Eduardo García-JuncedaInstituto de Química Orgánica General. CSIC.

Diseño y desarrollo de sistemas multi-enzimáticos para la formación estereoselectiva de enlaces C-C.

INTRODUCCIÓN

Edificio Empire State Puente de La Torre de Londres Torre Eiffel

REACCIÓN ALDÓLICA.

INTRODUCCIÓN

R1

O

R2

OH

R3

R1

O

R2

Cetonadonadora

H R3

O

Aldehídoaceptor

+

Generan 2 nuevos estereocentros con enantio- y diastereoselectividades generalmente excelentes.

Las 4 aldolasas son estereocomplementarias y la estereoquímica de los dos nuevos centros quirales formados está controlada por el enzima y no por los sustratos

ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP

PRINCIPAL INCONVENIENTE: DEPENDENCIA DE DHAP.

- Limita su campo de aplicación- Síntesis química compleja y con rendimientos moderados (65%)- Sustrato de coste muy elevado ⇒ inviable su uso a gran escala

- Lábil a pH neutros y básicos ⇒ menores rendimientos del aldol

ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP

DHAK DE CITROBACTER FREUNDII

Citrobacter freundii

Siebold, C. et al., J. Biol. Chem. 278:48236 (2003).

Dom-K Dom-L

conector

DHA ATPMg+2

Fosfolípido

DHAK DE CITROBACTER FREUNDII

I. Sánchez-Moreno, et al., ChemBioChem, 2009, 10, 225.

DHAK DE CITROBACTER FREUNDII

1. Sánchez-Moreno, I., et al., ChemBioChem, 10: 225, (2009); 2. Johnson, E.A., et al., J. Bacteriol., 160: 55, (1984); 3.Molin, M., et al., J. Biol. Chem., 278: 1415, (2003); 4. Itoh, N., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 193, (1999); 5.Yoshihara, K., et al., Appl. Environ. Microbiol., 62: 4663, (1996).

SISTEMA ROBUSTOdistintas aldolasas dependientes de DHAP

amplia batería de aldehídos con diversidad estructural

SISTEMA MULTI-ENZIMÁTICO

Sanchez-Moreno, I. et al., Chem. Comm,1634 (2004).

SISTEMA MULTI-ENZIMÁTICO

ii)i)

Puntos optimizables:

la necesidad de trabajar con tres enzimas.

la dependencia del pH para el correcto funcionamiento del sistema de regeneración de ATP.

Poly-P

DISEÑO DEL ENZIMA DE FUSIÓN QUINASA-ALDOLASA

His6 Dom K Dom L LINKER FBPA

NtCt

DHAK

FBPA

Ct

LINKER Dom L Dom K His6

DHAK

Nt

Iturrate, L. et al., Chem. Comm,1721 (2009).

To5DHAK = 48.7 ºC

T05FBPA = 54.9 ºC

ESTABILIDAD TÉRMICA DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN.

Representación de la fracción de proteína desnaturalizada, fu.

To5DLF = 53.7 ºC

T05Mezcla = 49.3 ºC

DLF: v = 0.4111 mmol/min

WT: v = 0.0234 mmol/min

0

2

4

6

8

0 20 40 60 80 100

ALD

OL

(μm

ol)

t (min)

HO OHO

+ATP ADP

OPO32-

OH

OH

ODHAKFBPA FBPA

OO

DHA O

1

2

SUBSTRATE CHANNELLING.

Iturrate, L. et al., Chem. Comm,1721 (2009).

FBPA

FBPA

DHAK

FBPA

FBPA

DHAK

Enzimas libres Enzima de fusión

SUBSTRATE CHANNELLING.

Iturrate, L. et al., Chem. Comm,1721 (2009).

GDHGDH

GDH

GDH

GDHFBPA

FBPA

DHAK

FBPA

FBPA

DHAK

SUBSTRATE CHANNELLING.

GDH

GDH

GDH

SUBSTRATE CHANNELLING.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0 5 10 15 20 25 30 35

Unidade

s de

 α‐GDH 

µg de α‐GDH

Sistema de fusión Sistema multienzimático Sistema de fusión sin AcH

Evolución Dirigida

EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.

EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.

Especie 4

Especie 3

Especie 2

Gen original

Recombinación

Mutagénesis

Especie 1

Gene híbridos

EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.

pRSET-dhak

HindIIIMluI

Library ofL-domain variants

pRSET-dhak (4559 pb)

f1 ori

PT7

ampr

6xH EK domK C

AdeI HindIII

domL

EP-PCR

Shuffled libray of L-domain variants

Recombinación

artificial

Ligation and transformation

Clones of shuffled libray

Screening by DHAK activity using poly-P

EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.

Screening de actividad DHAK usando poli-P como donador de grupos fosforilo

1,021,031,041,051,061,071,081,091,1

0 200 400 600

Time (s)

A 34

0 nm

Background

Mut. 3-C3

0,940

0,950

0,960

0,970

0,980

0,990

0 200 400 600

Time (min)

A 34

0nm Wild type DHAK

EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.

(activitymut – mean activitymut )

standard desviation control

=Z(X – μ )σc

=

Z ≥ 31H2

2C1 2D12H3

3C33E4

3H2

4B35A2

5B15C1

5F12

6A3

6D56D66F2

EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.

1H2 (13.5 mU/mg)

5F12 (10.5 mU/mg)

3E4 (7.70 mU/mg)

(1.5 – 3.0 mU/mg)

(< 0.5 mU/mg)

EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.

Mutante 1H2

Glu526Lys

Agradecimientos

Israel Sánchez-Moreno

Laura Iturrate

Rocío Martín Hoyos

Juan Francisco García-García

Isabel Oroz

Elisa G. Doyagüez

MEC (CTQ2004-03523/BQU y CTQ2007-67403/BQU)

Alejandro Macías

Dr. Alfonso Fernández-Mayoralas

Comunidad de Madrid