determinacion de salmonella en el huevo y pollo

Determinacin de Salmonella en Huevos y Pollo

objetivos Validar una estrategia de analisis de salmonella en el huevo y pollo que permita garantizar la fiabilidad del producto con el fin de aplicarlo en granjas y mataderos de pollos. Disminuir la incidencia y prevalencia de infecciones mediante actuaciones de control en toda la cadena alimentaria y el control de este patogeno en todas las etapas de la cadena de procesamiento de estos alimentos.fundamento teorico

El gnero Salmonella est compuesto por bacilos Gram negativos aerobios facultativos. Algunos de los cuales, son responsables de una enfermedad bacteriana denominada salmonelosis. La salmonelosis humana es una de las principales zoonosis de transmisin alimentaria tanto a nivel mundial como a nivel europeo y nacional y provoca graves consecuencias econmicas, sociales y sanitarias.

Los huevos de gallina recin puestos no suelen estar contaminados, s bien algunos microorganismos pueden ganar acceso a stos a travs del oviducto. Los microorganismos presentes en el interior del huevo proceden principalmente del tracto intestinal de las aves, el ponedero, el polvo, las cajas de embalaje y almacenamiento, etctera,y pueden penetrar a travs de los poros del cascarn si ste se encuentra caliente y se contamina con materia fecal fra, entonces los grmenes pasan al interior, conforme este territorio se va enfriando.Entre los microorganismos productores de infecciones alimentarias que pueden estar presente en el huevo se encuentran Salmonella spp u otras Enterobacterias.(Viora S, Barrios H, Ferraroti J, Anselmo RJ. Estudio de un brote familiar de origen alimentario porSalmonella enteritidis. Memorias de la Conferencia Internacional sobre Ciencia y Tecnologa de los Alimentos. La Habana, 1994).En los ltimos aos en algunos pases se han incrementado los casos de infecciones alimentarias por el consumo de huevo contaminado con Salmonella; en Espaa a partir de 1978 se han incrementado las infecciones debidas a Salmonella enteritidis asociada con huevos o con productos elaborados a base de huevo como la mayonesa.En los Estados Unidos huevos de gallinas infectados fueron responsables de varios informes de infecciones en el humano porSalmonella enteritidisentre 1976 y 1986,y en Inglaterra tambin ha sido implicada laSalmonella enteritidisPT4 y laSalmonella typhimuriumen brotes por medio del huevo.Por todo lo antes expuesto y por ser la salmonelosis la segunda causa de infeccin alimentaria en Cuba y la primera en el mundo,realizamos el presente trabajo para conocer el grado de contaminacin del huevo por Salmonella y la calidad sanitaria de este alimento.

material y metodo

3.1. Aparatos y material

Asas de siembra estriles Autoclave Balanza de precisin 0.01g Bolsa estril de masticador Cabina de flujo laminar Diluctor Estufa de incubacin Gradillas Masticador Mechero de alcohol Mini-Vidas Placas de petri Pinzas y tijeras de acero inoxidable Probeta de vidrio graduada Pipetas y puntas estriles

3.2. Reactivos y productos

Agua desmineralizada Agua de peptona tamponada APT Alcohol de 70 Galeras API 20E (Biomerieux) y reactivos Kit Vidas Inmuno-Concentracin Salmonella II (ICS2) Medio de enriquecimiento selectivo Selenito Medios slidos selectivos en placa: Agar SM-ID, Agar Hecktoen (HE), Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD). Parafina Solucin salina estril

3.3. Muestras

4 muestras de pollo fresco troceado (pechuga de pollo,contramuslo del pollo,zanco del pollo ala de pollo) 2 muestras de huevos de tamao medio (yema + clara y huevo completo)

procedimiento

Para validar un mtodo de anlisis de Salmonella en huevo y pollo se siguen los siguientes pasos:1. Se analizan las muestras de pollo y los huevos para garantizar que no presentan Salmonella. 2. Se preparan los inculos a nivel de lmite de deteccin y se verifican mediante controles por triplicado. 3. Se inoculan las muestras con una cantidad de Salmonella conocida y se analizan de nuevo tras su inoculacin. 4. Se realiza la mezcla de las muestras inoculadas y no inoculadas y se analizan para comprobar si se detecta Salmonella al mezclar muestras positivas y negativas.

Debido a que el procedimiento es de deteccin, se autoclavan las muestras positivas para eliminar la Salmonella presente en ellas antes de inocularlas con una cantidad conocida. A continuacin, se describe de manera detallada el procedimiento a seguir para realizar la validacin del mtodo. La investigacin de Salmonella spp. est estructurada en cuatro fases sucesivas: (ver Anexos) Preparacin de la muestra y preenriquecimiento en agua de peptona tamponada durante 182 horas a 371C. Los microorganismos del gnero Salmonella pueden encontrarse en pequea cantidad y mezclados con otros interferentes ms numerosos. El preenriquecimiento es tambin necesario para recuperar microorganismos lesionados. Inmunoconcentracin. Tras la incubacin, se inocula en el material especfico (ICS) para el proceso de inmunoconcentracin automtica con Mini-Vidas, que los asla de interferentes. Nota: la inmunoconcentracin se compara con el procedimiento tradicional mediante un enriquecimiento selectivo en selenito.Aislamiento e identificacin. A partir del inmunoconcentrado obtenido se realiza la siembra en dos medios selectivos slidos: placa con medio Agar Hektoen (HE) y placa con medio Agar XLD (Xilosa Lisina Desoxicolato) o medio Agar SM (cromgenos con sustrato glucuronato). Las placas se incuban a 37C y se examinan a las 24h para comprobar si tienen colonias sospechosas de ser Salmonella spp. Confirmacin: Si hay colonias sospechosas es necesaria confirmacin con pruebas bioqumicas y serolgicas. 1. PREPARACIONDE LA MUESTRA Y PRE-ENRIQUECIMIENTOSe debe trabajar en condiciones de asepsia. Para ello, se realizar la manipulacin de las muestras siempre en cabina de flujo laminar o con el mechero de alcohol encendido. Adems, todos los elementos que entren en contacto con la muestra deben ser estriles.Preparacin previa de muestraProductos crnicos: Tomar una muestra representativa (25 gramos) y cortarla en trozos de 0,5 1 cm. La fraccin de alimento destinada a su anlisis debe ser representativa de la totalidad de la muestra. Si el alimento est integrado por distintos componentes se tomarn fracciones representativas de cada uno de ellos, tanto en superficie como en profundidad. Lavar con alcohol y flamear el material de trabajo necesario para la manipulacin entre operacin y operacin y trabajar con el mechero de alcohol encendido.

Huevos: El anlisis de los huevos puede realizarse con o sin esterilizacin de la cscara. Para la deteccin de la flora total (cscara+yema+clara) no es necesario esterilizar los huevos antes de abrirlos. Los huevos se abren utilizando tcnicas aspticas y se introduce la cscara y su contenido en un recipiente estril. Para la deteccin de la flora interna (yema+clara) es necesaria la esterilizacin. Para ello, se quita cualquier suciedad de la cscara con un pao y agua. Utilizando una toallita empapada en alcohol al 70% se limpia toda la superficie y se deja secar completamente sin contaminacin. A continuacin, se rompe el huevo y se abre aspticamente introduciendo el contenido en un recipiente estril.Pesada de la muestra1. Se pesan 25 gramos de cada muestra en bolsas estriles del masticador (previa tara) para evitar contaminacin en su manipulacin.2. La porcin de muestra a analizar se introduce en la bolsa del masticador utilizando material de trabajo estril y flameado entre operacin y operacin.3. Evitar manipular la muestra en el interior de la bolsa si la cantidad pesada no se ajusta exactamente a la especificada (excepcionalmente hasta el 5%). Si la diferencia es mayor manipular la muestra con el mayor cuidado posible.Adicin del diluyente y preenriquecimiento1. El peso de la muestra en gramos se multiplica por 9 y el resultado indica el volumen de diluyente en mililitros que es necesario aadir para obtener la dilucin 1:10 (suspensin madre).2. En nuestro caso, como hemos pesado 25g de muestra en cada bolsa, para preparar la suspensin madre, se aaden 225ml del medio de preenriquecimiento (agua de peptona tamponada).3. Para evitar alteraciones de crecimiento de microorganismos por cambios bruscos de temperatura, el diluyente debe estar a temperatura ambiente.4. El diluyente se transfiere de modo asptico a la bolsa estril de masticador que contiene la muestra.5. Se homogenizar en el masticador durante 1-2 minutos (nunca ms de 2 minutos), pudiendo variar ese tiempo en funcin de la textura y composicin de la muestra. Deben tomarse precauciones especiales cuando exista riesgo de rotura de la bolsa (presencia de partculas o componentes de la muestra con formas afiladas o duras) o de componentes de difcil homogeneizacin.6. Incubar la suspensin madre en la bolsa de masticador en recipiente que garantice su estabilidad a 37 1C durante 18 2 horas.7. En muestras cidas o acidificantes comprobar tras la incubacin que el pH es mayor a 4,5.8. Para garantizar un correcto flujo de aire, las bolsas debern colocarse en grupos de 8-10 unidades como mximo, separados entre s y de las paredes del incubador por lo menos 25mm.*Nota: El tiempo de preparacin desde la preparacin de la suspensin inicial hasta el momento en que el inculo entra en contacto con el medio de cultivo nunca debe exceder los 45 minutos.2. ENRIQUECIMIENTOInmunoconcentracin en MiniVidas1. Sacar los reactivos necesarios de la nevera (Vidas Inmuno-Concentracin Salmonella ICS) y dejar atemperar 30 minutos. Utilizar un cartucho cdigo ICS y un cono ICS para cada muestra.2. Homogenizar mediante agitacin las muestras y el estndar a analizar y transferir aspticamente mediante pipeta con punta estril 0.8ml del caldo de preenrequecimiento (sustituir por el estndar cuando se efecte la calibracin) al pocillo 4 para realizar la inmunoconcentracin. Las puntas de pipeta estriles son de un nico uso, cambiar entre cada muestra.3. Colocar en el sistema los conos y los cartuchos y programar las muestras. Iniciar el anlisis (ejecucin automtica). La etapa de inmunoconcentracin se completa en 40 minutos aproximadamente. *Nota: Las muestras inmunoconcentradas deben ser utilizadas en la media hora que sigue a la finalizacin del test.Enriquecimiento selectivo en Selenito1. Homogenizar mediante agitacin las muestras y transferir mediante pipeta estril 1ml del caldo de preenrequecimiento en un tubo con 9ml de Selenito.2. Incubar los tubos a 43 1C durante 20 4 horas.

3. CULTIVO EN MEDIO SOLIDOSiembra e incubacin de las placas1. En cmara de flujo laminar, transferir una alcuota del inmunoconcentrado con un asa estril calibrada de 01ml a dos placas de Petri, una con Agar Hektoen y otra con XLD o SM. Sembrar con aislamiento permitiendo el desarrollo de colonias bien aisladas. Repetir el proceso para cada una de las muestras.2. Mantener las placas cerradas y sin invertir mientras el inculo no se absorbe (5-10 minutos). Si pasado este tiempo el inculo todava no se absorbe, colocar la placa en el incubador e invertirla tras 10-20 minutos.3. Incubar a 37 1C durante 20 4 horas.4. Si es posible, la estufa de incubacin no se llenar completamente en una nica operacin, para evitar tiempos prolongados de estabilizacin. Para garantizar un correcto flujo de aire, las placas debern colocarse en pilas de 6 unidades como mximo, y separadas entre s y de las paredes del incubador por lo menos 25mm.5. Con las muestras en selenito se sigue el mismo proceso una vez se hallan incubado.

Examen de las placasDespus de la incubacin las placas deber ser examinadas inmediatamente. Si no es posible, se almacenarn un mximo de 24 horas en nevera. Se examinan las placas y se identifica como presunta Salmonella spp. toda colonia sospechosa.

Las colonias tpicas de Salmonella cultivadas en Agar Hektoen (HE) son verdes con el centro negro; verdes sin centro negro (no productoras de sulfhdrico) amarillas con centro negro (lactosa positivas). Las colonias tpicas de Salmonella en Agar XLD son de color de rosa a rojo con o sin centro negro. Las colonias tpicas de Salmonella en SM son de color de rosa a veces con un contorno incoloro. Nota. Deben de confirmarse las colonias tpicas y las dudosas, porque independientemente de la experiencia, su aspecto puede variar no slo de una especie a otra sino tambin de un lote de medio de cultivo a otro.4. PRUEBAS BIOQUIMICAS1. Es necesaria siempre la confirmacin de las colonias sospechosas.2. Para realizar la confirmacin bioqumica vamos a utilizar un test bioqumico para Enterobacteriaceae de la galera API 20E. (ver Anexos)3. Este tipo de tests incluyen una batera de pruebas bioqumicas que nos permiten reducir el tiempo y el trabajo necesario para la realizacin de cada uno de los anlisis.4. Seleccionar una colonia considerada tpica o sospechosa (preferentemente con aspecto morfolgico diferente) en cada placa.5. Resuspender cada colonia en agua salina y realizar un test bioqumico para Enterobacteriaceae de la galera API 20E para cada muestra.6. Incubar a 36 2C durante 18-24 horas.

Muestras inoculadas con Salmonella Los anlisis realizados en las muestras adquiridas en una cadena de distribucin indican presencia de Salmonella en las 4 muestras de pollo. Para poder garantizar la validez del estudio se autoclavan las muestras para eliminar la Salmonella y mantener el efecto matriz en la medida de lo posible. La muestra de huevo completo se descarta (evitamos problemas de procesamiento de muestra dado que en ocasiones la cscara perfora la bolsa del masticador) y la muestra de contenido de huevo no necesita autoclavarse porque no presenta salmonella. Una vez autoclavadas se pesa 25 gr de cada muestra y se aade el agua de peptona tamponada tal y como se indica en el apartado anterior. Cada muestra se hace por duplicado. Se aade el inculo en cada bolsa: en las muestras se aaden 0,08ml de la dilucin 10-5 y en los duplicados 0,02ml de la dilucin 10-6. Homogeneizar el contenido de las bolsas de masticador e incubar a 37 1C durante 18 2 horas. Tras la incubacin se realiza la inmunoconcentracin en MiniVidas, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, de las muestras y los duplicados. Adems, dos de las muestras y sus duplicados se inoculan tambin en tubos con selenito y se incuban a 37 1C durante 20 4 horas. El inmunoconcentrado se siembra con asa de siembra de 0,1ml en placas con medio de cultivo Agar Hektoen y XLD o SM y se incuba a 37 1C durante 20 4 horas. Tras la incubacin de los tubos con selenito se siembran placas de Agar Hektoen y se incuban a 37 1C durante 20 4 horas. Realizar la comprobacin bioqumica de las colonias sospechosas mediante un test bioqumico para Enterobacteriaceae de la galera API siguiendo las instrucciones indicadas anteriormente e incubar a 36 2C durante 18-24 horas.Muestras compuestas Cada muestra compuesta est formada por cinco muestras individuales. (ver Anexos) Para realizar el anlisis de las muestras compuestas se parte de la solucin madre de cada muestra. Descartamos realizar la combinacin de la muestra antes del preenriqueciminto pesando 5gr de cada muestra en una sola bolsa de masticador porque si la mezcla se hace tras el enriquecimiento de 25 gramos de cada muestra por separado se consigue que la toma de muestra sea ms representativa. En 2 tubos se aaden 1ml de la solucin madre de 4 muestras antes de aadirle el inculo y 1 ml de la solucin madre de una muestra tras aadirle el inculo. En los otros 2 tubos se aaden 1ml de la solucin madre de 4 muestras antes de aadirle el inculo y 1 ml de la solucin madre de un duplicado tras aadirle el inculo. Se realiza la inmunoconcentracin en MiniVidas de los 4 tubos, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Se inoculan tambin 4 tubos con Selenito y se incuban a 37 1C durante 20 4 horas. El inmunoconcentrado se siembra con asa de siembra de 0,1ml en placas con medio de cultivo Agar Hektoen y SM. Tras la incubacin de los tubos con selenito se siembran placas de Agar Hektoen y se incuban. Realizar la comprobacin bioqumica de las colonias sospechosas mediante un test bioqumico para Enterobacteriaceae de la galera API siguiendo las instrucciones indicadas anteriormente e incubar a 36 2C durante 18-24 horas.resultadosEl anlisis microbiolgico de las muestras tomadas en una cadena de distribucin ha determinado que las 4 muestras de pollo estn contaminadas con Salmonella.

IdPlaca HEAPI 20E

M1Colonias sospechosasPresencia/25gr




M5Ausencia de coloniasAusencia/25gr

M6Ausencia de coloniasAusencia/25gr

Tabla1. Resultados de las muestras individuales.Los resultados de las muestras de huevos indican que no estn contaminados con Salmonella ni con otros microorganismos ya que en las placas tampoco han crecido otras colonias.Verificacin del inculoPara verificar el inculo se siembran 3 placas de medio Hecktoen con 0,1ml de la dilucin 10-6. Tras la incubacin se hace el recuento de las colonias de cada placa y se obtienen los siguientes resultados.

Placa HERecuento de colonias

122ufc/0,1ml

223ufc/0,1ml

315ufc/0,1ml

Tabla2. Recuento de las colonias de Salmonella El inculo que hemos utilizado para realizar la validacin del mtodo de anlisis de Salmonella tiene una concentracin de 20 ufc/0,1ml de la dilucin 10-6.

Muestras y duplicados inoculados con Salmonella

Las muestras y sus duplicados fueron sometidos a un proceso de esterilizacin y posteriormente inoculados con una cantidad conocida de Salmonella.

De acuerdo con la estandarizacin, para 0,3ml de la dilucin 10-6 el resultado esperado es 138ufc (terico) por lo tanto, en 0,1ml es de 46ufc. Sin embargo, este dato no es real, ya que se ha comprobado que el inculo en realidad tiene 20ufc/0,1ml de la dilucin 10-6

20ufc0,1ml20ufc0,1ml

x0,02mlx0,008ml

x = (20x0,02) / 0,1 = 4ufcx = (20x0,008) / 0,1 = 1,6ufc

Segn los resultados obtenidos al ajustar la concentracin del inculo las muestras fueron inoculadas con 4ufc y los duplicados con 1,6ufc.Las muestras y sus duplicados se analizaron mediante una inmunoconcentracin y un mtodo tradicional de enriquecimiento selectivo en Selenito.

Inmunoconcentracin

IdPlaca HEPlaca XLDPlaca SMAPI E20

M1.1Colonias sospechosasColonias sospechosasPresencia/25gr










Tabla3. Resultados obtenidos por inmunoconcentracin

Enriquecimiento selectivo en Selenito

IdPlaca HEAPI E20

M1.1Colonias sospechosasPresencia/25gr




Tabla4. Resultados obtenidos por enriquecimiento selectivo. Como era de esperar tras la inoculacin el resultado de todas las muestras ha sido positivo para Salmonella. Adems, no se aprecian diferencias en los resultados obtenidos. Independientemente del mtodo utilizado para el anlisis (inmunoconcentracion o mtodo tradicional con enriquecimiento selectivo en selenito) o del medio de cultivo empleado (HE, XLD, SM).

Muestras compuestasLas muestras compuestas estn formadas por la combinacin de las muestras sin inocular con las muestras y duplicados inoculados con Salmonella.Se analizaron por inmunoconcentracion y por el mtodo tradicional con enriquecimiento selectivo en selenito obteniendo los siguientes resultados:

Inmunoconcentracin

IdPlaca HEPlaca SMAPI E20

T1Colonias sospechosasColonias sospechosasPresencia/25gr




Tabla5. Resultados obtenidos por inmunoconcentracin

Enriquecimiento selectivo en Selenito

IdPlaca HEAPI E20

T1Colonias sospechosasPresencia/25gr




Tabla6. Resultados obtenidos por enriquecimiento selectivo. Todas las muestras compuestas fueron positivas para Salmonella y adems, se obtuvieron los mismos resultados por inmunoconcentracin y por el mtodo tradicional.

conclusiones

Hemos validado una estrategia de analisis de salmonella en el huevo y pollo que permita garantizar la fiabilidad del producto con el fin de aplicarlo en granjas y mataderos de pollos ya que los huevos y los productos derivados del huevo constituyen el principal vehculo de las salmonelosis humanas aunque la venta de alimentos con presencia de de Salmonella est prohibida es muy importante extremar las precauciones a la hora de manipular los alimentos en casa porque, como se ha comprobado en este estudio, puede haber productos de venta al pblico con Salmonella.

Disminuir la incidencia y prevalencia de infecciones mediante actuaciones de control en toda la cadena alimentaria y el control de este patgeno en todas las etapas de la cadena de procesamiento de estos alimentos y controles microbiolgicos son imprescindibles para reducir el riesgo de contaminacin de los consumidores por eso, es muy importante investigar mtodos ms eficaces.

Los resultados obtenidos en el estudio confirman que nuestro mtodo es suficientemente sensible y especfico para evitar que el efecto de la dilucin tras la combinacin de las muestras afecte a la deteccin del microorganismo.

Se logra aislar la Salmonella incluso cuando se combinan 4 muestras negativas con una muestra positiva inoculada con

determinacion de salmonella en el huevo y pollo

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