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DISPERSIONES MULTIFÁSICAS EN FERMENTADORES: ENTENDIENDO

FENÓMENOS QUE OCURREN EN TRES DIMENSIONES Y A ALTA VELOCIDAD

ESPECIALIDAD: Ingeniería Química

Dr. Enrique Galindo Fentanes Doctor en Biotecnología, Especialidad en Ingeniería de Bioprocesos

Fecha de ingreso: 20 de Septiembre de 2007

M E X I C O

Especialidad: Ingeniería Química 2

Dispersiones multifásicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimensiones y a alta velocidad

CONTENIDO Página 1. Resumen Ejecutivo 3 2. Introducción 5 3. Desarrollo del Tema 7 3.1 Dispersiones multifásicas 7 3.2 Caracterización de las dispersiones 7 3.2.1 Caracterización de dispersiones por análisis de imágenes 8 3.2.2 Uso de cámaras de alta velocidad 8 3.3 Desarrollos previos en nuestro laboratorio 9 3.4 Desarrollos recientes de nuestro laboratorio 9 3.4.1 Técnica estereoscópica 10 3.4.2 Videoendoscopía de alta velocidad 10 3.5 Metodologías utilizadas 11 3.5.1 Configuración general del sistema 11 3.5.2 Adquisición microestereoscópica de imágenes y su análisis tridimensional 12 3.5.3 Video de alta velocidad 13 3.5.4 Videoendoscopía de alta velocidad 13 3.5.5 Modelos de estudio 16 3.5.5.1 El hongo Trichoderma harzianum 16 3.5.5.2 El nemátodo Steinernema carpocapsae 16 3.6 Resultados 17 3.6.1 Imágenes en dos dimensiones 17 3.6.2 Imágenes en tres dimensiones 17 3.6.3 Videos de alta velocidad 21 3.6.4. Determinación de la velocidad de objetos 21 3.7 Aportaciones 25 4. Conclusiones 27 5. Referencias 28 6. Agradecimientos 32 7. Anexos 33 7.1 Técnica estereoscópica 33 7.2 Condiciones de operación de los sistemas 37 8. Breve Curriculum vitae 38



1. RESUMEN EJECUTIVO En numerosos procesos de las industrias química y bioquímica es necesario dispersar diferentes fases (líquidas, gaseosas, sólidas) para homogenizar el contenido del reactor, maximizar la transferencia de nutrientes (incluyendo el oxígeno) y satisfacer las principales necesidades de los procesos. La dispersión es particularmente crítica en fermentaciones, donde pueden estar involucradas hasta cuatro fases (líquidos inmiscibles, aire, biomasa). El proceso de dispersión se lleva a cabo mediante la introducción de energía (por agitación, bombeo o burbujeo) dentro del biorreactor, para romper y mantener suspendidas las burbujas de gas o las gotas de la fase líquida dispersa. Es también relevante mantener suspendidas y homogenizar los sólidos cuando están presentes. La caracterización de este tipo de dispersiones se ha realizado por diversas técnicas, destacando las de análisis de imágenes, a fin de conocer parámetros como el tamaño de los objetos (gotas y burbujas) y poder correlacionarlos con la transferencia de masa. La mayoría de los sistemas de análisis de imágenes utilizan cámaras convencionales de video (60 cuadros por segundo) acopladas a una fuente de luz estroboscópica, que permite “congelar” el movimiento de los objetos en el campo visual. Las imágenes adquiridas de esta forma permiten caracterizar las dispersiones de manera bidimensional y obtener una aproximación de lo que sucede dentro del biorreactor. Sin embargo, los fenómenos suceden en tres dimensiones y de forma dinámica y este tipo de caracterización no permite identificar posibles traslapes entre los distintos planos focales y por lo tanto, establecer la posición espacial de las gotas y burbujas. En este trabajo se presentan los principales aportes en la caracterización de las dispersiones multifásicas que ocurren en fermentadores, en la forma que suceden: en tercera dimensión y a alta velocidad. Para ello fue necesario desarrollar en primer término, un sistema basado en dos cámaras de video acopladas a un estereomicroscopio, con el que fue posible adquirir pares estereoscópicos de imágenes de la misma escena que permiten la visualización de los fenómenos en tres dimensiones y sobre todo, el establecimiento de las coordenadas tridimensionales de los objetos (burbujas y gotas), con lo cual es posible establecer la posición espacial de los objetos. Por otro lado, se desarrolló un sistema basado en una cámara de video de alta velocidad (de 5,130 cuadros por segundo, 520 x 512 pixeles), acoplada a una sonda de luz de alta intensidad. Estas técnicas se han utilizado para caracterizar la dispersión de sistemas modelo que simulan el proceso de fermentación para la producción de aromas frutales por el hongo filamentoso (Trichoderma harzianum), el cual utiliza aceite de ricino como fuente de carbono. Por otro lado, se han aplicado también estas técnicas para caracterizar un sistema modelo de fermentación para la producción de nemátodos (Steinernema carpocapsae), los cuales se utilizan como agentes de control biológico de plagas en la agricultura. El sistema en tres dimensiones ha permitido discernir, de manera inequívoca, la inclusión de burbujas en gotas de aceite y se demostró que el sistema en dos dimensiones sobreestima la cantidad de elementos incluidos en la fase orgánica. La presencia de la fase sólida (ya sea el hongo o el nemátodo)



incrementa la inclusión de burbujas dentro de gotas de aceite, llegando a ser de hasta 30 % del total de las burbujas presentes en el sistema. El uso de la cámara de alta velocidad ha permitido identificar algunos de los eventos que forman las estructuras multifásicas y ha permitido a su vez, la medición experimental de la velocidad de desplazamiento dentro del tanque de los elementos de la dispersión. El conocimiento generado con estas metodologías es de relevancia para el campo de la ingeniería química, ya que por primera vez ha sido posible establecer de forma detallada y con datos experimentales las características, a nivel microscópico, que determinan el transporte de nutrientes en los procesos de fermentación y, con ello, las bases para proponer mejores modelos de transferencia de nutrientes que permitan un más eficiente diseño de los biorreactores y la optimización de estos procesos. Palabras clave: dispersión, multifases, fermentación, imágenes, estereoscopía, hongos, nemátodos



2. INTRODUCCIÓN En numerosos procesos de la industria química y bioquímica es necesario dispersar varias fases. En el caso particular de la industria que usa procesos de fermentación para producir una amplia gama de productos (antibióticos, ácidos orgánicos, vitaminas, proteínas, biofármacos, etc.) es necesario dispersar –en agua- aceites o solventes orgánicos, aire y la biomasa. La mayor parte de los procesos de fermentación que se utilizan para producir metabolitos de alto valor agregado, requieren de oxígeno, un gas de muy baja solubilidad en agua, que es el medio universal en donde se desarrollan las actividades biológicas. En consecuencia, para proveer de oxígeno a las células que se están cultivando, es necesario transferirlo continuamente a la fase acuosa. Esto se logra burbujeando y dispersando el gas que se introduce al biorreactor. Hay otros casos en los que existe una segunda fase líquida que también es necesario dispersar, como en el caso de los aceites vegetales que se utilizan como nutriente de las células o cuando se usan solventes para extraer compuestos tóxicos para ellas. Es también relevante el caso cuando existe una fase sólida que debe ser dispersada en el proceso. Entre los ejemplos de fases sólidas hidrodinámicamente importantes se incluyen a la biomasa de hongos filamentosos, de células animales o vegetales y organismos tales como los nemátodos, los cuales también se producen por procesos de fermentación. La productividad del proceso de fermentación depende en buena medida de la eficiencia con la que se dispersen las fases. Para los casos del oxígeno y de sustratos líquidos inmiscibles en agua, la dispersión determina (en función del tamaño de las burbujas de gas y gotas de la fase líquida dispersa) la eficiencia de los procesos de transferencia de masa. Mientras más pequeñas sean las burbujas y las gotas, mayor será el área disponible para la transferencia. La dispersión es también fundamental para garantizar homogenidad en las condiciones fisicoquímicas (que a su vez determinan la cantidad y tipo de metabolitos que se producen). Sin embargo, el proceso de dispersión puede ocasionar daño a la biomasa y la energía suministrada al reactor debe mantenerse por debajo de ciertos límites críticos. En consecuencia, es necesario lograr un compromiso entre la dispersión de las fases y la fragilidad de las células u organismos en el biorreactor. La dispersión se lleva a cabo en biorreactores de diferentes tipos, siendo el tanque agitado el más usado en la industria biotecnológica. Las interacciones entre un líquido (el medio acuoso) y otro líquido inmiscible (la fase orgánica), un sólido (la biomasa) y el gas (aire) presentes en ciertos procesos de fermentación, son particularmente complejas. Gran parte de los estudios encaminados a lograr un mejor entendimiento de estos fenómenos y sus implicaciones en la fisiología y la productividad de los procesos se han enfocado desde un punto de vista macroscópico. Es decir, se ha estudiado el efecto de las variables de proceso (agitación, pH, temperatura, tensión superficial, etc.) sobre la productividad de los cultivos. Sin embargo, estos estudios tienen la desventaja de ser sistema-específicos, lo que ha impedido



que puedan aspirar a tener una aplicación más generalizada, ya que no están basados en conceptos y características fundamentales de los procesos de transferencia de masa. Las técnicas modernas de análisis digital de imágenes han permitido el estudio de los fenómenos de dispersión y mezclado en sistemas multifásicos. Esto ha abierto una vía importante en el estudio de los mecanismos de transporte de nutrientes en sistemas de fermentación complejos. Sin embargo, la mayoría de los trabajos hasta ahora disponibles en la literatura, se han limitado a sistemas de dos fases (líquido-líquido o líquido-gas) que no son representativos de la complejidad real en sistemas de fermentación. Además, estos sistemas han sido caracterizados mediante análisis de imágenes bidimensional y de “foto fija”. Para resolver estas limitaciones, el trabajo aquí expuesto ha utilizado técnicas de estereoscopía, videoendoscopía y video digital de alta velocidad para el estudio, in situ, de lo que ocurre a nivel microscópico y en tres dimensiones en un biorreactor con un caldo de fermentación de alta complejidad (de hasta 4 fases) y la caracterización de los procesos de interacción entre las fases, que suceden a alta velocidad.



3. DESARROLLO DEL TEMA 3.1 Dispersiones multifásicas Varios de los procesos de las industrias química, de alimentos, farmacéutica, de papel, de plástico, petroquímica y minera, son dispersiones multifásicas donde se utiliza la operación de mezclado para la dispersión y homogenización de las fases (Leng, 2004). También es el caso de las fermentaciones para la producción de enzimas y antibióticos (Pazouki, 2000) y en los procesos oxidativos y de flotación en el tratamiento de aguas residuales (Nienow, 1986), entre otros. En algunos de estos procesos, es necesario dispersar un gas (generalmente aire) en un líquido, con el fin de transferir oxígeno al sistema biológico en cultivo. En otros, se involucra la presencia de una segunda fase líquida, por lo general inmiscible (Malinowski, 2001), que puede ser la fuente de carbono, así como un solvente utilizado como agente para mejorar la transferencia de oxígeno o como agente extrayente de metabolitos tóxicos para el microorganismo (Serrano-Carreón, 2002). Si se trata de fermentaciones en las que estén involucrados hongos filamentosos (Pazouki, 2000), el sistema incluye una tercera fase (sólida) que resulta hidrodinámicamente importante considerando el tamaño de partícula y su morfología (Rocha-Valadez, 2005). Esto también es relevante cuando lo que se está cultivando en el biorreactor son células animales o vegetales (Wang, 2005; Ramachandra, 2002) u organismos completos como nemátodos (Ehlers, 2001). 3.2 Caracterización de las dispersiones Las dispersiones multifásicas están determinadas por la potencia volumétrica (Pg/V) (Zhou, 1998b), por las propiedades físicas de las fases (Zhou, 1998a; Tsouris, 1996), por la presencia de agentes surfactantes (Kawase, 1990) o de partículas sólidas (Kawase, 1997; Ozkan, 2000), además de la velocidad de agitación y de la geometría del agitador o impulsor. Una forma de caracterizar estas dispersiones es por muestreo (Córdova-Aguilar, 2003); sin embargo, este enfoque macroscópico, no reporta información sobre el área de transferencia de masa. Otra forma es medir el tamaño de las gotas y de las burbujas (Dalmau, 1998). Entre las técnicas para determinar el diámetro de las gotas o burbujas se encuentran: a) la medición de la transmisión de luz a través de una interfase (gas-líquido o líquido-líquido) (Rebelein, 1986); b) a través de una sonda capilar de boro (Bae, 1989); c) midiendo la diferencia de la velocidad de transmisión de una onda acústica en dos líquidos (Boyd, 1998); d) con un contador Coulter y la adición de materiales conductivos (Bae, 1989) y e) por fotografía directa (Chen, 1967; Coulaloglou, 1976). Algunos de estos métodos son técnicas basadas en la toma de muestra, por lo que perturban el flujo y rompen el equilibrio de rompimiento y coalescencia o modifican la distribución de tamaños de gotas o burbujas. En su mayoría, son técnicas que se han utilizado sólo en sistemas de dos fases (gas-líquido, líquido-líquido).



3.2.1 Caracterización de dispersiones por análisis de imágenes El análisis de imágenes es otra forma de estudiar la estructura de estas dispersiones (gas-líquido y líquido-líquido) a mayor detalle (Pacek, 1994; Galindo, 2000), con lo cual ha sido posible tener información - en línea- de la distribución de tamaños de gotas y/o burbujas, sin interferir con los patrones de flujo de la dispersión, además de poder relacionar esta información con el área de transferencia de masa. El análisis cuantitativo de las imágenes se inició con mediciones manuales de los objetos (Chen, 1967) que luego se sistematizaron con el uso de los sistemas de cómputo. Para que una imagen pueda ser procesada por la computadora, necesita ser digitalizada, es decir, convertida en una forma numérica (Junker, 2006). Esto permitió utilizar fotografías tomadas en la pared del tanque (Chen, 1967), dimensionar manualmente las gotas o burbujas a partir de estas fotografías y hacer la caracterización de las dispersiones. Sin embargo, el análisis de dispersiones por medio de estas fotografías es un método tedioso, que requiere de mucho trabajo manual. Debido a lo anterior, se han implementado procedimientos digitales para obtener las imágenes, facilitando así la cuantificación de las gotas (Pacek, 1994) y burbujas (Machon, 1997) así como su caracterización en cuanto a tamaño y distribución. A partir de mediciones del diámetro de gotas o burbujas del sistema (tamaño) y considerando el número de objetos que forman el conjunto de datos, se obtiene un valor promedio que se define como diámetro Sauter, de acuerdo a la siguiente fórmula:

Este valor relaciona el área interfacial (a) por unidad de volumen y el área para la transferencia de masa, la cual esta dada por:

donde h= fracción retenida del gas. 3.2.2 Uso de cámaras de alta velocidad El desarrollo de técnicas de iluminación avanzadas y de cámaras de video de alta velocidad ha permitido la determinación de tamaños de partículas en dispersiones multifásicas a mayores profundidades de campo (Tayali, 1990). Uno de los sistemas más utilizados es la velocimetría (PIV) con luz láser, para el análisis de dispersiones gas-líquido en tanques agitados (Laakkonen, 2005), así como para evaluar los patrones de flujo existentes en tanques agitados (Escudié, 2003). Se han utilizado cámaras de video de alta velocidad, que permiten obtener imágenes para la medición en dispersiones líquido-líquido, cuando la fase dispersa está en altas concentraciones, tal como reportan Lovick (2005), quienes utilizaron una cámara de video de alta velocidad acoplada a un endoscopio, para la medición de una dispersión líquido-líquido.

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n dd

n d=

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= ∑∑



3.3 Desarrollos previos en nuestro laboratorio Galindo (2000) tomaron como base el sistema reportado por Pacek (1994) para desarrollar una metodología con el fin de caracterizar dispersiones de hasta cuatro fases, utilizando sistemas modelo que simulan el cultivo del hongo Trichoderma harzianum en aceite de ricino. La metodología (Pacek, 1994) para cuantificar gotas constaba de una cámara de video acoplada a un estereomicroscopio y que envía su señal a una videograbadora. Las imágenes grabadas se desplegaban en una computadora donde se medían las gotas manualmente. Posteriormente Machon (1997) utilizaron esta metodología para cuantificar los tamaños de burbujas como función de la tensión superficial. Dalmau (1998), con un sistema similar midieron los tamaños de gotas en un sistema modelo de tres fases (medio acuoso, aceite y aire) para la producción de una lipasa. Sin embargo, Galindo (2000) fueron quienes demostraron por primera vez la factibilidad de la técnica de análisis de imágenes para la caracterización de dispersiones de hasta cuatro fases. La metodología desarrollada permitió la adquisición de las imágenes en línea, sin necesidad de tomar muestras. El procesamiento de las imágenes es completamente digital a través de una cámara conectada a una tarjeta que captura las señales de video y las transfiere a la computadora, sin requerir un sistema de videograbación (Galindo, 2005). Con este sistema fue posible realizar un análisis cuantitativo más detallado de la dispersión, además de evaluar la estructura de la misma y observar las interacciones aceite-micelio-aire y aceite (Galindo, 2005). También se han estudiado algunos de los factores que afectan la dispersión de las fases en estos sistemas modelo, tales como el contenido de aceite, la concentración y morfología de la biomasa y la presencia de proteínas (Larralde, 2002; Lucatero, 2003; Pulido-Mayoral, 2004; Galindo, 2005). 3.4 Desarrollos recientes de nuestro laboratorio Todos los trabajos anteriores se desarrollaron utilizando imágenes, que son proyecciones bidimensionales del fenómeno que ocurre dentro del biorreactor. Por otra parte, los trabajos previos involucraron una cámara convencional de video, en donde las imágenes de lo que sucede en el interior del tanque se tomaron mediante el uso de una fuente de luz estroboscópica para “congelar” el movimiento de los objetos. En este trabajo se describe el desarrollo y aplicación de técnicas más sofisticadas que han permitido una caracterización muy detallada de los fenómenos en tercera dimensión y a alta velocidad. Estas técnicas, que se describen a continuación, son la estereoscopía y la videoendoscopía de alta velocidad. Uno de los principales problemas que presenta el monitoreo en línea computarizado de las dispersiones que ocurren dentro del cultivo de un sistema biológico en un fermentador con agitación mecánica, es la dificultad en la adquisición de imágenes de alta calidad de los eventos microscópicos que ocurren a altas velocidades en el interior del tanque. El problema es aún más complejo cuando se requieren analizar zonas más profundas del biorreactor (como por ejemplo las zonas más cercanas a los impulsores), ya que las condiciones de iluminación y de velocidad son aún más críticas. Más aún, los fenómenos dinámicos que ocurren en el interior del tanque generan estructuras complejas, como por ejemplo gotas de la fase aceitosa conteniendo en su interior fracciones de otras fases (como agua y aire), las cuales son imposibles de caracterizar con precisión con métodos tradicionales de análisis de imágenes en dos dimensiones.



En base a estos requerimientos, se diseñó un sistema de análisis de imágenes, que permite la caracterización cuantitativa de las dispersiones que ocurren dentro de un fermentador modelo, tanto en dos como en tres dimensiones. No existe reportado en la literatura ningún método similar que permita el análisis microscópico en tres dimensiones de las estructuras (a nivel individual) que conforman la dispersión multifásica, ni tampoco se ha reportado la posibilidad de analizar la formación de estructuras complejas que se producen con la interacción dinámica de las diferentes fases que conforman el cultivo. 3.4.1 Técnica estereoscópica La técnica de estereoscopía está fundamentada en el principio de los ojos humanos, en el que cada ojo, al observar un objeto, tiene un campo de visión diferente, ya que éstos se encuentran colocados a un determinado ángulo de separación. El cerebro por su parte, interpreta ambas imágenes superponiéndolas en la parte frontal, dando lugar a un campo visual binocular en el que se observa el efecto de profundidad a la que está colocado el objeto. Por lo tanto, cuando los ojos se fijan en un punto específico, existe un desfasamiento de los objetos observados en las dos imágenes. Este desfasamiento es resuelto por el cerebro por triangulación, determinando así la profundidad relativa de los objetos y reconstruyendo la escena en forma tridimensional. Si existen varios objetos en la escena, uno de ellos servirá como referencia y los otros objetos aparecerán desfasados horizontalmente en la imagen compuesta, con lo cual se podrá calcular la distancia de desfasamiento o profundidad y con ello, determinar la posición de estos objetos con respecto al de referencia (Umbaugh, 1997). Tomando como base este fundamento, se diseñó un sistema de adquisición de imágenes acoplando dos cámaras de video a los oculares de un estereomicroscopio con una apertura angular que brinda el efecto estereoscópico. Se utilizó una tarjeta de adquisición, la cual se sincronizó con la señal de disparo (de las cámaras y de la fuente de luz estroboscópica), con lo que se obtuvieron pares de imágenes simultáneas de una sóla escena. En el presente trabajo, se utilizó este sistema estereoscópico para la adquisición de imágenes y el cálculo de la posición espacial de las estructuras presentes en un sistema modelo de fermentación tetrafásica (medio salino, aceite, aire y biomasa). Hasta donde se tiene conocimiento, esta es la primera vez en la que una técnica estereoscópica ha sido utilizada para la caracterización de dispersiones multifásicas y en nuestro caso, en un tanque agitado. 3.4.2 Videoendoscopía de alta velocidad La adquisición de imágenes de objetos en movimiento ocasiona distintos problemas, el principal como consecuencia de la velocidad de los objetos en relación con la velocidad de la cámara. Cuando los objetos a analizar se mueven a una velocidad mayor a la del barrido de la cámara, resultan imágenes movidas o difusas (Taboada, 2003; Tayali, 1990). En este trabajo, usando una cámara de video de alta velocidad, capaz de grabar a velocidades mayores a 5130 imágenes de 512 x 512 pixeles por segundo, la cual utiliza una fuente de luz directa de alta intensidad, fue posible adquirir fotografías



nítidas de objetos que se mueven a altas velocidades dentro del tanque. No hay antecedentes en la literatura respecto a utilizar este tipo de sistemas para la caracterización de sistemas multifásicos de alta complejidad, como los que suceden en algunos procesos de fermentación. 3.5 Metodologías utilizadas 3.5.1 Configuración general del sistema La figura 1 muestra la configuración del sistema de análisis de imágenes que permite la caracterización en zonas cercanas a la pared del tanque tanto en dos como en tres dimensiones. El sistema consta principalmente de un tanque de vidrio de 7 litros, montado en un soporte, alineado axialmente con una turbina de mezclado que administra potencia al sistema. De manera externa, se montó un soporte que sostiene a un estereoscopio. El sistema incluye una fuente de iluminación estroboscópica la cual fue sincronizada a una o dos cámaras de TV a través de un dispositivo electrónico construido en nuestro laboratorio. De esta manera, las partículas que se mueven a alta velocidad en el tanque de mezclado son captadas únicamente durante el centelleo de la luz estroboscópica (10 microsegundos), lo que permite obtener imágenes ‘no movidas’ de alta calidad de los eventos que ocurren en el interior del tanque. Esta luz es transmitida al interior del tanque por medio de una guía de luz de fibra óptica, la cual es alineada con el punto focal de las cámaras de TV. Es importante hacer notar que la distorsión que produce la pared cilíndrica del tanque es corregida a través de una chaqueta cúbica llena de agua, instalada entre el tanque y las cámaras de TV. Al sistema se le suministra oxígeno, mediante burbujeo de aire a través de un difusor sinterizado de acero inoxidable (para HPLC, diámetro de poro 20 μm). En una primera etapa, el trabajo estuvo enfocado a la adquisición de imágenes de muy alta calidad, que permitieron observar in situ y en tiempo real, las burbujas de aire y gotas de aceite que se mueven a alta velocidad dentro del tanque de mezclado (Taboada, 2003; Galindo, 2005). La calidad de imágenes obtenidas permitió, en una segunda etapa, el desarrollo de algoritmos para su procesamiento y análisis de manera semi-automática, aspecto que es fundamental cuando es necesario procesar -como en nuestro caso-, un número muy grande de imágenes. En este sentido, en colaboración con el grupo del Dr. Gabriel Corkidi, del Laboratorio de Imágenes y Visión por Computadora del CCADET-UNAM, se desarrollaron algoritmos que permiten diferenciar (“segmentar”) y cuantificar en forma automática y semi-automática, tanto las burbujas de gas como las gotas de aceite. Cabe señalar que no existen alternativas ni dispositivos comerciales que sean capaces de llevar a cabo lo anterior. Con el fin de detectar -confiablemente- las circunferencias que conforman los contornos de las gotas y de las burbujas, se utilizó una técnica basada en la trasformada de Hough, pero con algoritmos inéditos que hacen sensiblemente más eficiente su aplicación tanto en 2 D (Taboada, 2006), como en el análisis en 3 D (Corkidi, 2007).



Figura 1. Sistema de adquisición de imágenes en 2 y 3 dimensiones, configuración para analizar zonas cercanas a la pared del tanque. 1) Computadora. 2) Cámara de TV. 3) Sincronizador estroboscopio. 4) Estereomicroscopio. 5) Soporte. 6) Estroboscopio. 7) Impulsor. 8) Turbina Rushton. 9) Guía de luz de fibra óptica. 10) Adaptación a 2 cámaras TV para análisis en 3D.

3.5.2 Adquisición micro-estereoscópica de imágenes y su análisis tridimensional Para la adquisición de imágenes en tres dimensiones, el estereoscopio fue mecánicamente modificado para poder instalarle dos cámaras de TV en los oculares del mismo. Cabe hacer notar que los estereo-microscopios comerciales sólo tienen capacidad para una sola cámara de TV (observación de sólo una de las dos imágenes del par estereoscópico). De hecho, estos equipos están diseñados para poder tener el efecto tridimensional visual solo a través de los oculares del microscopio y no a través de equipo electrónico. Las cámaras de TV se conectaron a una sola tarjeta de adquisición de imágenes RGB (instalada en el interior de una computadora de tipo personal), de tal manera que una de ellas está conectada al canal ROJO y la otra a los 2 canales VERDE y AZUL (que en combinación dan el color CYAN). De esta manera se obtiene una imagen estereoscópica combinada en ROJO y CYAN (figura 2), la cual puede ser observada con efecto tridimensional a través de lentes especiales (se incluye

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un juego con este documento para poder apreciar el fenómeno en las imágenes señaladas). Se utilizaron algoritmos para el cálculo de profundidades relativas entre burbujas y/o gotas con el fin de discernir si provienen de planos diferentes o si están físicamente unas dentro de otras. Además, se incorporó un sistema de calibración para cada magnificación utilizada en la adquisición de las imágenes y se estimó la precisión del sistema estereoscópico. En el Anexo 1 se presentan los detalles del fundamento teórico de los algoritmos utilizados y los procedimientos de adquisición, calibración y estimación de la precisión del sistema. Figura 2. Imágenes estereoscópicas que al observarse con lentes estereoscópicos, se ve el efecto tridimensional. 3.5.3. Video de alta velocidad En la figura 3 se ilustra el sistema de análisis de imágenes utilizando una cámara de video de alta velocidad y una fuente de luz directa de alta intensidad. Con este sistema fue posible adquirir imágenes nítidas e iluminadas, como la que se muestra en la figura 4. Se adquirieron videos de 200 imágenes, a 5130 cuadros por segundo (512 x 384 pixeles) con magnificaciones de 6 X, 8 X y 11 X. Estos videos se utilizaron para la determinación tanto de los diámetros de gotas de aceite y burbujas de aire como del porcentaje de inclusiones de burbujas de aire en gotas de aceite. 3.5.4 Videoendoscopía de alta velocidad Se implementó un sistema de video-endoscopía de alta velocidad que permite capturar secuencias de imágenes en diferentes zonas del tanque donde se estén generando las



estructuras complejas, con la finalidad de abrir la posibilidad para describir y entender los fenómenos que ocurren durante la interacción dinámica de las diferentes fases. Figura 3. Sistema de video de alta velocidad 1) Computadora, 2) Cámara de video de alta velocidad, 3) Cabezal de estereomicroscopio, 4) Fuente de luz directa, 5) Tanque de vidrio con tapa, (6) Sonda de luz directa. Figura 4. Imagen obtenida con el sistema de video de alta velocidad

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La figura 5 muestra esquemáticamente el sistema diseñado para la adquisición de imágenes. El sistema está compuesto por una cámara digital de video de alta velocidad (Redlake MotionPro HS4) que permite adquirir hasta 5130 cuadros/segundo de 512 x 512 pixeles. Con esta cámara, se pueden captar secuencias de imágenes de procesos que suceden a alta velocidad y, además, realizar una reconstrucción secuencial de los eventos de interés. Asimismo, se le acopló a la cámara un boroscopio de prisma oscilante (Serie 5 de Olympus). El uso del boroscopio permitió la captura de secuencias dinámicas de las interacciones de las fases dispersas en diferentes puntos del tanque. La iluminación se realizó con una fuente de luz Arco Xenon de 180W, directa, y de considerable mayor intensidad a la luz estroboscópica utilizada en el sistema desarrollado anteriormente (Galindo, 2005). La luz se transmite al interior del tanque por medio de una guía de luz de fibra óptica, la cual fue acoplada al boroscopio de manera rígida (alineada con su eje óptico) de manera que se puedan mover simultáneamente por el tanque, conservando constante una distancia luz-boroscopio. De esta manera, se tiene la iluminación suficiente para capturar imágenes en zonas profundas del tanque. La cámara con el boroscopio y la luz fueron colocadas en un tripié para facilitar su manejo por las diferentes zonas del tanque. Figura 5. Sistema de adquisición de imágenes, configuración para analizar zonas profundas del tanque. 1) Tripié. 2) Cámara de alta velocidad. 3) Boroscopio. 4) Luz arco Xenon. 5) Computadora. 6) Tanque de mezclado. 7) Difusor de aire. 8) Turbina Rushton. 9) Guía de luz de fibra óptica 10) Detalle que muestra la distancia y posición que debe tener la luz del baroscopio.

Detalle

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Posición de la Imagen

Distancia: 5mm – 1cm

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3.5.5 Modelos de estudio 3.5.5.1 El hongo Trichoderma harzianum La 6-pentil-α-pirona (6PP) es una lactona que tiene aroma a coco y presenta actividad fungicida (Bonnarme, 1997) y que es producida por el hongo Trichoderma harzianum. Este hongo puede crecer en la forma de micelio o agregado laxo (figura 6 a) o bien como pellets (figura 6 b). Se ha demostrado que en el caso de Trichoderma, como en otros cultivos de hongos filamentosos, existen condiciones hidrodinámicas óptimas para el crecimiento y/o la producción de un metabolito dado. La producción de la 6PP es función de la hidrodinámica presente dentro del fermentador y responde a un cambio en el metabolismo de la fuente de carbono (Rocha-Valadez, 2005). Sin embargo, es importante mencionar que en este sistema tan complejo y dinámico, el transporte de nutrientes (y por ende su disponibilidad) está muy lejos de estar plenamente entendido a detalle. Figura 6. Trichoderma harzianum dos tipos de morfología: a) micelio disperso, b) pellets. 3.5.5.2 El nemátodo Steinernema carpocapsae Los nemátodos entomopatógenos (NEPs) del género Steinernema spp. (figura 7) son enemigos naturales de diferentes insectos, por lo que se utilizan como agentes de control biológico contra insectos-plaga que atacan a diversos cultivos agrícolas (Islas-López, 2005). Figura 7. Macho adulto de Steinernema carpocapsae de primera generación.

b) a)



La producción de NEPs se hace por lo general en biorreactores con agitación neumática, aunque también se utilizan tanques agitados mecánicamente. En vista de su tamaño (300 - 500 μm), los nemátodos pueden sufrir daño mecánico cuando se cultivan en biorreactores y son partículas sólidas que hay que dispersar eficientemente, pero sin dañarlas (Shapiro-llan, 2002). Adicionalmente, los nemátodos pueden interaccionar importantemente con las burbujas de gas y/o las gotas de aceite (componente del medio para su cultivo) contribuyendo potencialmente a los fenómenos de ruptura y coalescencia de gotas y burbujas. 3.6 Resultados 3.6.1 Imágenes en dos dimensiones Un requisito indispensable en cualquier técnica de análisis de imágenes es la adquisición de imágenes de alta calidad. La figura 8 muestra ejemplos de imágenes adquiridas de alta calidad en dos dimensiones, mostrando diferentes fenómenos. La alta calidad de imágenes obtenida permitió observar y registrar fenómenos muy interesantes, por ejemplo, la introducción de burbujas de aire dentro de gotas de aceite (Larralde, 2002) y la presencia de microgotas de agua dentro las mismas (Escobar-Anzurez, 2005). La identificación de estos fenómenos es relevante ya que implica el replanteamiento de lo comúnmente aceptado sobre el transporte de nutrientes en la fermentación, en donde se asume que las burbujas transfieren el oxígeno que contienen a través de la interfase burbuja-agua. Figura 8. Imágenes típicas de alta calidad (2 dimensiones) obtenidas con el sistema desarrollado: a) Gotas de aceite con superficie lisa, burbujas de aire libres y burbujas atrapadas en aceite; b) Interacción del micelio con gotas y burbujas; c) Estructuras complejas representativas de dispersiones múltiples. 3.6.2 Imágenes en tres dimensiones Una de las principales aportaciones de este trabajo fue la identificación tridimensional de las gotas y burbujas presentes en la dispersión. Aplicando los algoritmos de segmentación desarrollados, el sistema fue capaz de calcular la posición z de los objetos (profundidad) y con ello fue posible establecer si los objetos estaban incluidos (color verde) o traslapados (color amarillo), como se ilustra en la figura 9. La figura 10 muestra una secuencia de imágenes generada a partir de una escena real. Con los datos tridimensionales obtenidos con el sistema, una escena real es rotada sobre el eje vertical, mostrando cómo objetos que aparecen aparentemente traslapados en un cierto ángulo de vista, no lo están en la realidad, haciendo evidente el error que se introduce en observaciones donde no se utilizan técnicas

a) b) c)



tridimensionales. Ello ha permitido discernir si lo que se ve en la proyección en dos dimensiones, se trata de traslapes o inclusiones. Figura 9. Determinación de inclusiones y traslapes, (partículas verdes: inclusiones, partículas amarillas: traslapes).

Figura 10. Secuencia giratoria de la escena real (última imagen) reconstruida en 3 dimensiones (cada imagen gira 10 grados sobre su eje vertical central). Se observa cómo objetos que aparecen traslapadas en la primera imagen de la secuencia, en realidad no lo están (ver imágenes subsecuentes).



Con el fin de establecer las posibles diferencias entre los datos adquiridos en dos y tres dimensiones, se estudió un sistema de cuatro fases, previamente caracterizado por Lucatero (2003), quienes evaluaron el efecto de la concentración de la biomasa de Trichoderma harzianum, ya sea en forma de pellets o de agregados laxos, sobre el porcentaje de burbujas (con respecto al total medido de la muestra) que se encuentran incluidas dentro de las gotas de aceite. En la figura 11 se observa que, en el caso de la técnica estereoscópica (3 D), a mayores concentraciones de biomasa (en la forma de pellets), el porcentaje de burbujas dentro de las gotas de aceite tiende a aumentar de un 12 a un 30 %. Este porcentaje es menor que el obtenido con la técnica bidimensional (2 D), el cual se determinó próximo al 40 % independientemente de la concentración de biomasa (en forma de pellets). Asimismo, en la figura 12 se observa que cuando se incrementa la concentración de biomasa en la forma de micelio disperso, el porcentaje de burbujas dentro de las gotas de aceite tiende a aumentar. En el caso de la técnica estereoscópica, este porcentaje se incrementó del 13 al 40 %, mientras que con la técnica bidimensional el mismo parámetro se determinó entre el 40 y 75 %. Esto es de particular importancia ya que tanto las tendencias como los valores absolutos del porcentaje de burbujas incluídas en las gotas de aceite fueron diferentes (y en general, menores) cuando se utilizó la técnica 3 D respecto a los resultados con la técnica convencional en dos dimensiones. Por tanto, cuando el sistema multifásico es caracterizado en tres dimensiones, es posible establecer sin ambigüedad las condiciones de transferencia de oxígeno, camino difusional y fase en contacto directo con las burbujas de aire.

Figura 11. Influencia de la concentración de biomasa en forma de pellets sobre el porcentaje de burbujas dentro de las gotas de aceite con las técnicas bidimensional y estereoscópica.

0

20

40

60

80

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4Biomasa (g/L)

% b

urb

uja

s d

entr

o

2 D (Lucatero, 2003)

3 D



Figura 12. Influencia de la concentración de biomasa en forma de micelio disperso sobre el porcentaje de burbujas dentro de las gotas de aceite utilizando las técnicas bidimensional y estereoscópica. En términos del diámetro de gotas y burbujas, en la figura 13, se ilustra un ejemplo para el caso cuando se usaron pellets del hongo Trichoderma harzianum. El diámetro Sauter de las gotas de aceite y de las burbujas de aire fue muy similar a lo reportado previamente por Galindo (2000) y por Lucatero (2003) usando la técnica bidimensional. Ésto es lógico, ya que la determinación del diámetro de los objetos no se espera que dependa de si el sistema es caracterizado en dos o tres dimensiones.

Figura 13. Influencia de la concentración de biomasa en forma de pellets sobre el diámetro Sauter de las gotas de aceite y las burbujas de aire en un sistema de cuatro fases.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Biomasa (g/L)

Diá

metr

o S

au

ter

(μm

)

Gotas de aceite

Burbujas de aire

0

20

40

60

80

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Biomasa (g/L)

% b

urb

uja

s d

en

tro

2 D (Lucatero, 2003)

3 D



3.6.3 Video de alta velocidad El sistema de alta velocidad permitió obtener imágenes nítidas, bien iluminadas y con un elevado número de objetos enfocados (figura 14), con lo cual se pueden determinar confiablemente los d32 y la distribución de tamaños.

Figura 14. Secuencia de imágenes obtenidas con el sistema de video de alta velocidad de un sistema de tres fases. Con este sistema se logró la toma de secuencias de imágenes en diversas zonas de turbulencia del tanque y registrar los eventos que suceden en las dispersiones (principalmente interacciones entre burbujas, gotas de aceite y biomasa micelial). La alta velocidad de adquisición permitió visualizar de manera detallada las estructuras complejas que se forman en estas zonas, como las que se muestran en la figura 15. Para efectos de visualización, en esta figura se muestran sólo algunos cuadros de la secuencia, donde es posible apreciar el movimiento de las estructuras a través de la zona de enfoque. Cabe resaltar que en las imágenes se observan objetos que no son esféricos, que corresponden a estructuras que se encuentran en proceso de formación. Es importante resaltar que este tipo de fenómenos no habían sido registrados con anterioridad utilizando la cámara convencional. Con respecto al modelo de nemátodos, en la figura 16 se presentan algunas imágenes adquiridas por video-endoscopía de alta velocidad, donde es posible apreciar que en este sistema también se forman estructuras complejas o gotas multifásicas. 3.6.4 Determinación de la velocidad de objetos Con el sistema de alta velocidad se han adquirido secuencias de imágenes en la que aparecen las mismas estructuras hasta en 40 imágenes en forma ligeramente distinta, lo cual permite una caracterización muy detallada de las dispersiones y determinar los efectos dinámicos que se llevan a cabo en el reactor. Por ejemplo, es posible determinar las inclusiones siguiendo la secuencia del video, de tal manera que si una burbuja de aire y una gota de aceite siguen la misma trayectoria y velocidad, se considera que la burbuja está dentro de la gota y si a lo largo de la secuencia la velocidad y trayecto no es el mismo, la burbuja se encuentra fuera como se puede apreciar en la figura 17.



Figura 15. Tres ejemplos de secuencias de estructuras complejas adquiridas por el sistema de videoendoscopía de alta velocidad.

Secuencia 1 Secuencia 2 Secuencia 3

Tiempo k

Tiempo k + 5

Tiempo k + 10

Tiempo k + 15

Tiempo k + 25 Tiempo k + 25 Tiempo k + 25

Tiempo k Tiempo k

Tiempo k + 5 Tiempo k + 5





Figura 16 . Secuencia de imágenes obtenidas con el sistema de videoendoscopía de alta velocidad de un sistema de cuatro fases, siendo la cuarta fase, nemátodos en fase de IJ, donde se registrar la formación de gotas multifásicas (conteniendo burbujas de aire y pequeñas gotas de agua) dentro del tanque, así como NEP’s. Figura 17. Secuencia de imágenes para discernir los objetos incluídos dentro de las gotas de aceite de los objetos sobrelapados. De igual manera, con este sistema de video de alta velocidad fue posible estudiar la cinética de la dispersión y caracterizar de forma muy fina los cambios que ocurren en el sistema. Un ejemplo de esto se observa en la figura 18, donde se incluyen imágenes representativas de lo que sucede desde que se inicia la agitación en el tanque y conforme transcurre el tiempo de dispersión. Las inclusiones de burbujas en gotas de aceite se incrementaron con respecto al tiempo de dispersión y con este sistema fue posible registrar fenómenos como el proceso de formación de gotas multifásicas (figura 19) o la interacción entre las estructuras (figuras 20 y 21). Es posible también determinar la velocidad a la que se mueven las distintas estructuras como se ejemplifica en la figura 22. Para este cálculo, se toman dos imágenes de una secuencia, en donde la estructura de interés se observe enfocada y se mide el desplazamiento de la estructura enfocada y a la vez se determina el tiempo transcurrido entre la adquisición de ambas imágenes. Por ejemplo, para el caso que se reporta en la figura 22, se calculó una velocidad de 29.6 cm/s para la gota de aceite señalada.

Dentro

Fuera

Tiempo K Tiempo K + 5 Tiempo K + 10Tiempo KTiempo K Tiempo K + 5Tiempo K + 5 Tiempo K + 10Tiempo K + 10



Tiempo desde el inicio de la dispersión (min)

% de burbujas dentro de gotas

Figura 18. Imágenes típicas y porcentaje de inclusiones con respecto al tiempo de dispersión en un sistema de tres fases conteniendo proteína. Figura 19. Formación de gotas multifásicas en un sistema de tres fases (agua-aire-aceite), con presencia de proteína. Figura 20. Interacción entre las diversas estructuras presentes en un sistema de tres fases (en presencia de proteína).

2

3.1

5

9.3

10

10.6



Figura 21. Interacción entre una gota de aceite, una burbuja de aire y un NEP en estadío IJ. Estas son estructuras presentes en un sistema de cuatro fases con nemátodos.

Figura 22. Determinación de la velocidad con la que mueven las gotas y burbujas dentro del tanque de mezclado en un sistema de tres fases con BSA y Pg de 0.5 kW/m3 (29.6 cm/s). 3.7 Aportaciones Los procesos fermentativos que involucran dispersiones multifásicas son altamente complejos y por lo tanto, muy difíciles de caracterizar. En estos procesos, se ha observado la existencia de estructuras complejas, las cuales consisten en gotas de aceite que contienen una gran cantidad de burbujas de aire y de gotas muy pequeñas de agua. Este fenómeno se acentúa cuando hay concentraciones altas de biomasa, o

t0 + 5.8 x 10-4 s t0



bien, cuando en el medio existen proteínas, lo cual puede modificar sensiblemente la transferencia de oxígeno al cultivo, lo cual tiene generalmente un efecto muy importante en el rendimiento y/o productividad del proceso de fermentación. Hasta el momento se desconocen los mecanismos por los cuales se forman estas gotas multifásicas. Una posibilidad serían las colisiones gota-burbuja y/o gota-micelio/nemátodos. El primer paso que se dió para dar respuesta a estas interrogantes, fue la implementación de un sistema capaz de visualizar el proceso de formación de dichas estructuras, de manera que se puedan conocer los factores que están participando en su formación. Se ha establecido que ciertas condiciones, como un mayor contenido de biomasa (sobre todo en forma de agregados laxos) o la presencia de bajas concentraciones de proteína, aumentan el porcentaje de burbujas que se encuentran dentro de gotas de aceite, llegando a constituir hasta un 30 % del total determinado por el sistema de 3 D. Este hecho es particularmente relevante ya que la transferencia de oxígeno (de la burbuja al seno del líquido, donde puede ser aprovechado por el microorganismo) es muy complejo, ya que involucra, primero, la difusión del oxígeno de la burbuja de aire al medio aceitoso (que es cerca de 500 veces más viscoso que el agua, pero que tiene una solubilidad cerca de 8 veces más alta que en el agua) y luego su difusión de la gota de aceite al seno del líquido. Usualmente, los modelos aceptados de transferencia de oxígeno en fermentaciones sólo asumen que la principal resistencia a la transferencia de masa sucede en la interfase gas-agua. En consecuencia, la información generada en este trabajo permitirá explicar y modelar con mayor precisión los fenómenos que suceden en las fermentaciones multifásicas y, por lo tanto, proponer mejores sistemas o condiciones de transferencia de oxígeno para estos sistemas.


Especialidad: Ingeniería Química

27

4. CONCLUSIONES Se desarrollaron e implementaron técnicas que permitieron obtener detalles microscópicos y dinámicos de los procesos de dispersión que ocurren en procesos complejos de fermentación. La técnica estereoscópica permitió la caracterización de dispersiones multifásicas de manera muy precisa, ya que además de conocer el tamaño de las gotas y burbujas, fue posible discernir objetiva e inequívocamente si las burbujas de aire están incluídas o están traslapadas. El sistema de videoendoscopía de alta velocidad permitió obtener imágenes nítidas y con el número necesario de objetos enfocados para caracterizar las dispersiones. El seguimiento de la secuencia permitió también la determinación de inclusiones y el cálculo de la velocidad de los objetos dentro del biorreactor. Fue posible documentar la interacción entre los nemátodos y las otras fases involucradas en el proceso así como verificar que la agitación mecánica no causó fragmentación de ellos. La caracterización de las dispersiones como realmente suceden (en tres dimensiones y a alta velocidad) ha permitido establecer las condiciones -a nivel microscópico- bajo las cuales se lleva a cabo el transporte de nutrientes en los procesos de fermentación y, con ello, abren una puerta para el diseño y optimización de estos procesos sobre bases científicas.



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6. AGRADECIMIENTOS Se reconoce y agradece la extensiva colaboración del Dr. Gabriel Corkidi, del Laboratorio de Imágenes y Visión por Computadora del Centro de Ciencias Aplicadas y Desarrollo Tecnológico (CCADET) de la UNAM, en el desarrollo de las técnicas de análisis de imágenes. Se reconoce la participación de Patricia Larralde, Ma. Teresa Brito, Savidra Lucatero, Nancy Pulido, Jean Brière, Teddy Voisson, Othón Escobar, Luz Helena Horita, Leticia Vega y Rufino Díaz en los trabajos preliminares de diseño, montaje y caracterización de sistemas de análisis de imágenes que conforman los antecedentes de este trabajo. Se agradece el apoyo técnico de Blanca Taboada y de Ma. Soledad Córdova y la participación de las estudiantes Itzma Itzel Ruíz, Eliane Guevara y Gabriela Maciel en el montaje de los equipos, producción de la biomasa de Trichoderma harzianum y de Steinernema carpocapsae y en el desarrollo experimental de este proyecto. Para el desarrollo de esta línea de investigación, se contó con el apoyo económico de la UNAM y del CONACyT.



7. ANEXOS 7.1 Anexo 1

7.1.1 Técnica estereoscópica

7.1.1.1 Adquisición micro-estereoscópica de imágenes y su análisis tridimensional Considerando que la adquisición del par de imágenes estereoscópicas conlleva una serie de problemas mecánicos, electrónicos y computacionales, se utilizó una sola tarjeta de adquisición para las dos cámaras de video, por lo cual no fue necesario sincronizar dos sistemas de adquisición independientes. Para realizar una prueba de factibilidad del nuevo sistema propuesto, se adquirieron imágenes de un modelo sencillo de esferas de unicel de tamaños diferentes y colocadas a distintas profundidades. Estos objetos simularon las gotas y burbujas que se observan en una dispersión real. La prueba consistió en calcular la posición relativa de las esferas, teniendo una esfera de referencia (la de mayor tamaño). Para ello se desarrollaron algoritmos utilizando como base un programa comercial de procesamiento de imágenes, con lo cual se determinó la correspondencia entre los mismos objetos en el par de imágenes, así como el cálculo de su posición espacial. De esta manera, el par estereoscópico de imágenes adquirido fue codificado para su visualización estereoscópica y procesamiento utilizando los algoritmos desarrollados. El ángulo de separación de las cámaras era susceptible de variar en cada experimento. Esto no permitía que los algoritmos de cálculo de z y correspondencia generaran información consistente y reproducible. En consecuencia, se modificó el mecanismo de acoplamiento de las cámaras para mantener fijo el ángulo entre ellas, para lo cual se diseñaron y fabricaron algunas piezas que permitieron alinear las cámaras con mayor precisión y así adquirir imágenes de las estructuras en movimiento. Por otra parte, se modificaron los algoritmos de procesamiento, de tal manera que la correspondencia entre ambas imágenes fuera más sencilla de obtener. 7.1.1.2 Segmentación y correspondencia

La técnica estereoscópica implica dos partes, una es la adquisición del par de imágenes estereoscópicas, donde se debe colocar cuidadosamente las dos cámaras de video con la misma referencia vertical, de manera que las coordenadas y de los centros de gravedad de los objetos tengan hipotéticamente los mismos valores. La otra parte es el procesamiento de los pares estereoscópicos, cuyas funciones son: 1) Separación de la imagen estereoscópica en sus dos componentes (imagen izquierda

e imagen derecha). 2) Alineación de las imágenes en función de los objetos de referencia, lo que es muy

importante ya que de esta manera se mantiene el mismo eje y en ambas imágenes, mientras que el eje x varía en las dos imágenes debido al ángulo de separación de las cámaras con que se adquirieron las imágenes. Si hay variaciones en los ejes y, no hay correspondencia de un mismo objeto en las dos imágenes del par estereoscópico y el algoritmo de correspondencia no es válido.

3) Segmentación de objetos (gotas y burbujas). 4) Cálculo de las profundidades entre objetos. 5) Despliegue de resultados (objetos dentro o fuera de otros, i.e. gotas de agua

dentro de gotas de aceite, burbujas de aire dentro de gotas de aceite).



La segmentación consiste en extraer los objetos de interés (gotas o burbujas) en una imagen, para lo cual es necesario delimitar los contornos de dicho objeto. Una vez segmentado el objeto en la imagen izquierda, se realiza la correspondencia (matching), es decir, se determina si el objeto segmentado en las imágenes izquierda y derecha es el mismo. Sobre la imagen izquierda se segmenta un objeto (gota o burbuja) y se forma un círculo que se mueve a la imagen derecha (mismo eje y y desplazamiento en eje x). Para realizar la correspondencia de los objetos, el algoritmo está diseñado para no permitir al usuario segmentar otro objeto de la misma imagen izquierda, a menos que ya se haya segmentado el mismo objeto, en la imagen derecha. Asimismo, una vez alineadas las imágenes, el algoritmo no permite modificar la posición y del objeto en proceso de segmentación, es decir moverlo hacia arriba o hacia debajo de la coordenada y designada para este objeto segmentado en la imagen izquierda. De esta manera la coordenada y y el radio del objeto segmentado permanecen constantes. Con los valores de las coordenadas del centro de los objetos en ambas imágenes, se calcula el valor del eje z del objeto segmentado y se determina su posición espacial. 7.1.1.3 Modelo teórico del sistema estereoscópico En la figura A 1 se muestra un esquema del sistema estereoscópico en el que se consideran dos cámaras con características físicas idénticas (la dimensión y el número de pixeles por sensor y su posición relativa con respecto al sistema óptico). Asimismo, sólo un parámetro intrínseco define el modelo teórico de la cámara llamado focal f. El sensor está colocado delante de la lente para representar la imagen digital no invertida proporcionada por la cámara (las lentes invierten la imagen pero los dispositivos electrónicos asociados a la cámara corrigen este efecto). Se considera que las dos imágenes se encuentran alineadas a un mismo eje óptico, dando lugar al plano A. De esta manera se pueden definir dos parámetros: la distancia D existente entre los sensores de ambas cámaras y el ángulo θ formado entre los dos ejes ópticos. Por tanto, la posición de cualquier punto pi que se encuentre dentro del sistema de referencia πxyz, se puede calcular mediante triangulación.

Figura A 1. Esquema del sistema estereoscópico desarrollado.



Se hace uso de la trigonometría para obtener la posición (x,y,z) del punto pi dentro de la referencia πxyz, desde su posición con respecto al sensor p1 de la cámara izquierda (x1,y1) en la referencia π1 y con respecto al sensor de la cámara p2 (x2,y2) en la referencia π2 (figura A 2).

Figura A 2. Cálculo de la posición espacial de los objetos. 7.1.1.4 Cálculo de los objetos incluidos dentro de las gotas de aceite Las posiciones espaciales de los diferentes objetos permiten discernir si los objetos están atrapados realmente, de los resultados que se obtienen utilizando una técnica bidimensional, donde no es posible determinar la posición espacial de los objetos. Para esto, se calcula la distancia Euclidiana entre los centros de gravedad de gotas o burbujas (Dxyz, ver la figura A 3). Tanto las gotas como las burbujas son consideradas como esferas perfectas desde su segmentación, la cual se realiza con círculos. En la figura A 3 se considera que la partícula C2 está dentro de la partícula C1, con una tolerancia de inclusión ε, si Dxyz+R2 x (1-ε) ≤ R1 se cumple. La tolerancia de inclusión puede ser ajustada para fijar un criterio de inclusión, es decir, determinar la fracción de la partícula C2 que requiere estar dentro de la partícula C1 para ser considerada como partícula incluida. Para considerar a C2 como una partícula incluida, la máxima fracción de C1 que puede estar fuera debe ser de 1/8 de su radio. 7.1.1.5 Precisión del sistema Para calcular el error del sistema, se utilizó un portaobjetos de vidrio con un círculo grabado de 3 mm de diámetro, en cuyo centro se encuentra una recta de 1 mm dividida en secciones de 10 μm cada una. Este micrómetro se colocó en la platina de un microscopio, cuyo desplazamiento fue controlado por un programa de computadora. El micrómetro se colocó en una posición en la que el círculo y la regla tuvieran el mismo tamaño en las imágenes adquiridas por las cámaras izquierda y derecha, con la finalidad de lograr el alineamiento perpendicular.



Utilizando las magnificaciones 1.0 y 1.2 del estereomicroscopio, se adquirieron imágenes del micrómetro que se fue desplazando 10 mm sobre el eje πz con intervalos de 100 μm. Posteriormente, se segmentó el círculo del micrómetro para cada magnificación e intervalo adquiridos, se evaluó la posición sobre el eje z con el modelo teórico y el resultado se comparó con la distancia conocida y determinada por el programa de computación (ver figura A 4).

Figura A 3. Determinación de la inclusión y traslapes de burbujas y gotas

Figura A 4. Determinación de la precisión del sistema estereoscópico utilizado.



7.2 Anexo 2 7.2.1 Condiciones de operación de los sistemas 7.2.1.1 El hongo Trichoderma harzianum El sistema consistió de un tanque de mezclado de 0.21 m de diámetro y 0.24 m de altura, con una turbina Rushton (D/T=0.5) colocada a una altura de 0.10 m del fondo del tanque, un difusor sinterizado con tamaño de poro de 20 µm (Waters Chromatography) y 4 mamparas. El tanque fue colocado en una chaqueta de acrílico con agua para mantener la temperatura a 29°C (como ocurre en la fermentación) y por otro lado, para corregir las deformaciones geométricas de las gotas y burbujas al observar a través del tanque de vidrio. La iluminación fue proporcionada por una fuente de luz estroboscópica (EG 6 G Optoelectronics, modelo MVS-2600) con una potencia de 60 Hertz, introducida al interior del tanque por medio de una guía de fibra óptica, colocada a 5 mm de la pared del tanque, a la altura de la descarga del impulsor y frente a la lente del estereoscopio. La fase continua fue una solución de sales con la misma composición que el medio de cultivo para la producción de micelio de Trichoderma harzianum (Serrano-Carreón, 2002). La fase dispersa fue aceite de ricino al 5 % (v/v). La fase sólida fue biomasa Trichoderma harzianum a diferentes concentraciones (0.05 a 2.4 g/l), con dos tipos de morfología: pellets y micelio disperso y clumps. Se trabajó con una agitación de 200 rpm y un flujo de aire de 0.25 vvm. El volumen de operación fue de 6.7 l. Las imágenes adquiridas se procesaron, segmentando manualmente los objetos para así determinar la distribución de tamaños de gotas y burbujas. 7.2.1.2 El nemátodo Steinernema carpocapsae Se diseñó un sistema modelo en base a las concentraciones iniciales de los componentes del medio de producción (Islas-López, 2005). El sistema modelo diseñado consistió en una solución de NaCl al 0.5 %, 8.2 % v/v de aguamiel y 2.5 % v/v de aceite de maíz. La yema de huevo se sustituyó por albúmina bovina debido a que las partículas de yema ocasionan turbidez y dificultan la segmentación de objetos. Se utilizó un tanque de 1.2 L equipado con un impulsor de paletas inclinadas D/T = 0.33, 4 mamparas y un difusor de gas (sinterizado). Las imágenes se tomaron bajo las condiciones de operación similares al tanque de producción, para lo cual se estimó la potencia suministrada por medio de un dinamómetro (Reséndiz, 1991). La velocidad de agitación fue de 8.45 rps y la aireación de 1 vvm. Se cultivaron nemátodos en tres etapas de su ciclo de vida (IJ, J1 y adultos) para ser utilizados como fase sólida. Se adquirieron imágenes de los sistemas modelos trifásicos con un sistema de visión estéreo-microscópica y videos de 200 imágenes (512 x 512 pixeles) con el sistema de video-endoscopía de alta velocidad. Las imágenes adquiridas se procesaron, segmentando manualmente los objetos para así determinar la distribución de tamaños de gotas y burbujas.



8. BREVE CURRICULUM VITAE Ingenierio Químico (Universidad Autónoma de Puebla, 1979), Maestro y Doctor en Biotecnología (UNAM, 1983 y 1989), Posdoctorado en la Universidad de Birmingham, Inglaterra (1990). Investigador del Instituto de Biotecnología de la UNAM desde 1984. Autor de 112 artículos de investigación original, de 47 trabajos de divulgación o revisión y editor de dos libros. Autor de 6 patentes. Participó en el desarrollo de tres procesos biotecnológicos que han sido transferidos a sus usuarios. Ha dirigido 25 tesis de licenciatura, 19 de maestría y 4 de doctorado. Ha recibido varias distinciones, destacando el Premio de la Academia de la Investigación Científica (1994) y el Premio Sven Brohult (2004), máxima distición que otorga la International Foundation for Science. Desde 1984 es miembro del Sistema Nacional de Investigadores, donde tiene el nivel III desde 1999. Fue Presidente de la Sociedad Mexicana de Biotecnología y Bioingeniería, A.C. (1999-2000). Ha formado parte de comités de alto nivel, destacando la Comisión Dictaminadora del SNI y el Comité de Trabajo de Ingeniería y Tecnología del Foro Consultivo Científico y Tecnológico. Actualmente es Jefe del Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis del Instituto de Biotecnología de la UNAM, en Cuernavaca, Morelos, Presidente de la Academia de Ciencias de Morelos y miembro del Comité Ejecutivo del North American Mixing Forum. Su trabajo se centra en la ingeniería de bioprocesos, en particular en los aspectos hidrodinámicos de sistemas de cultivo de biomasa y en el desarrollo y escalamiento de procesos biotecnológicos para las industrias alimentaria y agrícola.

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