Eduardo García-JuncedaInstituto de Química Orgánica General. CSIC.
Diseño y desarrollo de sistemas multi-enzimáticos para la formación estereoselectiva de enlaces C-C.
INTRODUCCIÓN
Edificio Empire State Puente de La Torre de Londres Torre Eiffel
REACCIÓN ALDÓLICA.
INTRODUCCIÓN
R1
O
R2
OH
R3
R1
O
R2
Cetonadonadora
H R3
O
Aldehídoaceptor
+
Generan 2 nuevos estereocentros con enantio- y diastereoselectividades generalmente excelentes.
Las 4 aldolasas son estereocomplementarias y la estereoquímica de los dos nuevos centros quirales formados está controlada por el enzima y no por los sustratos
ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP
PRINCIPAL INCONVENIENTE: DEPENDENCIA DE DHAP.
- Limita su campo de aplicación- Síntesis química compleja y con rendimientos moderados (65%)- Sustrato de coste muy elevado ⇒ inviable su uso a gran escala
- Lábil a pH neutros y básicos ⇒ menores rendimientos del aldol
ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP
DHAK DE CITROBACTER FREUNDII
Citrobacter freundii
Siebold, C. et al., J. Biol. Chem. 278:48236 (2003).
Dom-K Dom-L
conector
DHA ATPMg+2
Fosfolípido
DHAK DE CITROBACTER FREUNDII
I. Sánchez-Moreno, et al., ChemBioChem, 2009, 10, 225.
DHAK DE CITROBACTER FREUNDII
1. Sánchez-Moreno, I., et al., ChemBioChem, 10: 225, (2009); 2. Johnson, E.A., et al., J. Bacteriol., 160: 55, (1984); 3.Molin, M., et al., J. Biol. Chem., 278: 1415, (2003); 4. Itoh, N., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 193, (1999); 5.Yoshihara, K., et al., Appl. Environ. Microbiol., 62: 4663, (1996).
SISTEMA ROBUSTOdistintas aldolasas dependientes de DHAP
amplia batería de aldehídos con diversidad estructural
SISTEMA MULTI-ENZIMÁTICO
Sanchez-Moreno, I. et al., Chem. Comm,1634 (2004).
SISTEMA MULTI-ENZIMÁTICO
ii)i)
Puntos optimizables:
la necesidad de trabajar con tres enzimas.
la dependencia del pH para el correcto funcionamiento del sistema de regeneración de ATP.
Poly-P
DISEÑO DEL ENZIMA DE FUSIÓN QUINASA-ALDOLASA
His6 Dom K Dom L LINKER FBPA
NtCt
DHAK
FBPA
Ct
LINKER Dom L Dom K His6
DHAK
Nt
Iturrate, L. et al., Chem. Comm,1721 (2009).
To5DHAK = 48.7 ºC
T05FBPA = 54.9 ºC
ESTABILIDAD TÉRMICA DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN.
Representación de la fracción de proteína desnaturalizada, fu.
To5DLF = 53.7 ºC
T05Mezcla = 49.3 ºC
DLF: v = 0.4111 mmol/min
WT: v = 0.0234 mmol/min
0
2
4
6
8
0 20 40 60 80 100
ALD
OL
(μm
ol)
t (min)
HO OHO
+ATP ADP
OPO32-
OH
OH
ODHAKFBPA FBPA
OO
DHA O
1
2
SUBSTRATE CHANNELLING.
Iturrate, L. et al., Chem. Comm,1721 (2009).
FBPA
FBPA
DHAK
FBPA
FBPA
DHAK
Enzimas libres Enzima de fusión
SUBSTRATE CHANNELLING.
Iturrate, L. et al., Chem. Comm,1721 (2009).
GDHGDH
GDH
GDH
GDHFBPA
FBPA
DHAK
FBPA
FBPA
DHAK
SUBSTRATE CHANNELLING.
GDH
GDH
GDH
SUBSTRATE CHANNELLING.
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0 5 10 15 20 25 30 35
Unidade
s de
α‐GDH
µg de α‐GDH
Sistema de fusión Sistema multienzimático Sistema de fusión sin AcH
Evolución Dirigida
EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
Especie 4
Especie 3
Especie 2
Gen original
Recombinación
Mutagénesis
Especie 1
Gene híbridos
EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
pRSET-dhak
HindIIIMluI
Library ofL-domain variants
pRSET-dhak (4559 pb)
f1 ori
PT7
ampr
6xH EK domK C
AdeI HindIII
domL
EP-PCR
Shuffled libray of L-domain variants
Recombinación
artificial
Ligation and transformation
Clones of shuffled libray
Screening by DHAK activity using poly-P
EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
Screening de actividad DHAK usando poli-P como donador de grupos fosforilo
1,021,031,041,051,061,071,081,091,1
0 200 400 600
Time (s)
A 34
0 nm
Background
Mut. 3-C3
0,940
0,950
0,960
0,970
0,980
0,990
0 200 400 600
Time (min)
A 34
0nm Wild type DHAK
EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
(activitymut – mean activitymut )
standard desviation control
=Z(X – μ )σc
=
Z ≥ 31H2
2C1 2D12H3
3C33E4
3H2
4B35A2
5B15C1
5F12
6A3
6D56D66F2
EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
1H2 (13.5 mU/mg)
5F12 (10.5 mU/mg)
3E4 (7.70 mU/mg)
(1.5 – 3.0 mU/mg)
(< 0.5 mU/mg)
EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE LA DHAK.
Mutante 1H2
Glu526Lys
Agradecimientos
Israel Sánchez-Moreno
Laura Iturrate
Rocío Martín Hoyos
Juan Francisco García-García
Isabel Oroz
Elisa G. Doyagüez
MEC (CTQ2004-03523/BQU y CTQ2007-67403/BQU)
Alejandro Macías
Dr. Alfonso Fernández-Mayoralas
Comunidad de Madrid