual la expresión temporal de genes en células
vegetales transformadas y para determinar la distribución de la expresión de los
genes. Otra aplicación de estos genes es la de disectar familias de genes, además
para establecer protocolos de transformación o para mejorar esos protocolos
analizando los primeros eventos de transformación (Martín , et al., 1992).
8. El gen reportero uidA
El gen uidA (gusA) que codifica la enzima ~-glucuronidasa (GUS) es el gen
reportero más utilizado en plantas (Jefferson, 1987). Es ampliamente utilizado debido
a la posibilidad de localizar la actividad de la enzima histoquímicamente en tejidos de
plantas más o menos intactos. También puede cuantificarse la actividad de GUS a
través de ensayos fluorométricos, los cuales son sensibles y baratos (Wilkinson y
Lindsey, 1990; Gummeson, 2002).
El gen gus fue desarrollado primeramente como un marcador de fusión de
genes en Escherichia coli y en el nemátodo Caenorhabditis elegans, pero
recientemente ha sido empleado para monitorear la expresión de genes quiméricos en
plantas (Bottino, 2002).
El gen originalmente proviene de E. coli y es codificado por el locus uidA
(gusA) . La proteína codificada es una ~-glucuronósido glucuronosohidrolasa, una
22
hidrolasa acídica que cataliza la degradación de un rango de ~-glucurónidos
(Wilkinson y Lindsey, 2000). La enzima es llamada ~-glucuronidasa (GUS
E.C:3.2.1.31) y sus sustratos consisten de conjugados del ácido 0-glucurónico a
través de un enlace ~-0-glucosídico a una aglicona (Jefferson, 1989). Los sustratos de
la enzima generalmente son solubles en agua y la mayoría están disponibles de
manera comercial (Jefferson, et al. , 1986).
El gen ha sido secuenciado y su producto muestra ser un homotetrámero
estable, de una subunidad, de masa molecular relativa de 68000 kDa, tolera muchos
detergentes y una amplia gama de condiciones iónicas. Es más activa en presencia de
agentes reductores como los tioles, entre ellos el ditiotreitol o el ~-mercaptoetanol. No
tiene cofactores, ni requerimientos iónicos, es inhibido por algunos iones metálicos
divalentes, como Cu2• y Zn2
•, por lo que se recomienda incluir EDTA cuando se llevan
a cabo los ensayos. La actividad de ~-glucuronidasa puede ser determinada a un pH
fisiológico, con un óptimo entre 5.2 y 8.0. Esta enzima es activa en un 50% a pH 4.3 y
es resistente a la inactivación térmica, con una vida media a 55°C en
aproximadamente 2 horas (Jefferson et al., 1987).
Tipos de sustratos artificiales de la enzima p-glucuronidasa
Actualmente se disponen de una variedad de sustratos artificiales para la
detección de la expresión de GUS tanto in vivo como in vitro. Todos estos sustratos
contienen el azúcar ácido 0-glucupiranosidurónico unido por medio de un enlace
glucosídico a un grupo hidroxilo (usualmente un hidroxilo fenólico) de una molécula
cromogénica, fluorogénica u otra detectable (Naleway, 1992; Stomp, 1992).
Dependiendo del tipo de análisis que se lleve a cabo serán los sustratos
utilizados:
1. Análisis histoquímico: utiliza el ácido 5-Bromo-4-Cioro-3-lndolil ~-0-
glucurónico (X-Giuc).
2. Análisis fluorogénico: emplea el ácido 4-Metilumbeliferil ~-0-glucurónico (4-
MUG).
23
3. Análisis calorimétrico: utiliza el p-Nitrofenil p-D-glucurónido (pNPG).
Los análisis fluorogénicos son usualmente de 100 a 1000 veces más sensibles que
los métodos espectrofotométricos.
Ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil p-D-glucurónico (X-Giuc)
Este sustrato es recomendable para la localización histoquímica de la
actividad de GUS y se encuentra disponible de manera comercial. Este provee
solamente un método calorimétrico de la detección de la actividad de GUS, la
precipitación del producto en una solución acuosa permite la localización de la
actividad de la enzima in vivo. El producto de la acción de la p-glucuronidasa sobre el
X-Giuc es un compuesto sin color. Durante la reacción se produce un derivado indoxil,
el cual sufre una dimerización oxidativa que produce un precipitado de color azul
índigo en el sitio de la degradación enzimática. Esta dimerización es estimulada por el
oxígeno atmosférico y puede ser mejorada utilizando un catalizador oxidativo como la
mezcla ferricianuro/ferrocianuro de K+ (Bottino, 2002).
La formación del color requiere de tres reacciones separadas. Después de la
reacción enzimática, el derivado indoxil se dimeriza y entonces es oxidado hasta la
mancha final de color índigo (Naleway, 1992).
Ácido 4-metilumbeliferil P-D-glucurónico (4-MUG)
Es el sustrato fluorogénico más ampliamente utilizado para la detección de la
actividad de p-glucuronidasa in vitro. El Ácido 4-Metilumbeliferil p-D-glucurónico (4-
MUG) no es fluorescente hasta que es hidrolizado y el grupo hidroxilo es ionizado por
la p-glucuronidasa para liberar 4-metilumbeliferona (Jefferson, 1987). Durante la
hidrólisis se produce el fluorocromo 4-metilumbeliferona (7-hidroxi-4-metil cumarina)
junto con el azúcar ácido glucurónico. Utilizando excitación a 363 nm y midiendo la
emisión a 447 nm, el fondo de fluorescencia del sustrato es despreciable, aunque este
sustrato exhibe una ligera fluorescencia intrínseca, excita a 316 nm. La medición de la
24
actividad de GUS con este sustrato es de tres a cuatro órdenes de magnitud más
sensible que el X-Giuc o el pNPG. Este sustrato es utilizado para la detección
cuantitativa de la actividad de la enzima (Naleway, 1992).
p-nitrofenil p-D-glucurónido (pNPG)
Este compuesto es un sustrato estándar espectrofotométrico para la detección
de la actividad de ~-glucuronidasa in vitro. La detección de la actividad es resultado de
un cambio en la máxima absorción del fenol sobre la degradación del enlace
glucosídico y la liberación del 4-nitrofenol. El 4-nitrofenol es medido
espectrofotométricamente entre 402 y 41 O nm, y la intensidad de la absorbancia a
esas longitudes de onda se relaciona directamente con la actividad específica. Aunque
el p-nitrofenil glucurónido no es un sustrato fluorogénico, se utiliza como estándar para
el ensayo enzimático por su bajo valor de Km.
Otros sustratos
Otros compuestos utilizados como sustratos son el ácido Resorufin ~-0-
glucurónido, que es un sustrato alterno al 4-MUG y produce resorufina . Se utiliza
cuando existe fluorescencia intrínseca en los extractos celulares , debido a grandes
cantidades de clorofila o debido a la absorción de cromóforos endógenos, los cuales
producen serios problemas en el análisis de la fluorescencia. Otro compuesto es el
análogo del 4-MUG, el ácido 4-Trifluorometilumbeliferil ~-0-glucorónico (4-TFMUG) , el
cual libera la trifluorometilumbeliferona. Por último, dos sustratos utilizados son la
Fluoresceína Mono-~-0-glucurónido , que es un derivado de la fluoresceína y el Naftol
AS-81 ~-0-glucurónido, este sustrato libera el naftol fluoróforo AS-81 , 6-8romo-2-
hidroxi-3-naftoii-O-anisidina. (Naleway, 1992; Van der Eycken et al., 2000).
Además de los sustratos que rinden productos que dan una coloración azul,
se puede utilizar otro como la sal del 5-8romo-6-cloro-3-indolii-~-O-glucurónido
25
ciclohexilamonio, que es un sutrato cromogénico que produce un color magenta, pero
que es más caro que los otros sustratos (Carroll y Moss, 1995).
Ventajas y desventajas del uso del gen reportero uidA
Entre las ventajas de utilizar este gen reportero se encuentra la estabilidad de
la enzima, la simplicidad del ensayo enzimático y la variedad de sustratos disponibles.
La ventaja principal es la ausencia de actividad de GUS en muchos organismos
(Naleway, 1992). El patrón de expresión de GUS en plantas transgénicas puede ser
fácilmente examinado con un microscopio de luz.
La desventaja de utilizar gus como un gen reportero incluye su acumulación
(lo cual hace difícil o imposible de monitorear continuamente la actividad del promotor
sobre el tiempo) y la necesidad de sacrificar las células que están siendo empleadas
para determinar la actividad de GUS (Bio 580, 2001 ).
El protocolo de detección de la actividad de GUS en tejidos verdes es difícil
debido a que el teñido de color azul es poco perceptible, lo que hace necesario el
decolorar el tejido con etanol , siendo esta la principal desventaja del uso de este gen
reportero o cuando se tiene actividad endógena (Martín , et al. , 1992; Wilkinson y
Lindsey, 1990).
9. Transformación de plantas mediada por A. tumefaciens empleando el
gen reportero uidA
La transformación temporal o transitoria y la estable para la producción de
plantas transgénicas es una herramienta poderosa, con la que se puede investigar la
regulación de la expresión de genes (Peters, et al, 1999; Wenck et al., 1999). El
sistema de A. tumefaciens ha sido utilizado para la transformación de numerosas
plantas, y el uso del gene reportero gus para el establecimiento de protocolos de
transformación. La cepa LBA4404 de A. tumefaciens y el gene reportero gus han sido
empleados en la transformación de orquídeas (Phalaenopsis) (Belarmino y Mii, 2000);
26
para estudiar la influencia de los factores sobre la eficiencia del proceso de
transferencia de genes en moras (Vaccinium spp.), usando las cepas LBA 4404 y EHA
105 (Cao, et al., 1998). En arroz el gen gus ha sido utilizado para determinar las
condiciones óptimas de transformación con las cepas LBA 4404 y C58C1 (Chan, et
al., 1992) y también es útil para monitorear la transformación durante el período
inmediato de la transferencia de genes en Petunia Míchtell (Janssen y Gardner, 1989;
1993).
Otros usos de este sistema son : el desarrollo de sistemas de transformación
regeneración de Lobe/ia erinus (Payne y Lloyd, 1998), para estudiar los factores que
afectan la transformación de menta (Mentha x pi perita L.) con la cepa EHA 105 y el
plásmido pBISN1 o una modificación del p81.121 (Niu, et al., 2000) y en el estudio de
los factores que afectan la transformación y regeneración de Citrus sinensis L.
(Osbeckx Poncirus trifoliata L. Raf.) con la cepa EHA 105 y el plásmido p35GUSINT
(Cervera, et al., 1998); en la identificación y localización de células transformadas de
Ricinus communis L. Var. Gibsonii cv. Carmencita , Cucurbita máxima L. , Vicia faba L.
y Ka/anchoe daigremontiana Hamet et Perrier con la cepa A281 que contenía el p35S
gus-int (Rezmer, et al., 1999); y también para la comparación de diferentes métodos
de regeneración y transformación de Galega orientalis Lam con las cepas LBA 4404,
AGL 1 y EHA 105 (Collen y Jarl , 1999).
Adicionalmente se ha utilizado para obtener plantas transformadas de Prunus
dulcis Mili , a partir de explantes de hojas y la cepa LBA 4404 con el plásmido
p35GUSINT y EHA 105 con el mismo plásmido o con pFAJ3003 (Miguel y Oliveira,
1999), además para estudiar la influencia de diferentes factores sobre la eficiencia de
la transferencia del gen gus en cotiledones de Pinus pinea L. con las cepas EHA 1 05,
LBA 4404 y C58C (Humara, et al., 1999; Nakamura et al., 1998) y para la
transformación de Eustoma grandiflorum, con las cepas A722 y A2002 y los plásmidos
pKIW 111 O y pLN26 (Ledger et al. , 1997).
Por todo lo anterior, se desprende que la tecnología para la transformación de
plantas , puede reducir de manera importante el tiempo necesario para el
mejoramiento genético de especies como B. ore/lana, que tiene un largo ciclo de vida.
27
Por lo que en este trabajo se pretendió establecer un protocolo eficiente de
transformación a partir de hipocotilos y/o callos de dos variedades de B. ore/lana,
utilizando la cepa LBA4404 de A tumefaciens y el gen uidA.
28
HIPÓTESIS
Debido a que muchas plantas dicotiledóneas son susceptibles a la
transformación mediada por A. tumefaciens, el achiote por ser una planta
dicotiledónea no debe ser recalcitrante a la transformación con el gen uidA.
OBJETIVOS
Objetivo general
Obtener plantas transformadas de B. ore/lana L. (variedades criolla y/o trilobulada)
con el gen reportero uidA vía A. tumefaciens a partir de hipocotilos y/o callos.
Objetivos específicos
1. Regenerar directamente brotes transformados a partir de hipocotilos de dos
variedades de B. ore/lana (criolla y/o trilobulada)
2. Regenerar brotes transformados a partir de callos de hipocotilos o de Jos obtenidos
a partir de brotes crecidos en medio PC con 1 mg.L-1 de BAP de la variedad criolla.
3. Inducir callos a partir de hipocotilos de dos variedades de B. ore/lana o de brotes
crecidos en medio PC con con 1 mg.L'1 de BAP de la variedad criolla.
4. Determinar la relación óptima de citocinina/auxina para la obtención de brotes a
partir de callos de las dos variedades.
5. Determinar la dosis letal de kanamicina (dosis-respuesta) a ambos tipos de callos.
6. Transformar los hipocotllos y/o callos con la cepa LBA4404::pCAMBIA 2301 .
29
7. Determinar la fase de crecimiento óptima para la transformación de los callos de
hipocotilos y de los obtenidos a partir de brotes crecidos en medio PC con 1 mg.L'1 de
BAP.
8. Verificar los hipocotilos y callos transformados por medio de la prueba Histoquímica
de GUS.
9. Mantener y enraizar los brotes transformados.
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30
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42
CAPÍTULO 2
MÉTODOS
En la figura 4 se presenta un diagrama de la estrategia experimental que se
llevó a cabo para transformar 8. ore/lana mediante A. tumefaciens . En las secciones
siguientes se detallan cada una de las etapas y actividades realizadas.
2.1. Material vegetal
2.1 .1. Medios de Cultivo
En todos los casos se utilizó como base el medio PC (Phillips y Collins , 1979).
En la germinación de las plántulas se usó el medio semisólido a la mitad de su fuerza
iónica a pH 5.5. Para la infección y cocultivo se utilizó a pH 5.2 sin calcio, líquido y
semisólido respectivamente. Los explantes para la inducción de brotes se recibieron
en medio PC semisólido a pH 5.5 suplementado con 1 mg.L'1 de BAP, 100 mg.L'1 de
cefotaxima y 7.5 mg.L'1 de kanamicina para la variedad criolla y 100 mg.L'1 de
cefatoxima y 2.5 mg.L'1 para la variedad trilobulada. Para el crecimiento bacteriano se
utilizó el medio YEB (Sambrook et al., 1989) a pH 5.6 y a pH 7.0.
2.1.2. Obtención de las plántulas
Para la obtención de las plántulas , se emplearon semillas de achiote (Bixa
ore/lana L.) de las variedades conocidas como criolla y trilobulada del campo
experimental del Centro Regional Universitario de la Península de Yucatán (CRUPY).
Las plántulas se obtuvieron mediante la germinación de semillas asépticas y
escarificadas. Las semillas fueron desinfectadas y escarificadas con etanol al 70% por
5 minutos, se enjuagaron con agua destilada estéril y posteriormente con una solución
de NaCIO al 75% (Cloro Comercial , Cloralex©) durante 7 minutos con agitación 43
constante , esta solución se desechó, posteriormente se le añadió otra solución de
NaCIO al 50% para lavar con agitación durante 18 minutos. Por último las semillas se
enjuagaron con agua destilada estéril. Las semillas después de ser desinfectadas
fueron puestas a embeber en agua destilada estéril durante 72 horas. Finalmente
fueron germinadas en medio PC a la mitad de su fuerza iónica (Phillips y Collins ,
1979). Se utilizaron explantes de hipocótilo de 1 cm de longitud de plántulas de 15-20
días de edad y/o callos jóvenes recién resembrados.
2.1.3. Obtención de los callos
Para la inducción de callos de las dos variedades, se utilizaron como
explantes, segmentos de hipocotilos, procedentes de las plántulas germinadas in vitro.
En todos los casos se empleó como medio basal el medio PC (Phillips y Collins,
1979). Los hipocotilos fueron rayados longitudinalmente con la ayuda de un bisturí y
cultivados en medio PC suplementado con 1 mg.L-1 de ácido naftalenacético (ANA) y 3
mg.L·1 de bencilaminopurina (BAP). Una vez formados los callos , su mantenimiento se
realizó en medios de cultivo con ANAIBAP. Las resiembras se realizaron cada 20 días
(Koefoed, 1997).
2.1.3.1. Caracterización de los callos
2.1.3.1.1. Determinación de la relación óptima de citocinina/auxina para la
obtención de brotes
En la determinación de la relación óptima de citocinina/auxina para la
obtención de brotes a partir de los callos se emplearon dos fitorreguladores : 6-Bencil
amino purina (6-BAP) y ácido naftalenacético (ANA). Las concentraciones utilizadas
para cada una de ellas se encuentran en el Cuadro 3. Para 6-BAP se utilizaron de O
hasta 2.25 mg.L-1 y para ANA de O y 0.5 mg.L-1. En total se tuvieron 20 tratamientos y
44
se emplearon 5 frascos con medio PC por tratamiento para cada una de las
variedades.
Cuadro 3. Concentraciones de citocinina/auxina (mg.L'1) empleadas para la
determinación de la relación óptima para la obtención de brotes.
~ o 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 1.75 2.0
A
o 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0.5 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Las concentraciones de BAP y ANA estan dadas en mg.L .
2.25
10
20
2.1.3.2. Determinación de la dosis letal de kanamicina (dosis-respuesta)
para ambos tipos de callos
La concentración de kanamicina que es letal para ambos tipos de callos se
determinó utilizando 1 O concentraciones de este antibiótico, desde O hasta 20 mg.L-1
(Cuadro 4) y se trabajaron 5 frascos por tratamiento para cada variedad. Se determinó
la apariencia de los callos hasta un mes después de dejarlos expuestos a este
antibiótico en medio PC. La apariencia y el necrosamiento de los callos fue el
parámetro a medir como respuesta ha dicho antibiótico.
45
Cuadro 4. Concentraciones de Kanamicina (mg.L'1 ) empleadas para la determinación de la dosis letal (dosis-respuesta).
Concentración de Kanamicina (mg.L· )
o
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
20.0
2.1.3.3. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la
transformación de callos
Para la realización de este objetivo se utilizaron 0.5 g de callos jóvenes de la
variedad criolla, los cuales se transformaron a los 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 O, 15 y 20 días
después de la resiembra . La infección de los callos consistió de 15 minutos de
incubación con la bacteria transformada con el plásmido a 0.1 de D.0600nm: 72 horas
de cocultivo y subsiguiente el iminación de la bacteria con 250 mg.L-1 de cefotaxima
durante 24 horas a 28°C. La transformación se evaluó a los 12 días después del
cocultivo, por medio de la prueba histoquímica de GUS, siendo el criterio de selección
de la edad óptima el número de áreas o puntos azules detectados en los callos.
46
2.2. Agrobacterium tumefaciens
2.2.1. Cepa
Se utilizó la cepa LBA4404 (tipo octopina), de Agrobacterium tumefaciens
(Hellens et al. , 2000) la cual fue transformada con el método de congelamiento
descongelamiento {Zhang et al. , 1999; Ballina et al. , 2002) con el plásmido pCAMBIA
2301 (Figura 3).
2.2.2. Plásmido
Se utilizó el plásmido pCAMBIA 2301 (Center for the Application of Molecular
Biology to lnternational Agricultura), que contiene el gen de la neomicina
fosfotransferasa (nptll) bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la
coliflor (CaMV) y el gen uidA que codifica a la p-glucuronidasa con el intrón de la
catalasa para la expresión específica en eucariotas bajo el control del promotor 35S
del CaMV (Figura 3).
T-Botder (left)
GáMif35S prómotét
Ecoltl ¡pfJC 18
HittdlU
Gus t1rst ~xon
~~ ~
Gus second exon
Miel Pmll , 8$tU 1
T•Bor<ler (bgfit)
Histidme tag
Figura 3. El plásmido pCAMBIA 2301 (Cortesía de H. Ballina, 2002)
47
2.2.3. Transformación de LBA4404 con el plásmido pCAMBIA 2301
La cepa LBA4404 se transformó con el plásmido pCAMBIA 2301, que
contiene el gene uidA que codifica la enzima p-glucuronidasa, utilizando el método
reportado por Zhang y Zeevaart (1999). La selección de las clonas transformadas se
realizó con los antibióticos kanamicina, rifampicina, y estreptomicina (Cuadro 5). Para
verificar los transformantes a pCAMBIA2301 se realizaron minipreparaciones de ADN
plasmídico de las colonias resistentes a kanamicina y los plásmidos aislados se
separaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 1%. Posteriormente de las
minipreparaciones que presentaron una banda del tamaño de 11,621 pares de bases
(bp), las colonias respectivas se cultivaron en medio líquido por 48 horas siguiendo la
metodología reportada por Eady y colaboradores (2000).
Cuadro 5. Antibióticos utilizados para la selección de la cepa bacteriana.
LBA4404
Cepa Agente selectivo de la bacteria
Rifampicina 100 mg.L·
Estreptomicina 100 mg.L'1
Fuente: Hellen, et al., 2000.
Agente selectivo del plásmido
Kanamicina 50 mg.L·
2.3. Transformación y regeneración del material vegetal.
2.3.1. Transformación de hipocotilos de B. ore/lana
Se emplearon segmentos de hipocotilos de plántulas germinadas de 15-20 días
de edad, los cuales fueron cortados aproximadamente de 1 cm de longitud . Se les
hicieron rayaduras longitudinales con la ayuda de un bisturí en toda su superficie. Los
explantes fueron introducidos en cajas de Petri que contenían 10 mi de medio PC
líquido con o sin AgN03 . Se completó a un volumen de 20 mi adicionando 1 O mi más
de medio PC menos el volumen del inóculo bacteriano con 5 mg.L-1 de AgN03 . Se
adicionó el inóculo bacteriano diluido a 0.1 D.O. y se dejó en contacto con los
48
explantes durante 30 minutos (tiempo de infección). Una vez trancurrido este tiempo,
los explantes se pasaron a cajas de Petri que contenían papel absorbente para
eliminar el exceso de bacterias. Posteriormente, se colocaron en cajas de Petri con
medio PC semisólido y se incubaron a 28°C durante 96 horas (Cocultivo).
Transcurrido el tiempo de cocultivo, los explantes se pasaron a cajas Petri que
contienen 20 mi de medio PC con cefotaxima a una concentración de 250 mgL\ se
cubrieron con papel aluminio para protegerlas de la luz y se incubaron a 28°C por 96
horas, para eliminar el exceso de bacteria (Ballina et al., 2002). Finalizado este
tiempo, los explantes se secaron en cajas Petri que contenían papel absorbente y se
pasaron a frascos que contenían 20 mi de medio PC semisólido adicionado con
cefotaxima a 250 mg.L-1 y kanamicina a la concentración recomendada para cada
variedad. Los frascos se colocaron en el cuarto de cultivo a 25°C y luz continua para
la inducción de brotes (Guerrero, 2001 ; Ni u et al., 2000).
2.3.2. Regeneración de brotes transformados directos a partir de
hipocotilos de dos variedades de B. ore/lana (Criolla y Trilobulada)
Para la regeneración de brotes transformados directos a partir de hipocotilos
transformados, éstos se colocaron en medio PC suplementado con 1 mg.L-1 de BAP,
kanamicina y cefotaxima como se indicó en los medios de cultivo para cada variedad.
Se incubaron en el cuarto de cultivo a 25°C y luz continua para la inducción y
regeneración de brotes. Las resiembras se hicieron cada 20 días.
2.3.3. Transformación de callos provenientes de hipocotilos de B.
ore/lana
Paralelamente a la transformación de los hipocotilos, se generaron 2 líneas de
callos para transformar. Estas líneas fueron caracterizadas con la finalidad de tener el
mejor balance de auxina/citocinina para la obtención de brotes, además, se les
determinó la dosis letal de kanamicina (dosis-respuesta) , la fase de crecimiento óptima
49
para la transformación de los callos y por último se transformaron con la cepa
LBA4404::pCAMBIA 2301 .
2.3.3.1 . Transformación de los callos con la cepa LBA4404::pCAMBIA
2301
Una vez seleccionada la edad óptima de los callos para la transformación , se
creció por 48 horas una colonia individual de la cepa A. tumefaciens transformada
previamente con el plásmido pCAMBIA2301 siguiendo la metodología reportada por
Eady (2000) y se utilizó la fase de crecimiento óptima para la transformación de callos,
previamente determinada. Las condiciones de transformación fueron las mismas que
se emplearon para la transformación de hípocotilos y se tomaron 0.5 g de los callos
para la transformación .
2.3.3.2. Inducción de la formación de brotes a partir de los callos
transformados
Para la inducción de brotes a partir de los callos transformados se utilizó el
medio PC suplementado con la concentración previamente determinada de 6-BAP y 8
g.L"1 de agar.
2.3.3.3. Regeneración de brotes transformados a partir de callos de las
variedades Criolla y trilobulada de B. ore/lana
Se utilizó el medio PC suplementado con 1 mg.L-1 de 6-BAP y 8 g.L-1 de agar
(Guerrero, 2001 ). Para la regeneración de brotes transformados directos a partir de
callos transformados, éstos se colocaron en medio PC suplementado con 1 mg.L-1 de
BAP, kanamicina y cefotaxima como se indicó en los medios de cultivo para la
50
variedad criolla . Se incubaron en el cuarto de cultivo a 25°C y luz continua para la
inducción y regeneración de brotes. Las resiembras se hicieron cada 20 días.
2.3.3.4. Inducción de brotes y/o callos a partir de hipocotilos
transformados de B. ore/lana L con el pCAMBIA2301 para obtener
transformación estable
Con el fin de obtener brotes y/o callos transformados, se modificaron algunos
parámetros del método de transformación : la temperatura de cocultivo (22°, 25°C y
28oC) (Srivatanakul, et al., 2001 ), el pH del medio de cocultivo (5.2 y 5.6), la adición
de ácido ascórbico (1 00 mgL- \ el incremento en la concentración de acetosiringona
(200 f..LM), la adición de 17 mgL-1 de MnS04 al medio YEB para el crecimiento de la
bacteria (Chen y Punja, 2002) , recibir los explantes en medio PC sin kanamicina e
incrementar la concentración del antibiótico cada dos semanas (Aisheikh et al., 2002)
hasta alcanzar la concentración final recomendada para cada variedad de achiote.
Se realizó un experimento por duplicado, donde se trabajaron todas estas
variables. Paralelamente se indujeron brotes a partir de hipocotilos transformados de
B. ore/lana.
2.4. Verificación de la transformación del material vegetal
2.4.1. Prueba Histoquímica de GUS
Los hipocotilos transformados se colocaron en tubos eppendorf que contenían
150 ~~~ de la solución X-Giuc (Naleway, 1992). Se les hizo vacío durante 5 minutos y
se incubaron durante 24 horas a 37°C en oscuridad . La solución X-Giuc se preparó de
la siguiente forma :
51
Cuadro 6. Componentes de la reacción de la ¡3-glucuronídasa.
Componente Conc. Final Conc. Stock Para
100 mi
NaH2P04 100 mM 1M 10ml
EDTA 10 mM 0.5 M 2 ml
K3Fe(CN)s O.SmM 16 mg
~Fe(CN)s.3H20 O.SmM 21 mg
Triton X-100 0.2% 0.2ml
A la mezcla anterior se le adicionó 25 , .. d de X-Giuc (5-Bromo-4-cloro-3-indolii
~-D-glucurónido) predisuelto en DMSO a una concentración final de 1 mg/ml (Stomp,
1992; Wilkinson y Lindsey, 1990).
Una vez transcurrido el tiempo de incubación se eliminó la solución de tinción
y se decoloró el tejido con etanol al 70%, siendo este proceso lento, o con una mezcla
de metanol :acetona (3:1, v/v), hasta que se eliminaron los pigmentos vegetales . Se
eliminó la solución de decoloración y se dejaron embebiendo los cortes en glicerol al
50% para su conservación a 4°C (Humara, et al., 1999).
2.4.2. Selección de los brotes transformados de B. ore/lana por medio de
la prueba histoquímica de GUS
Los brotes potencialmente transformados se propagaron y de los duplicados
se seleccionaron los brotes transformados de B. ore/lana por medio de la prueba
histoquímica de GUS (Janssen y Gardner, 1989; 1993; Rezmer et al., 1999). Esta
prueba consistió en teñir los brotes transformados con la solución de X-Giuc (Humara
et al., 1999). Los brotes fueron observados directamente o con un estereoscopio
(Nikon SMZ800) (Stomp, 1992).
52
2.4.3. Verificación de Jos callos transformados por medio de la prueba
Histoquímica de GUS
Los callos transformados de B. ore/lana propagados, se seleccionaron por
medio de la prueba histoquímica de GUS, como se describió previamente.
2.4.4. Verificación de Jos brotes transformados con la prueba
histoquímica de GUS.
Los brotes potencialmente transformados se propagaron y de los duplicados
se seleccionaron los brotes transformados de B. ore/lana por medio de la prueba
histoquímica de GUS. Esta prueba consistió en teñir los brotes transformados con la
solución de X-Giuc (Humara el al., 1999). Los brotes fueron observados directamente
o con un estereoscopio (Nikon SMZ800) (Stomp, 1992).
2.5. Mantenimiento de Jos regenerantes transformados
2.5.1. Mantenimiento de los brotes transformados
Para el mantenimiento de los brotes transformados se empleó el mismo medio
PC con 1 mg.L-1 de 6-BAP o sin reguladores de crecimiento y 8 g.L-1 de agar.
2.5.2. Enraizamiento de Jos brotes transformados
Los brotes se enraizaron de manera individual en medio PC suplementado
con 1.5 mg.L'1 de ácido indol-butírico (IBA).
53
2.5.3. Adaptación de las plantas transformadas de B. ore/lana en
invernadero
Una vez que las raíces de las plántulas alcanzan entre 5-1 O cm de longitud, se
remueven de los frascos y se lavan para eliminar los residuos de agar, posteriormente
se transfieren a macetas que contengan una mezcla de tierra y agrolita (1 :1 ), se
cubrirán con una bolsa de polietileno transparente para su aclimatación en el
invernadero, serán mantenidas durante una semana a 25-30°C y después durante tres
semanas, las bolsas serán perforadas manualmente con el fin de reducir la humedad
relativa , con luz natural a una densidad de 310 ¡..tmol m·2 s·\ la cual fue aumentada a
572 ¡J.mol m·2 s·1. Dos semanas después, las plantas se transfieren a campo a una
densidad de aproximadamente 1985¡J.mol m·2 s·1.
54
Figura 4. Diagrama de flujo de los experimentos a realizar.
55
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58
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
3.1. Agrobacterium tumefaciens
3.1.1. Selección de la cepa de A. tumefaciens con base en el tipo de
opina para la transformación de B. ore/lana L.
En nuestro grupo de trabajo, Guerrero-Rodríguez (2001) reportó la
transformación transitoria de dos variedades de B. ore/lana con el gen reportero uidA
utilizando el plásmido p81121. Pero debido a que en dicho vector, el gen utilizado
carece de intrones, los resultados reportados también podrían ser atribuidos a la
actividad bacteriana y no solamente debida a la de los tejidos vegetales
transformados. Por lo anterior, se optó por trabajar con el plásmido pCAMBIA2301 que
posee el gen uidA con el intron de la catalasa , lo cual asegura que la actividad de
GUS que se detecte, será únicamente debida al tejido vegetal trasformado, ya que la
bacteria no podrá procesar el ARNm correspondiente al gen uidA (citado por Ballina
Gómez, 2002). En el trabajo de Ballina-Gómez, también se reporta que las mejores
cepas de A. tumefaciens para transformar al achiote son las tipo succinamopina
(EHA 1 05) ya que presentan en promedio 11 .3 puntos azules/explante, en
comparación con la tipo octopina (LBA4404) que tenía en promedio 5.9 puntos
azules/explante y la menos indicada son las de tipo nopalina (C58C1) con 0.3 puntos
azules/explante a los 12 días después de la transformación (Cuadro 7) (Ballina-Gómez
et al, 2002). El número de áreas transformadas/explante a los 3 días es inferior a los
de 12 días, como se muestra en los datos cualitativos de la figura 6.
Con respecto a la expresión del gen uidA a los 12 días en los explantes
transformados con EHA 105, se observó una alta variabilidad en el número e
intensidad de los puntos azules. Estos resultados son similares a los reportados por
59
Humara y colaboradores (1999) para la transformación de cotiledones de Pinea pinea
con EHA 1 05; a los obtenidos por Miguel y Oliveira (1999) y Ca o y colaboradores
(1998) cuando transformaron almendra (Prunus dulcis Mili.) y mora ( Vaccinium spp.)
respectivamente, ya que ellos al comparar EHA 1 05 con LBA4404 observaron que los
explantes transformados con la primera tuvieron el mayor número de explantes
positivos a GUS.
EHA 105 es una cepa hipervirulenta que tiene un elevado crecimiento por lo
que presenta problemas al tratar de eliminarla con el antibiótico cefotaxima, con lo
cual todos los explantes se contaminan , impidiéndonos la obtención de brotes
potencialmente transformados. Por tal motivo nos decidimos utilizar la cepa LBA4404
(tipo octopina) como la más adecuada para la transformación en achiote, ya que se
elimina fácilmente de los explantes con el antibiótico cefotaxima.
Cuadro 7. Prueba histoquímica de GUS de los explantes de hipocotilos de B. ore/lana transformados con el plásmido pCAMBIA 2301 y tres cepas de A. tumefaciens.
CEPA DE PRUEBA HISTOQUIMICA DE GUS
A. tumefaciens (Áreas azules/explante)
3 días 12 días
EHA 105 (Succinamopina) 4.9 11 .3
LBA4404 (Octopina) 3.2 5.9
C58C1 (Nopalina) 0.16 0.3
3.2. Regeneración
3.2.1 Sistema de regeneración de brotes de B. ore/lana L.
La propagación de plantas de interés comercial por medio de técnicas in vitro
ha mostrado ser una alternativa útil cuando éstas se propagan por semillas y se
presentan problemas de baja viabilidad y velocidad de germinación, o cuando se
carece de materiales elite que puedan ser empleados como esquejes vegetativos (Sha
et al., 2002). El primer requisito para un programa de mejoramiento biotecnológico es
60
el contar con un método eficiente de regeneración (Siril y Dhar, 1996). Por eso, los
primeros experimentos realizados en nuestro grupo se dirigieron a desarrollar y
eficientizar el método de regeneración de achiote (8. ore/lana) a partir de hipocotilos.
Para la inducción de los brotes, el medio PC se suplementó con 4.43 ¡.tM de 6-BAP,
los brotes se indujeron de 20 a 60 días, posteriormente se procedió a su multiplicación
en el mismo medio de cultivo, en un tiempo aproximado de 25 a 30 días, para
proceder al enraizamiento durante 30 a 45 días. Por último se dejaron adaptando en
macetas hasta tener la planta completa en 30-45 días. Se obtuvo un porcentaje de
regeneración de 3.25 plántulas/explante y 75-85% de plantas regeneradas. Las
condiciones del protocolo de regeneración se encuentran resumidas en las figuras 5 y
6.
61
Figura 5. Sistema de regeneración de hipocotilos de 8. ore/lana. A: estado inicial de los tallos de achiote en medio PC. B: formación de brotes, C: Organogénesis indrecta, O: Organogénesis directa, E: Formación de brotes en la sección terminal, F: formación de brotes en la sección central, G: Enraizamiento de brotes en medio PC con 7.38 J.LM de ácido indolacético (IBA) en frascos cubiertos con papel aluminio, cultivados bajo luz contínua, H: Plántulas en macetas para el proceso de aclimatación.
62
3
25-30
3Q.4S
TOTA~US..:!lS d
.... ,' . - . - . J ' " . .
4·. ~ MüM> + ~'9·:4 1¡'!M A-gN'O) '6'0 ~ iti'O'gén'ó tíi'M
-- -- . -- -. - - D . . . • -':J
1 A:g"r'ó~ítA + tti'er ra 'r'ója 1(H~
Figura 6. Proceso de regeneración de Bixa orellana L
63
3.3. Transformación transitoria de explantes de hipocotilos de Bixa
ore/lana L con LBA4404::pCAMBIA 2301
Se obtuvo una metodología para la expresión transitoria. del gen uidA-intrón en
hipocotilos de B. ore/lana. Se monitoreó la expresión de dicho gen mediante la prueba
histoquímica de GUS a los 3 y 12 días después de la transformación (Figura 7), se
produjeron las típicas áreas azules debidas al precipitado azul insoluble. No se
encontraron áreas azules en los controles. Las áreas encontradas variaron en tamaño,
estos resultados son similares a los obtenidos cuando se empleó la expresión
transitoria de GUS en Petunia Mitchell (Janssen y Gardner, 1989). Los puntos de
tinción observados en los explantes de hipocótilo nos aseguran que la actividad de
GUS es debida a la transformación de los explantes y no a la actividad bacteriana.
El empleo de la expresión transitoria de GUS para la transformación de
hipocoti los de B. ore/lana, es un indicativo de que esta especie es susceptible de ser
transformada, y esta técnica ha sido empleada para demostrar la transformación de
Pinus pinea L. (Humara, et al. , 1999}, kiwi (Actinidia deliciosa var. deliciosa cv
Hayward) (Janssen y Gardner, 1993), fruto de níspero (Diospyros kaki Thunb)
(Nakamura et al., 1998).
3.4. Inducción de brotes y/o callos a partir de hipocotilos transformados
de 8. ore/lana L con el pCAMBIA2301 para obtener transformación
estable
Utilizando el protocolo descrito, se obtuvieron callos a partir de la tercera
semana después de la transformación (Figura 8), esto comprobó que mantener los
hipocotilos en medio PC con 100 mg.L-1 de cefotaxima, pero sin kanamicina (O mg.L-
1} e incrementar la concentración de la kanamicina cada dos semanas hasta alcanzar
la concentración final recomendada para cada variedad de achiote (Aisheikh, et al.,
2002), permitía que los explantes se recuperaran y se produjeran callos (Fig. 8 y 9).
Conforme la concentración de la kanamicina se incrementó, los callos empezaron a
64
adquirir una coloración café y una apariencia necrótica, por lo que solamente
prevalecieron los que potencialmente estaban transformados. Al realizar la prueba
histoquímica de GUS a los callos, solamente tres muestras dieron positiva a dicha
prueba (Figuras 9 A y B), estos callos provenían de hipocotilos transformados en
medio PC con pH 5.2 y 22°C de temperatura de cocultivo, PC con pH 5.2 y 28°C de
temperatura de cocultivo y PC con pH 5.6 y 28°C de temperatura de cocultivo. La
prueba GUS fue realizada a las dos semanas de transformación. Por otra parte, el
hecho de adicionar MnS04 no mejoró la obtención de brotes y no tuvo una relevancia
estadística. Además, de las tres temperaturas de cocultivo probadas, la que mejor
resultado tuvo para la obtención de áreas o puntos azules, fue la de 28°C, mientras
que a 22°C solamente se obtuvo un punto azul.
A
e
C58C1 C58C.1
E F
LBA4404
Figura 7. Tinción histoquímica de GUS de los explantes de hipocotilos de B. ore/lana de la variedad criolla, transformados con las tres cepas de A. tumefaciens. Paneles A, C y E: 3 días después de la transformación y Paneles B, D y F: 12 días después de la transformación.
Paralelamente se indujeron brotes a partir de hipocotilos transformados de B.
ore/lana. Los brotes obtenidos dieron negativo a la prueba histoquímica de GUS y la
mayoría fueron de tamaño pequeño (Figura 9). Esto podría haberse debido a la
65
posición estática del hipocotilo en el medio de cultivo semisólido, lo que ocasionó que
el contacto con el antibiótico del medio solamente se diera en una determinada zona
del explante y por lo tanto quedaron zonas sin tener contacto con el antibiótico que
son las que regeneraron los brotes.
Figura 8. Inducción de callos a partir de hipocotilos transformados de B. ore/lana de la variedad criolla con lBA4404::pCAMBIA 2301. los hipocotilos se mantuvieron en medio PC con 100 mg.l -1 de cefotaxima y O mg.l-1 de kanamicina. la concentración de la kanamicina se incrementó cada dos semanas hasta alcanzar una concentración final de 7.5 mg.l-1•
3.4.1. Inducción y mantenimiento de callos a partir de hipocotilos
transformados de B. ore/lana L.
La inducción de callos se produce cuando la proporción de auxinas es
superior a la de las citocininas. Se ha obseNado que son en realidad, las primeras,
las responsables de la aparición de este tipo de tejido, mientras que las citocininas
sólo favorecen su proliferación (Pérez et al., 1999). Los callos obtenidos a partir de
hipocotilos transformados se propagaron a 25°C en medio PC semisólido a pH 5.5.
Este medio contenía 1 mgL-1 de BAP y 1.0 mgL-1 de ANA, además de 100 mg.L-1 de
cefatoxima y 2.5 mgL-1 de Kn para la variedad criolla, estos callos fueron de tamaño
pequeño y presentaron un crecimiento lento, por otra parte presentaron poca
66
disposición a separarse (baja friabilidad). Los callos fueron subcultivados cada 20 días
en medio de cultivo con las mismas características.
Figura 9. Inducción de brotes y callos a partir de hipocotilos transformados de 8 . ore/lana de la variedad criolla con LBA4404::pCAMBIA 2301. Los hipocotilos se mantuvieron en medio PC con 100 mg.L·1 de cefotaxima y O mg.L"1 de kanamicina. La concentración de la kanamicina se incrementó cada dos semanas hasta alcanzar una concentración final de 7.5 mg.L"1
• Panel A: obtención de brotes a partir de hipocotilos transformados y Panel 8 : obtención de callos y brotes a partir de los hipocotilos transformados.
67
Figura 10. Tinción histoquímica de GUS de los hipocotilos y callos de B. ore/lana de la variedad criolla, transformados con la cepa LBA4404 y el pCAMBIA2301. Panel A: hipocotilos Paneles By C: callos. La prueba se realizó a los 12 días después de la transformación.
68
3.5. Determinación de la relación óptima de citocinina/auxina para la
obtención de brotes a partir de callos
La iniciación y proliferación de callos provenientes de plantas in vitro requiere
normalmente de la presencia de reguladores de crecimiento o de análogos de éstos, o
de una combinación de lo mismos en el medio de cultivo. Auxinas, citocininas y
algunos compuestos con actividad de auxina o citocinina han mostrado ser efectivas
en muchos casos (Chang y Schmidt, 1991). Los callos de la mayoría de especies,
usualmente son capaces de regenerar raíces adventicias y brotes adventicios. La
formación de brotes adventicios en los callos puede llevarse a cabo si hay una baja
concentración de auxinas y una alta concentración de citocinina. La bencilaminopurina
(BA) es la citocinina más efectiva para inducir la formación de brotes adventicios
(Pierik, 1987). Por todo esto, siempre que se vaya hacer un estudio de transformación
de cualquier tipo de explante de alguna especie es necesario conocer los
requerimientos óptimos de los reguladores de crecimiento para la regeneración, por lo
que se decidió iniciar estudios para conocer la relación óptima de citocinina/auxina
para la formación de brotes a partir de callos de dos variedades de achiote. Se
probaron dos reguladores: 6-BAP (10 concentraciones) y ANA (dos concentraciones)
en el medio PC, se dejaron los callos en dichos medios durante un mes y se evaluó el
comportamiento de los callos. Posteriormente se resembraron y se dejaron otro mes
para ser evaluados.
Después del primer mes solamente se obtuvo un brote para los callos de la
variedad criolla en el tratamiento con 1.25 mg.L-1 de 6-BAP y O mg.L-1 de ANA, para el
segundo mes se obtuvieron 2 brotes en los tratamientos con 1.25 y 1.5 mg.L-1 de 6-
BAP y O mg.L-1 de ANA (Ver Figura 11) y ya en el tercer mes se obtuvieron 4 brotes
para esas mismas concentraciones (Cuadro 8). Esto nos estaba indicando que el 6-
BAP era el regulador clave para la obtención de brotes y que el ANA podía suprimirse.
69
Figura 11 . Determinación de la relación óptima de citocinina/auxina para la obtención de brotes a partir de callos de achiote de la variedad criolla. A: callos con un mes de resiembra en medio PC suflementado con O mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L"1 de ANA; 8: 1.25 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L" de ANA, C: callos con dos meses de resiembra en medio PC suplementado con 1.25 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L"1 de ANA; D: callos con dos meses de resiembra en medio PC suplementado con 1.5 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L"1 de ANA; E: callos con tres meses de resiembra en medio PC suplementado con 1.5 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L"1 de ANA y F: callos con tres meses de resiembra en medio PC suplementado con 1.25 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L"1 de ANA
70
Cuadro. 8. Número de brotes obtenidos a partir de callos de achiote de la variedad criolla en medio PC con diferentes concentraciones de auxina/ citocinina.
Tipo de regulador Número de brotes formados
6-BAP ANA 1•' mes 2° mes 3° mes
mg.L-1 mg.L-1
o o o o o 0.25 o o o o 0.5 o o o o
0.75 o o o o 1.0 o o o o
1.25 o 1 2 4
1.5 o 1 2 4
1.75 o o o o
2.0 o o o o 2.25 o o o o o 0.5 o o o
0.25 0.5 o o o 0.5 0.5 o o o
0.75 0.5 o o o 1.0 0.5 o o o
1.25 0.5 o o o 1.5 0.5 o o o
1.75 0.5 o o o 2.0 0.5 o o
2.25 0.5 o o
71
Por otra parte, en los callos de la variedad trilobulada solamente se
presentaron brotes en los medios que carecían de ANA y que además tenían las
concentraciones de 6-BAP entre 1.25 y 1.5 mg.L-1 (Cuadro 9 y Figura 12). Estos
resultados son congruentes con lo reportado en la bibliografía , ya que se ha
reportado que concentraciones entre 1 y 1 O mg.L-1 de esta citocinina promueve la
división celular y que en altas concentraciones podría inducir la formación de brotes
adventicios, aunque la formación de raíces generalmente se inhibe, además de que
promueve la formación de brotes axilares debido a la disminución de la dominancia
apical y a que retarda el envejecimiento (Pierik, 1987).
Por otra parte, el balance entre auxinas y citocininas en un cultivo in vitro
suele ser determinante para el patrón de desarrollo que siga el tejido, de allí que la
respuesta que puede esperarse del tejido ante este balance puede ser desde la
proliferación de yemas, brotes adventicios , tejido calloso, embriogénesis y producción
de raíces, dependendiendo de las concentraciones de la auxina y de la citocinina
(Pérez et al. 1999). Los resultados obtenidos indicaban un bajo número de brotes
para las dos variedades , esto quizás se debió a la edad de los callos utilizados
(aproximadamente 180 días), pero independientemente de esto, las concentraciones
obtenidas podían ser útiles en estudios posteriores.
72
Figura 12. Determinación de la relación óptima de citocinina/auxina para la obtención de brotes a partir de callos de achiote de la variedad trilobulada. A: callos con un mes de resiembra en medio PC suplementado con O mg.L-1 de 6-BAP y O mg.L"1 de ANA; B: 1.25 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L-1 de ANA, C: callos con dos meses de resiembra en medio PC suplementado con 1.25 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L"1 de ANA; D: callos con dos meses de resiembra en medio PC suplementado con 1.5 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L" 1 de ANA; E: callos con tres meses de resiembra en medio PC suplementado con 1.5 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L-1 de ANA y F: callos con tres meses de resiembra en medio PC suplementado con 1.25 mg.L"1 de 6-BAP y O mg.L-1 de ANA
73
Cuadro. 9. Número de brotes obtenidos a partir de callos de achiote de la variedad trilobulada en medio PC con diferentes concentraciones de auxlna/ citocinina.
Tipo de regulador( mg.L' ) Número de brotes formados
6-BAP ANA 1"' mes 2°mes 3°mes
o o o o o 0.25 o o o o 0.5 o o o o
0.75 o o o o 1.0 o o o o
1.25 o 1 2 4
1.5 o 1 2 4
1.75 o o o o 2.0 o o o o
2.25 o o o o o 0.5 o o o
0.25 0.5 o o o 0.5 0.5 o o o
0.75 0.5 o o o 1.0 0.5 o o o
1.25 0.5 o o o 1.5 0.5 o o o 1.75 0.5 o o o 2.0 0.5 o o o
2.25 0.5 o o o
3.6. Determinación de la dosis letal de kanamicina (dosis-respuesta)
para callos de achiote de las variedades criolla y trilobulada
Los antibióticos son ampliamente utilizados como agentes selectivos
(kanamicina, higromicina y bleomicina), para identificar los tejidos transformados y
para controlar o eliminar los microorganismos contaminantes (Pollock et al., 1983),
favoreciendo el desarrollo de los tejidos (Chang y Schmidt, 1991; Sarma et al., 1995).
74
explante en particular es un elemento clave en el desarrollo de un sistema de
transformación genética (Colby et al., 1990). Para una transformación efectiva
mediada por A. tumefaciens, se requiere la presencia de kanamicina en el medio
para suprimir la proliferación de células no transformadas (Aisheikh, et al., 2002), ya
que la sensibilidad a este antibiótico afecta la recuperación de las plantas
transformadas y varía ampliamente entre tejidos y especies, la sensibilidad a
kanamicina debe ser determinada durante los pasos iniciales del desarrollo de un
sistema de transformación , por lo que previo a la transformación de los callos de
achiote de las variedades criolla y trilobulada , se determinaron las concentraciones
de kanamicina que eran letales para los callos. Se utilizaron 8 concentraciones de
este antibiótico (de O mg.L-1 hasta 20 mg.L"1 de kanamicina), para encontrar la
concentración a utilizar después de la transformación, con la finalidad de eliminar en
gran medida la formación de falsos positivos. El efecto fue evaluado al mes para
ambas variedades. S e pudo observar que la variedad e riolla fu e susceptible a 1 as
concentraciones de kanamicina por arriba de 10 mg.L-1, ya que los callos presentaron
una apariencia necrótica, con coloración parduzca, estos resultados son similares a
los reportados para Vitis vinífera y V. rupestris, ya que éstas especies fueron
sensibles a concentraciones de 7 mg.L"\ mientras que Rosaceae fue inhibida a 10
mg.L"1 (Yepes y Aldwinckle, 1994). Los resultados pueden observarse en la Figura
13. La variedad trilobulada fue susceptible a concentraciones desde 5.0 mg.L"\
valores similares a los reportados para muchos genotipos de manzanos, los cuales
estaban entre 5 y 7 mg.L"1 (Y e pes y Aldwinckle, 1994 ), estos callos presentaron
coloraciones parduzcas como se observa en la Figura 14. Los callos de la variedad
criolla fueron menos susceptibles que los de la variedad trilobulada, resultados que
confirman 1 a tendencia obtenida por Guerrero-Rodríguez ( 2001) e on h ipocotilos de
las mismas variedades de B. ore/lana L. (2.5 y 7.5 mg.L-1 para las variedades
trilobulada y criolla respectivamente.
75
Figura 13. Dosis-respuesta a 8 concentraciones de kanamicina, utílizando callos de achiote (8. ore/lana L.) de la variedad criolla (A: O, B: 2.5, C: 5.0, D: 7.5, E: 10.0, F: 12.5, G: 15.0 y H: 20.0 mg.L"1 de kanamicina).
A .. s e o
.. r .· -\z • · ·•
.• E ,.-.; • . G . H Figura 14. Dosis-respuesta a 8 concentraciones de kanamicina, utilizando callos de achiote (8. ore/lana L.) de la variedad trilobulada (A: O, B: 2.5, C: 5.0, D: 7.5, E: 10.0, F: 12.5, G: 15.0 y H: 20.0 mg.L"1de kanamicina).
3. 7. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la
transformación de callos de la variedad Criolla
Se seleccionaron los callos de la variedad criolla para realizar los estudios de
transfonnación ya que se contaba con callos jóvenes (menos de 20 días de edad) y
callos viejos (180 días de edad) recién resembrados. Se empleó la prueba
76
histoquímica de GUS como parámetro de transformación y ésta se realizó a los 12
días después de la transformación. Los primeros experimentos mostraron que los
callos de achiote fueron susceptibles a la transformación con el gen reportero uidA, vía
A. tumefaciens. Solamente dieron positivos para la prueba histoquímica de GUS los
callos transformados a los días 2, 5 y 1 O después de la resiembra. El mayor número
de áreas azules se obtuvieron en los días 2 y 5. Estos resultados mostraban que la
edad óptima para la transformación de los callos se daba en la fase exponencial de
crecimiento {días 2-5).
Con esta evidencia, se diseñó un nuevo experimento tomando un rango
mayor de días (entre O,:?. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 y 20). Para la tinción de los callos
se tomaron muestras por duplicado de cada experimento. La prueba histoquímica de
GUS fue positiva para los callos de 2, 7, 9, 10 y 20 días después de la resiembra,
aunque el número de puntos o áreas azules fue diferente. Los callos del día 7
presentaron el mayor número de puntos o áreas azules (Figura 15), seguido por los
callos del día 9, aunque el número de áreas siempre fue menor al encontrado en
hipocotilos transformados de la misma variedad. Por lo que la mejor edad para
transformar los callos de la variedad criolla es a los 7 días después de la resiembra,
ya que en dichos callos se presentaron el mayor número de puntos o áreas azules
(Cuadro 1 O). La diferencia entre los días óptimos de transformación de los dos
experimentos se debió a que los callos del primer experimento provenían de una
línea de callos muy vieja (1.5 años aproximadamente de resiembras) mientras que
los del segundo experimento tenían aproximadamente 180 días de generados.
Los resultados obtenidos en este experimento son similares a los obtenidos
en trigo (Triticum aestivum cv Bobwhite) por Cheng y colaboradores (1997), ya que
ellos transformaron callos de 14 días de edad y a los de Llamoca-Zárate y
colaboradores (2000) que tranformaron callos de Opuntia ficus-indica de 1 O días de
edad. También son parecidos a los resultados de Hanaka y colaboradores {1999), ya
que ellos al transformar callos de Coffea canephora, utilizaron callos subcutivados
frescos de 3 días de edad. Todos los callos transformados fueron colocados en
medio PC con 3 mg.L-1 de 6-BAP y 1 mg.L-1 de ANA y 100 mg.L-1 de cefotaxima y 7.5
77
mg.L-1 de kanamicina para su mantenimiento y proliferación. Estos callos
transformados no formaron brotes y presentaron una coloración café claro y en
algunos casos café oscura, además, presentaron baja friabilidad.
e
D
Figura 15. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la transformación de callos de achiote de la variedad criolla por medio de la prueba histoquímica de GUS.Callos de diferentes días de subcultivo fueron cocultivados con la cepa LBA4404 de A. tumefaciens conteniendo el plásmido pCAMBIA2301 de acuerdo a como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente los callos fueron sometidos a la prueba histoquímlca de GUS, desteñidos y fotografiados. A: callos sin transformar, B: callos de 2 días de subcultivo, C: callos de 7 días de subcultivo, D: callos de 9 días de subcultivo, E: callos de 10 días de subcultivo y F: callos de 20 días de subcultivo.
3.8. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la
transformación de callos de la variedad criolla obtenidos a partir de
brotes cultivados en medio PC con 1 mg.L-1 de BAP.
Debido a que los resultados obtenidos con los callos subcultivados después
de aproximadamente 6 meses no eran muy claros para seleccionar la edad óptima
para transformar y además de que éstos, una vez transformados no formaron brotes,
se optó por trabajar con una linea de callos obtenida de brotes cultivados en medio
78
PC con 1 mg.L·1 de 8AP, éstos callos eran más jóvenes que los de la línea anterior,
ya que se habían obtenido de brotes recién resembrados y además se formaron 1 O
días después de dicha resiembra . Por otra parte, una característica de estos callos
era su friabilidad y su apariencia, siendo ésta de una coloración brillante y de color
verde claro
(Fig. 16A), a diferencia de la otra línea, además de que se disgregaban con facilidad.
Los callos fueron transformados bajo las mismas condiciones, se determinó la
expresión del gen uidA por medio de la prueba histoquímica de GUS y los resultados
obtenidos mostraron un mayor número de puntos o áreas azules (Fig . 158-0).
.
Cuadro 10. Número de áreas o puntos azules de GUS en callos de la variedad criolla de B. ore/lana L. 12 días después de la transformación con la cepa LBA 4404: :pCAMBIA2301.
EDAD DE LOS CALLOS PRUEBA HISTOQUIMICA DE GUS
{días) Números de áreas o puntos azules/callo
2 2 ± 0.5
3 o 4 o 5 o 6 o 7 4
8 o 9 2 ± 0.7
10 1 ± 0.4
15 o 20 1 ±
. . Los valores son med1as de dos repet1c1ones.
Como puede observarse en la Figura 16, los callos del día 9 presentaron el
mayor número de áreas o puntos azules (Figuras 16E y F), seguidos por los de los
días 11 (Figura 16G y H), 19 (Figuras 16K y L), y 29 (Figuras 16Ñ y 0), mientras que
los del día 5 (Figuras 168, C y 0), presentaron el menor número de áreas o puntos
azules. Esto nos indicó que la edad óptima para la transformación se da en el día 9,
79
que aparentemente corresponde a la fase exponencial de crecimiento de los callos
(Cuadro 11 ). Al comparar este resultado con el del experimento anterior se nota una
diferencia de 2 días, pero siempre la edad óptima para la transformación de ambos
tipos de callos aparentemente corresponde a la fase exponencial de crecimiento.
80
A
L
o
Figura 16. Determinación de la fase de crecimiento óptima para la transformación de callos de achiote de la variedad criolla provenientes de brotes crecidos en medio PC con 1 mg.L"1 BAP,por medio de la prueba histoquímica de GUS. Callos de diferentes días de subcultivo fueron cocultivados con la cepa LBA4404 de A. tumefaciens conteniendo el plásmido pCAMBIA2301 de acuerdo a como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente los callos fueron sometidos a la prueba histoquímica de GUS, desteñidos y fotografiados. A: callos sin transformar, B, C y 0: callos de 5 días de subcultivo, E y F: callos de 9 días de subcultivo, G y H: callos de 11 días de subcultivo, 1 y J : callos de 15 días de subcultlvo, K y L: callos de 19 días de subcultivo, M y N: callos de 24 días de subcultivo, Ñ y 0: callos de 29 días de subcultivo
81
Cuadro 11. Número de áreas o puntos azules de GUS en callos de la variedad criolla de B. ore/lana L. provenientes de brotes cultivados en medio PC con 1 mg.L' 1 BAP, 12 días después de la transformación con la cepa LBA 4404: :pCAMBIA2301 .
EDAD DE LOS CALLOS PRUEBA HISTOQUIMICA DE GUS
(días) Números de áreas o puntos azules/cano'
o o 5 3 ± 0.7
9 15 ± 2.0
11 8 ± 0.9
19 8 ± 0.9
24 7 ± 1.0
29 8 ± 0.8
·Los valores son medias de 2 repeticiones.
3.8. Mantenimiento de los callos transformados con la cepa LBA4404 y
el plásmido pCAMBIA2301.
Una vez transformados, los callos se mantuvieron en medio PC suplementado
con 1 mg.L-1 de 6-BAP, 100 mg.L-1 de cefotaxima y 7.5 mg.L-1 de Kanamicina a 25°C
con luz contínua, para la formación de brotes. Los callos transformados se
resembraron cada 30 días en el mismo medio hasta la formación de brotes (3 meses),
para determinar mediante la prueba histoquímica de GUS si los brotes que se
formaron son positivos a GUS.
82
3.9. Selección de brotes transformados de la variedad criolla de 8.
ore/lana, por medio de la prueba histoquímica de GUS.
Después de tres meses de resiembra se obtuvieron algunos brotes a partir de
los callos jóvenes transformados con LBA4404 y el plásmido pCAMBIA2301 . Estos
brotes fueron resembrados en medio PC con 1 mg.L-1 de 6-BAP, 100 mg.L-1 y 7.5
mg.L-1 de kanamicina. Se les hizo la prueba histoquímica de GUS a los brotes
obtenidos (figura 17), los cuales presentaron muy pocas áreas azules y no se encontró
una hoja totalmente teñida de azul, esto podría deberse a que la transformación no fue
eficiente.
83
8
Figura 17. Tinción histoquímica de GUS de los brotes obtenidos de callos jóvenes de B. ore/lana de la variedad criolla, transformados con la cepa LBA4404 y el pCAMBIA2301 . Panel A: brotes de tres meses de edad, Paneles B, C y D: brotes positivos a GUS. La prueba se realizó a los 3 meses después de la transformación.
84
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90
CAPÍTULO 4
Agrobacterium-mediated transient transformation of annatto (Bixa
ore/lana L.) hypocotyls with the gus reporter gene.
J.M. Zaldívar-Cruz\ H. Ballina-Gómez2, C. Guerrero-Rodríguez, E. Avilés-
Berzunza & G.C. Godoy-Hernández*
Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas. Centro de
Investigación Científica de Yucatán , A.C. C.43 No. 130, Chuburná de Hidalgo
97200, Mérida, Yucatán , México. Fax: (999) 9-81-39-00; (*requests for
offprints. E-mail: [email protected])
This chapter was accepted for publication in Plant Gel/, Tissue and Organ Culture
(2003).
Key words: genetic transformation , p-glucuronidase, neomycin phosphotransferase 11 .
Abstract
Hypocotyls from annatto seedlings, were inoculated with Agrobacterium tumefaciens
harboring a binary vector, pBI.121 or pCAMBIA2301 , containing the p-glucuronidase
(gus) gene. Histochemical GUS assay of infected hypocotyls from two annatto varieties
showed transient gus gene expression between 3 and 12 days after inoculation .
Abbreviations: PC-L2 medium- Phillips and Collins (1979); GUS- P- glucuronidase;
BAP - 6-benzyl-aminopurine; G Medium - germination medium; 1 Medium - infection
medium; CC Medium - co-cultivation medium; SF Medium - shoot formation medium
91
lntroduction
Bixa ore/lana L. is an evergreen small tree , native to tropical America and
widely distributed throughout the tropics (Srivastava et al., 1999). lts seeds contain
large amounts of bixin , an apocarotenoid used as a colorant for foods , cosmetics ,
medicinal products and textiles. Genetic improvement of B. ore/lana by conventional
breeding is difficult because it is restricted by a long reproductive cycle and the limited
genetic variability within the available germplasm (Aparnathi et al., 1990). An alternative
to overcome these limitations is the introduction of new traits by Agrobacterium
mediated genetic transformation, which is the most commonly used method for
transferring genes into plants cells (Gelvin , 2000). Protocols for in vitro propagation of
Bixa ore/lana L. have been developed from shoot apex and nodal explants (D'Souza
and Sharon, 2001) and from seed callus {Sha, et al., 2002). We are reporting the
transient gus gene expression in two annatto varieties via Agrobacterium tumefaciens .
To our knowledge, this is the first report of annatto susceptibility to A. tumefaciens
mediated genetic transformation .
Materials and methods
Seeds of annatto (Bixa ore/lana L.) from Criolla and Peruana varieties were
supplied by local farmers from Yucatán, México. The main morphological difference
between these cultivars is in the fruits , which are pods with two valves ; pods from
Criolla present a lanceolated shape, whereas those of Peruana have a spherical
shape. Bixin contents in seeds ranks between 0.8-.1 .2 and 1.8-2.5% for Criolla and
Peruana respectively (G. Godoy-Hernández, personal communication).
Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404, was used in all experiments.
Binary vectors were pBI.121 (Ciontech Laboratories lnc.) and pCAMBIA2301 (Center
for the Application of Molecular Biology to lnternational Agriculture). Both plasmids
contain the ~-glucuronidase and neomycin phosphotransferase 11 genes within the T
DNA borders. However, in pBI.1 21 the ~-glucuronidase gene is uninterrupted, whereas
92
in pCAMBIA2301 it is interrupted by an intron sequence of catalase gene of castor
bean in its T-ONA region . This intron has to be removed for eukaryotic expression .
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 was cultured in YEB medium (Sambrook
et al., 1989) containing 100 mg 1"1 rifampicin (Sigma, S t. Louis, M o.) and 100 mg 1"1
streptomycin (sulfate salt; Sigma, St. Louis, Mo.) (Eady et al. , 2000). Bacteria were
made competents with CaCI 2 and plasmids were introduced with a heat shock
treatment (Zhang and Zeevaart, 1999). Transformants harboring pCAMBIA2301 or
pBI.121 were screened on solid YEB medium containing 100 mg 1·1 rifampicin , 100 mg
1"1 streptomycin and 50 mg 1"1 kanamycin (sulfate salt; Sigma, St. Louis , Mo.)
(Sambrook et al, 1989).
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 containing pCAMBIA2301 or pBI.121
were cultured in 50 mi Erlenmeyer flasks containing 10 mi of YEB medium (pH 5.6)
with antibiotics at 28°C on a shaker adjusted to 200 rpm and then collected by
centrifugation . The pellet was resuspended in a YEB medium containing 200 ¡..tM of
acetosyringone and antibiotics.
Seeds from both varieties were soaked 5 min in 70% ethanol , followed by
subsequent washes in sodium hypochlorite 4.5% (7 min) and 3% (18 min) and sterile
distilled water. Seeds were imbibed for 3 days in sterile distilled water before being
plated on G medium (PC-L2 half ionic strength medium and without growth regulators)
and incubated at 25 ± 2oc under continuous light (photon flux density of 40-60 O mol m· 2 s·1) provided by 39 W fluorescent lamps (Philips USA).
For the transformation experiments , hypocotyls were taken from 6 week old
seedlings and were wounded by making cuts longitudinal but they were superficials
with a scalpel on a Petri dish into 1 cm cylinder long. Hypocotyl segments were
infected for 30 min by immersion in 20 mi of 1 Medium (PC-L2 liquid medium with a
bacteria! concentration adjusted to 0.1 00600 nm ). To eliminate the excess of bacteria,
tissues were blotted on sterilized filter paper and placed on CC medium (PC-L2
medium solidified with 8.0 g 1"1 agar, 1 mg 1"1 BAP). After 3 days cocultivation at 28oC in
the dark, hypocotyls from Peruana variety were transferred to SF Medium [PC-L2
medium supplemented with 1 mg 1·1 BAP, 250 mg 1"1 cefotaxime (sodium salt ; Sigma,
93
St. Louis , Mo.) and 2.5 mg r1 kanamycin] whereas hypocotyls from Criolla variety were
transferred to SF Medium supplemented with 1 mi r1 BAP, 100 mg r1 cefotaxime and
7.5 mg 1-1 kanamycin . The cultures were maintained at 25 ± 2°C under continuous light
(photon flux density of 40-60 O mol m·2 s·1, provided by 39 W fluorescent lamps (Philips
USA).
Results
Transient expression of GUS was histochemically assayed from 3 to 12 days
after infection by staining the hypocotyls with X-GLUC, according to Jefferson (1987).
Briefly, approximately 24 hypocotyls were vacuum-infiltrated in the buffer solution for 5
min and thereafter incubated at 3JOC in darkness for 24 hours (Humara et al, 1999).
Prior to counting the number of blue spots the explants were washed in methanol:
acetone (3: 1, v/v) . Each blue spot was considered as one transient GUS-expressing
focus.
Hypocotyls from both varieties showed severa! blue spots caused by the
transient GUS expression 3 and 12 days after inoculation (Figure 48, C and D). By
contrast, untransformed controls did not show any blue staining (Figure 4A and 4E). In
hypocotyls from both cultivars, the LBA4404::pCAMBIA2301 vector resulted in a low
GUS expression, as it was required the use of dissecting microscope in order to asses
foci counts. In hypocotyls transformed with LBA4404:: p81.121 blue staining was
clearly visible by naked eye.
94
pB1.121 pCAMBIA 2301
3 days 12 days 3 days
Peruana
Criolla
Figure 4.1. Histochemical GUS assays during the transformation of two varieties of Bixa ore/lana L.: Peruana {A-0) and Criolla (E-H). Hypocotyls were transformad with either pBI.121 or pCAMBIA 2301 vía Agrobacterium tumefaciens {strain LBA4404). A and E: negative controls.
95
Table 4.1. lnfection frequency and number of GUS spots of two varieties at 12 days after
inoculation with straln LBA 4404::pCAMBIA2301.
Varieties
Peruana
Criolla
Number of
infectad
hypocotyls
160
160
Number of GUS lnfection frequency (%)
positive hypocotyls
80 50
160 100
Mean ± SE
Number of GUS
spots/hypocotyl
0.75 ± 0.36
8.88 ± 1.23
lnfection frequency (%) = Number of GUS-positive explants/number of explants infectad.
Data are presented as mean ± SE number of at least 2 different experiments.
The high GUS activity in explants transformed with LBA4404::p81.121, could
be only attributed to the expression of the residual bacteria, attached to the explants.
On the other hand, GUS activity in tissues exposed to LBA4404::pCAMBIA2301 can
be attributed to the actual expression of the gus gene inserted into the plant genome,
since it required the removal of the catalase intron, which interrupts the gus gene
sequence. As a distinction from other species, such as Ricinus communis (Rezmer et
al, 1999), annatto did not present endogenous GUS activity.
Based in these results, we decided to evaluate the infection frequency and
number of GUS expression spots only in explants transformed with pCAMBIA2301 .
The blue spots on the explants were counted at 12 days after transformation for both
varieties . The infection frequency was generally higher after 12 rather than after 3
days. Criolla variety was more susceptible than Peruana {Table 4.1) as the number of
blue spots recorded was higher.
96
Conclusion
In conclusion , the use of gus reporter gene containing the catalase intron
(pCAMBIA2301) successfully eliminated the background GUS activity produced by
bacteria! sources (LBA4404 with pBI.121) and demonstrated for the first time that the
transfer of T-ONA via Agrobacterium tumefaciens and expression of gus reporter gene
on hypocotyls from two varieties of B. ore/lana is possible .
Acknowledgements
This work was supported by the Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACYT) from México. Grant No. 28643-B and scholarships for J.M. Zaldívar-Cruz
(#66872, CONACYT), C. Guerrero-Rodríguez and H. Ballina-Gómez.
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98
CAPITULO 5
CONCLUSIONES GENERALES
En este trabajo, se planteó la obtención de plantas transformadas con el gen
uidA vía A. tumefaciens a partir de hipocotilos de dos variedades de achiote y/o callos
de la variedad criolla (8. ore/lana L.) .
Con base en los resultados obtenidos en los diferentes experimentos
realizados se puede concluir que:
1. Los callos de la variedad criolla son susceptibles a la kanamicina en
concentraciones por arriba de 1 O mg.L-1 y los de la variedad trilobulada a
concentraciones de 5.0 mg.L-1•
2. El mejor balance de auxina/citocinina para la formación de brotes a partir
de callos es de O mg.L-1 de ANA y 1.25-1 .5 mg.L"1 de 6-BAP para ambas variedades
de callos .
3. Los hipocotilos de las variedades criolla y trilobulada de Bixa ore/lana L.
así como los callos de la variedad criolla pueden transformarse de manera transitoria
con el gen uidA. La expresión transitoria del gen uidA en la transformación de
hipocotilos y callos de B. ore/lana, nos da un indicativo de que la especie es
susceptible de ser transformada por medio de Agrobacterium tumefaciens
(Nakamura, et al., 1998).
4. El número de áreas azules en los hipocotilos es mayor que el número de
áreas azules obtenido en los callos, esto podría deberse a que las condiciones de
transformación para los hipocotilos no necesariamente son funcionales para los
callos , o que un tejido es más "transformable" que el otro.
4. La mejor edad para transformar los callos de la variedad criolla es a los 7
días después de la resiembra , si se trata de callos provenientes de resiembras de
aproxidamente 180 días de edad , mientras que si trata de callos provenientes de
brotes resembrados en medio PC con 1 mg.L"1 de 6-BAP, éstos deben de
transformarse a los 9 días de su aparición .
99
5. Se han obtenido brotes después de aproximadamente tres meses de la
transformación de hipocotilos de ambas variedades, así como de callos jóvenes
(aproximadamente 6 meses ) de la variedad criolla . Algunos de los brotes presentan
pequeñas áreas o zonas azules después de haberles realizado la prueba
histoquímica de GUS.
100
CAPÍTULO 6
PERSPECTIVAS
Mediante la transformación por Agrobacterium pueden transferirse segmentos
largos de ADN y rendir bajo número de copias y por lo tanto el porcentaje de
transformación de muchas plantas es bajo (Srivatanakul , et al., 2001 ). Además , este
método de transformación está influenciado por un número de factores que incluyen la
especie bacteriana, la temperatura, la herida en los explantes, los fenoles, los genes
de virulencia y la división de la célula hospedera (Niu , et al. , 2000; Humara et al.,
1999). Por lo que se hace necesario realizar más experimentos donde se prueben
algunos factores adicionales con el fin de mejorar la expresión del gen reportero y una
mayor posibilidad de regenerar brotes completamente transformados de las áreas
puntuales transformadas (Baron, et al., 2001 ; Dillen , et al., 1997;Fullner y Nester,
1996).
De ta l manera que podría probarse el pre-acondicionamiento de los explantes
antes de la transformación en medio PC suplementado con BAP (medio de cocultivo)
a 28°C, ya que reportes previos han mostrado que el pre-acondicionamiento mejora la
eficiencia de tranformación (Toldi et al., 2002). Además , para eliminar el crecimiento
de brotes no transformados , sería adecuado probar recibirlos en medio PC para
inducción de brotes suplementado con una concentración elevada de kanamicina ,
tanto en medio líquido y en medio sólido, ya que los trabajos de Alsheiskh y
colaboradores (2002) muestran que esta metodología resulta eficaz para eliminar los
falsos positivos y probar el empleo de otra cepa de A. tumefaciens, como la cepa
EHA 105 (Aoki et al., 2002). Otro factor a probar es el empleo de Tween20 en el medio
de inoculación, ya que se ha observado que concentraciones entre 0.1-1 .0 mejoran la
expresión del gen uidA (Susuki y Nakano, 2002) .
Dado que los brotes tanto de hipocotilos como de callos se obtienen
aproximadamente después de tres meses, podría probarse el efecto que tiene en la
regeneración el N-fenii-N '-1 ,2,3-tidiazol-5-ilurea (TDZ), ya que se ha demostrado que
101
este compuesto que posee actividad tipo citocinina (Huetteman y Preece, 1993)
facilita la micropropagación eficiente de muchas especies recalcitrantes (Murthy et al.,
1998),. En nuestro grupo este compuesto ha sido probado en 3 variedades de achiote
y ha dado excelentes resultados en la formación de brotes tanto en hipocotilos como
en raíces (Datos no mostrados).
Con lo anterior se podría tener un sistema de transformación estable con el
gen uidA vía hipocotilos y/o callos, y obtener primeramente brotes potencialmente
transformados , verificando la presencia del gen en los brotes que dieron positivos a la
prueba histoquímica de GUS por medio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(RCP) y por medio de la hibridación Tipo Southern para determinar el número de
copias que están presentes en el genoma de la planta. Luego sería mantener y
propagar los brotes transformados y por último enraizar los brotes y ponerlos en
invernadero.
Una vez establecido el protocolo de transformación estable, podría utilizarse
para introducir genes de interés, con el fin de obtener plantas transformadas con altos
contenidos de bixina mediante la sobreexpresión de genes involucrados en la
biosíntesis de este apocarotenoide (dxs , psy, etc.) (Jako y colaboradores, 2002) o
conferirle resistencia al ataque de hongos (como Oidium bixae) mediante la expresión
de genes como los que codifican quitinasas (Chen y Punja, 2002).
102
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