Diagnóstico en microbiología de los alimentos:

de la placa de cultivo a la era

genómica

Dr. David Rodríguez Lázaro Grupo de Investigación en Seguridad Alimentaria

SEGURIDAD ALIMENTARIA: VIEJOS PATOGENOS, NUEVOS RETOS

Murcia 29 Enero de 2014

?

¿Seguridad Alimentaria? ¿Qué y por qué?

Scallan et al. (2011). Emerg Inf Dis 17: 7-15

USA

9,388,075 casos

• Coste anual en EE.UU. de casos agudos de gastroenteritis asociados a alimentos (47.780.779): 77.700 M$

Scharff, 2012

81% 77.700 M$ ≈ 59.759 M€

243% 74.284 M€ 24.598 M€ (Investigación)

Gran impacto económico

Epidemiología

Control del riesgo

Análisis del riesgo

Exposición

Comunicación del riesgo

Barreras colectivas Barreras individuales

Gestión del riesgo

SEGURIDAD ALIMENTARIA

Epidemiología

Control del riesgo

Análisis del riesgo

Exposición

Comunicación del riesgo

Barreras colectivas Barreras individuales

Gestión del riesgo

SEGURIDAD ALIMENTARIA

1. Paso final de aislamiento en medio sólido (agar)

2. Este medio será selectivo o diferencial (favorece el crecimiento y/o diferenciará las bacterias bajo estudio según éstas empleen fuentes de energía)

3. Siempre será un resultado presuntivo (NO DEFINITIVO), es necesario confirmación mediante pruebas extras para la correcta identificación

TIEMPO

= $$$$$ Reducción de tiempo de personal

Movilización rápida de los lotes (Reducción tiempo en almacén)

Capacidad discriminatoria • Origen de contaminación

• Detección de formas re-emergentes

Ausencia de métodos de referencia o adecuados • Microorganismos patógenos emergentes: p.ej. Cronobacter • Microorganismos alterantes específicos.

• A nivel mundial: 750 millones análisis anuales • Industria alimentaria: 420 millones • Análisis de rutina (viables totales): 360 millones

• Dos ideas importantes: Las compañías diagnósticas preparan tests diagnósticos antes de los requerimientos normativos Las empresas de alimentos no quieren realizar los análisis microbiológicos in situ, prefieren enviarlos a laboratorios alimentarios o centros de investigación

Tom Wesler. Strategic Consulting Inc. USA

• Análisis microbiológico:

56 % alimentos

30 % farmacia

10 % agua ambiental

4 % agua de consumo

37,2 % aerobios mesófilos

30,8 % E. coli (coliformes)

15,7 % mohos y levaduras

16,3 % patógenos

El coste es igual a la suma del resto

+ Más rápida

+ Más sencilla

+ Más sensible

+ Más específica

+ permite CUANTIFICACIÓN

Organización Internacional para la Estandarización

CEN/TC 275– Food analysis – Horizontal methods WG 6 – Microbial contamination

COMITÉ EUROPEO PARA LA NORMALIZACIÓN

La PCR diagnóstica tendrá el mismo estatus que las técnicas de cultivo bacteriológico convencionales para el año 2010.

La PCR diagnóstica tendrá el mismo estatus que las técnicas de cultivo bacteriológico convencionales para el año 2010 2020.

MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN

Concentration/pre-enrichmentPrecipitation (PEG), ultra-filtration-centrifugation

immunoconcentration, cationic separation TYPING

DETECTION

CultureCell cultureMicroscopy

SAMPLING1. Representativeness 2. sample characteristics 3. time of conservation4. conditions of storage

Molecularmethods

Immunologicalmethods

Nuclec acidpurification

Amplification Reactione.g. PCR, real- time PCR, RT-PCR, NASBA, LAMP, EMA-PCR

e.g.Plaque assayTCDI50

e.g.EIARIAELISA

e.g.SequencingMultiplex PCRserology

ExtractionSwabbing, rinsing, homogenization, gland. extraction

Rodríguez-Lázaro et al. FEMS Microbiol Rev. 2012

MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN

MENSAJE:

Deben ser: 1. Armonizados: definición y uso de PNTs 2. Controlados: uso de controles 3. Validados: empleo de ensayos de validación

(“ring trials )

?

USO de CONTROLES

PARA EVALUAR LOS RESULTADOS

MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN

Concentration/pre-enrichmentPrecipitation (PEG), ultra-filtration-centrifugation

immunoconcentration, cationic separation TYPING

DETECTION

CultureCell cultureMicroscopy

SAMPLING1. Representativeness 2. sample characteristics 3. time of conservation4. conditions of storage

Molecularmethods

Immunologicalmethods

Nuclec acidpurification

Amplification Reactione.g. PCR, real- time PCR, RT-PCR, NASBA, LAMP, EMA-PCR

e.g.Plaque assayTCDI50

e.g.EIARIAELISA

e.g.SequencingMultiplex PCRserology

ExtractionSwabbing, rinsing, homogenization, gland. extraction

Rodríguez-Lázaro et al. FEMS Microbiol Rev. 2012

• Control del procesado de la muestra • Control negativo del procesado de la muestra • Control ambiental • Control negativo de extracción

• Control positivo de amplificación • Control negativo de amplificación • Control estándar (sólo para cuantificación) • Control de amplificación

PREPARACIÓN

DETECCIÓN

ISO 22174:2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens -- General requirements and definitions

adenovirus humano(virus diana)

norovirus murino(virus control SPC)

11 laboratorios a nivel europeo

• El y puede interferir con los resultados finales

• La definición y discusión de los es

• El para evitar problemas

• Los evaluados son para la detección de

Selection and improving of fit-for-purpose sampling procedures for specific foods and

risks

(www.baselineeurope.eu)

Coordinator – Prof. Gerardo Mamfreda UNIBO (IT)

Aproximación: Usar los mismos medios de enriquecimiento (Half-Fraser para L. monocytogenes)

Evaluar alternativas para reducir el tiempo para resultados finales

Reducir los tiempos de incubación

Usar una protocolos de extracción de ADN sencillos y fáciles

Usar un método de PCR a tiempo real

Evaluar alternativas para reducir el coste del análisis

Usar rango de diluciones más bajo (1:3 y 1:5)

Parámetros a evaluar: Tamaño de la muestra (25 g o 50 g)

Dilución de la muestra (1:3, 1:5 o 1:10)

Tiempos de incubación (8, 18 or 24 horas de enriquecimiento)

Protocolo de extracción de ADN (calentamiento, resina Chelex, o kit de columna)

Comparación métodos alternativos vs ISO standards

L. monoctyogenes 1-10 ufc

10-100 ufc 100-1000 ufc

25 g 50 g

ISO Diluciones: 1:3 1:5 1:10

Incubación: 8 h 18 h 24 h Extracción ADN:

Calentamiento Chelex columna

Dilution Incubation times ISO

Baseline QIAGEN

Baseline CHELEX

Baseline BOILING

1 cfu / sample

1:3

8 h 3/3 0/3 0/3 0/3

18 h 3/3 0/3 0/3 0/3

24 h 3/3 1/3 0/3 0/3

1:5

8 h 3/3 0/3 0/3 0/3

18 h 3/3 0/3 0/3 0/3

24 h 3/3 2/3 1/3 0/3

1:10

8 h 3/3 0/3 0/3 0/3

18 h 3/3 0/3 0/3 0/3

24 h 3/3 3/3 1/3 0/3 ✔

50 muestras naturales:

25 contaminadas: 25/25 25/25

25 no-contaminadas: 25/25 25/25

ISO BASELINE

Listeria monoctyogenes

Dilución 1:10 Half Fraser (ISO)

Incubación 24 h

Extracción ADN: Columnas de QIAGEN

PCR a tiempo real Rodríguez Lázaro et al (2004) Appl. Environ. Microbiol.

7 Países 13 Institutos

Grupo de Investigación en Seguridad Alimentaria

Investigadores principales: Dr. David Rodríguez Lázaro Dra. Marta Hernández Pérez

Becarios: Jaime Ariza Miguel Eva Antolín Simón

Técnicos Superiores de Inv: Patricia González García Lorena López Enríquez

Antiguos miembros: Dra. Marta Diez (Univ. Burgos, ES) Dra. Lucía González (ITACyL, ES) Dra. Katarina Kovac (Biosistemika Inc., SL) Dra. Mónica Martínez (ICP-CSIC, ES) Dra. Katarina Oravcova (Univ. St. Andrews, UK) Diana Bezos (Univ. Valladolid, ES) Raquel Campo (Univ. Valladolid, ES) Sonia Ramos (Univ. Burgos, ES)