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Eduardo García-JuncedaInstituto de Química Orgánica General. CSIC.
Diseño y desarrollo de sistemas multi-enzimáticos para la formación estereoselectiva de enlaces C-C.
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INTRODUCCIÓN
Edificio Empire State Puente de La Torre de Londres Torre Eiffel
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REACCIÓN ALDÓLICA.
INTRODUCCIÓN
R1
O
R2
OH
R3
R1
O
R2
Cetonadonadora
H R3
O
Aldehídoaceptor
+
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Generan 2 nuevos estereocentros con enantio- y diastereoselectividades generalmente excelentes.
Las 4 aldolasas son estereocomplementarias y la estereoquímica de los dos nuevos centros quirales formados está controlada por el enzima y no por los sustratos
ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP
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PRINCIPAL INCONVENIENTE: DEPENDENCIA DE DHAP.
- Limita su campo de aplicación- Síntesis química compleja y con rendimientos moderados (65%)- Sustrato de coste muy elevado ⇒ inviable su uso a gran escala
- Lábil a pH neutros y básicos ⇒ menores rendimientos del aldol
ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP
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DHAK DE CITROBACTER FREUNDII
Citrobacter freundii
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Siebold, C. et al., J. Biol. Chem. 278:48236 (2003).
Dom-K Dom-L
conector
DHA ATPMg+2
Fosfolípido
DHAK DE CITROBACTER FREUNDII
I. Sánchez-Moreno, et al., ChemBioChem, 2009, 10, 225.
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DHAK DE CITROBACTER FREUNDII
1. Sánchez-Moreno, I., et al., ChemBioChem, 10: 225, (2009); 2. Johnson, E.A., et al., J. Bacteriol., 160: 55, (1984); 3.Molin, M., et al., J. Biol. Chem., 278: 1415, (2003); 4. Itoh, N., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 193, (1999); 5.Yoshihara, K., et al., Appl. Environ. Microbiol., 62: 4663, (1996).
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SISTEMA ROBUSTOdistintas aldolasas dependientes de DHAP
amplia batería de aldehídos con diversidad estructural
SISTEMA MULTI-ENZIMÁTICO
Sanchez-Moreno, I. et al., Chem. Comm,1634 (2004).
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SISTEMA MULTI-ENZIMÁTICO
ii)i)
Puntos optimizables:
la necesidad de trabajar con tres enzimas.
la dependencia del pH para el correcto funcionamiento del sistema de regeneración de ATP.
Poly-P
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DISEÑO DEL ENZIMA DE FUSIÓN QUINASA-ALDOLASA
His6 Dom K Dom L LINKER FBPA
NtCt
DHAK
FBPA
Ct
LINKER Dom L Dom K His6
DHAK
Nt
Iturrate, L. et al., Chem. Comm,1721 (2009).
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To5DHAK = 48.7 ºC
T05FBPA = 54.9 ºC
ESTABILIDAD TÉRMICA DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN.
Representación de la fracción de proteína desnaturalizada, fu.
To5DLF = 53.7 ºC
T05Mezcla = 49.3 ºC
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DLF: v = 0.4111 mmol/min
WT: v = 0.0234 mmol/min
0
2
4
6
8
0 20 40 60 80 100
ALD
OL
(μm
ol)
t (min)
HO OHO
+ATP ADP
OPO32-
OH
OH
ODHAKFBPA FBPA
OO
DHA O
1
2
SUBSTRATE CHANNELLING.
Iturrate, L. et al., Chem. Comm,1721 (2009).
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FBPA
FBPA
DHAK
FBPA
FBPA
DHAK
Enzimas libres Enzima de fusión
SUBSTRATE CHANNELLING.
Iturrate, L. et al., Chem. Comm,1721 (2009).
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GDHGDH
GDH
GDH
GDHFBPA
FBPA
DHAK
FBPA
FBPA
DHAK
SUBSTRATE CHANNELLING.
GDH
GDH
GDH
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SUBSTRATE CHANNELLING.
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0 5 10 15 20 25 30 35
Unidade
s de
α‐GDH
µg de α‐GDH
Sistema de fusión Sistema multienzimático Sistema de fusión sin AcH
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Evolución Dirigida
EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
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EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
Especie 4
Especie 3
Especie 2
Gen original
Recombinación
Mutagénesis
Especie 1
Gene híbridos
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EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
pRSET-dhak
HindIIIMluI
Library ofL-domain variants
pRSET-dhak (4559 pb)
f1 ori
PT7
ampr
6xH EK domK C
AdeI HindIII
domL
EP-PCR
Shuffled libray of L-domain variants
Recombinación
artificial
Ligation and transformation
Clones of shuffled libray
Screening by DHAK activity using poly-P
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EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
Screening de actividad DHAK usando poli-P como donador de grupos fosforilo
1,021,031,041,051,061,071,081,091,1
0 200 400 600
Time (s)
A 34
0 nm
Background
Mut. 3-C3
0,940
0,950
0,960
0,970
0,980
0,990
0 200 400 600
Time (min)
A 34
0nm Wild type DHAK
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EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
(activitymut – mean activitymut )
standard desviation control
=Z(X – μ )σc
=
Z ≥ 31H2
2C1 2D12H3
3C33E4
3H2
4B35A2
5B15C1
5F12
6A3
6D56D66F2
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EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
1H2 (13.5 mU/mg)
5F12 (10.5 mU/mg)
3E4 (7.70 mU/mg)
(1.5 – 3.0 mU/mg)
(< 0.5 mU/mg)
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EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
Mutante 1H2
Glu526Lys
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Agradecimientos
Israel Sánchez-Moreno
Laura Iturrate
Rocío Martín Hoyos
Juan Francisco García-García
Isabel Oroz
Elisa G. Doyagüez
MEC (CTQ2004-03523/BQU y CTQ2007-67403/BQU)
Alejandro Macías
Dr. Alfonso Fernández-Mayoralas
Comunidad de Madrid