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UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS
LICENCIATURA EN CIENCIAS AGRÍCOLAS CON ÉNFASIS EN GERENCIA AGRÍCOLA
DETERMINACIÓN DE LA ESPECIE DEL NEMÁTODO Rotylenchulus ASOCIADO A MELÓN. ESTANZUELA, ZACAPA
TESIS
VICTOR MANUEL VENTURA PERDOMO 10806-06
GUATEMALA, ABRIL DE 2012 CAMPUS CENTRAL
UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS
LICENCIATURA EN CIENCIAS AGRÍCOLAS CON ÉNFASIS EN GERENCIA AGRÍCOLA
DETERMINACIÓN DE LA ESPECIE DEL NEMÁTODO Rotylenchulus ASOCIADO A MELÓN. ESTANZUELA, ZACAPA
TESIS
PRESENTADA AL CONSEJO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS
POR
VICTOR MANUEL VENTURA PERDOMO
PREVIO A CONFERÍRSELE EN EL GRADO ACADÉMICO DE
LICENCIADO
EL TÍTULO DE
INGENIERO AGRÓNOMO CON ENFASIS EN GERENCIA AGRÍCOLA
GUATEMALA, ABRIL DE 2012 CAMPUS CENTRAL
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR
RECTOR: P. Rolando Enrique Alvarado López, S.J. VICERRECTORA ACADEMICA: Dra. Marta Lucrecia Méndez González de
Penedo VICERRECTOR DE INVESTIGACION Y PROYECCION: P. Carlos Rafael Cabarrús Pellecer, S.J. VICERRECTOR DE INTEGRACION UNIVERSITARIA: P. Eduardo Valdés Barría, S.J. VICERRECTOR ADMINISTRATIVO: Lic. Ariel Rivera Irías SECRETARIA GENERAL: Licda. Fabiola Padilla Beltranena
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y AGRÍCOLAS
DECANO: Dr. Marco Antonio Arévalo Guerra VICEDECANO: Ing. Miguel Eduardo García Turnil, MSc SECRETARIA: Inga. María Regina Castañeda Fuentes DIRECTOR DE CARRERA: Licda. Anna Cristina Bailey Hernández, MA
NOMBRE DEL ASESOR DE TESIS
Ing. Julio Roberto Garcia Morán, MA
TRIBUNAL QUE PRACTICÓ LA DEFENSA PRIVADA
Dr. Marco Antonio Arévalo Guerra Ing. Miguel Eduardo García Turnil, MSc Ing. José Manuel Benavente Mejía, MA
DEDICATORIA A: Mis Padres: General de División y Licenciado Víctor Manuel Ventura Arellano
MSc Silvia Aurora Perdomo Chacón de Ventura Por darme vida, educación y compartir conmigo la felicidad de ser profesional.
Hermanos: Alejandro José Ventura Perdomo
Silvia Isabel Ventura Perdomo David José Ventura Perdomo Por su cariño y caminar juntos en el trayecto de mi vida profesional brindándome su apoyo.
Padrinos: Mayra Orellana de Cordón
Coronel de Infantería DEM y Licenciado Oscar Humberto Cordón Paiz. Por sus consejos y apoyo incondicional.
Familia: Argüello Vásquez
Por creer en mi persona, y brindarme su apoyo a distancia, en la duración de mi carrera profesional.
AGRADECIMIENTOS
A: Dios, por brindarme bendición y sabiduría a lo largo de mi carrera profesional. Mis padres General de División y Licenciado Víctor Manuel Ventura Arellano MSc, y Silvia Aurora Perdomo Chacón de Ventura, por brindarme y enseñarme el valor de la vida. La Universidad Rafael Landívar Campus Central, mi Alma Mater por el aprendizaje y conocimientos adquiridos. Mi familia Ventura Perdomo, tíos, primos y sobrinos por su atención en cada paso de mi vida y carrera profesional. Dra. Paula Agudelo y David Harshman, por su atención y apoyo durante la identificación molecular en Clemson, Carolina del Sur, Estados Unidos. Ing. Julio Roberto García Morán, MA por su asesoría y apoyo incondicional en los momentos cumbres de mi carrera. Empresa Agroexportadora PAO, Estanzuela Zacapa, por brindarme sus instalaciones para la realización de mi trabajo de graduación. Mis compañeros Alfredo Padilla, Luis Socop, Eduardo Velásquez y Andrés Mayén, por apoyo y compañerismo a lo largo de la carrera de estudio.
INDICE GENERAL
RESUMEN i
SUMMARY ii
I. INTRODUCCIÓN 1
II. MARCO TEÓRICO 3
2.1. CULTIVO DEL MELÓN Cucumis melo Cucurbitacea L. 3
2.1.1. Origen del cultivo 3
2.1.2. Taxonomía del melón 3
2.1.3. Morfología del melón 4
2.2. REQUERIMIENTOS EDAFOCLIMÁTICOS 5
2.3. PRINCIPALES PLAGAS DEL CULTIVO DE MELÓN 6
2.3.1. Minador (Lyriomyza huidobrensis, Lyriomiza trifolli) 6
2.3.2. Mosca blanca (Bemisia tabaco, Trialeurodes vaporariorum) 6
2.3.3. Nemátodo 7
2.4. ENFERMEDADES CAUSADAS POR HONGOS 7
2.4.1. Mal del talluelo 7
2.4.2. Oídio (Sphaerotheca fuliginea, Erysiphe cichoracearum) 7
2.4.3. Mildiu (Pseudoperonospora cubensis) 7
2.5. IMPORTANCIA ECONÓMICA DEL MELÓN 8
2.6. ZONAS DE PRODUCCIÓN EN GUATEMALA 9
2.7. NEMÁTODOS 9
2.7.1. Antecedentes 9
2.8. FORMAS DE DIAGNÓSTICO DE NEMÁTODOS 12
2.8.1. Diagnóstico de nematodos con metodología tradicional 12
2.8.2. Diagnóstico de nematodos por medio de PCR (Reacción
de la cadena de la Polimerasa)
13
2.9. NEMÁTODO Rotylenchulus spp 14
2.9.1. Taxonomía 14
2.9.2. Anatomía y morfología 15
2.9.3. Bioecología 16
2.9.4. Importancia fitosanitaria de Rotylenchulus sp. 18
2.9.5. Estudios realizados sobre el nematodo reniforme 18
III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 20
3.1. Definición del problema y justificación del trabajo 20
IV. OBJETIVOS 21
4.1. Objetivo General 21
4.2. Objetivos Específicos 21
V. METODOLOGÍA 22
5.1. LOCALIZACIÓN Y ÁREA DE TRABAJO 22
5.2. UNIDADES DE ANÁLISIS 22
5.3. TIPO DE INVESTIGACIÓN 23
5.4. PROCEDIMIENTO 24
5.4.1. Consulta documental 24
5.4.2. Fase de campo 24
5.4.3. Fase de laboratorio 25
5.4.3.1. Determinación del tamaño de la muestra 26
5.4.3.2. Clave utilizada para la identificación del género
Rotylenchulus
26
5.4.3.3. Identificación de especies de inmaduros 28
5.4.3.4. Identificación de especies de hembras maduras 29
5.4.3.5. Identificación de especies en hembras inmaduras
por el método molecular PCR
29
5.5. ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN 31
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 32
6.1. Determinación del Género Rotylenchulus 32
6.2. Distribución de Rotylenchulus en campo 33
6.3. Resultados de bioensayo 35
6.4. Determinación de R. reniformis en hembras vermiformes 36
6.5. Determinación de R. reniformis en hembras maduras 40
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Características morfológicas del melón 4
Cuadro 2. Temperaturas críticas para el cultivo del melón en diferentes
etapas del cultivo
5
Cuadro 3. Población inicial de nemátodos de R. reniformis en 100 cc de
suelo
33
Cuadro 4. Descripción de abreviaciones utilizadas para las mediciones de
especímenes extraídos de los bioensayos en la determinación de la especie
de Rotylenchulus
37
Cuadro 5. Resultados obtenidos de las variables para determinación de la
especie de Rotylenchulus reniformis. Los valores resaltados corresponden
a R. reniformis
39
Cuadro 6. Resultados obtenidos en la medición de hembras maduras para
la identificación de Rotylenchulus reniformis. Los valores resaltados
corresponden a R. reniformis
44
Cuadro 7. Distribución de poblaciones iniciales y finales de R. reniformis 48
6.6. Determinación de la especie por medio de PCR 45
6.7. Distribución de especie del nemátodo reniforme 48
VII. CONCLUSIONES 50
VIII. RECOMENDACIONES 51
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52
X. ANEXOS 57
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Principales zonas de producción de melón en Guatemala 9
Figura 2. Ciclo de vida de R. reniformis, en donde A: Planta en suelo
infestado con R. reniformis, B: Vermiforme inmadura penetrando con la
parte anterior, C: Macho no parasítico, D: Hembra en avanzado estadío de
maduración de gónadas, E: Hembra madura alimentándose en sincitio,
depositando huevos en matriz gelatinosa, F: segundo, Tercer, y Cuarto
estadío juvenil en suelo
17
Figura 3. Hembra inmadura Rotylenchulus reniformis extraída de suelo,
montada en solución TAF
32
Figura 4. Representación gráfica de las poblaciones iniciales de R.
reniformis en 100 cc de suelo
34
Figura 5. Bioensayo establecido en invernadero del Centro de Producción
San Ignacio
36
Figura 6. Longitud del estilete de una hembra inmadura 37
Figura 7. Vulva de una hembra inmadura de R. reniformis 38
Figura 8. Presencia de machos que acompañan a las hembras inmaduras 38
Figura 9. Hembra madura de Rotylenchulus reniformis adherida a raíz de
melón
41
Figura 10. Fase de formación en hembra de Rotylenchulus reniformis
extraída de raíces de las plantas de melón en los bioensayos
41
Figura 11. Célula primaria de infección en la raíz de melón 42
Figura 12. Vulva de hembra madura con aceite de inmersión 43
Figura 13. Cabeza de hembra madura parasitando a células 43
Figura 14. Secuenciación de los genes, en los especímenes de R.
reniformis analizados por PCR
46
Figura 15. Extensión en gel de agarosa de las muestras de PCR. Los
valores C1: R. reniformis, C2: R. reniformis, C3: Rotylenchulus sp, C4: R.
reniformis, C5: R. reniformis, C6: R. reniformis
47
i
DETERMINACIÓN DE LA ESPECIE DEL NEMÁTODO Rotylenchulus ASOCIADO A MELÓN. ESTANZUELA, ZACAPA
RESUMEN
El estudio determinó la especie del nemátodo Rotylenchulus en suelos asociados a melón en el Valle del Motagua, municipio de Estanzuela, Zacapa. Se realizaron muestreos de suelo en la empresa Agroexportadora PAO, en cinco localidades con cultivo de melón tipo Cantaloupe. Se realizaron extracciones de los nemátodos a través del método tamizado, centrifugado y flotación en azúcar para determinar la presencia del género Rotylenchulus con ayuda de la descripción de Mai y Mullin (1996) y se cuantificaron las poblaciones iniciales. Se confirmó la presencia de Rotylenchulus en todas las localidades muestreadas y se contabilizó la mayor población en el sitio San Lucas. Posteriormente se realizaron bioensayos para la reproducción de hembras maduras en plántulas de melón en un período de 40 días a una temperatura de 27 °C bajo invernadero. Se obtuvieron hembras vermiformes y maduras del sitio San Lucas, las cuales se utilizaron para la identificación de la especie a través de caracterización morfométrica con ayuda de las descripciones del C.A.B. (1977). La especie identificada fue Rotylenchulus reniformis. Se utilizaron primers específicos de la base de datos GENBANK para la confirmación de la especie a través del análisis molecular PCR siendo; Forward 5´- CGC TGG CGT CTC TGC GTT GT-3´ y Reverse 5´- TGG CAT ACC CCA CGC TCC ACT-3´. Se confirmó que la especie encontrada en las localidades fue R. reniformis. Se recomienda continuar con los estudios de este nemátodo con un enfoque de manejo integrado.
ii
DETERMINATION OF THE SPECIES OF Rotylenchulus ASSOCIATED WITH MELON. ESTANZUELA, ZACAPA
SUMMARY
The study determined the species of the nematode Rotylenchulus in soils associated to melon in the Valley of Motagua, in the area of Estanzuela, Zacapa. Soil sampling was made in the company Agroexportadora PAO, in five places with cantaloupe melon. Extractions of nematodes were made through sieving, centrifugation and sugar flotation method to determine the presence of the genus Rotylenchulus using the description of Mai and Mullin (1996) and was quantified the initial populations quantified themselves. The presence of Rotylenchulus in all locations was confirmed and the greater population was counted in San Lucas site. Later, bioassays were conducted for the reproduction of mature females in plants of melon in a period of 40 days at 27 °C of temperature under greenhouse. Vermiform and mature females were obtained from San Lucas site, which was used for the identification of the species through morphometric characterization using the description of the C.A.B (1977). The identified species was Rotylenchulus reniformis. Specific primers were used from the GENBANK database for the confirmation of the species through molecular analysis PCR being; Forward 5´- CGC TGG CGT CTC TGC GTT GT-3´ and Reverse 5´- TGG CAT ACC CCA CGC TCC ACT-3´. It was confirmed that the species found in the localities was R. reniformis. It is recommended to continue with the studies of this nematode with an integrated management approach.
1
I. INTRODUCCIÓN
Actualmente el cultivo del melón (Cucumis melo) es de gran importancia para la
economía del país por la alta generación de divisas, que llegaron a ser 124
millones de dólares (968 millones 440 mil quetzales) por la exportación del
producto según lo reportado por AGEXPORT para el año 2010. En los valles del
Motagua, municipio de Estanzuela y la Fragua éste cultivo provee empleos para
los campesinos de la región, además según el INE (Instituto Nacional de
Estadística) el área sembrada es de 12 mil hectáreas, repartidas en 77 fincas
productivas. La cosecha está destinada hacia mercados centroamericanos,
estadounidenses y europeos. Zacapa tiene la mayor producción de melón con
96%, seguido de Santa Rosa 2% y Jutiapa 2% (Barrientos, 2006).
Los mercados de cucurbitáceas exigen más calidad e inocuidad en los productos
principalmente el melón debido a que es bien cotizado por ser un producto que
no se cultiva en los países destino, debido a que no tienen la tierra adecuada y
la variedad de microclimas que imperan en Guatemala. Por estas exigencias es
que el producto se ha ido tecnificando para llenar los requerimientos de los
mercados internacionales. No obstante dentro de estas exigencias esta el
control de enfermedades del suelo, especialmente el control de nemátodos que
han ido desarrollando resistencia al Bromuro de Metilo por el mal manejo de esta
molécula. De esta manera las poblaciones se han ido incrementando
(Barrientos, 2006).
En Guatemala no existen estudios previos que determinen la especie del
nemátodo del género Rotylenchulus sp., en el cultivo del melón en el Valle del
Motagua, Zacapa, municipio de Estanzuela, que está presente en los suelos y
que en algunas ocasiones se ha confundido con la sintomatología típica de
Meloidogyne.
2
Este estudio tuvo como objetivo la identificación de la especie del nemátodo
Rotylenchulus sp., asociado al cultivo del melón, en el valle de Motagua, Zacapa
a través de caracterización morfométrica y análisis molecular de especímenes
extraídos de suelo.
3
II. MARCO TEORICO
2.1. CULTIVO DEL MELÓN Cucumis melo Cucurbitacea L.
2.1.1. Origen del cultivo
Barrientos (2006), indica que no se ha precisado el origen de este cultivo. Varios
autores aceptan que el melón es de origen africano (Bisognin, 2002). Se
considera también a la India como centro para la domesticación de la especie,
porque es el país donde existe mayor variabilidad de esta. Afganistán y China
son considerados como países secundarios de la diversificación del melón y se
le atribuye a España el país de la diversidad genética en este cultivo (Álvarez,
2004).
2.1.2. Taxonomía del melón
Según Chinchilla (2009) el melón es clasificado de la siguiente manera:
REINO Plantae
DIVISION Magnoliophyta
CLASE Magnoliopsida
ORDEN Violales
FAMILIA Cucurbitaceae
GENERO Cucumis
ESPECIE Cucumis melo
4
2.1.3. Morfología del melón
Cuadro 1. Características morfológicas del melón
PARTE DE LA PLANTA CARACTERISTICAS
MORFOLÓGICAS
FUENTE
Planta Andromonoica, con
flores masculinas y
femeninas, separadas en
la misma planta
Di Trani (2007)
Flores Estaminadas y
hermafroditas
Di Trani (2007)
Tallo Herbáceo, rastrero o
trepador con zarcillos
Álvarez (2004)
Raíz Ramificada, abundante y
rápido crecimiento
Álvarez (2004)
Hojas Limbo orbicular aovado,
reniforme o pentagonal
Álvarez (2004)
Flores Solitarias de color
amarillo. Masculinas,
femeninas y
hermafroditas
Álvarez (2004),
McGregor (1976)
Fruto Esférica, elíptica. Textura
lisa o rugosa. Pulpa
verde, blanca
anaranjada.
Álvarez (2004)
5
2.2. REQUERIMIENTOS EDAFOCLIMÁTICOS
El clima requerido para que el cultivo del melón se desarrolle adecuadamente,
son climas áridos y no excesivamente con presencia de humedad. Las regiones
con humedad excesiva y baja insolación hacen que el desarrollo se retrase, o
tenga un efecto negativo, lo que promueve alteraciones en la maduración y
calidad de los frutos (Leñado, 1994).
Las temperaturas requeridas por este cultivo son importantes para que su
desarrollo sea el adecuado (Leñado, 1994).
Cuadro 2. Temperaturas críticas para el cultivo del melón en diferentes etapas
del cultivo
(Leñado, 1994).
La humedad relativa al inicio de su desarrollo debe ser del 65-75%, durante la
floración 60-70% y para la fructificación la humedad oscila entre 55-65%. La
presencia de agua durante los períodos de crecimiento y maduración de los
frutos, tiene que ser en gran cantidad para obtener buenos resultados tanto en
rendimiento como en calidad (Álvarez, 2004).
HELADA MÍNIMA 1°C
DETENCIÓN DE VEGETEACIÓN
AIRE 13-15 °C
SUELO 8-10 °C
GERMINACIÓN
MÍNIMA 15 °C
ÓPTIMA 22-28 °C
MÁXIMA 39 °C
FLORACIÓN ÓPTIMA 20-23 °C
DESARROLLO ÓPTIMA 25-30 °C
MADURACIÓN
DEL FRUTO ÓPTIMA 25 °C
6
La duración de la luminosidad en relación con la temperatura, influye tanto en el
crecimiento de la planta como en la inducción floral, fecundación de las flores y
ritmo de absorción de elementos nutritivos (Leñado, 1994).
El cultivo del melón se adapta a gran cantidad de tipos de suelo, pero
predominan los suelos con textura areno- arcillosa con presencia de buena
fertilidad, bien drenados y con el pH entre 5.8-7.2 (Heredia, 2002). Tiene una
alta sensibilidad a la carencia de micro elementos y macro elementos (Álvarez,
2004).
2.3. PRINCIPALES PLAGAS DEL CULTIVO DE MELÓN
2.3.1. Minador (Liriomyza huidobrensis, Liriomyza trifolli)
Los adultos son moscas que se internan en las plantaciones, específicamente en
los tejidos de las hojas, además las larvas que eclosionan de los huevos viven
en grandes poblaciones dentro de las hojas. Los daños por un ataque de este
insecto pueden ser graves si lo hacen intensamente hacia las plantas jóvenes
(Barrientos, 2006).
2.3.2. Mosca blanca (Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum)
Insectos vectores del virus del amarilleo, el cuál es causado bajo condiciones de
invernadero. Los controles principales de este virus se pueden realizar por
medio de limpieza de malezas alrededor del invernadero, colocación de mallas
en las ventanas para la ventilación; además de la utilización de trampas
amarillas engomadas (Chinchilla, 2009).
7
2.3.3. Nemátodo
Microorganismo que ataca principalmente a las raíces, que son muy sensibles al
ataque, provocando un engrosamiento y malformaciones que pueden llegar a
obstaculizar e inutilizar el sistema radicular. Las altas poblaciones de nematodos
son la razón principal de causar posibles daños (Álvarez, 2004).
2.4. ENFERMEDADES CAUSADAS POR HONGOS
2.4.1. Mal del talluelo
Son varios los agentes causantes de enfermedades como necrosis en las raíces;
así como de pudriciones de los tallos en plantas jóvenes. Uno de los agentes
con más frecuencia es Phythium spp., pero recientes estudios han determinado
como patógenos que causan esos síntomas, a: Rhizoctonia solani, Phytophthora
spp., y Acremonium (Álvarez, 2004).
2.4.2. Oídio (Sphaerotheca fuliginea, Erysiphe cichoracearum)
Hongo que ataca con mayor frecuencia al cultivo del melón, en donde sus
principales síntomas son la aparición de manchas circulares blanquecinas
ubicadas en la superficie de la hoja, que al inicio aparecen de forma separada,
pero si no se controla la invasión se puede dar en toda la superficie de la hoja.
Además de atacar las hojas puede aparecer en frutos, zarcillos, tallos y pecíolos
(Álvarez, 2004).
2.4.3. Mildiu (Pseudoperonospora cubensis)
Las plantas que son afectadas por éste agente presentan en las hojas manchas
amarillentas que son irregulares, y en el envés tiene aspecto aceitoso que con el
8
paso del tiempo se necrosan. Cuando el ataque es a gran escala las hojas se
secan por completo y se enrollan con dirección al haz de la hoja (Álvarez, 2004).
2.5. IMPORTANCIA ECONÓMICA DEL MELÓN
El melón es un producto bien conocido y aceptado por los consumidores
norteamericano y europeo. Por ser un fruto que se produce en zonas tropicales
secas, en Guatemala se dan con estacionalidad (junio a mayo).
AGRIFRESCO (2002), establece que en los últimos años la superficie de melón
ha ido en aumento, así como la producción ha aumentado proporcionalmente,
esto indica la utilización de variedades híbridas de mayor rendimiento y una
mejora y especialización del cultivo. Para abastecer el mercado de melón,
Europa realiza importaciones procedentes principalmente de Brasil (41.8%),
Costa Rica (22.2%), Israel (13.5%), Marruecos (11.1%), Honduras (3.6%),
Ecuador (1.4%), Guatemala (1.2%), África Del Sur (1.1%), República
Dominicana (0.7%), Venezuela (0.6%) y el resto de las exportaciones son
cubiertas por otros países (2.9%). En el ámbito de la Unión Europea las
importaciones por países son variables, destacando el Reino Unido que importa
28.36%, en segundo lugar de importancia esta Holanda con 18%, muy de cerca
le siguen Francia que tiene 17.75% y Alemania con 17.26%. Con porcentajes
menores Portugal con 5.40%, Italia con 3.96%, España con 2.40%, Suecia con
2.20%, Austria con 2.12%, Dinamarca con 2.04% y por debajo del 1% de
importaciones cada uno están Finlandia y Grecia. (AGRIFRESCO, 2002).
9
2.6. ZONAS DE PRODUCCIÓN EN GUATEMALA
Guatemala posee varias zonas de producción de melón principalmente en
Zacapa como se muestra en la figura 1, que es el departamento líder en
producción a nivel nacional, en donde se encuentran también los municipios de
Usumatlán, Estanzuela, Huite y Teculután respectivamente. Dentro de los
departamentos con menor producción le siguen Santa Rosa y Jutiapa
(Barrientos, 2006).
Figura 1. Principales zonas de producción de melón en Guatemala
(Barrientos, 2006).
2.7. NEMATODOS
2.7.1. Antecedentes
Guatemala posee diversos microclimas, y variedad de suelos a nivel mundial
según Simmons (1959), razón por la cual existe también diversidad de
microorganismos patógenos que causan daños en los cultivos. Según Crozzoli
(1994), los microorganismos más importantes en la agricultura son los
nemátodos y establece que no se le dan importancia debido a que son difíciles
de trabajar y porque los síntomas que se presentan en las plantaciones no son
96%
2% 2%
Zacapa
Santa Rosa
Jutiapa
10
tan evidentes como los síntomas provocados por un hongo, bacteria o virus
(Crozzoli, 1994).
De acuerdo con Crozzoli (1994) al no ponerle importancia a los nematodos
estableció que la reducción del rendimiento causada por los nemátodos llega a
12.3% a nivel mundial y alrededor de 80% cuando estos se asocian a otras
enfermedades fitoparásitas. Guatemala es un país en vías de desarrollo por lo
que la relación nematólogos- problemas existentes es escasa o nula. No existen
suficientes profesionales para la identificación de las especies de nematodos de
importancia para los cultivos, y los únicos que existen tardarán años en
identificarlos. Según este autor los problemas causados por los nemátodos
aumentan con el paso de los años, y afectan a los cultivos tradicionales y no
tradicionales de exportación; así como a la floricultura (Crozzoli, 1994).
En el caso de la floricultura en Guatemala según Cardona (2001) se detectó la
presencia del nemátodo Rotylenchulus reniformis; en los municipios de
Escuintla, Masagua y Tiquisate en el departamento de Escuintla y Chicacao en
el departamento de Suchitepéquez; con la ayuda del Programa de Vigilancia
Fitosanitaria en Cultivos de Exportación (VIFINEX). Cardona (2001), estableció
que además de la identificación de la especie se requirió el estudio de la
dispersión geográfica, variedades de plantas ornamentales afectadas, relación
macho-hembra, relación parásito-hospedante, relación parásito-suelo y la
relación clima-distribución de la especie. Además indicó que las poblaciones de
los nemátodos disminuyen en suelos con exceso de arcilla, a diferencia de los
suelos franco o franco arenosos en donde las poblaciones son mayores
(Cardona, 2001).
Crozzoli (1994), estableció que no es específica la sintomatología del ataque de
nematodos que se produce en las plantaciones las cuales son: reducción del
tamaño de la planta, clorosis, malformaciones de inflorescencias y hojas; así
como el síntoma principal que son las agallas, el cual es el síntoma
11
característico del género Meloidogyne sp., en cambio Rotylenchulus sp.,
produce masas de huevos y el daño que causan en las plantaciones crean
confusión sobre el género que provoca el problema. El género Rotylenchulus
sp., pasa desapercibido ya que actúa conjuntamente con Meloidogyne sp., razón
por la cual la sintomatología en las raíces, en este caso melón tienen semejanza
de un género con el otro (Crozzoli, 1994).
El nemátodo del género Rotylenchulus sp., es semiendoparasítico con presencia
de un estomatoestilete, que al entrar en contacto con las raíces produce una
lesión alrededor del lugar en donde se da el ataque, se conoce que el nemátodo
penetra a la corteza en forma perpendicular al cilindro central y es así como
establece su lugar de alimentación en la endodermis. La presencia del nematodo
en la plantación provoca un debilitamiento en la nutrición de las plantas, así
como el aumento en la incidencia de un ataque de hongos o bacterias (Crozzoli,
1994).
El mecanismo de defensa del nemátodo Rotylenchulus sp., son la utilización de
reservas de comida guardadas en el cuerpo del nematodo como carbohidratos y
grasas. Los nematodos jóvenes y adultos vermiformes, tienen la habilidad de
sobrevivir en estaciones frías por un tiempo de 25- 27 meses, y que la retención
de mudas de cutícula de anteriores ciclos juveniles, juegan un papel importante
en la regulación del contenido de agua en su cuerpo. Otro factor importante para
que estos microorganismos puedan vivir es la textura del suelo y la temperatura
(Inserra, 1992).
Los nemátodos fitoparasíticos son animales multicelulares y son generalmente
microscópicos que miden alrededor de 0.5 mm de largo y poseen los principales
sistemas fisiológicos de todos los organismos, menos el sistema respiratorio y
circulatorio. Tienen forma de gusano delgado cilíndrico y alargado, con un
diámetro reducido en los extremos. Las hembras son más grandes que los
machos según diferentes formas en las especies que se conocen. No son
12
segmentados y están protegidos por una cutícula acelular, transparentes y
semipermeable de proteínas, lípidos y carbohidratos que lo ayudan a sobrevivir.
Sobreviven en todo tipo de ambientes, pero prefieren el medioambiente húmedo;
estos microorganismos atacan principalmente tallos, hojas, semillas y la parte
principal de las plantas, las raíces (Schumann & D´Arcy, 2010).
2.8. FORMAS DE DIAGNÓSTICO DE NEMÁTODOS
2.8.1 Diagnóstico de nematodos con metodología tradicional
Según Schumann & D´Arcy (2010) el diagnóstico de nemátodos que infectan a
las plantas, son desde los foliares, hasta los que infectan a los bulbos de las
plantas; pueden ser diagnosticados al separar tejido infectado o con síntomas de
presencia de nemátodos, observándolos a través de un microscopio. Es muy
común observar la cantidad de nemátodos presentes en los tejidos, pero
únicamente los que tienen presencia de estilete son patógenos potencialmente
dañinos. Las extracciones de suelo y los tejidos de las plantas tienen que ser
examinadas en microscopio o estereoscopio para determinar en donde se
localizan los nemátodos fitoparásitos. Los nemátodos son extraídos de
muestras de suelo, y contados para determinar el número de nemátodos por
volumen o peso de suelo o planta (Schumann & D´Arcy, 2010).
De acuerdo con Schumann & D´Arcy (2010), los nemátodos tienen que ser
contabilizados debido a que es el número que determina la severidad del
problema. Los nemátodos fitopatógenos son identificados por su tamaño y forma
generales, la apariencia del estilete, tipo de cola, superficie de la cutícula, y otras
características morfológicas. La identificación de los nemátodos se realizan
hasta género con un microscopio y claves dicotómicas que están basadas en
características de los estados juveniles y los ciclos de vida de los nematodos
que generalmente se encuentran en las extracciones realizadas al suelo
(Schumann & D´Arcy, 2010).
13
Shurtleff & Averre (2000), establece que hay que tener seguridad de que los
nemátodos a examinar sean hembras maduras, y examinar variedad de
nemátodos en donde se incluyan cinco o más especímenes para obtener
variabilidad en los resultados. Además los nemátodos que son extraídos de
suelo generalmente poseen dos o más tipos de nemátodos parasíticos,
incluyendo los de vida libre (Shurtleff & Averre, 2000).
2.8.2 Diagnostico de nematodos por medio de PCR (Reacción de la cadena
de la Polimerasa)
Este es otro método para el diagnóstico de nemátodos y otros patógenos
importantes que existen en la actualidad. Según Schumann & D´Arcy (2010),
desde los años 80 el método de PCR ha empezado a ser usado ampliamente
para conocer el diagnóstico de enfermedades y plagas debido a que es
relativamente simple y sensible.
El diagnóstico por PCR incluye pasos importantes que deben seguirse para
obtener los resultados esperados en donde Schumann & D´Arcy (2010) los
secuencia de la siguiente manera: obtención del ADN, desnaturalización del
ADN, utilización de cebadores para ubicar las secuencias, Taq de polimerasa de
ADN para extensión de primers y por último la extensión del ADN. En el método
de PCR los primers son la selección de pequeñas partes de ADN que van de
18-20 nucleótidos, en donde pueden ser pares con segmentos específicos de los
genomas del patógeno. El PCR requiere de equipo especial, y es de costo
elevado (Schumann & D´Arcy, 2010).
14
2.9. NEMATODO Rotylenchulus spp
Linford y Oliviera establecieron el género Rotylenchulus, con Rotylenchulus
reniformis como los tipos de especies. El nombre genérico fue dado por Linford y
Oliviera (1940) porque pensaron que las especies de nemátodos eran similares
al género Rotylenchulus teniendo descendencia de ese género y otros
Hoplolaimidae. Los nombres de las especies fueron puestos por la pequeña
figura de las hembras maduras.
Este género de nemátodo esta extensamente distribuido en las regiones
tropicales y subtropicales del mundo. Hay reportes de este género en Centro y
Sur América, Sudeste de Asia, Caribe y México respectivamente (Robinson et
al., 1997).
2.9.1. Taxonomía
REINO Animalia
FILUM Nematoda
CLASE Secernentea
SUBCLASE Diplogasteria
ORDEN Tylenchida
SUBORDEN Tylenchina
SUPERFAMILIA Tylenchoidea
FAMILIA: Hoplolaimidae
SUBFAMILIA: Rotylenchulinae
GENERO: Rotylenchulus
(Siddiqi, 2000)
15
2.9.2. Anatomía y morfología
Las hembras poseen un cuerpo vermiforme delgado y espiral en forma de C; con
una longitud alrededor de 0.40 mm. El estilete da vuelta y se inclina
posteriormente, además el bulbo medio del esófago posee distintas válvulas y
las glándulas basales del esófago están posicionadas de forma lateral y ventral
al intestino. La vulva no es prominente ocurre en el 70% de la longitud de su
cuerpo. Los ovarios de la hembra inmadura están opuestos por una doble flexión
y la cola es estrecha y se posiciona con una curva (Chitambar, 1997).
El cuerpo de las hembras maduras según sufre una transformación para tomar
la forma de un riñón, con un cuello irregular que mide 0.38-0.52 mm de longitud.
Al sufrir esta transformación la vulva se diferencia por la aparición de labios y el
cuerpo que se encuentra alejado del ano tiene forma hemisférica con una parte
delgada al final con una longitud de 5-9 µm. En esta etapa el estilete está bien
desarrollado y la cutícula es más gruesa. Los ovarios son más largos y los
huevos son depositados en una matriz gelatinosa (Sipes, 2000).
Los machos son vermiformes, con la parte anterior reducida y la presencia de un
estilete reducido. El esófago de los machos es degenerado con el bulbo y la
válvula de tamaño mediano, además de que los machos de este género no se
alimentan; siendo las hembras las únicas que se alimentan. La espícula es larga
y delgada con forma curva y ubicada en la parte ventral. Los machos y juveniles
permanecen en el suelo (Coblentz, 2005).
El mecanismo de ataque que tienen las hembras de este género es que a las
células jóvenes de las raíces son estimuladas cuando empiezan a alimentarse,
dando lugar a la formación de hipertrofias en el periciclo y las células de la
endodermis, incrementando la densidad del citoplasma. A pesar de esto las
células permanecen uninucleadas con largos nucléolos (Singh, 1979). De
16
acuerdo con Jatala (1991), el nematodo de este género ataca alrededor de 140
especies en más de 115 géneros de plantas en 46 familias.
Las infestaciones de todos los nemátodos tienen un efecto debilitante sobre el
sistema radicular, lo que lleva a la reducción de efectividad en la absorción y
transporte de agua y nutrientes (Fierro, 2006). El nematodo del género
Rotylenchulus sp, parasita a gran variedad de plantas cultivadas y árboles
frutales, en donde se encuentra ampliamente distribuido. Es un
semiendoparásito sedentario que se alimenta del tejido cortical del floema
provocando una decoloración de las raíces, secado y pérdida de las hojas en
última instancia (Rebois, 1970).
Las hembras de varios nemátodos sedentarios que son patógenos en las
plantas, depositan sus huevos en una matriz gelatinosa, dicha matriz protege a
los huevos de antagonismo y deshidratación; por lo que es considerada como un
importante mecanismo de sobre vivencia (Agudelo, 2004). La hembra de
Rotylenchulus sp, produce una matriz gelatinosa con un aspecto similar a la
producida por la hembra del nematodo que produce agallas. Por no ser del
mismo género tienen por lo menos dos diferencias fundamentales: la matriz
gelatinosa del género Meloidogyne sp., es producida por las glándulas del recto,
mientras que la producida por el género Rotylenchulus sp., la hacen por medio
de las glándulas de la vulva (Robinson et al., 1997).
2.9.3 Bioecología
Los nemátodos del género Rotylenchulus sp., o nemátodos reniformes como
comúnmente se les llama son semiendoparasitos sedentarios. Su ciclo de vida,
es único en donde los nemátodos salen después de eclosionar del huevo en el
estadío J2 y que a través de cuatro mudas dan paso para la hembra inmadura
en el suelo sin alimentación (Bridge & Starr, 2010).
17
Los estados juveniles, machos y hembras inmaduras se encuentran en el suelo.
El estadío J4 o juvenil 4 es el estado infectivo del nematodo, en donde penetra
las raíces y se convierte en sedentario. La reproducción sin la presencia de
machos es muy común dentro de las poblaciones de especies de Rotylenchulus
(Shurtleff & Averre, 2000).
Figura 2. Ciclo de vida de R. reniformis, en donde A: Planta en suelo infestado
con R. reniformis, B: Vermiforme inmadura penetrando con la parte anterior, C:
Macho no parasítico, D: Hembra en avanzado estadio de maduración de
gónadas, E: Hembra madura alimentándose en sincitio, depositando huevos en
matriz gelatinosa, F: Segundo, Tercer, y Cuarto estadio juvenil en suelo
(Robinson, 1997).
18
2.9.4 Importancia fitosanitaria de Rotylenchulus sp.
Este es el nemátodo de mayor importancia económica, debido a que abarca
gran cantidad de siembras y plantas nativas. Robinson (1997) establece que
está ampliamente distribuido como resultado de la variedad de plantas que
ataca. Dentro del amplio rango de ataque que posee, se encuentra el melón
como uno de los cultivos principales. Por ser un microorganismo que daña gran
variedad de cultivos, se han puesto medidas cuarentenarias en todo el mundo
por la contaminación que puedan tener las exportaciones y utilizan esta medida
para contrarrestar las poblaciones (Robinson, 1997).
En la actualidad los manejos integrados utilizan variedad de métodos para
reducir las poblaciones de nemátodos son los más efectivos. Los manejos
fitosanitarios se hacen más efectivos cuando se hace individualmente por
especie de nemátodos o en conjunto cuando se conocen las especies que
predominan en cada plantación. La elección para los manejos, se pueden basar
en ensayos de suelo y plantas, para formular una estrategia de control, tomando
en cuenta el costo y los impactos medioambientales que se realicen (Schumann
& D´Arcy, 2010).
2.9.5 Estudios realizado sobre el nematodo reniforme
El género Rotylenchulus es el más dañino de los nematodos por su amplia
cobertura de daños a nivel mundial. Son conocidas diez especies, en donde
todas son parásitos sedentarios que se encuentran en las raíces para latitudes
tropicales y subtropicales del mundo, las cuales se diferencian en base a claves
dicotómicas. Una de las especies que más importancia tiene, y ha sido objetivo
de varias investigaciones es Rotylenchulus reniformis ya que su biología,
importancia económica y el control son las bases principales para la elaboración
de experimentos que lleven a su control (Robinson, 1997).
19
Rotylenchulus reniformis y Rotylenchulus parvus, son las especies que Robinson
(1997), establece como las de mayor distribución en latitudes cálidas, en donde
R. reniformis es una de las especies que forman un sincitio en su lugar de
alimentación. Algunas descripciones taxonómicas para especies de
Rotylenchulus están incompletas por lo que las hembras maduras de esas
especies no se conocen, dando lugar a R. reniformis para ser la única especie
estudiada y probada como la más importante económicamente y es por esa
razón que los estudios para esa especie tienen una investigación de alto rango;
abarcando su ciclo de vida, hospedero, relación parásito-hospedero, daño a
plantaciones, sobrevivencia, manejo y su comportamiento (Robinson, 1997).
En estudios previos se han comparado dos especies de Rotylenchulus donde R.
macrosomus difiere de R. reniformis por tener un cuerpo más grande, la posición
de su cuerpo es más compleja, la posición de la vulva ubicada más anterior que
en R. reniformis y la terminación de la cola más punteada. R. macrosomus se
utiliza para determinar la incidencia que tiene hacia unos cultivos, en donde R.
reniformis tiene una mayor incidencia en los cultivos razón por la cuál es el
nematodo de mayor importancia económica a nivel mundial (Cohn & Mor, 1998).
20
III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
3.1. Definición del problema y justificación del trabajo
El cultivo del melón Cucumis melo Cucurbitacea L., es importante dentro de la
economía de Guatemala por la generación de divisas para el país, que según el
censo realizado por el Instituto Nacional de Estadística (INE), (2010) el país
produjo un total de 457,898.54 t de fruto que se repartieron en 12 mil hectáreas
en fincas que se dedican a la producción del melón y generó US$124 millones
de dólares según lo reportado por el Banco de Guatemala. De acuerdo con la
Unión Europea (UE) en su ficha del melón; el departamento de Zacapa es el que
más destaca en la producción de melón con sus municipios Usumatlán,
Teculután, Cabañas, Huite, y Estanzuela. Los principales mercados de
Guatemala son, El Salvador, Estados Unidos, Honduras y la Unión Europea
(Linares, 2007).
En los campos de cultivo del melón en el Valle del Motagua, se han realizado
muestreos en donde han encontrado nematodos fitoparásitos y se ha detectado
la presencia del género Rotylenchulus. Sin embargo, la identificación de este
género no se ha llevado a cabo de una forma sistemática y ha sido muy
subjetivo el diagnóstico confundiendo los síntomas y signos con el género
Meloidogyne en algunas ocasiones.
Por otro lado no existen estudios previos donde se haya determinado especies
de nematodos asociados a melón en el departamento de Zacapa. El presente
estudio determinó en primera instancia, la especie del género Rotylenchulus
asociado al cultivo de melón en el Valle de Motagua, municipio de Estanzuela,
Finca Los Yajes; dado que la importancia de conocer la especie de un género de
nemátodo radica en la patogenicidad del individuo con el hospedero y
consecuentemente puede conformar parte de un estudio integral para el manejo
de los nematodos y el fitomejoramiento del melón.
21
IV. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Detectar el nemátodo reniforme en la finca los Yajes, de la empresa
Agroexportadora PAO, asociado al cultivo de melón (Cucumis melo), en el Valle
de Motagua, municipio de Estanzuela, Zacapa.
4.2. Objetivos Específicos
Identificar la especie de Rotylenchulus en la finca los Yajes de la empresa
Agroexportadora PAO, a través del método morfometrico y molecular.
Establecer la distribución de las especies del nemátodo Rotylenchulus en la
finca los Yajes, de la empresa Agroexportadora PAO asociado al cultivo del
melón (Cucumis melo).
Identificar primers específicos para la identificación de Rotylenchulus reniformis
a través de análisis molecular.
22
V. METODOLOGIA
5.1. LOCALIZACIÓN Y ÁREA DE TRABAJO
El estudio se realizó en el Valle del Motagua, departamento de Zacapa en la
finca los Yajes de la empresa Agroexportadora PAO ubicada en Estanzuela,
dentro del departamento de Zacapa, Guatemala, Guatemala, la cual se
encuentra a una altura de 220 msnm, y localizado bajo las coordenadas
15°46´50” latitud norte y 88°18´30” longitud oeste del meridiano de Greenwich.
Holdridge (1982) clasificó a esta zona de vida como Monte Espinoso Sub-
Tropical, debido a que posee días soleados durante el verano, además de que
su precipitación está dentro del rango 500 mm a 1,000 mm, con un promedio
de 85 mm. Esta zona de vida presenta una temperatura media anual que oscila
entre los 19°C y 24°C respectivamente.
Según Simmons et al (1959) los suelos del Valle del Motagua están dentro de
la clasificación de la serie Chicaj, por tener la característica de ser suelos con
textura muy pesada, llegan al punto de ser casi impermeables al agua y al aire.
La materia madre de estos suelos es ceniza volcánica y posee terrenos de
relieve planos y los drenajes internos inadecuados.
5.2. UNIDADES DE ANALISIS
El estudio se inició con la toma de muestras de suelo, que sirvieron para su
análisis en laboratorio y asegurarse de que existía presencia de nematodos.
Posteriormente se realizó el montaje de bioensayos para la siembra de melón
y reproducción de las hembras que son las únicas que infectan a las raíces
para su extracción e identificación.
23
Para el estudio se tenían ya establecidos los puntos de muestreo donde existía
presencia del nemátodo reniforme para que se facilitara el trabajo del
muestreo.
5.3. TIPO DE INVESTIGACION
Se desarrolló una investigación descriptiva debido a que se determinó la
especie del nematodo y se dan las características principales que lo definen
como la especie que afecta al cultivo del melón en la finca Los Yajes que tuvo
la presencia de este nemátodo.
El estudio se realizó por fases por ser una investigación de tipo descriptiva. Las
fases que se siguieron para la determinación de la especie fueron:
a. Realización del muestreo del suelo con presencia de nematodos
b. Extracción de los nematodos en el suelo por el método tamizado,
centrifugado y flotación en azúcar
c. Realización de Bioensayos para reproducción de hembras en plantas de
melón
d. Extracción de las hembras presentes en las raíces
e. Identificación de la especie por las características morfométricas que
presentaron los microorganismos extraídos por medio de descripciones de
diferentes autores.
f. Identificación de la especie a través del método molecular de PCR en el
laboratorio de nematología de la Universidad de Clemson ubicado en
Carolina del Sur, Estados Unidos.
24
5.4. PROCEDIMIENTO
5.4.1. Consulta documental
Se realizó una investigación en el mes de diciembre del año 2010, en las áreas
donde existía presencia del nematodo Rotylenchulus que afecta al cultivo del
melón en la finca los Yajes y puntos ubicados por la empresa Agroexportadora
PAO.
Los muestreos se planificaron por áreas con la ayuda de un cronograma de
actividades que fue elaborado según el número de localidades afectadas dentro
de la finca y su ubicación bajo las coordenadas 15°46´50” latitud norte y
88°18´30”; dando inicio en el mes de mayo del año 2011.
5.4.2. Fase de campo
Se tomaron muestras de suelo en el mes de mayo de 2011 en las áreas
infestadas conocidas como Sección 1B, La Hacienda, Sección 3C, Sección 5 y
San Lucas en donde se colectaron juveniles, machos maduros y hembras
inmaduras del género Rotylenchulus a una profundidad de 10-15 cm siguiendo
la metodología establecida por Shurtleff & Averre (2000), (Anexo 5) con
densidades de 1 submuestra en 10m2 por tablón de cultivo para que se formaran
muestras complejas de 20 submuestras y así se obtuvieron muestras
homogéneas de 200 m2. Los muestreos realizados estaban formados por: las
muestras que se realizaron en 1 ha de suelo infestado que era equivalente a una
cantidad de 1 kg de suelo que sirvieron para las extracciones y reproducciones
de semillas y hembras maduras.
25
5.4.3. Fase de laboratorio
Se realizó la extracción de hembras inmaduras, machos, y juveniles del suelo
por medio del método de tamizado, centrifugado y flotación en azúcar Agudelo
(2011), (Anexo 2). Las lecturas de machos, hembras inmaduras y juveniles, se
hicieron con relación al número de nematodos existentes en 100 cc de suelo que
fue el dato de referencia para la población inicial y observar si incidía en la
aparición de hembras maduras.
Se realizaron bioensayos en los invernaderos del Centro de Producción San
Ignacio de la Universidad Rafael Landívar en el mes de Junio de 2011 con los
especímenes obtenidos en cada una de las localidades muestreadas, en donde
se buscó conocer la sintomatología que se desarrolla a nivel radicular. El
montaje de los bioensayos se inició con el aislamiento del suelo después de
confirmada la presencia de nematodos. Se utilizaron macetas transparentes con
capacidad de 1,100 c.c, en donde se utilizó 50% de arena blanca (vermiculita)
esterilizada y 50% repartido en arena blanca y suelo infectado que se desinfectó
aplicándole Banrot 50 WP para prevenir principalmente hongos del suelo. Las
macetas fueron recubiertas con papel de aluminio y fueron depositadas dos
semillas de melón con cinco repeticiones en cada maceta, en donde por
localidad se realizó una repetición de cinco macetas; y se colocaron en
invernadero para dar un total de 25 macetas.
Se observaron las macetas y las raíces periódicamente y se tomaron fotografías
para observar el avance del daño sobre el tejido radicular a los 20, 30, y 40 días
después de que se realizó la siembra. Cada vez que se cumplían los días de
estudio se extrajeron las plántulas para observar si existía presencia de hembras
maduras por el método de disección de raíces teñidas, donde se observaron en
el estereoscopio, y se realizó la lectura correspondiente en el microscopio.
26
La identificación de las especies de inmaduros se realizó fijando los nematodos
en solución TAF, que es a base de Trietalonamina, Formalina 40% y agua
destilada, lo que permitió que este fijador conservara los nematodos por largo
tiempo permitiendo que la apariencia se mantuviera y los especímenes no se
desecaran (Coyne, Nicol & Cole, 2007).
5.4.3.1 Determinación del tamaño de la muestra
El tamaño de la muestra para realizar los montajes se realizó en base a un
muestreo previo tomando las variables S= largo del estilete, L=largo del cuerpo y
V= posición de la vulva, en donde se determinó la desviación estándar y la
media para cada variable y con ayuda de la fórmula:
2
Utilizando un α=0.05 se obtuvo que es necesario una muestra de 1 nematodo
de hembra inmaduro y 5 especímenes de hembras maduras.
5.4.3.2 Clave utilizada para la identificación del género Rotylenchulus
1a.Stylet absent………………………………………………..……….Not a plant
parasite
2b.Stylet present………………………………………………………………………..2
2 a. Two – part esophagus, no valvulated apparatus, anterior part slender,
posterior part glandular and muscular; stylet usually without basal swelling [Order
Dorylaimida]………………………………………………………………………...……3
2 b. three – part esophagus usually with a valvulated metacorpus (median bulb)
followed by a slender isthmus and glandular basal bulb; stylet usually with basal
S (α*µ)
α
27
knobs [Orders Aphelenchida and
Tylenchida]……………………………………………………………………………….6
6 a. Dorsal esophageal gland outlet in metacorpus, anterior to valve, or in that
position when median bulb absent (usually difficult to see); metacorpus very
large, often appears nearly as wide as the diameter of the body [Order
Aphelenchida]……………………………………………………………………………7
6 b. Dorsal esophageal gland outlet in procorpus ( usually can be seen more
readily in recently prepared water mounts than in glycerine mounts); metacorpus
moderate to reduced in size ( less than three-fourths body width) [Order
Tylenchida]……………………………………………………………………….………9
9 a. Head with setae; no plant parasites………………………Atylenchus,
Eutylenchus
9b. Head without setae; numerous plant
parasites……………………………………………………………………………...10
10a. Metacorpus absent or reduced; if reduced, no sclerotized
valve……………………………………………………..…………..……Nothanguina,
Nothotylenchus
10 b. Metacorpus with sclerotized valves present (usually can be seen more
readily in recently prepared water mounts than in glycerine
mounts)…………………………………………………………………………………11
11 a. Mature females greatly enlarged (pear-shaped, lemon-shaped, kidney-
shaped or saccate); found in roots of plants either embedded or attached by
neck; some occur as cysts in
soil………………………………………………………………………………………12
11b. Mature females vermiform; may be slender to slightly
swollen……………………………………………………………………………...…..23
28
12 a. Mature females soft, elongate-saccate, or kidney-shaped with tail (except
for Sphaeronema, wich is spherical without a
tail)………………………………………………………………………………………13
12 b. Mature females becoming cysts or remaining soft-bodied; pyriform-saccate,
spheroid, or lemon-shaped, usually without a
tail………………………………………………………………………………………..18
13a. Mature female with two
ovaries……………………………………...……………………………Rotylenchulus
13b. Mature female with one
ovary…………………………………………………………………………………….14
5.4.3.3 Identificación de especies de inmaduros
Se pescaron los nematodos que en apariencia tenían forma de C vistos desde el
estereoscopio marca Leica con una lima de endodoncia K-File marca Dentsply
de la casa Maillefer con medida de 25 mm y se colocaron diez especímenes en
un portaobjetos.
El portaobjetos contenía solución TAF (Anexo 3). Se observaron en el
microscopio y se descartaron los que no tenían apariencia similar a
Rotylenchulus. Al descartarlos se hizo la lectura en el microscopio LEICA EC3
GME aumento 10X junto con el programa Leica Application Suite LAS EZ
versión 1.8.0; donde se tomaron fotografías y se midieron las partes principales
para llegar a la especie que eran: largo del estilete, longitud total, y posición de
la vulva; se usó la descripción del libro C.I.H. (1972), (Anexo 6).
29
5.4.3.3 Identificación de especies de hembras maduras
El método de extracción que se utilizó para las hembras maduras, fue el método
de disección de raíces teñidas en rojo de metilo o rojo utilizado como colorante
artificial. La metodología que se utilizó para la tinción de raíces fue la establecida
por la Universidad de Clemson en su curso de Identificación de nematodos
fitoparásitos (Anexo 4) (Clemson, University)
Después de realizar las mediciones de L= longitud de la hembra y V= posición
de la vulva, y utilizando la metodología de tamaño de muestras para hembras
inmaduras, en donde el tamaño de la muestra fue de 5 hembras maduras que
eran significativas para ser Rotylenchulus reniformis se identificó la especie
según la descripción del libro C.I.H. (1972) (Anexo 6).
5.4.3.4 Identificación de especies en hembras inmaduras por el método de
molecular PCR
Para la confirmación de las especies identificadas morfométricamente se
realizaron extracciones de hembras inmaduras y se trasladaron en solución
fisiológica de NaCl 1M a la Universidad de Clemson en Carolina del Sur,
Estados Unidos, donde se realizó la identificación con el método PCR en el mes
de noviembre de 2011 (Anexo 7 y 8).
El análisis se inició con el diseño de primers específicos en una secuencia de la
base de datos GENBANK, en donde se escogió la longitud en pares de bases
que se trabajó, y se obtuvo todas las especificaciones, para que el mismo
programa creara los primers con una longitud de producto o amplicon de 560
pares de bases. Los aspectos críticos de los primers es que deben tener una
longitud de 18-22 bp, conocer la temperatura de fusión que es importante al
momento de programar en el termociclador la temperatura de alineación. Una
30
baja temperatura de alineación dará una baja rigurosidad, y una alta temperatura
de alineación dará alta rigurosidad. El punto más importante para el diseño de
primers es el contenido de CG, que debe ser mayor a 50%. El diseño de lo
primers se envió a IDT (Integrated DNA Technologies), las especificaciones de
los primers utilizados se detalla en el Anexo 11.
Se realizaron extracciones de ADN de los individuos llevados a la Universidad
de Clemson en el mes de noviembre de 2011, con el kit Extract-N-Amp Tissue
PCR Kit (Sigma-Aldrich), poniendo la extracción a 4°C y la preparación de las
reacciones para seis tubos eppendorf para microcentrífuga. Los primers
utilizados fueron: Forward 5´CGC TGG CGT CTC TGC GTT GT 3´ con una
longitud de 20 bases de ADN y el Reverse 5´ TGG CAT ACCCCA CGC TCC
ACT 3´ con una longitud de 21 bases de ADN que se muestran con descripción
detallada en el Anexo 11, específicos para el nematodo R. reniformis. Fue
necesaria la preparación de los primers en dos concentraciones diferentes; la
primera 1:10 se realizó del primer original y la segunda concentración 1:10 se
preparó de la primera solución para reducir la aparición de primer dimer.
Posteriormente el termociclador fue programado con 35 ciclos y una temperatura
de alineación de 50 °C, como se muestra en el Anexo 8 Figura 16.
Posteriormente se preparó el gel de agarosa a 1% para correr el gel por medio
de electroforesis en el TAE buffer, depositando el ADN en los carriles del gel que
se mezcló con 6X Orange DNA Loading Dye para que precipitara.
31
5.5. ANALISIS DE LA INFORMACIÓN
Se realizaron diferentes pasos para llegar a determinar la especie del nematodo
reniforme, los cuales fueron determinados de la siguiente manera:
a. Identificación del género en base a clave dicotómica de Mai & Mullin,
(1996)
b. Se realizó la identificación de la especie sobre especímenes de hembras
inmaduras colocadas en montajes con solución TAF, por medio de
mediciones (Coyne & Cole2007)
c. Identificación de la especie en base a hembras maduras colocadas en
montajes con solución de glicerina acidificada por medio de mediciones
d. Confirmación de la especie por medio de análisis molecular PCR
e. Descripción de la especie y las zonas con presencia del nematodo
reniforme
32
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Determinación del Género Rotylenchulus
De la extracción que se realizó previo a la realización de los bioensayos se
observaron nemátodos que en su forma sésil tenían forma de C desde el
estereoscopio. Este es un criterio para poder realizar los montajes y así
determinar el género Rotylenchulus en un estadio vermiforme que pueden ser
hembras y machos respectivamente. Para facilitar la identificación se descartan
los nemátodos que no presentan una forma de C y nemátodos con mucha
movilidad que pueden referir a nemátodos de vida libre. La figura 3, presenta
una hembra inmadura del género Rotylenchulus montada en microscopio con
aumento 20X.
Figura 3. Hembra inmadura Rotylenchulus reniformis extraída de suelo, montada
en solución TAF.
Fuente: El autor
33
Con ayuda de la clave para géneros de nemátodos fitoparásitos de Mai & Mullin
(1996), (Anexo 1), se identificaron 20 nemátodos extraídos de las muestras
caracterizando morfométricamente a varios especímenes. El género identificado
fue Rotylenchulus por presentar tres partes de esófago, un estomatoestilete de
tamaño medio con nódulos basales, la abertura de la glándula esofageal dorsal
(DEGO) a más de un estilete de distancia después de los nódulos basales que
se observó mejor en montajes recientes, la hembra inmadura vermiforme con la
posición de la vulva posterior. Las hembras maduras cambian su forma original a
forma de riñón y la descripción fundamental fue que las hembras maduras
presentan dos ovarios llegando a ser Rotylenchulus.
6.2 Distribución de Rotylenchulus en campo
Al realizar la identificación del género, se realizaron muestreos en localidades
que aparentemente tenía presencia del nematodo reniforme, se realizaron las
extracciones por el método de tamizado, centrifugado y flotación en azúcar. En
los conteos realizados se obtuvieron poblaciones iniciales en 100 cc de suelo de
la siguiente manera:
Cuadro 3. Población inicial de nematodos de R. reniformis en 100 cc de suelo
LOCALIDAD VERMIFORMES/100CC
SECCION 1B 14
LA HACIENDA 40
SECCION 3C 40
SECCION 5 54
SAN LUCAS 160
34
Teniendo las poblaciones iniciales de los nemátodos se procedió a la realización
de bioensayos dentro de invernadero para la reproducción de hembras maduras,
y desarrollar una comparación sobre las poblaciones iniciales vs aparición de
hembras maduras. En esta fase de la investigación se buscaba asegurar la
presencia del nematodo del género Rotylenchulus, y en los bioensayos se buscó
aislar hembras adultas para la identificación de las especies.
Figura 4. Representación grafica de las poblaciones iniciales de R. reniformis en
100 cc de suelo
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SECCION 1B LA HACIENDA SECCION 3C SECCION 5 SAN LUCAS
Can
tid
ad d
e n
em
ato
do
s
Localidades de la finca los Yajes muestreadas
35
6.3 Resultados de bioensayo
Se realizó la siembra en el mes de junio en los invernaderos del Centro de
Producción San Ignacio de la Universidad Rafal Landívar; de semilla de melón
en los suelos de las cinco localidades muestreadas, en donde la germinación de
la semilla se observó homogénea a los ocho días después de haber realizado la
siembra. A lo largo del bioensayo las plantas de la Sección 3 y La Hacienda no
presentaron un crecimiento uniforme en comparación con la Sección 5, Sección
3C, Sección 1B y San Lucas. El crecimiento desigual se vio principalmente en
las raíces, que mostraron poco desarrollo y las hojas basales no dieron paso al
crecimiento de las hojas principales de la planta. Esto se puede atribuir a que el
suelo en estas secciones estaba bajo en nutrientes y eran suelos con exceso de
arcilla que impedían el desarrollo radicular. A partir del día 30 al 40 las plantas
que estaban en crecimiento sobre el suelo de San Lucas presentaron necrosis
en las puntas de las hojas, y muerte total en las hojas primarias, además de un
escaso o pobre desarrollo de raíces; atribuyéndose esto al ataque de los
nemátodos que al final fue la única muestra que presentó las hembras maduras
infectando a la raíz.
36
Figura 5. Bioensayo establecido en invernadero del Centro de Producción San
Ignacio
Fuente: El Autor
6.4 Determinación de R. reniformis en hembras vermiformes
Se realizó tomando en cuenta las localidades muestreadas (San Lucas, Sección
5, Sección 1B, Sección 3C y La Hacienda), realizando las extracciones de
nemátodos por el método de tamizado, centrifugado y flotación en azúcar,
obteniendo así a las hembras vermiformes, machos y juveniles. Se observaron
diez nemátodos y se identificó la especie en base a características
morfométricas.
37
Cuadro 4. Descripción de abreviaciones utilizadas para las mediciones de
especímenes extraídos de los bioensayos en la determinación de la especie de
Rotylenchulus
ABREVIACION DESCRIPCION
S Largo del estilete medido en micras
L Longitud total del nematodo medido en
mm
V Posición de la vulva puesto en
porcentaje
Figura 6. Longitud del estilete de una hembra inmadura
Fuente: El Autor
Dentro de las mediciones que se realizaron para la identificación de la especie
en hembras inmaduras se tomaron las abreviaciones que se muestran en el
cuadro 3, en donde de acuerdo con descripción presentada por C.I.H. (1972); el
estilete se encontraba dentro de los rangos de S= 16-18 µm, tal y como se
muestra en la figura 6 donde se puede observar el estilete con una medida de
S=16.40 µm, aumentado (100X), y con ayuda de aceite de inmersión.
38
Figura 7. Vulva de una hembra inmadura de R. reniformis
Fuente: El autor
Figura 8. Presencia de machos que acompañan a las hembras inmaduras
Fuente: El Autor
39
La descripción presentada por C.I.H. (1972); detalla la presencia de machos
como se muestra en la figura 8, además de la ubicación de la vulva en los
rangos de 68-73%, la descripción final del estilete que se encontraba entre los
rangos de 16-21µm determinó a la especie del nematodo reniforme. La parte
esencial para saber sobre la especie del nematodo Rotylenchulus fue la
posición de la vulva en donde se tomó la medida desde el final de la cola hasta
donde se encontraba la vulva, que se puede observar en la figura 7, y se sacó
con relación al largo total del nematodo.
Cuadro 5. Resultados obtenidos de las variables para determinación de la
especie de Rotylenchulus reniformis. Los valores resaltados corresponden a R.
reniformis
MEDICION HEMBRAS INMADURAS
MONTAJE S (µm)Longitud
del estilete
L (mm) Largo del nemátodo
V (%) Posición
de la vulva
1 17.89 382.61 70%
2 17.95 336.91 73%
3 17.60 316.84 75%
4 16.26 325.61 72%
5 16.80 306.95 76%
6 16.35 338.45 73%
7 16.88 327.97 74%
8 16.48 341.36 72%
9 16.06 359.61 73%
10 16.20 299.97 75%
Promedio 16.85 333.63 74 %
Desviación Estandard
0.72 24.47 1.84 %
Después de realizar los montajes y las mediciones en partes específicas de las
hembras vermiformes presentes en las cinco localidades muestreadas (San
Lucas, Seccion 5, Seccion 1B, Sección 3C y la Hacienda), y con base a la
descripción presentada por C.I.H. (1972); (Anexo 6), se llegó a determinar que la
40
especie encontrada fue R. reniformis debido a que todas las mediciones
realizadas S= 16-18 µm, V > 68-73% y L= 0.34-0.42 mm coincidían y estaban
dentro del rango para ser de esta especie. En referencia a la fórmula para
tamaño de muestra que se usó en este estudio, se utilizó la muestra de diez
especímenes para determinar la representatividad de las variables en estudio. Al
aplicar la fórmula se obtuvo n = 0.72 lo que indicó que un nemátodo era
representativo para ser de la especie encontrada, en donde debido a la
variabilidad obtenida, la aparición de una especie diferente a R. reniformis fue
muy difícil y como se observa en el cuadro 4; los especímenes 1,2,6,8 y 9
mostraron la mayor similitud dentro de la especie R. reniformis,
6.5 Determinación de R. reniformis en hembras maduras
La identificación de la especie en hembras maduras se realizó en base a un
muestreo destructivo de plántulas; y extrayendo a las hembras de la raíz por
medio de disección de raíces teñidas según la metodología propuesta por
Agudelo (2011). Se puede observar a una hembra inmadura en fase de
formación para hembra madura; extraída de una raíz en la figura 10, en donde la
formación para una hembra madura se va observando con el engrosamiento de
la cabeza y la vulva se va hinchando hasta mostrar presencia de labios; como se
muestra en la figura 9, para ir produciendo la matriz gelatinosa donde se
encuentran los huevecillos.
41
Figura 9. Hembra madura de Rotylenchulus reniformis adherida a raíz de melón
Fuente: El Autor
Figura 10. Fase de formación en hembra de Rotylenchulus reniformis extraída
de raíces de las plantas de melón en los bioensayos
Fuente: El Autor
42
Figura 11. Célula primaria de infección en la raíz de melón
Fuente: El Autor
Según las descripciones estudiadas, las hembras maduras de Rotylenchulus,
presentan una forma característica de riñón como se muestra en la figura 9 y
con presencia de una matriz gelatinosa conteniendo los huevecillos, y que el
modo de infección es semiendoparasítico como se presenta en la figura 13. Con
base a estas descripciones de género, se tomaron características para definir la
especie tales como longitud de la hembra y posición de la vulva. Estas
descripciones según C.I.H. (1972); fueron esenciales para poder llegar a la
especie junto con la figura 11, que muestra la célula primaria de infección
formada por las hembras maduras y que es el primer lugar de infección para
posteriormente formar el sincitio.
43
Figura 12. Vulva de hembra madura con aceite de inmersión
Fuente: El Autor
Figura 13. Cabeza de hembra madura parasitando a células
Fuente: El Autor
44
Cuadro 6. Resultados obtenidos en la medición de hembras maduras para la
identificación de Rotylenchulus reniformis. Los valores resaltados corresponden
a R. reniformis
MONTAJE L (mm) Longitud de la hembra
V: Posición de la vulva
1 0.4369 71%
2 0.35629 79%
3 0.44893 72%
4 0.46515 70%
5 0.37003 77%
6 0.35757 68%
7 0.35602 74%
8 0.40747 72%
9 0.44323 73%
10 0.44565 73%
Promedio 0.41 73%
DE 0.04 3.23 %
Se determinó la especie de acuerdo con la descripción propuesta por C.I.H.
(1972); (Anexo 6); en donde el largo del cuerpo L= 0.38-0.52 mm y la posición
de la vulva V= 68-73 % coincidió con los especímenes 1, 3, 4, 8, 9 y 10 que se
muestran en el cuadro 5. Para la determinación de la especie se corroboró la
representatividad de los especímenes utilizando la fórmula de tamaño de
muestra que sirvió para hembras vermiformes; obteniendo un n= 4.76, que se
puede interpretar, en que existió mayor variabilidad con respecto a los estados
inmaduros, debido a que algunas de las hembras extraídas no estaban en un
estado maduro adecuado; sin embargo para la determinación de la especie
fueron representativos 5 individuos; por lo que en los especímenes que
coincidieron con las mediciones, se llegó a determinar la especie R. reniformis.
Realizando una correlación entre los especímenes vermiformes y los adultos,
existe una alta probabilidad de que en los suelos muestreados se encuentre
únicamente la especie R. reniformis debido a la poca variabilidad que se obtuvo
en las lecturas de los especímenes extraídos al inicio, teniendo en cantidades
45
pequeñas a nematodos de vida libre comprobado por la realización de otra
extracción del suelo utilizado para la reproducción de hembras maduras.
6.6. Determinación de la especie por medio de PCR
Se realizó la identificación molecular por el método de PCR, en base a
individuos extraídos en donde se analizó el gen ribosomal 18S, 5.8S y el gen
28S, realizando extracciones de ADN y preparando las reacciones con los
primers que fueron diseñados en la base de datos GENBANK con número de
acceso GU003970, tomando como referencia una longitud de 809 pares de
bases como se muestra en la figura 14, obteniendo en los primers diseñados un
amplicon o una longitud de producto de 560 bp. Se realizaron las reacciones, se
programó en el termociclador, se corrió en gel de agarosa, se purificaron y se
secuenció obteniéndose los resultados que se detallan según los genes que se
analizaron y la similitud que tiene con la especie encontrada morfométricamente.
46
Rotylenchulus reniformis isolate FJ45 18S ribosomal RNA gene,
partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal
RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence;
and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
Length=809
Score = 917 bits (496), Expect = 0.0
Identities = 503/506 (99%), Gaps = 1/506 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 29 TGGCGGTGATGAGACAACGCGTTAGGACTGCGTACCTTGTTAGTCTGGTATGCGGTTTAA 88
|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 232 TGGCTGTGATGAGACAACGCGTTAGGACTGCGTACCTTGTTAGTCTGGTATGCGGTTTAA 291
Query 89 GACTCAATGAGCGCCCTGGTTTGGCGCCGCCAGCAttttttttCAAATAAAAACTTTTTA 148
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 292 GACTCAATGAGCGCCCTGGTTTGGCGCCGCCAGCATTTTTTTTCAAATAAAAACTTTTTA 351
Query 149 CaaaaaaaaCAAAATTCTAGTCTTATCGGTGGATCACTCGGCTCGTGGGTCGATGAAGAA 208
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 352 CAAAAAAAACAAAATTCTAGTCTTATCGGTGGATCACTCGGCTCGTGGGTCGATGAAGAA 411
Query 209 CGCAACCAACTGCGATAAATAGTGTGAACTGCAGAAACCTTGAACACAAAACATTCGAAT 268
|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 412 CGCAGCCAACTGCGATAAATAGTGTGAACTGCAGAAACCTTGAACACAAAACATTCGAAT 471
Query 269 GCGCATTGCGCCACCGGAGTAACATCAGGTGGCACGTCTGGTTCAGGGTCGACATACAAA 328
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 472 GCGCATTGCGCCACCGGAGTAACATCAGGTGGCACGTCTGGTTCAGGGTCGACATACAAA 531
Query 329 CATGCACTGCATTTGCGTGCGGAATTGTGGGATCAACAGATGATACCGCATTTGTAATGG 388
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 532 CATGCACTGCATTTGCGTGCGGAATTGTGGGATCAACAGATGATACCGCATTTGTAATGG 591
Query 389 CACCTTACTAGGGTTGAACATGTCCAACATGTGATTGTGTAATGTTTTAATCCATGTTTT 448
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 592 CACCTTACTAGGGTTGAACATGTCCAACATGTGATTGTGTAATGTTTTAATCCATGTTTT 651
Query 449 ACAACTTGTGACCCCGGGACAAACTTGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGCAATCC 508
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 652 ACAACTTGTGACCCCGGGACAAACTTGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGCAATCC 711
Query 509 AATTAGTGGAGCGTGGGGGTATGCCA 534
|||||||||||||||||| |||||||
Sbjct 712 AATTAGTGGAGCGTGGGG-TATGCCA 736
Figura 14. Secuenciación de los genes, en los especímenes de R. reniformis
analizados por PCR
Se corrió el gel por 35 minutos a 110 V, obteniendo en cinco reacciones una
extensión entre 500-525 pares de bases como se muestra en la figura 16, lo que
indicó que la especie era R. reniformis. Las muestras de PCR que mostraron
extensión se purificaron y se enviaron el 2 de diciembre de 2011 a secuenciar a
CUGI (Clemson University Genomic Institute). La secuenciación se corrió en la
base de datos de GENBANK, en donde se obtuvo una identidad de 503/506
dando un 99% de similitud con respecto a la especie R. reniformis (figura 14),
47
con número de acceso GU003959.1 y en los errores de confiabilidad, que
indicaban que no era de ese género ni especie se obtuvo 1/506 dando 0% de
error, por lo tanto a través de este análisis se puede establecer que la especie
encontrada es R. reniformis, lo cual coincide con la especie determinada a
través de características morfométricas, indicando que en la localidad de San
Lucas el nemátodo que está presente es el nemátodo reniforme.
Figura 15. Extensión en gel de agarosa de las muestras de PCR. Los valores
C1: R. reniformis, C2: R. reniformis, C3: Rotylenchulus sp, C4: R. reniformis, C5:
R. reniformis, C6: R. reniformis
48
6.7 Distribución de especie del nematodo reniforme
En el cuadro 6 se muestra detalladamente los resultados de hembras inmaduras
con relación a la población inicial de nematodos previos a realizar el bioensayo,
y la cantidad de hembras maduras al finalizar los 40 días del estudio.
Cuadro 7. Distribución de poblaciones iniciales y finales de R. reniformis
LOCALIDAD VERMIFORMES INICIALES/100CC
MADURAS FINALES/10 PLANTAS
SECCION 1B 14 0
LA HACIENDA 40 0
SECCION 3C 40 0
SECCION 5 54 0
SAN LUCAS 160 25
En las localidades de La Hacienda, Sección 3C, Sección 5 y Sección 1B a pesar
de que existió población de nemátodos, eran muy bajas en comparación con
San Lucas, en donde se puede asumir que son localidades en donde si está
presente el nemátodo, pero no es la población adecuada para llegar a infectar a
las raíces del melón y se puede observar con los resultados obtenidos.
La población inicial de los nemátodos fue factor principal para que población
inicial vs aparición de hembras maduras fuera evidente, lo que se pudo
comprobar luego de la realización del bioensayo debido a que en la localidad de
San Lucas como se muestra en el cuadro 6, fue la localidad que presentó mayor
población inicial y donde se encontraron un total de 25 hembras maduras en una
muestra de 10 plantas que dieron la especie R. reniformis, tras cumplirse los 40
días de haberse realizado la siembra, en donde las condiciones dentro del
invernadero principalmente temperatura fueron favorables a partir del día 11
como se muestra en el Anexo 9 figura 17, lo que influyó para que la aparición de
las hembras fuera positivo. En los días 20 y 30 no se encontraron hembras
maduras, debido a que no era el tiempo suficiente, y el ciclo para que las
49
hembras estuvieran en un estado maduro no era el adecuado, además que al
inicio del bioensayo las temperaturas eran muy altas; lo que pudo haber incidido
en la muerte de los nematodos de las otras localidades, así como las
poblaciones iniciales bajas fue el otro factor que impidió la aparición de hembras
adultas en el resto de localidades, además en las localidades de La Hacienda,
Sección 5, Sección 3C, Sección 1B presentaban suelos con alta cantidad de
arcilla, en comparación con el suelo de la localidad de San Lucas que era un
suelo mas arenoso, lo que pudo influir en que la aparición de hembras maduras
no se diera, aunque la temperatura fuera la adecuada. Estando de acuerdo con
la descripción que Cardona (2001) hace acerca de que las poblaciones
disminuyen en suelos con exceso de arcilla, y aumentan sus poblaciones en
suelos franco o franco arcillosos, en donde hay mayor espacio para movilidad
de los nemátodos.
50
VII. CONCLUSIONES
Se determinó la especie R. reniformis en los individuos aislados de la localidad
San Lucas, a través de la caracterización morfométrica y confirmación a través
del análisis molecular PCR.
En los aislamientos de suelo se encontraron hembras vermiformes en todas las
localidades, sin embargo únicamente la localidad de San Lucas presentó
hembras maduras en los bioensayos, que coincide con la mayor población inicial
en suelo.
En los suelos de la finca los Yajes, está presente el nemátodo R. reniformis y
muy difícil encontrar nemátodos de otros géneros y especies, por la variabilidad
obtenida en los resultados al momento de contabilizar y hacer las
identificaciones.
Se diseñaron 4 primers específicos para la identificación molecular de R.
reniformis, de los cuales se usaron 2 para este estudio: Forward 5´CGC TGG
CGT CTC TGC GTT GT 3´ y Reverse 5´ TGG CAT ACCCCA CGC TCC ACT 3´.
Extraído de los genes ribosomales 18S, 5.8S y el gen 28S.
51
VIII. RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar estudios relacionados con la dinámica poblacional y
estructuras poblaciones del nemátodo reniforme en la Finca los Yajes, con el fin
de establecer épocas de incremento poblacional y factores edáficos que influyen
en las estructuras poblacionales.
Se recomienda el estudio sobre la patogenicidad del nemátodo reniforme en
diferentes variedades de melón para observar tolerancia y resistencia de
algunos materiales que pueden ser potenciales para su uso en el área de
estudio
Se recomienda realizar un estudio de manejo integrado del nemátodo reniforme,
para que el método de control a utilizar sea de mayor eficiencia y con un manejo
sostenible para el ambiente.
Se recomienda realizar las primeras lecturas de bioensayos con R. reniformis a
partir de los 30 días después de la siembra de melón, en un intervalo de 10 días
hasta alcanzar los 60 días de haber realizado la siembra.
52
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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57
X. ANEXOS
1. Metodología para la extracción de nematodos en suelo por el método de
tamizado, centrifugado y flotación en azúcar
Se siguió la metodología de Agudelo (2011), en donde indica separar 100 c.c.,
de suelo infectado que se realiza incorporando suelo en 500 ml de agua y se
llega a 600 por volumen. Posteriormente se realiza una mezcla homogénea en
donde se desterrona el suelo, que se deja reposar 10 segundos y es pasado por
tamices alineados verticalmente con medidas 20,120 y 500. Se recupera el suelo
del tamiz 500 y se lleva a tubos para centrifuga a los que se le agrega 15 g de
kaolin para que precipite todo los sólidos, y centrifugarlo durante 5-6 minutos. Se
desecha el agua y se le agrega 15 ml de sacarosa al 50% o 1.33 M., y se lleva a
centrifuga por 30 segundos, el agua que quede se recupera en el tamiz 500,
donde se lava hasta quitar el excedente de sacarosa, para al final se recuperar
20 ml de solución con nematodos en un beaker.
2. Fijación de nematodos en solución TAF
La solución TAF se preparó con 2 ml de Trietanolamina, 7 ml de Formalina 40%
y 91 ml agua destilada, en donde se calentó el fijador hasta punto de ebullición
en baño maría, y se agregó el fijador caliente en un volumen igual a la
suspensión de nematodos obtenida (Coyne & Cole 2007).
58
3. Tinción de raíces en rojo de metilo
La tinción de raíces se realizó; lavando las raíces para quitar el excedente de
tierra, se preparó una solución de rojo de metilo o colorante artificial al 12.5 %,
que se dejaron hervir por 30 segundos en una plancha caliente dentro del
laboratorio o se puede utilizar microondas. Se dejó enfriar la solución y se
lavaron las raíces con abundante agua. Se dejaron las raíces en glicerina
acidificada, que se preparó con 40 ml de glicerina + 5 gotas de ácido clorhídrico
5N y se dejaron en reposo de 2 a 3 días. Se observaron las raíces para
encontrar a las hembras teñidas que estaban adheridas a la raíz (Agudelo, 2011)
4. Metodología de extracción de suelo
La metodología utilizada fue colectar suelo en la zona afectada con una
profundidad de 15 a 20 cm, y colectar submuestras en puntos que van de 10 a
20 submuestras, en donde al tener suelos arenosos se realizan a una
profundidad de 25 cm. Para la realización de los muestreos se utilizaron
barrenos, y se realizaron muestras homogéneas de los muestreos, para totalizar
1 kg. El numero de submuestras a realizar dependerá del tamaño del área que
se va a investigar, en donde para un área pequeña de 500 m2 se toman
alrededor de 8-10 submuestras, para áreas de tamaño medio que van de 500
m2 a 0.4 ha tomar de 10-15 submuestras, y para un área de 0.4 – 2 ha tomar
como mínimo 20 submuestras y máximo 40 (Shurtleff & Averre, 2000).
59
5. Metodología para la identificación de especie para hembras inmaduras
según CIH. Descriptions of plant parasitic nematodes del Commonwealth
Institute of Helminthology, obtainable from Commonwealth Agricultural
Bureaux (C.A.B) (1972)
60
6. Metodología para extracción de ADN
10 µl solución de extracción + individuo de nematodo
2.5 µl preparación de tejidos
Incubación 55 °C 10 minutos
Incubación 95 °C 3 minutos + vortex
10 µl solución de neutralización
7. Metodología para PCR
Preparación de primers 100 µl agua para solución madre, concentración 1:10
solución de trabajo: 10 µl del primer + 90 µl agua
2 µl de ADN
1 µl Forward Primer
1 µl Reverse Primer
10 µl PCR Mix ( dntp´s, Taq, Buffer)
6 µl Agua
Mapa de los pasos realizados en la programación del termociclador
Fuente: El Autor
Vortex
61
9. Registro de temperaturas durante la duración del bioensayo
Temperatura y humedad relativa durante los 40 días de realización del
bioensayo
10. Localidades muestreadas para el estudio
Localidades muestreadas con presencia del nematodo
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39
° C
T (°C) HR (%)
62
11. Descripción de los primers utilizados para la identificación de la
especie por medio del método PCR
63
64
65