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Diagnóstico molecular de PRRS
Reunión GITEP 11/12/13
Ariel Pereda
Laboratorio de Aves y Porcinos
Instituto de Virología - INTA
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Clínica: Fallas reproductivas – Respiratorias (depende de patogenicidad)
Diagnóstico de PRRS
Adultos Camadas afectadas Lechones destetados
Reducción del apetito Mortinatos Pérdida de apetito - Letargia
Fiebre Alta mortandad pre destete Fallas en crecimiento
Partos prematuros - Abortos Lechones momificados Distress respiratorio
≥10% de mortandad Nacimientos deparejos Petequias y equimosis en piel
Prob. neurológicos Edema periorbital Pelo áspero
Complementarios: Laboratorio • Serología ELISA (Clasif. Granjas, circ. Viral, Cuarentena) • Virología Aislamiento (lento, no afectado x mutaciones) • Molecular RT-PCR – Real Time RT-PCR – EPIMOL
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Diangóstico diferencial
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Muestras a remitir para diagnóstico Serología: Suero o plasma. A partir de los 5 días post infección hay presencia de IgM y a los 14-21 dpi IgG sérica. Pico máximo a los 40-50 dpi y caen lentamente hasta los 4 a 6 meses Aislamiento viral y Diagnóstico Molecular: (1 – 2 dpi, pico de viremia a los 10 dpi) Sangre entera EDTA) Buffy Coat Suero Plasma Pulmones Linfonódulos (mediastínico) Bazo Tonsilas PRRSV replica en macrófagos alveolares
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TEST MOLECULARES DISPONIBLES
RT-PCR CONVENCIONAL • Muchos protocolos existentes • La mayoría dirigidos al ORF7 • Simples o “nested” • Más rápidos que el aislamiento • No requiere de virus viable • Alta sensibilidad • Riesgo de contaminación cruzada
RT-PCR EN TIEMPO REAL • Menor cantidad de protocolos existentes • Dirigidos al ORF5, ORF 6 y ORF7 • Semi cuantitativos • Más rápidos que el aislamiento • No requiere de virus viable • Más sensibles que el convencional • Menor Riesgo de contaminación cruzada
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Kits Comerciales para Real Time RT-PCR
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Por la naturaleza del virus
Se deben tener al menos 2 o 3
diferentes test diagnósticos
2013 - USA
2012 - EU
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Biología Molecular Epidemiología
Epidemiología Molecular
" el estudio de la distribución y determinantes de enfermedades que afectan
transitoriamente a muchos individuos en un sitio determinado"
Epidemiología: definición
Evolución: definición
La teoría que explica como los organismos cambian a través del tiempo
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Fenotipo
• Caracteres: color de la flor
• Estados de cada carácter: rojo, amarillo, rosa.
Genotipo
Caracteres: cada posición de nucleótido o aminoácido
Estados de cada carácter: A, G, T o C
Secuencia
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¿Para qué son necesarios
estudios filogenéticos?
•Filogenia: ¿Cuál es la historia de este grupo de especies? ¿Cómo se
relacionan? ¿cuál es la historia de este gen?
•Delimitación de especies: ¿Pertenecen estas dos poblaciones a una sola
especie o a dos especies diferentes?
•Estructura de poblaciones: ¿Como se explica la diferenciación entre
poblaciones de la especie X?
•Origen: ¿De dónde viene el individuo X?
•Relaciones: ¿Está este grupo de individuos relacionado?
•Individualización: ¿Cómo la muestra del individuo X se relaciona con el
individuo Y?
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Metodologías aplicadas a los estudios
epidemiológicos
•Hibridización por sonda
•PCR diferencial
•Corte por enzima de restricción
PRESENCIA Y TIPIFICACIÓN
•RAPDs
•AFLP
•Microsat
•Secuenciación
PRESENCIA, TIPIFICACIÓN Y ANÁLISIS
FILOGENÉTICO
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0.1 O1Campos58
OTaiwan97
Asia1
Paquistan54
SAT3
Bechuanaland 65
SAT1
Bostwana68
SAT2
Kenya57
A24Cruzeiro55
A27Colombia67
C1SantaPau58
C3Argentina85
Representación visual de la posible relación histórica entre los
organismos en estudio
Árbol filogenético
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• Nucleótidos vs. proteínas
• Mutaciones: Cambios en la composición genética del individuo durante la
replicación del ADN en relación a un estado ancestral.
• 1.Sustituciones.
• 2.Eliminaciones.
• 3.Inserciones.
• 4.Inversiones.
Regiones conservadas vs. regiones variables
Saturación: se debe a múltiples cambios en el mismo sitio
•En el estudio de la evolución, es fundamental conocer la escala
temporal y espacial de la dinámica de los procesos
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Análisis filogenético
Grupo monofilético
Ramas
Árbol sin raíz
Tiempo evolutivo
Dicotomía
Politomía
Ancestro
OTU
Árbol con raíz
98
remuestreo
Unidades
Taxonómicas
Operativas
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La evolución de los patógenos presenta un desafío
para el sistema de salud.
Le permite escapar de la respuesta inmune del
huesped
Le permite cambiar el rango de hospedador y
modificar su virulencia.
La identificación de sitios claves en el genoma viral
Desarrollo de modelos de evolución viral y transmisión
Evolución
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¿Para qué son necesarios
estudios filogenéticos?
•Filogenia: ¿Cuál es la historia de este grupo de especies? ¿Cómo se
relacionan? ¿cuál es la historia de este gen?
•Delimitación de especies: ¿Pertenecen estas dos poblaciones a una sola
especie o a dos especies diferentes?
•Estructura de poblaciones: ¿Como se explica la diferenciación entre
poblaciones de la especie X?
•Origen: ¿De dónde viene el individuo X?
•Relaciones: ¿Está este grupo de individuos relacionado?
•Individualización: ¿Cómo la muestra del individuo X se relaciona con el
individuo Y?
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ORF 5
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Conclusiones
Diagnóstico molecular de PRRS • Más Rápido • Más sensible • Más costoso
Sigue necesitando del diagnóstico clínico anamnesis
No es suficiente contar con un solo test
Epidemiología molecular de PRRSV • Ubicación temporo-espacial • Análisis de riesgo • Taxonomía - clasificación • Indicador de antigenicidad