diagnosticando la circovirosis: ¿qué podemos hacer desde ... · abortadas o lechones...
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Joaquim Segalés
Diagnosticando la circovirosis: ¿qué podemos hacer desde un punto de
vista práctico?
Esquema
• Necesidad de diagnóstico de
laboratorio en la actualidad
• Herramientas de laboratorio
disponibles y su interpretación
• Criterios diagnósticos para PCV2-ES
• Criterios diagnósticos para PCV2-IS
• Criterios diagnósticos para PCV2-ER
• Criterios diagnósticos para PDNS
Diagnóstico laboratorial de PCV2-ES en España (2000-2011)
0
100
200
300
400
500
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700
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900
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
PMWS Non-PMWS
Introducción de la
primera vacuna de
PCV2 en España
Tres vacunas
de PCV2
en el mercado
desde 2009
PCV2-SD Non-PCV2-SD
Diagnóstico laboratorial de PCV2-ES en España (2000-2011)
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2004
2005
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2007
2008
2009
2010
2011
PMWS Non-PMWS
Introducción de la
primera vacuna de
PCV2 en España
Tres vacunas
de PCV2
en el mercado
desde 2009
PCV2-SD Non-PCV2-SD
Necesidad de diagnóstico de
laboratorio en la actualidad
• Todavía, en granjas con una imagen
clínica compatible con PCV2-ES
• Para descartar los casos clínicos en los
que el desmedro de los cerdos es el
signo principal
• Lo más importante, cuando no se
alcanzan los resultados esperados
con la vacunación, o hay sospechas
de “fallos vacunales”
Herramientas de laboratorio
disponibles
• Histopatología
• Immunohistoquímica/hibridación in situ
• PCR
• PCR Real-time/cuantitativa
• Secuenciación
• Aislamiento vírico
• Detección de anticuerpos (IPMA – IFA,
ELISA)
Histopatología
• Permite la determinación de lesiones
microscópicas características de la
infección por PCV2:
– TEJIDOS LINFOIDES: deplección
linfocitaria junto con inflamación
granulomatosa
– No lesión linfoide: inflamación
linfohistiocítica (mononuclear)
• En casos severos, virtualmente cualquier
tejido puede verse afectado
Histopatología
NORMAL
MODERADA
MEDIA
SEVERA
PCV2-ES
Histopatología
NORMAL
MODERADA
MEDIA
SEVERA
• PCV2-IS
• Periodo de convalecencia
posterior a PCV2-ES
• Fases iniciales de PCV2-ES
Immunohistoquímica/
hibridación in situ
• Permite la determinación del agente
(PCV2) dentro de las lesiones existentes
• Permite la semi-cuantificación del
agente (PCV2)
• En casos severos, PCV2 puede ser
virtualmente detectado en todos los
tejidos en los casos de PCV2-ES
BAJO
ALTO
MODERADO
PCV2-ES
Immunohistoquímica/
hibridación in situ
BAJO
ALTO
MODERADO
• PCV2-IS
• Periodo de convalecencia
posterior a PCV2-IS
• Fases iniciales de PCV2-IS
Immunohistoquímica/
hibridación in situ
PCR
0
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20
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40
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70
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0-5 6-11 12-16 17-20 21-28
Grupos de edad (semanas)
Granjas afectadas PCV2-ES Granjas sin PCV2-ES
PC
V2
PC
R p
revale
ncia
Sib
ila e
t al.,
2004
PCR
0
10
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30
40
50
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0-5 6-11 12-16 17-20 21-28
Grupos de edad (semanas)
Granjas afectadas PCV2-ES Granjas sin PCV2-ES
PC
V2
PC
R p
revale
ncia
Sib
ila e
t al.,
2004
La ubicuidad de PCV2
no permite usar las
técnicas de detección
cualitativas para
diagnosticar PCVDs
PCR Real-time cuantitativa
-
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0 1 2 3 4
Lo
g 1
0 c
op
ies/m
l
Medias Moderadas Severas
LESIONES PCV2-ES
a b c
PCV2-ES
PCV2-IS
¿Otras?
Olvera et al., 2004
y = 1,354x - 2,0485
R² = 0,2858
0
2
4
6
8
10
12
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00
Gra
do
med
io g
lob
al
Copias de PCV2 DNA/ml de suero (log10)
Correlación entre PCR cuantitativa y grado patológico
PCR Real-time cuantitativa
y = 1,354x - 2,0485
R² = 0,2858
0
2
4
6
8
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0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00
Gra
do
med
io g
lob
al
Copias de PCV2 DNA/ml de suero (log10)
Correlación entre PCR cuantitativa y grado patológico
PCR Real-time cuantitativa
La probabilidad de ser PCV2-ES cuando se
detectan
elevadas cargas de PCV2 es alta.
Sin embargo, el uso de RT-qPCR DEBE SER
interpretado en el contexto de una
población
y no en individuos aislados
Secuenciación
• Se ha vuelto más importante en los
últimos años– estudios filogenéticos
• Da información sobre el genotipo (PCRs
genotipo-específicas se han desarrollado
para investigación)
• Posiblemente, serán más utilizadas en
el futuro, especialmente en aquellos
casos “PCV2 positivos, con sospecha de
fallo vacunal”
Aislamiento del virus
• Excelente técnica para tener el virus “en
las manos” – ¡¡pero actualmente sin
interés diagnóstico!!!
Técnicas de detección de
anticuerpos frente a PCV2 • IPMA (ensayo de immunoperoxidasa monocapa)
- titulación
• IFA (test de anticuerpos immunoflurescentes) –
titulación
• ELISA – diferentes productos comerciales;
generalmente, interpretados como
positivo/negativo
http://www.thermoscientific.com
Detección de anticuerpos
Grupos de edad (semanas)
PC
V2
an
ticu
erp
os
tota
les
(IP
MA
)
Sib
ila e
t al.,
2004
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0-5 6-11 12-16 17-20 21-28
Granjas afectadas PCV2-ES Granjas sin PCV2-ES
Detección de anticuerpos
Grupos de edad (semanas)
PC
V2
an
ticu
erp
os
tota
les
(IP
MA
)
Sib
ila e
t al.,
2004
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De nuevo, la ubicuidad de PCV2
no permite utilizar las técnicas
de detección de anticuerpos
del virus para
diagnosticar PCVDs
Granjas afectadas PCV2-ES Granjas sin PCV2-ES
Detección de anticuerpos
• La titulación de sueros generalmente
permite la interpretación biológica
de los resultados serológicos
Detección de anticuerpos
Pileri et al., 2014
Criterios diagnósticos para
PCV2-ES
DEFINICIÓN DE GRANJA TIPO CON PCV2-ES
• Incremento en la mortalidad postdestete
comparada con los datos históricos de la
granja, conjuntamente con la observación
de signos clínicos compatibles con PCV2-
ES
• Diagnóstico de PCV2-ES en al menos uno
de cada 3-5 lechones necropsiados en ese
momento
Diagnóstico Individual
1. Signos clínicos compatibles:
principalmente desmedro y dificultad
respiratoria
H/E
PCV2
ISH
2. Histopatología:
moderada a severa deplección linfoide
e inflamcción granulomatosa
3. Detección de PCV2:
moderada a alta cantidad de virus
Consejos prácticos (PCV2-ES)
• Utilizar cerdos con enfermedad aguda
(1ª semana de la evolución clínica) – 3 a
5 cerdos
• Tejidos diana: linfonódulos
Criterios diagnóstico para
PCV2-IS
1. Falta de signos clínicos manifiestos
2. Ninguna o mínimas lesiones
histopatológicas en tejidos
(principalmente linfoides)
3. Baja cantidad de PCV2 en unos pocos
tejidos (linfoide)
• Los criterios 2 y 3 pueden ser potencialmente
sustituidos por técnicas de detección de PCV2
tales como la PCR estandar
Seg
alé
s, 2
012
Criterios diagnóstico para
PCV2-ER
• Los dos principales problemas
ligados a PCV2 desde el punto de
vista reproductivo:
– Problemas de gestación temprana
(mínimamente caracterizados)
– Problemas de gestación tardíos
Aparentemente baja frecuencia de
ambos. ¿Hay un impacto subclínico de
PCV2 en reproducción?
Gestación temprana
1. Repeticiones cíclicas
2. Seroconversión a PCV2 después de la
repetición y/o PCR positiva a PCV2
alrededor de la repetición
Sugerido en:
Gestación tardía
1. Signos clíncos compatibles:
principalmente abortos y momificados
2. Histopatología:
miocarditis fibrosa a necrotizante en
los fetos
3. Detección de PCV2:
moderada a alta cantidad de virus
Fotos cortesía de Dr. Darin Madson (ISU, USA)
Consejos prácticos
(PCV2-ER – gestación tardía)
• Utilizar diferentes fetos de cerdas
abortadas o lechones
momificados/nacidos muestos
– PCV2 podría estar solo en unos pocos fetos
en el momento de toma de muestras
• Tejidos diana: miocardio fetal
Criterios diagnósticos para
PDNS
1. Lesiones cutáneas hemorrágicas y
necrotizantes y/o riñones inflamados y pálidos
con petequias corticales generalizadas
2. Vasculitis necrotizante sistémica, y
glomerulonefritis fibrinosa y necrotizante
PCV2 se presenta habitualmente en los
casos de PDNS pero su existencia no
es un síntoma patognomónico
Muchas gracias por su
atención